Name: Specyficzne i dokładne wykrywanie patogenu zazieleniania cytrusów Candidatus liberibacter spp. za pomocą konwencjonalnego PCR na próbkach tkanek liści cytrusów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-29T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Poznaj metodę PCR do wykrywania patogena zazieleniania cytrusów Candidatus liberibacter spp. w tkankach liści. Ta technika jest szybka, ekonomiczna i dostępna dla rolników oraz badaczy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Konceptualizacja, H.C. i Z. Q. F.; Dochodzenie, H. C., J. C. i Z. Q. F; Zasoby, Z. Q. F.; Pisanie - Oryginalny projekt, I. A. P.; Pisanie – Recenzja i redakcja, I. A. P., J. C., H. C., S. L. T. i Z. Q. F.; Wizualizacja, H. C.; Nadzór, Z. Q. F.; Pozyskiwanie funduszy, Z. Q. F i F. Q. L.
Projekt wspierany przez Grant Stanowy dla Poprawy Jakości Nauczania Nauczycieli w Południowej Karolinie zatytułowany Poprawa Wiedzy Nauczycieli Przedmiotów Ścisłych na temat Procesów, Struktur i Funkcji Roślin poprzez Zaangażowanie w Badania nad Naukami o Roślinach (Nauka o Roślinach)
Fundusze przyznane przez Departament Edukacji Stanów Zjednoczonych (numer CFDA 84.367B)
Autorzy chcieliby podziękować dr Nian Wang z University of Florida za dostarczenie próbek genomowego DNA z zakażonego Citrus sinensis Valencia.

