Króliczy model trwałej ekspresji transgenu w przeszczepach interpozycji żyły szyjnej do tętnicy szyjnej wspólnej
10 września 2018
Ta metoda opisuje umieszczanie przeszczepów żył interpozycyjnych u królików, transdukcję przeszczepów i osiągnięcie trwałej ekspresji transgenu. Pozwala to na badanie fizjologicznych i patologicznych ról transgenów i ich produktów białkowych w przeszczepionych żyłach oraz testowanie terapii genowych w chorobach przeszczepów żył.
Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące patogenezy niewydolności przeszczepu żyły. Na przykład może zidentyfikować mediatory niepowodzenia przeszczepu i przetestować strategie mające na celu zapobieganie niepowodzeniu przeszczepu. Główną zaletą tej techniki jest jej zdolność do uzyskania trwałej, stabilnej ekspresji transgenu w śródbłonku przeszczepu żyły.
Po znieczuleniu królika zgodnie z protokołem tekstowym należy ogolić zwierzę od wcięcia mostka do krawędzi żuchwy. Po zakończeniu operacji chirurgicznej użyj elektrokoagulacji, aby przeciąć skórę wzdłuż linii środkowej między wcięciem mostka a żuchwą, o długości około siedmiu do dziewięciu centymetrów. Następnie przymocuj zaciski do ręczników, aby utrzymać otwarte nacięcie.
Tępo rozetnij pod powięzią wzdłuż całej linii środkowej. Następnie użyj elektrokoagulacji, aby przeciąć rozciętą warstwę powięziową wzdłuż linii środkowej. Następnie, zaczynając od prawej strony, rozkrój mięsień gnykowy mostka pokrywający tchawicę i mięsień mostkowy, aby odsłonić tętnicę szyjną wspólną.
Następnie ostrożnie wypreparuj od czterech do pięciu centymetrów odcinek tętnicy szyjnej wspólnej i jej większe odgałęzienia wolne od otaczających tkanek. Użyj szwów jedwabnych 5-0, aby podwiązać większe gałęzie wspólnej tętnicy szyjnej przed przecięciem każdej gałęzi dystalnie do szwu. Po powtórzeniu sekcji na lewej tętnicy szyjnej wspólnej, użyj kleszczy przytrzymujących tkanki, aby tymczasowo zamknąć warstwę tkanki podskórnej.
Następnie wypreparuj powięź powierzchowną ze skóry po prawej stronie, aż do odsłonięcia zewnętrznej żyły szyjnej. Wypreparuj od czterech do pięciu centymetrów odcinka żyły szyjnej zewnętrznej i uwolnij jej gałęzie od otaczającej tkanki. Użyj jedwabnych szwów 5-0, aby podwiązać gałęzie, a następnie odetnij gałęzie.
Następnie podwiązać izolowaną żyłę na obu końcach, przeciąć koniec czaszki i przepłukać światło heparynizowaną solą fizjologiczną. Aby przeprowadzić przeszczep żyły, użyj klipsa naczyniowego, aby zacisnąć prawą tętnicę szyjną wspólną na końcu czaszki izolowanego segmentu. Następnie umieść klips naczyniowy na końcu ogonowym.
Teraz wykonaj arteriotomię ogonową tylko czaszką do zacisku ogonowego o długości równej średnicy czaszkowego końca odcinka żyły. Następnie wprowadzić cewnik dożylny połączony ze strzykawką z heparynizowaną solą fizjologiczną przez tętnicę ogonową i przepłukać światło tętnicy szyjnej. Płyn wydostanie się przez arteriotomię.
Wracając do żyły szyjnej, wytnij żyłę i połóż ją obok tętnicy szyjnej. Za pomocą pojedynczych szwów z polipropylenu 7-0 zszyć ogonowy koniec arteriotomii ogonowej do czaszkowego końca odcinka żyły. Następnie umieść drugi ścieg o 180 stopni od pierwszego ściegu, aby zszyć krawędź czaszki tętnicy ogonowej do czaszkowego końca odcinka żyły.
Umieść trzeci ścieg w punkcie w równej odległości od pierwszych dwóch ściegów po bocznej stronie zespolenia. Następnie umieść czwarty ścieg po przyśrodkowej stronie zespolenia w równej odległości od pierwszych dwóch ściegów i naprzeciwko trzeciego ściegu. Umieść cztery dodatkowe ściegi między każdym ze ściegów od jednego do czterech.
Wykonaj arteriotomię czaszki po ogonowej stronie dystalnego klipsa. Odległość między czaszkowym końcem arteriotomii czaszkowej a ogonowym końcem arteriotomii ogonowej powinna być taka sama jak długość odcinka żyły. Długość arteriotomii czaszki jest równa średnicy ogonowego końca odcinka żyły.
