Specyficzne i dokładne wykrywanie patogenu zazieleniania cytrusów Candidatus liberibacter spp. za pomocą konwencjonalnego PCR na próbkach tkanek liści cytrusów
29 czerwca 2018
Zielenienie cytrusów jest szczególnie destrukcyjną chorobą atakującą uprawy cytrusów na całym świecie. Przedstawiono prostą metodę wykorzystującą PCR i ekstrakcję genomowego DNA tkanki liści cytrusów w celu dokładnej i precyzyjnej identyfikacji patogenu zielenienia cytrusów, Candidatus liberibacter spp.
Ogólnym celem tej procedury jest dokładne wykrycie patogenu zielenienia cytrusów Candidatus liberibacter spp. w tkance liści cytrusów. Metoda ta pozwala hodowcom cytrusów i badaczom szybko i dokładnie zidentyfikować obecność patogenu odpowiedzialnego za powodowanie zazielenienia cytrusów.
Procedurę zademonstruje Ian Palmer, doktorant z mojego laboratorium. Ta metoda jest wydajna, opłacalna i można ją dostosować do analizy ilościowej. Dodatkowo może być wykonywany przy minimalnym poziomie doświadczenia laboratoryjnego i sprzętu.
Najpierw użyj czystych nożyczek, aby wyciąć cały świeży liść z drzewa cytrusowego i umieść w czystej plastikowej torbie na kanapki. Następnie schłodzić moździerz i tłuczek, dodając niewielką ilość ciekłego azotu. Następnie użyj nożyczek, aby wyciąć małe kawałki tkanki liścia o wielkości około jednego cala kwadratowego.
Umieść kawałki liści w moździerzu, aby natychmiast je zamrozić. Szybko rozpocznij mielenie tkanki liścia za pomocą zaprawy, aż ciekły azot wyparuje i pozostanie drobny zielony proszek. Następnie schładzaj metalową szpatułkę w ciekłym azocie przez 10 do 15 sekund.
Następnie za pomocą zimnej szpatułki zgarnij zmieloną tkankę z moździerza do mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Użyj pipety o pojemności 1000 ml, aby dodać 600 ml roztworu do lizy jąder do próbki. Następnie wirować próbkę przez jedną do trzech sekund.
Inkubować probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 15 minut. Po zakończeniu okresu inkubacji użyj pipety o pojemności 10 ml, aby dodać 3 ml roztworu RNA do likaniatu w celu usunięcia RNA. Następnie wymieszaj zawartość tuby, odwracając ją od dwóch do pięciu razy.
Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w inkubatorze gabinetowym. Po 15 minutach dodać 200 ml roztworu do wytrącania białek do próbki. Obracaj rurkę z dużą prędkością przez 20 sekund.
Następnie odwirować próbkę o temperaturze 13000G przez trzy minuty. W trakcie wirowania dodaj 600 ml izopropanolu utrzymywanego w temperaturze pokojowej do nowej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Po zakończeniu wirowania ostrożnie usunąć supernatant z probówki wirówkowej do probówki zawierającej izopropanol.
Wyrzuć granulkę. Odwróć rurkę, aby DNA było widoczne jak nić, taka nić. Następnie odwirować próbkę o temperaturze 13000G przez minutę w temperaturze pokojowej.
Zdekantować supernatant po odwirowaniu. Następnie dodaj 600 ml 70% etanolu do granulatu. Odwróć rurkę kilka razy, aby umyć granulkę.
Odwirować probówkę o temperaturze 13000G przez jedną minutę. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zassać supernatant. Następnie odwróć probówkę z otwartą pokrywką na chłonnym papierze, aby wyschła na powietrzu przez 15 minut.
Po wysuszeniu dodaj 100 ml roztworu do ponownego nawodnienia DNA do granulki. Inkubuj zawiesinę DNA w temperaturze 65 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez godzinę. Od czasu do czasu stukaj w probówkę podczas mieszania.
Dodaj 1 ml oczyszczonej wody do mikrokuwety. Odczytaj wodę jako pustą na spektrofotometrze. Następnie dodaj 1 ml próbki do mikrokuwety.
Umieść mikrokuwetę na spektrofotometrze i uzyskaj stężenie DNA. Utwórz reakcję PCR, dodając wszystkie odczynniki i 100 nanogramów genomowego DNA w probówce PCR o pojemności 50 ml. Wymieszaj odczynniki, delikatnie przesuwając probówkę, a następnie szybko odwiruj.
Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom program. Aby przygotować żel agarozowy, odważ 0,4 grama proszku agarozowego. Następnie dodaj proszek agarozy do kolby Erlenmeyera o pojemności 200 ml, dostosowując objętość do 50 ml za pomocą buforu 1X TAE.