1. Wyizoluj genomowe DNA z tkanki roślinnej za pomocą zestawu do ekstrakcji genomu
<ol>
	<li>Uzyskaj tkankę liści cytrusów, wycinając cały świeży liść z drzewa cytrusowego za pomocą czystych nożyczek i umieść liść w czystej plastikowej torbie na kanapki. 
	UWAGA: Worek zawierający tkankę liściową należy umieścić w lodówce o temperaturze 4 °C lub na lodzie w izolowanym pojemniku tak szybko, jak to możliwe po pobraniu, aby uniknąć zepsucia.</li>
	<li>Dodaj niewielką ilość ciekłego azotu, aby schłodzić moździerz i tłuczek. Podczas schładzania użyj nożyczek, aby wyciąć mały kawałek tkanki liściowej o wielkości około 1 cala kwadratowego. Umieść przeciętą tkankę w moździerzu, aby natychmiast ją zamrozić. W razie potrzeby dodaj więcej ciekłego azotu. 
	UWAGA: Podczas pracy z ciekłym azotem należy zawsze nosić rękawice ocieplane.</li>
	<li>Szybko zmiel tkankę roślinną na drobny proszek za pomocą moździerza. Kontynuuj mielenie, aż ciekły azot całkowicie wyparuje i pozostanie drobny zielony proszek.</li>
	<li>Krótko schłodzić metalową szpatułkę w ciekłym azocie przez 10 - 15 s, a następnie zmieloną tkankę wewnątrz moździerza przebrać do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml za pomocą szpatułki.</li>
	<li>Dodać 600 μl roztworu do lizy jąder (patrz tabela materiałów) za pomocą pipety o pojemności 1000 μl i wirować próbkę przez 1-3 s, a następnie inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 3 μl roztworu RNazy do lizatu za pomocą pipety 10 μl, odwrócić probówkę 2 - 5 razy, aby ją wymieszać, i inkubować w temperaturze 37 °C w inkubatorze szafkowym przez 15 minut. 
	UWAGA: Przed kontynuowaniem poczekaj, aż mieszanina ostygnie do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Dodać 200 μl roztworu do wytrącania białek, wirować z dużą prędkością przez 20 s, a następnie wirować przez 3 minuty przy 13 000 x g, aby uzyskać twardy osad. Podczas wirowania próbki dodaj 600 μl izopropanolu o temperaturze pokojowej do świeżej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl ostrożnie usunąć supernatant z odwirowanej próbki, przenosząc ją do świeżej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml zawierającej izopropanol. Granulkę można teraz wyrzucić. 
	UWAGA: Należy unikać zanieczyszczania supernatantu białkiem poprzez pozostawienie niewielkiej ilości supernatantu nad osadem.</li>
	<li>Odwróć probówkę, aż DNA stanie się widoczne jako masa nici przypominających nitki, a następnie odwiruj przy 13 000 x g przez 1 minutę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Zdekantować supernatant, dodać 600 μl 70% etanolu do osadu, kilkakrotnie odwrócić probówkę w celu przepłukania DNA i odwirować przy 13 000 x g przez 1 min.</li>
	<li>Ostrożnie zassać etanol, pozostawiając luźne osady DNA, a następnie otworzyć i odwrócić rurkę, spoczywającą na bibułie chłonnej. Suszyć na powietrzu w temperaturze pokojowej przez 15 min.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu do nawadniania DNA do wysuszonego osadu DNA, a następnie inkubować DNA w łaźni wodnej o temperaturze 65 °C przez 1 godzinę, mieszając okresowo, stukając w probówkę.</li>
	<li>Umieścić 1 μl oczyszczonej wody na mikrokuwecie i włożyć ją do spektrofotometru, który ma być użyty jako ślepa próba. Obliczyć stężenie obecnego DNA, umieszczając 1 μl próbki na mikrokuwecie i wkładając do spektrofotometru. Stężenie DNA (ng/μL) można obliczyć jako (A260- A320) × współczynnik rozcieńczenia × 50 ng/μL. 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. Próbka może być przechowywana w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
2. Wykonaj PCR na próbkach genomowego DNA
<ol>
	<li>Połączyć 10 μl 2x PCR Master Mix (patrz Tabela Materiałów), 1 μl startera do przodu (10 pM/μL), 1 μl startera odwrotnego (10 pM/μL) (patrz Tabela 2 dla sekwencji startera), 100 ng genomowego DNA wyekstrahowanego z próbki i oczyszczoną wodę (do 20 μL objętości końcowej) w probówce do PCR o pojemności 50 μL, Przesuń, aby wymieszać i krótko odwirować.</li>
	<li>Włóż probówkę PCR do termocyklera i uruchom odpowiednio (patrz Tabela 1). 
	UWAGA: W tym miejscu protokół można wstrzymać. W razie potrzeby przechowywać próbkę w temperaturze 4 °C po zakończeniu reakcji.</li>
</ol>
3. Elektroforeza amplifikowanego DNA w żelu agarozowym
<ol>
	<li>Odważyć 0,4 g agarozy w proszku i dodać ją wraz z 1x buforem TAE do czystej kolby Erlenmeyera o pojemności 200 ml, wypełniając ją do 50 ml.</li>
	<li>Kuchenka mikrofalowa na wysokich obrotach przez 1,5 minuty, wstrząsając co 30 s, aż agaroza całkowicie się rozpuści. 
	UWAGA: Podczas pracy z płynną agarozą należy nosić rękawice ocieplane, aby zapobiec poparzeniom.</li>
	<li>Dodaj 2,5 μl 10 mg/ml bromku etydyny do płynnej agarozy i wstrząśnij do wymieszania, a następnie wlej płynny żel agarozowy do równej formy żelowej. Po wylaniu szybko włóż standardowe grzebienie żelowe z 12 zębami.</li>
	<li>Pozostaw żel do ostygnięcia przez 20 minut w temperaturze pokojowej, następnie usuń grzebienie żelowe i umieść żel w płaskim pudełku z żelem wypełnionym 1x buforem TAE.</li>
	<li>Za pomocą mikropipety załaduj wszystkie amplifikowane próbki DNA do studzienek. Dodać 5 μl drabinki DNA (patrz tabela materiałów) do oddzielnego dołka od próbek.</li>
	<li>Próbki należy poddać elektroforezie przez 35 minut przy stałym napięciu 90 V, a następnie usunąć żel i umieścić w transiluminatorze UV.</li>
	<li>Sfotografuj i przeanalizuj wzór pasma żelowego podczas korzystania z transoświetlenia UV przy długości fali 302 nm.</li>
</ol>