Gdy żyła jest przedłużona czaszkowo od zespolenia wzdłuż tętnicy szyjnej, upewnij się, że żyła nie jest skręcona. Następnie użyj heparynizowanego soli fizjologicznej, aby przepłukać tętnicę szyjną i żyłę przez tętnicę czaszkową. Następnie umieść pierwszy ścieg, aby zszyć ogonowy koniec arteriotomii czaszki do ogonowego końca odcinka żyły.
Następnie umieść drugi ścieg o 180 stopni od pierwszego ściegu, aby zszyć krawędź czaszki arteriotomii czaszki do ogonowego końca odcinka żyły. Wykonaj zespolenie, jak pokazano wcześniej w filmie. Tymczasowo zwolnij klips czaszkowy, aby przeszczep żyły wypełnił się krwią i delikatnie uciskaj suchą gazą, aby zatrzymać krwawienie.
Powtarzaj ten krok, aż zespolenie przestanie krwawić. Następnie usuń zaciski czaszkowe i ogonowe. Użyj gazy, aby zatamować dodatkowe krwawienie w zespoleniach.
Użyj jedwabnego szwu 3-0, aby podwiązać oba końce wspólnego odcinka tętnicy szyjnej między zespoleniami. Następnie podziel tętnicę szyjną w połowie między ligatury. W przeszczepie żyły należy zaobserwować energiczne pulsacje.
Powtórz umieszczenie przeszczepu żyły po lewej stronie. Za pomocą szwu 5-0 PGA zamknij tkankę podskórną ciągłym wzorem. Następnie użyj szwu 3-0 PGA, aby zamknąć skórę wzorem śródskórnym i zakopać węzły na obu końcach.
Przeprowadzić opiekę pooperacyjną i USG przezskórne zgodnie z protokołem tekstowym. Aby przeprowadzić operację transferu genów, należy ostrożnie odizolować prawy przeszczep żyły, w tym 1,5 do dwóch centymetrów tętnicy szyjnej przylegającej do przeszczepu zarówno po stronie czaszki, jak i ogona. Powtórz sekcję po lewej stronie w ten sam sposób.
Użyj zwykłej soli fizjologicznej, aby wypełnić jamę rany operacyjnej po prawej stronie, aby umożliwić transmisję fal dźwiękowych. Podłącz dwumilimetrową sondę przepływu okołonaczyniowego do przepływomierza objętościowego i zanurz sondę w soli fizjologicznej w jamie rany. Ustaw natężenie przepływu na zero.
Umieść sondę przepływu wokół tętnicy szyjnej, ogonowej lub czaszkowej do przeszczepu żyły. Następnie użyj elektronicznego systemu akwizycji danych, aby zarejestrować dane z sondy przepływu. Po wstrzyknięciu heparyny królikowi przez cewnik dożylny i przepłukaniu go solą fizjologiczną, użyj klipsa naczyniowego, aby zacisnąć tętnicę szyjną wspólną na końcu czaszki przeszczepu żyły.
A następnie przyłóż drugi klips do tętnicy szyjnej około 10 milimetrów ogonowo do zespolenia ogonowego, aby pozostawić miejsce na arteriotomię. Następnie umieść luźno dwie jedwabne opaski wokół tętnicy szyjnej tuż doogonowo do przeszczepu żyły. Następnie za pomocą wcześniej przygotowanej igły wygiętej w rozmiarze 21 nakłuć szyję ogonową do przeszczepu i tylko czaszkę do klipsa naczyniowego ogonowego.
Przesuń igłę do światła w przód iw tył dwukrotnie, aby upewnić się, że światło jest czyste. Następnie ostrożnie wyjmij igłę. Po przygotowaniu strzykawki i cewnika dożylnego z DMEM zgodnie z protokołem tekstowym, włóż go do arteriotomii tętnicy szyjnej wspólnej do punktu zgięcia i przemyj światło przeszczepu żyły, wypełniając je dwukrotnie 0,5 mililitra DMEM.
Usuń DMEM z przeszczepu, używając palca w rękawiczce, aby lekko docisnąć czaszkowy koniec przeszczepu. Następnie ostrożnie przesuń palec wzdłuż przeszczepu w kierunku ogonowego końca przeszczepu, aby wypłukać zawartość światła przez arteriotomię. Wyjąć strzykawkę DMEM z cewnika, pozostawiając cewnik w naczyniu.