Podgrzewaj mieszaninę agarozy w kuchence mikrofalowej na wysokich obrotach przez około 1,5 minuty. Potrząsanie co 30 sekund, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Następnie dodaj 2,5 ml 10 miligramów na mililitr bromku etydyny do płynnej agarozy.
Następnie potrząśnij kolbą, aby wymieszać bromek etydyny i szybko wlej płynny żel agarozowy do równej formy żelowej. Natychmiast włóż standardowy grzebień do żelu na 12 zębów. Pozostaw żel do ostygnięcia przez około 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij grzebień żelowy.
Teraz umieść zestalony żel w jednostce do elektroforezy wypełnionej buforem 1X TAE. Załaduj całkowitą amplifikowaną próbkę DNA i 5 ml DNA później do oddzielnych studzienek na żelu. Uruchom jednostkę do elektroforezy przy stałym napięciu 90 V przez 35 minut.
Następnie usuń żel z urządzenia do elektroforezy. Następnie umieść żel na transiluminatorze UV. Zrób zdjęcia wzorów pasm żelowych w transiluminatorze przy 302 nanometrach.
Aby zidentyfikować bakterię zazieleniającą, amplifikowane genomowe DNA z amplifikacją PCR uzyskane zarówno z zakażonych, jak i niezakażonych próbek są poddawane elektroforezie. W żelu prążki te odpowiadające 500 parom zasad wskazują na obecność określonego regionu rybosomalnego DNA Las16S w bakterii CL asiaticas. Te prążki odpowiadające 700 parom zasad wskazują na obecność LAA2 / LAJ5 i wstawiają się obecne w sekwencji 16S rybosomalnego beta operonu DNA w bakterii.
Te wyraźne prążki przy 400 parach zasad wskazują na amplifikację tylko genu cytrusowego F-box, który odnosi się do wewnętrznej kontroli amplifikacji. Aby nasze wyniki były ważne, wymagana jest obecność tego pasma. Wręcz przeciwnie, obecność tylko prążka na 400 parach zasad, ale brak innych prążków na 500 i 700 parach zasad wskazuje na zdrową tkankę cytrusową.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około cztery godziny, jeśli jest wykonana prawidłowo. Procedura ta może zostać dostosowana w celu umożliwienia stosowania bardziej ilościowych metod, takich jak RTQPCR w celu wykrycia ilości obecnego patogenu.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę dokładnego wykrywania patogenu odpowiedzialnego za zielone złociszenie cytrusów, Candidatus liberibacter spp., w tkance liściowej cytrusów. Procedura wykorzystuje PCR oraz ekstrakcję genomowego DNA, umożliwiając szybką identyfikację dla rolników i badaczy.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Patologia roślin
- Genomika
- Nauki rolnicze
Wprowadzenie
- Greening cytrusów to niszczycielska choroba dotykająca uprawy cytrusów na całym świecie.
- Odpowiednim patogenem jest Candidatus liberibacter spp.
- Dokładna detekcja jest kluczowa dla zarządzania chorobą i ograniczania jej skutków.
- Niniejsza metoda została opracowana tak, aby była wydajna i dostępna dla różnych użytkowników.
Cel badania
- Zapewnienie niezawodnej metody wykrywania patogenu powodującego zieloną plamistość cytrusów.
- Wsparcie dla plantatorów cytrusów w identyfikacji obecności patogenu.
- Ułatwienie badań nad chorobą zielonej plamistości cytrusów.
Zastosowane metody
- PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy) w wykrywaniu patogenów.
- Ekstrakcja genomowego DNA z tkanki liści cytrusów.
- Wymagane minimalne doświadczenie laboratoryjne i podstawowe wyposażenie.
- Metoda kosztowo efektywna i możliwa do dostosowania do analizy ilościowej.
Główne wyniki
- Metoda ta umożliwia szybką i dokładną identyfikację patogenu.
- Zaprezentowano przez Iana Palmera, studenta studiów magisterskich.
- Udowodniono, że jest ona wydajna i niezawodna dla użytkowników.
- Wspiera bieżące badania oraz praktyki rolnicze.
Wnioski
- Niniejsza metoda stanowi cenny instrument w wykrywaniu zielonego zwyrodnienia cytrusów.
- Usprawnia ona możliwości rolników i badaczy w zakresie zwalczania tej choroby.
- Zachęca do dalszych badań nad zdrowotnością upraw cytrusowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Wczesne i specyficzne wykrywanie patogenów roślin, takich jak Candidatus liberibacter spp., ma kluczowe znaczenie dla ograniczania strat w uprawach i ochrony łańcuchów dostaw produktów rolnych. Ta metoda oparta na technice PCR umożliwia szybką i kosztowo efektywną identyfikację patogenu powodującego zielone pociągnięcia cytrusów w tkance liściowej, co wspiera podejmowanie terminowych decyzji o interwencji. Dzięki zapewnieniu skalowalnego narzędzia diagnostycznego metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w strategiach zarządzania chorobami w przedsiębiorstwach produkujących cytrusy.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia specyficzne wykrywanie Candidatus liberibacter spp. poprzez amplifikację sekwencji rDNA Las16S oraz insertów LAA2/LAJ5, co wspiera walidację celu w badaniach nad patogenami roślin.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje konwencjonalną metodę PCR przy minimalnych wymaganiach sprzętowych, co pozwala na szybki screening próbek tkanek cytrusów pod kątem obecności patogenu.