<ol><li>Field Office, F. lorida <a target="_blank" href="http://citrusindustry.net/wp-content/uploads/2016/10/cit1016.pdf">Citrus October Forecast Maturity Test Results and Fruit Size</a>. , USDA, NASS, Florida Field Office. (2016).</li>
<li>Singerman, A., Useche, P. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/2aa9/2db973c8f73893a0799ef82cb8883821127b.pdf">Impact of citrus greening on citrus operations in Florida.</a> Food and Resource Economics Department, UF/IFAS Extension. , EDIS (FE983) (2015).</li>
<li>Spreen, T. H., Hodges, A. <a target="_blank" href="https://conference.ifas.ufl.edu/citrus12/PDF%20Presentations/Fri-pdf/1045%20Spreen.pdf">The economic impact of HLB on the florida citrus industry</a>. , University of Florida. (2012).</li>
<li>UICEP. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Pathology%22">Pathology</a>. , (2013).</li>
<li>Jagoueix, S., Bove, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phloem-limited+bacterium+of+greening+disease+of+citrus+is+a+member+of+the+alpha+subdivision+of+the+Proteobacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Syst+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the Proteobacteria.</a> Int J Syst Bacteriol. 44 (3), 379-386 (1994).</li>
<li>Fujikawa, T., Iwanami, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitive+and+robust+detection+of+citrus+greening+%28huanglongbing%29+bacterium+%26%2334%3BCandidatus+Liberibacter+asiaticus%26%2334%3B+by+DNA+amplification+with+new+16S+rDNA-specific+primers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Sensitive and robust detection of citrus greening (huanglongbing) bacterium &#34;Candidatus Liberibacter asiaticus&#34; by DNA amplification with new 16S rDNA-specific primers.</a> Mol. Cell. Probes. 26 (5), 194-197 (2012).</li>
<li>Davis, M. J., Mondal, S. N., Chen, H., Rogers, M. E., Brlansky, R. H. <a target="_blank" href="https://apsjournals.apsnet.org/doi/abs/10.1094/PDIS-92-11-1547">Co-cultivation of 'Candidatus Liberibacter asiaticus' with actinobacteria from citrus with huanglongbing.</a> Plant Dis. 92 (11), 1547-1550 (2008).</li>
<li>Department of Agriculture & National Agriculture Statistics Service. <a target="_blank" href="https://www.cacitrusmutual.com/wp-content/uploads/2015/12/2015-USDA-Citrus-Fruits-Summary.pdf">Citrus Fruits 2015 Summary (September 2015)</a>. , (2015).</li>
<li>Hocquellet, A., Toorawa, P., Bové, J. M., Garnier, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+identification+of+the+two+Candidatus+Liberobacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing+by+PCR+amplification+of+ribosomal+protein+genes+of+the+%CE%B2+operon%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Probes%22%5BJournal%5D)">Detection and identification of the two Candidatus Liberobacter species associated with citrus huanglongbing by PCR amplification of ribosomal protein genes of the β operon.</a> Mol. Cell. Probes. 13 (5), 373-379 (1999).</li>
<li>Mafra, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reference+genes+for+accurate+transcript+normalization+in+citrus+genotypes+under+different+experimental+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Reference genes for accurate transcript normalization in citrus genotypes under different experimental conditions.</a> PLoS One. 7 (2), e31263(2012).</li>
<li>Li, W., Hartung, J. S., Levy, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+real-time+PCR+for+detection+and+identification+of+Candidatus+Liberibacter+species+associated+with+citrus+huanglongbing%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Meth%22%5BJournal%5D)">Quantitative real-time PCR for detection and identification of Candidatus Liberibacter species associated with citrus huanglongbing.</a> J. Microbiol. Meth. 66 (1), 104-115 (2006).</li>
</ol>

Huan Chen, Ian Arthur Palmer, Jian Chen, Ming Chang, Stephen L. Thompson, Fengquan Liu i Zheng Qing Fu deklarują brak konfliktu interesów.

Bardzo ważne jest, aby wszystkie kroki były dokładnie wykonane, aby osiągnąć optymalne warunki eksperymentalne. Podczas tej demonstracji wykorzystano całą tkankę liścia; Protokół można jednak zmodyfikować tak, aby teoretycznie obejmował każdy rodzaj tkanki roślinnej. Wcześniej naukowcy wyekstrahowali genomowe DNA z tkanki żyły liścia, a nie z całej tkanki liścia, i osiągnęli podobne wyniki11. Jeśli prążek odpowiadający cytrusowemu genowi FBOX nie pojawi się, wynik jest nieważny i może wys...