Podłączyć strzykawkę zawierającą roztwór wirusa, upewniając się, że powietrze nie dostało się do cewnika. Przesuń luźno zawiązane jedwabne opaski w dół tętnicy, aż znajdą się wokół końcówki cewnika, ale nie zaciskaj ich. Wlej 0,03 mililitra roztworu wirusa, aby wypchnąć pozostały DMEM z cewnika.
Następnie za pomocą palca usuń cały płyn ze światła przeszczepu żyły, delikatnie naciskając od czaszki do ogona. Zaciśnij dwie opaski wokół tętnicy i końcówki cewnika, aby uszczelnić światło. Następnie wlej roztwór wirusa, aż żyła zostanie rozdęta.
Delikatnie położyć strzykawkę na gnieździe z gazy. Po 20 minutach za pomocą pustej strzykawki delikatnie zassać roztwór zawierający wirusa z przeszczepu, aż naczynie się zapadnie. Wyjąć strzykawkę, pozostawiając cewnik na miejscu.
Następnie odetnij i rozwiąż jedwabne szwy i wyjmij cewnik z naczynia. Teraz użyj nici polipropylenowej 7-0 we wzorze X, aby zamknąć arteriotomię. Następnie delikatnie pociągnij końce szwów i zwiąż je ze sobą dwoma kwadratowymi węzłami.
Po przywróceniu przepływu krwi w przeszczepie żyły prawej zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy powtórzyć wlew wirusa po lewej stronie. Aby pobrać transdukowane przeszczepy, należy wypreparować przeszczepy żył i tętnice szyjne wspólne oraz dokonać pomiarów przepływu zarówno po lewej, jak i prawej stronie, jak pokazano wcześniej. Użyj jedwabnego szwu 3-0, aby podwiązać prawą tętnicę szyjną wspólną czaszki do przeszczepu.
Następnie użyj jedwabnego szwu 3-0, aby podwiązać ogon szyjny do przeszczepu. Wyciąć przeszczep żyły prawej, dzieląc sąsiednią tętnicę szyjną między każdym z podwiązaniami i sąsiednim zespoleniem. Następnie usuń przeszczep żyły od królika i użyj soli fizjologicznej, aby przepłukać światło.
Pierwszym kamieniem milowym, który musi osiągnąć nowy operator, jest stała drożność przeszczepu żyły zarówno po początkowej operacji przeszczepu żyły, jak i późniejszej operacji opóźnionej transdukcji. Gdy przeszczep żyły jest opatentowany, badanie ultrasonograficzne ujawni duże naczynie krwionośne z energicznym przepływem krwi od ogona do czaszki. Przeszczepy zostały pobrane trzy dni po transdukcji, pocięte na sekcje i wybarwione X-galem.
Obrazowanie powierzchni luminalnych typu en-face wykazało przeszczepy żył z wydajną transdukcją i słabą transdukcją. Jak pokazano na tym wykresie, poziomy mRNA beta galaktozydazy w przeszczepach żylnych transdukowanych przez nowego operatora nie różniły się znacząco od poziomów mRNA beta galaktozydazy w przeszczepach żyłowych transdukowanych przez doświadczonego operatora. Podczas wykonywania tego protokołu należy pamiętać o odwróceniu przeszczepu żyły czaszkowej do ogonowej przed zaciągnięciem zespolenia.
Jest to konieczne, aby uniknąć utrudnienia przepływu krwi przez bolus żylny. Po opanowaniu operacji tych można wykonać w ciągu około trzech godzin w przypadku procedury przeszczepu żyły, dwóch godzin w przypadku procedury transferu genów przeszczepu żyły i 45 minut w przypadku procedury pobrania. Nie zapominaj, że ponieważ protokół ten wymaga pracy z wektorami wirusowymi i ostrymi przedmiotami, należy przestrzegać odpowiednich procedur bezpieczeństwa biologicznego i ostrych narzędzi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Metoda ta opisuje sposób umieszczania interpozycyjnych przeszczepów żylnych u królików, co umożliwia badanie ekspresji transgenu oraz jego roli fizjologicznej. Stanowi ona platformę do testowania terapii genowych ukierunkowanych na leczenie chorób przeszczepów żylnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Biologia naczyniowa
- Ekspresja transgenu
Wstęp
- Niewydolność przeszczepu żylnego stanowi istotny problem kliniczny.
- Zrozumienie patogenezy niewydolności przeszczepu może prowadzić do opracowania lepszych strategii terapeutycznych.
- Trwała ekspresja transgenu w przeszczepach żylnych może ułatwić prowadzenie badań.
- Metoda ta pozwala na identyfikację mediatorów niewydolności przeszczepu.