Przesiewy i opracowanie analizy
- Wartość naukowa: Generuje wyraźne prążki amplikonów o długości 500 bp i 700 bp służące do detekcji patogenów, wraz z wewnętrzną kontrolą o długości 400 bp (gen F-box cytrusów) w celu zapewnienia poprawności analizy i ograniczenia liczby wyników fałszywie ujemnych.
- Wartość operacyjna: Możliwość adaptacji do analiz ilościowych, takich jak RT-qPCR, co pozwala na pomiar ładunku patogenów i standaryzację analizy w obrębie zestawów próbek.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera walidację systemów istotnych dla badania chorób poprzez wykrywanie patogenu w tkance liści cytrusów przed wystąpieniem objawów, co ułatwia prowadzenie wczesnych badań mechanistycznych nad interakcjami między gospodarzem a patogenem.
- Wartość operacyjna: Umożliwia replikację wyników detekcji w różnych laboratoriach dzięki standaryzowanym protokołom ekstrakcji DNA i PCR, co wspiera współpracę międzyfunkcyjną w biotechnologii rolniczej.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w początkowy etap procesu odkryć, wspierając weryfikację hipotez oraz ograniczanie ryzyka biologicznego w badaniach nad patogenami roślin przed przejściem do badań mechanistycznych lub translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez potwierdzenie obecności patogenu w tkance cytrusów, wyjaśniając podstawy biologiczne choroby zielonej plamistości cytrusów.
- Screening: Pozwala na uzyskanie gotowego do analizy genomowego DNA z tkanki liści, co wspiera powtarzalne wykrywanie patogenów oraz adaptację ilościową do zastosowań w badaniach przesiewowych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe pomiary stężenia DNA za pomocą spektrofotometrii oraz jakościowe wykrywanie patogenów poprzez elektroforezę żelową, co umożliwia analizę porównawczą próbek zainfekowanych i zdrowych.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przejścia od fazy odkryć do walidacji przedklinicznej poprzez umożliwienie wczesnego wykrywania patogenów w próbkach tkanek, co dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o zarządzaniu chorobą w oparciu o analizę ryzyka.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Ustanawia powtarzalny schemat diagnostyczny nadzoru nad patogenami cytrusów, który można stosować w różnych sezonach i regionach geograficznych przy minimalnych zmianach w protokole.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w wykrywaniu patogenów poprzez specyficzną amplifikację celów DNA *Candidatus* Liberibacter spp., ograniczając niejednoznaczność mechaniczną w etiologii choroby.
- Wartość operacyjna: Gwarantuje standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym etapom ekstrakcji DNA, PCR i elektroforezy w żelu, co umożliwia uzyskanie spójnych wyników przez różnych użytkowników i laboratoria.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie lepszych decyzji dotyczących zarządzania uprawami poprzez wczesną identyfikację zainfekowanych roślin, co zmniejsza ryzyko biologiczne i ekonomiczne w późniejszych stadiach.
- Wpływ na portfolio: Ułatwia priorytetyzację działań łagodzących skutki choroby z uwzględnieniem ryzyka poprzez identyfikację obecności patogenu przed wystąpieniem rozległych szkód w uprawach.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga podstawowej wiedzy z zakresu biologii molekularnej w technikach ekstrakcji DNA, PCR oraz elektroforezy żelowej.
- Zależne od dostępu do standardowego wyposażenia laboratoryjnego, w tym wirówki, termocyklera, spektrofotometru i transiluminatora UV.
- Wymaga standaryzacji przygotowania próbek i kwantyfikacji DNA w celu zapewnienia spójnej czułości detekcji we wszystkich próbkach tkanek.
- Należy uwzględnić zmienne stężenie patogenów w tkankach cytrusów, co może wpływać na granice detekcji i wymagać powtórzeń próbek w przypadkach niskiego miana.
- Ograniczone przez brak możliwości hodowli Candidatus liberibacter spp. in vitro, co sprawia, że detekcja oparta na metodzie PCR jest niezbędna do identyfikacji i walidacji patogenu.
Najczęściej zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Isolation of Genomic DNA from Plant Tissue
5:04
Perform PCR on Genomic DNA Samplesand Electrophoresis of the Amplified DNA II. Isolation of Genomic DNA from Plant Tissueon an Agarose Gel
7:34
Results: PCR Amplification of Genomic DNA to Identify the Citrus Greening Bacterium
8:52
Conclusion