Zazielenienie cytrusów, znane również jako huanglongbing, spowodowało znaczną utratę drzew cytrusowych. Jednym z reprezentatywnych przypadków jest Floryda, gdzie przewiduje się, że choroba spowoduje 70% zmniejszenie produkcji pomarańczowych pudełek z Florydy z 244 milionów skrzynek w sezonie 1997 - 1998 do 70 milionów skrzynek w sezonie 2016-20171. Ponad 90% drzew cytrusowych na Florydzie jest zainfekowanych2, i szacuje się, że przemysł cytrusowy na Florydzie traci około miliarda dolarów rocznie z powodu chorób cytrusów, w których główną rolę odgrywa zazielenianie cytrusów3. Zielenie cytrusów jest przenoszone głównie przez inwazyjną azjatycką psyllid cytrusową Diaphorina citri, ale może być również przenoszone przez przeszczepienie zakażonej tkanki. Choroba powoduje żółknięcie nerwów, asymetryczne żółte plamienie liści, przedwczesną defoliację, zamieranie gałązek, gnicie korzeni i śmierć rośliny. Co ważne, choroba powoduje, że roślina cytrusowa wytwarza kwiaty poza sezonem, które rzadko dają owoce. Owoce produkowane przez zainfekowane rośliny cytrusowe są niedojrzałe, zielone i gorzkie w smaku4.
Celem tej metody jest dokładna i precyzyjna identyfikacja ruchliwej bakterii Candidatus liberibacter spp., czynnika wywołującego zazielenienie cytrusów, żyjącego w łyku zakażonych drzew cytrusowych5. Genomowe DNA jest ekstrahowane z całej tkanki liścia, która zawiera żywe bakterie. To wyekstrahowane genomowe DNA jest używane jako matryca do konwencjonalnego PCR, w którym oligonukleotydy komplementarne do sekwencji 16S rDNA bakterii są używane do amplifikacji tej sekwencji. Oligonukleotydy komplementarne do cytrusowego genu FBOX są stosowane jako wewnętrzna kontrola amplifikacji. Zdecydowaliśmy się użyć tej metody, ponieważ udowodniono jej skuteczność w poprzednich badaniach6.
Ta metoda ma tę wyraźną zaletę, że jest prosta, stosunkowo tania i może być wykonana w każdym normalnie wyposażonym laboratorium biochemicznym. Ponadto PCR pozostaje najdokładniejszą i najbardziej precyzyjną metodą wykrywania tego patogenu, ze względu na trudności w hodowli tego patogenu7 oraz zdolność patogenu do przetrwania i rozmnażania się przez lata w obrębie bezobjawowego gospodarza8. Do skutecznego wykrycia tego patogenu zastosowano wiele różnych specjalistycznych testów PCR; jednak konwencjonalny PCR pozostaje najprostszym testem do dokładnego i specyficznego wykrywania, zwłaszcza w obrębie bezobjawowych gospodarzy8.

<table><tbody><tr><td>Zestaw do oczyszczania genomowego DNA Wizard</td><td>Promega</td><td>A1120</td><td>Źródło roztworów do lizy jąder, RNazy, wytrącania białek i rehydratacji DNA</td></tr><tr><td>Ciekły azot</td><td>Air Products</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler pro z panelem sterowania</td><td>Eppendorf</td><td>6321000019</td><td></td></tr><tr><td>1250 W Mikrofalówka</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>5424</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-93</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowa łaźnia wodna Isotemp 215</td><td>Fisher scientific</td><td>15-462-15Q</td><td></td></tr><tr><td>Szpatułka metalowa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z283274</td><td></td></tr><tr><td>Moździerz i tłuczek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z247464</td><td></td></tr><tr><td>LSE Mieszalnik wirowy</td><td>Corning</td><td>6775</td><td></td></tr><tr><td>2-propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 10 &mu; L końcówki</td><td>TipOne</td><td>1161-3730</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 200 &mu; L końcówki</td><td>TipOne</td><td>1163-1730</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne 1250 &mu; Końcówki L</td><td>TipOne</td><td>1161-1750</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw pipet o zmiennej objętości</td><td>VWR</td><td>75788-460</td><td></td></tr><tr><td>Bromek etydyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>IBI Scientific</td><td>IB70041</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17892</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Fisher Chemical</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Baza Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>&mu; kuweta</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td></td></tr><tr><td>Taca odlewnicza i grzebienie do układania w stosy</td><td>Carolina</td><td>213655</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT System</td><td>Bio-Rad</td><td>1704487EDU</td><td></td></tr><tr><td>Biospektrometr podstawowy</td><td>Eppendorf</td><td>6135000009</td><td></td></tr><tr><td>0,2 ml probówki PCR</td><td>Fisher scientific</td><td>AB-0620</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek 1,5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3439</td><td></td></tr><tr><td>2X Taq Green PCR Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>Podkład do przodu</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Podkład odwrócony</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Woda, klasa PCR</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3315953001</td><td></td></tr><tr><td>Żel Doc XR+</td><td>Bio-Rad</td><td>1708195</td><td></td></tr><tr><td>1 KB+ drabinka DNA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10787018</td><td></td></tr></tbody></table>