Cel badania
- Zbadanie fizjologicznych i patologicznych ról transgenów w przeszczepionych żyłach.
- Przetestowanie strategii mających na celu zapobieganie niepowodzeniu przeszczepu żylnego.
- Osiągnięcie stabilnej ekspresji transgenu w śródbłonku przeszczepu żylnego.
Zastosowane metody
- Umieszczenie żył interpozycyjnych u królików.
- Transdukcja przeszczepów w celu ekspresji genów.
- Ocena stabilności ekspresji transgenu.
- Procedury chirurgiczne, w tym znieczulenie i techniki nacinania.
Główne wyniki
- Pomyślnie uzyskano trwałą ekspresję transgenu.
- Metoda ta pozwala na badanie mediatorów odrzucania przeszczepu.
- Możliwe jest testowanie potencjalnych strategii zapobiegania odrzucaniu przeszczepu.
- Potwierdzono stabilną ekspresję w śródbłonku przeszczepu żylnego.
Wnioski
- Metoda ta stanowi cenne narzędzie do badania choroby przeszczepów żylnych.
- Umożliwia ona lepsze zrozumienie roli transgenów w biologii naczyniowej.
- W przyszłych badaniach technika ta może zostać wykorzystana do opracowania nowych metod terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Trwała ekspresja transgenu w przeszczepach interpozycyjnych z żyły szyjnej do tętnicy szyjnej u królików umożliwia rygorystyczne badanie funkcji genów oraz strategii terapeutycznych w przypadku niewydolności przeszczepów żylnych. Model ten zapewnia wiarygodność prognostyczną w walidacji celów oraz w ograniczaniu ryzyka mechanistycznego dla kandydatów do naczyniowej terapii genowej. Jego powtarzalność i skalowalność sprawiają, że jest on cennym zasobem w fazie wczesnych odkryć i badań translacyjnych w ramach portfeli rozwoju leków kardio-naczyniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie funkcji genów w mechanizmach adaptacji i niewydolności przeszczepów żylnych.
- Wspiera biologiczną redukcję ryzyka poprzez umożliwienie bezpośredniej oceny wpływu transgenu na patologię naczyniową.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze celu dla strategii przeciwzakrzepowych i przeciwmiażdżycowych.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zwalidowany system in vivo do ilościowej oceny ekspresji transgenu i wyników naczyniowych.
- Umożliwia standaryzację protokołów dostarczania i ekspresji genów w celu uzyskania powtarzalnych wyników.
- Wspiera późniejszy screening wektorów terapii genowej i potencjalnych interwencji w skalowalnym modelu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodny z punktami końcowymi istotnymi dla choroby, takimi jak wzrost neointimy, zapalenie naczyń i miażdżyca.
- Zapewnia ciągłość od etapu odkryć po walidację przedkliniczną, umożliwiając podłużne badania biologii przeszczepu.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez modelowanie klinicznie istotnych mechanizmów niewydolności przeszczepów żylnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Niniejszy model króliczy stanowi pomost pomiędzy wczesnym etapem odkryć a walidacją przedkliniczną w terapii genowej naczyń krwionośnych, wspierając testowanie hipotez, walidację celów oraz badania mechanistyczne przed identyfikacją wiodącego kandydata.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia rzetelne testowanie hipotezy zerowej dotyczącej funkcji genów w adaptacji i niewydolności przeszczepów żylnych.
- Przesiewanie: Zapewnia ilościowe i powtarzalne odczyty ekspresji transgenów oraz wyników naczyniowych.
- Analityka: Wspiera statystyczne porównanie skuteczności transferu genów i punktów końcowych biologicznych w grupach eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Modeluje procesy istotne dla danej choroby w celu dopasowania biomarkerów i postępu dostosowanego do ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną i kosztowo efektywną platformę do iteracyjnej oceny terapii genowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w badaniach nad terapią genową naczyń krwionośnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje protokoły transferu i ekspresji genów in vivo w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań oraz alokację kapitału poprzez dostarczenie rzetelnych danych przedklinicznych.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do terapii genowej ukierunkowanych na niewydolność przeszczepów żylnych z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest biegłość chirurgiczna w zakresie przeszczepiania naczyń oraz technik transferu genów.
- Wymagany jest dostęp do aparatury do pomiaru przepływu oraz platform analizy molekularnej.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów chirurgicznych i analitycznych pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Adaptacja do innych modeli naczyniowych może wymagać modyfikacji i walidacji protokołu.
- Ze względu na zastosowanie wektorów wirusowych niezbędne jest ścisłe przestrzeganie procedur bezpieczeństwa biologicznego oraz zasad postępowania z narzędziami ostrymi.