specyficzne i dokładne wykrywanie patogenu zazieleniania cytrusów candidatus liberibacter spp. za pomocą konwencjonalnego pcr na próbkach tkanek liści cytrusów

Specific and Accurate Detection of the Citrus Greening Pathogen Candidatus liberibacter spp. Using Conventional PCR on Citrus Leaf Tissue Samples

Zielenienie cytrusów, znane również jako huanglongbing, to destrukcyjna choroba cytrusów pustosząca uprawy cytrusów na całym świecie. Choroba ta powoduje asymetryczne żółte plamienie liści, żółknięcie nerwów, defoliację, gnicie korzeni, a ostatecznie śmierć rośliny cytrusowej. Zainfekowane rośliny cytrusowe mają zahamowany wzrost i wytwarzają kwiaty poza sezonem. Te kwiaty rzadko dają owoce, a te, które dają małe, gorzkie owoce cytrusowe o nieregularnym kształcie, które nie są pożądane. Choroba ta jest przenoszona przez azjatyckiego psyllida cytrusowego, Diaphorina citri, oraz przez przeszczepienie zakażonej tkanki cytrusowej. Patogen ma długi i zmienny okres inkubacji w roślinie cytrusowej - czasami lata, zanim pojawią się objawy. Próby hodowli tego patogenu in vitro nie powiodły się, prawdopodobnie ze względu na niskie i nierównomierne stężenie patogenu w zakażonej tkance cytrusowej lub dlatego, że trudno jest odtworzyć warunki środowiskowe sprzyjające wzrostowi patogenu. Bardzo trudno jest zidentyfikować chorobę przed jej rozprzestrzenieniem się, ze względu na długi okres inkubacji i niezdolność badaczy do wyhodowania patogenu. W rezultacie choroba ujawnia się dopiero po nagłym zniszczeniu całego plonu rolnika uprawiającego cytrusy. Przedstawiono tutaj metodę dokładnego i specyficznego wykrywania patogenu zielenienia cytrusów, Candidatus liberibacter spp., przy użyciu zestawu do ekstrakcji genomowego DNA i PCR. Ta metoda jest prosta, wydajna, opłacalna i można ją dostosować do analizy ilościowej. Ta metoda może być dostosowana do stosowania na dowolnej tkance cytrusowej; Jest jednak potencjalnie ograniczony ilością patogenu obecnego w tkance. Niemniej jednak metoda ta pozwoli rolnikom uprawiającym cytrusy na wcześniejszą identyfikację zakażonych roślin cytrusowych i ograniczenie rozprzestrzeniania się tej destrukcyjnej choroby, zanim będzie mogła się dalej rozprzestrzeniać.

Wynik dodatni objawia się obecnością wyraźnego prążka odpowiadającego 500 bp dla Candidatus Liberibacter asiaticus Las606/Lss6, oraz/lub wyraźny prążek odpowiadający 700 bp dla Laa2/Laj5, insert w operonie 16S rybosomalnego β9Prążek wewnętrznej kontroli amplifikacji musi również pojawić się na poziomie 400 bp. Prążek ten odpowiada amplifikacji cytrusów FBOX gen10i musi wyst...

Zielenienie cytrusów jest szczególnie destrukcyjną chorobą atakującą uprawy cytrusów na całym świecie. Przedstawiono prostą metodę wykorzystującą PCR i ekstrakcję genomowego DNA tkanki liści cytrusów w celu dokładnej i precyzyjnej identyfikacji patogenu zielenienia cytrusów, Candidatus liberibacter spp.

Specyficzne i dokładne wykrywanie patogenu zazieleniania cytrusów Candidatus liberibacter spp. za pomocą konwencjonalnego PCR na próbkach tkanek liści cytrusów

Citrus greening, also known as huanglongbing, is a destructive citrus disease ravaging citrus farms globally. This disease causes asymmetrical yellow leaf ...

Ogólnym celem tej procedury jest dokładne wykrycie patogenu zielenienia cytrusów Candidatus liberibacter spp. w tkance liści cytrusów. Metoda ta pozwala hodowcom cytrusów i badaczom szybko i dokładnie zidentyfikować obecność patogenu odpowiedzialnego za powodowanie zazielenienia cytrusów.Procedurę zademonstruje Ian Palmer, doktorant z mojego laboratorium. Ta metoda jest wydajna, opłacalna i można ją dostosować do analizy ilościowej. Dodatkowo może być wykonywany przy minimalnym poziomie doświadczenia laboratoryjnego i sprzętu.Najpierw użyj czystych nożyczek, aby wyciąć cały świeży liść z drzewa cytrusowego i umieść w czystej plastikowej torbie na kanapki. Następnie schłodzić moździerz i tłuczek, dodając niewielką ilość ciekłego azotu. Następnie użyj nożyczek, aby wyciąć małe kawałki tkanki liścia o wielkości około jednego cala kwadratowego.Umieść kawałki liści w moździerzu, aby natychmiast je zamrozić. Szybko rozpocznij mielenie tkanki liścia za pomocą zaprawy, aż ciekły azot wyparuje i pozostanie drobny zielony proszek. Następnie schładzaj metalową szpatułkę w ciekłym azocie przez 10 do 15 sekund.Następnie za pomocą zimnej szpatułki zgarnij zmieloną tkankę z moździerza do mikroprobówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Użyj pipety o pojemności 1000 ml, aby dodać 600 ml roztworu do lizy jąder do próbki. Następnie wirować próbkę przez jedną do trzech sekund.Inkubować probówkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez 15 minut. Po zakończeniu okresu inkubacji użyj pipety o pojemności 10 ml, aby dodać 3 ml roztworu RNA do likaniatu w celu usunięcia RNA. Następnie wymieszaj zawartość tuby, odwracając ją od dwóch do pięciu razy.Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 15 minut w inkubatorze gabinetowym. Po 15 minutach dodać 200 ml roztworu do wytrącania białek do próbki. Obracaj rurkę z dużą prędkością przez 20 sekund.Następnie odwirować próbkę o temperaturze 13000G przez trzy minuty. W trakcie wirowania dodaj 600 ml izopropanolu utrzymywanego w temperaturze pokojowej do nowej probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Po zakończeniu wirowania ostrożnie usunąć supernatant z probówki wirówkowej do probówki zawierającej izopropanol.Wyrzuć granulkę. Odwróć rurkę, aby DNA było widoczne jak nić, taka nić. Następnie odwirować próbkę o temperaturze 13000G przez minutę w temperaturze pokojowej.Zdekantować supernatant po odwirowaniu. Następnie dodaj 600 ml 70% etanolu do granulatu. Odwróć rurkę kilka razy, aby umyć granulkę.Odwirować probówkę o temperaturze 13000G przez jedną minutę. Po zakończeniu wirowania ostrożnie zassać supernatant. Następnie odwróć probówkę z otwartą pokrywką na chłonnym papierze, aby wyschła na powietrzu przez 15 minut.Po wysuszeniu dodaj 100 ml roztworu do ponownego nawodnienia DNA do granulki. Inkubuj zawiesinę DNA w temperaturze 65 stopni Celsjusza w łaźni wodnej przez godzinę. Od czasu do czasu stukaj w probówkę podczas mieszania.Dodaj 1 ml oczyszczonej wody do mikrokuwety. Odczytaj wodę jako pustą na spektrofotometrze. Następnie dodaj 1 ml próbki do mikrokuwety.Umieść mikrokuwetę na spektrofotometrze i uzyskaj stężenie DNA. Utwórz reakcję PCR, dodając wszystkie odczynniki i 100 nanogramów genomowego DNA w probówce PCR o pojemności 50 ml. Wymieszaj odczynniki, delikatnie przesuwając probówkę, a następnie szybko odwiruj.Umieść probówkę PCR w termocyklerze i uruchom program. Aby przygotować żel agarozowy, odważ 0,4 grama proszku agarozowego. Następnie dodaj proszek agarozy do kolby Erlenmeyera o pojemności 200 ml, dostosowując objętość do 50 ml za pomocą buforu 1X TAE.Podgrzewaj mieszaninę agarozy w kuchence mikrofalowej na wysokich obrotach przez około 1,5 minuty. Potrząsanie co 30 sekund, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Następnie dodaj 2,5 ml 10 miligramów na mililitr bromku etydyny do płynnej agarozy.Następnie potrząśnij kolbą, aby wymieszać bromek etydyny i szybko wlej płynny żel agarozowy do równej formy żelowej. Natychmiast włóż standardowy grzebień do żelu na 12 zębów. Pozostaw żel do ostygnięcia przez około 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wyjmij grzebień żelowy.Teraz umieść zestalony żel w jednostce do elektroforezy wypełnionej buforem 1X TAE. Załaduj całkowitą amplifikowaną próbkę DNA i 5 ml DNA później do oddzielnych studzienek na żelu. Uruchom jednostkę do elektroforezy przy stałym napięciu 90 V przez 35 minut.Następnie usuń żel z urządzenia do elektroforezy. Następnie umieść żel na transiluminatorze UV. Zrób zdjęcia wzorów pasm żelowych w transiluminatorze przy 302 nanometrach.Aby zidentyfikować bakterię zazieleniającą, amplifikowane genomowe DNA z amplifikacją PCR uzyskane zarówno z zakażonych, jak i niezakażonych próbek są poddawane elektroforezie. W żelu prążki te odpowiadające 500 parom zasad wskazują na obecność określonego regionu rybosomalnego DNA Las16S w bakterii CL asiaticas. Te prążki odpowiadające 700 parom zasad wskazują na obecność LAA2 / LAJ5 i wstawiają się obecne w sekwencji 16S rybosomalnego beta operonu DNA w bakterii.Te wyraźne prążki przy 400 parach zasad wskazują na amplifikację tylko genu cytrusowego F-box, który odnosi się do wewnętrznej kontroli amplifikacji. Aby nasze wyniki były ważne, wymagana jest obecność tego pasma. Wręcz przeciwnie, obecność tylko prążka na 400 parach zasad, ale brak innych prążków na 500 i 700 parach zasad wskazuje na zdrową tkankę cytrusową.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około cztery godziny, jeśli jest wykonana prawidłowo. Procedura ta może zostać dostosowana w celu umożliwienia stosowania bardziej ilościowych metod, takich jak RTQPCR w celu wykrycia ilości obecnego patogenu.

specific-accurate-detection-citrus-greening-pathogen-candidatus

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Źródło: Gulla, S. i inni. Wielolokusowa analiza powtórzeń o zmiennej liczbie dla bakterii patogennej ryb Yersinia ruckeri za pomocą multiplex PCR i kapilarnej elektroforezy. J. Vis. Exp. (2019).Protokół ten wyodrębnia genomowe DNA z Yersinia ruckeri poprzez zawieszenie izolowanych kolonii w ultraczystej wodzie i zastosowanie ciepła w celu lizy komórek. Wirowanie oddziela supernatant zawierający DNA od pozostałości komórkowych, co daje DNA szablonowe odpowiednie do genotypowania i analizy...

Ekstrakcja DNA genomowego z tkanek liści roślin zakażonych bakteriami patogennymi

Źródło: Chen, H. i inni. Specyficzne i dokładne wykrywanie patogenu zielenia cytrusowego Candidatus liberibacter spp. za pomocą konwencjonalnego PCR na próbkach tkanek liści cytrusowych. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje ekstrakcję całkowitego DNA genomowego z tkanki liści cytrusa zakażonej patogenną bakterią. Protokół umożliwia niezawodne odzyskiwanie DNA do dalszego wykrywania patogenu ograniczonego łykiem za pomocą PCR.

Ekstrakcja całkowitego DNA z liści w celu wykrywania infekcji bakteryjnej

Kwantyfikacja wzrostu patogenów jest potężnym narzędziem do charakteryzowania różnych odpowiedzi immunologicznych Arabidopsis thaliana (dalej: Arabidopsis). Opisana tutaj metoda przedstawia zoptymalizowany test infiltracji strzykawki w celu ilościowego określenia Pseudomonas syringae pv. Maculicola powiedział: Wzrost ES4326 w dorosłych liściach Arabidopsis.

Test infiltracji bakteryjnych liści w celu dokładnej charakterystyki reakcji obronnych roślin przy użyciu patosystemu Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae

Szybkie i dokładne wykrywanie patogenów roślin na miejscu, zwłaszcza patogenów przenoszonych przez glebę, jest kluczowe dla zapobiegania dalszej produkcji inokulum i rozprzestrzenianiu się chorób roślin na polu. Opracowana tutaj metoda wykorzystująca przenośny system detekcji PCR w czasie rzeczywistym umożliwia diagnostykę na miejscu w warunkach polowych.

Wykrywanie molekularne fitopatogenów przenoszonych przez glebę na miejscu za pomocą przenośnego systemu PCR w czasie rzeczywistym

Ten artykuł przedstawia protokół szybkiego testu identyfikacyjnego dla Bemisia tabaci opartego na technologii amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP). Protokół wymaga minimalnego przeszkolenia laboratoryjnego i dlatego może być wdrażany na miejscu w punktach wejścia dla importu roślin, takich jak porty morskie i lotnicze.

Test amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP) do szybkiej identyfikacji Bemisia tabaci

Opracowaliśmy metodę wykrywania zoospor Phytophthora capsici w źródłach wody za pomocą metody ekstrakcji DNA z bibuły filtracyjnej w połączeniu z testem amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli (LAMP), który może być analizowany w terenie lub w laboratorium.

Wykrywanie Phytophthora capsici w wodzie do nawadniania za pomocą amplifikacji izotermicznej za pośrednictwem pętli

W tej pracy opracowano szybką, czułą i przenośną metodę wykrywania Candidatus Liberibacter asiaticus, opartą na amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a.

Wykrywanie Candidatus Liberibacter asiaticus do stosowania w terenie za pomocą amplifikacji polimerazy rekombinazy w połączeniu z CRISPR-Cas12a

Zaprojektowaliśmy, wyprodukowaliśmy i zatwierdziliśmy urządzenie, które szybko przetwarza bogate w łyko tkanki z kory cytrusów i pączków. W porównaniu z obecnymi metodami, ekstraktor tkanek pączków (BTE) zwiększył przepustowość próbek i zmniejszył wymagane koszty pracy i sprzętu.

Automatyzacja przetwarzania pączków cytrusów w celu wykrywania patogenów na dalszych etapach procesu za pomocą inżynierii urządzeń

Ten manuskrypt opisuje nowatorskie urządzenie do bezpośredniego naparu roślinnego do badania skuteczności cząsteczek przeciwko bakteriom (Candidatus Liberibacter asiaticus) lub ich owadziczemu wektorowi (Diaphorina citri, Kuwayama), które w połączeniu są związane z chorobą cytrusów Huanglongbing.

Urządzenie do bezpośredniej infuzji do dostarczania cząsteczek w roślinach

W tym protokole ilustrowano test amplifikacji polimerazy rekombinazowej CRISPR/Cas12a do wykrywania inwazyjnego patogenu roślinnego, Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4.

Połączony test amplifikacji polimerazy rekombinazy CRISPR/Cas12a do wykrywania Fusarium oxysporum f. sp. cubense Tropical Race 4

Tutaj opisujemy prostą i szybką procedurę wykrywania DNA z patogenów pszczół, takich jak Lotmaria passim i Nosema ceranae, przy użyciu lizy komórek gotowej do amplifikacji, amplifikacji polimerazy rekombinazy i testów CRISPR/Cas12a.

Wykrywanie DNA pasożytów trypanosomatydów i Nosema ceranae na miejscu poprzez alkaliczną lizę sprzężoną z systemem RPA/CRISPR/Cas12a

Poznaj metodę PCR do wykrywania patogena zazieleniania cytrusów Candidatus liberibacter spp. w tkankach liści. Ta technika jest szybka, ekonomiczna i dostępna dla rolników oraz badaczy.

Specyficzne i dokładne wykrywanie patogenu zazieleniania cytrusów Candidatus liberibacter spp. za pomocą konwencjonalnego PCR na próbkach tkanek liści cytrusów (Wideo) | JoVE Journal

Specyficzne i dokładne wykrywanie patogenu zazieleniania cytrusów Candidatus liberibacter spp. za pomocą konwencjonalnego PCR na próbkach tkanek liści cytrusów

Przeglądaj więcej filmów