Name: Mysi model syngenicznego raka trzustki do badania skutków nieodwracalnej elektroporacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Poznaj nieodwracalną elektroporację w leczeniu raka trzustki przy użyciu syngenicznego modelu mysziego. Ta metoda pozwala badać wpływ IRE na mikrośrodowisko nowotworowe i odpowiedź immunologiczną.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

RRW otrzymało wsparcie dla tej pracy z grantu Collaborative Translational Research Grant, ufundowanego przez San Diego C3 Padres Pedal the Cause (#PTC2017).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach przeprowadzone zgodnie z tym protokołem muszą zostać zatwierdzone przez odpowiedni Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC). Wszystkie opisane tutaj procedury zostały zatwierdzone przez IACUC UCSD.
1. Pozyskaj zwierzęta odbiorcy
UWAGA: Linia komórkowa KPC-Luc 4580 powstała z guza powstałego w LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+; PDX1Cre/+; Mysz LSL-ROSA26 Luc/+ (KPC), która jest genetycznie zmodyfikowanym modelem komputera PC na tle C57BL/6. Zaletą tej linii komórkowej jest to, że konstytutywnie wyraża monitorowanie guza umożliwiające lucyferazy w modelach ortotopowych. Jednak inne linie komórkowe mogą być również używane, o ile są one zgodne z tłem genetycznym myszy biorcy.
<ol>
	<li>Określ z wyprzedzeniem grupy doświadczalne i liczbę zwierząt w grupie.</li>
	<li>Wybierz wiek (zalecane myszy w wieku 6 - 10 tygodni) i płeć używanych zwierząt zgodnie z hipotezą i użytą linią komórkową.</li>
</ol>
2. Komórki hodowlane
<ol>
	<li>Użyj zmodyfikowanego podłoża orła (DMEM) firmy Dulbecco: mieszanki składników odżywczych F12 (50:50) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% antybiotyku penicylinowo-streptomycynowego (kompletna pożywka wzrostowa) do hodowli komórek KPC-Luc 4580.</li>
	<li>W przypadku zamrożenia komórki należy rozmrozić na 4 dni przed implantacją guza.</li>
	<li>Hoduj komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 i 95% wilgotnością w warunkach aseptycznych.</li>
	<li>Trypsynuj komórki 0,25% trypsyny przez 5 minut w temperaturze 37 °C, zanim osiągną konfluencję >80% i zneutralizuj trypsynę, dodając dwukrotność objętości kompletnej pożywki wzrostowej. 
	UWAGA: Komórki te nie tworzą guzów skutecznie u myszy, jeśli są używane przy 100% zbiegu lub jeśli są pasażowane więcej niż 12 razy. Dlatego wskazane jest zamrożenie komórek we wcześniejszych przejściach przy optymalnym zbiegu.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i przystąp do indukcji guza, jeśli występuje odpowiednia liczba (0,5 - 1 x 106 komórek / mysz). Jeśli nie, rozwiń komórki o jeszcze jedno przejście, aż uzyskasz odpowiednią liczbę komórek.</li>
</ol>
3. Indukcja guzów SQ
<ol>
	<li>Przygotuj wymagane materiały: pipety i końcówki P1000 i P100, strzykawkę 1 ml, igły 25 G, matrycę błony podstawnej (BMM), podłoże podstawowe DMEM, probówki wirówkowe o pojemności 1,5 ml. Wszystkie materiały należy przechowywać w sterylnym i chłodnym (4 °C) do końca zabiegu. Trzymaj również maszynki do strzyżenia włosów i waciki nasączone alkoholem gotowe do użycia przez zwierzęta.</li>
	<li>Trypsynizuj (jak w kroku 2.4) i policz komórki, a następnie ponownie je zawieś w stężeniu 2 - 4 x 107 komórek/ml zimnego DMEM.</li>
	<li>Dodaj równą objętość 100% BMM, aby uzyskać końcowe zawieszenie komórek w 50% BMM. Ostateczna objętość powinna wynosić 50 μl zawiesiny komórkowej dla każdej wymaganej myszy. Przygotować 10% nadmiaru, aby wypełnić martwą przestrzeń w strzykawce i zapobiec ewentualnym błędom pipetowania.</li>
	<li>Podwielokrotną ilość zawiesiny o objętości 550 μl umieścić w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml umieszczonych w lodzie.</li>
	<li>Skrępować zwierzęta (6-tygodniowe samce myszy C57BL/6) za pomocą krępa lub ręcznie. 
	UWAGA: Alternatywnie, myszy można znieczulić 2,5% izofluranem w gazowym tlenie przy natężeniu przepływu 2 l/min za pomocą precyzyjnego waporyzatora.</li>
	<li>Ogolić miejsce wstrzyknięcia, które najlepiej znajduje się na boku nad nogą, za pomocą maszynki do strzyżenia. Za pomocą wacika nasączonego alkoholem należy dwukrotnie oczyścić miejsce wstrzyknięcia.</li>
	<li>Pobrać 250 μl zawiesiny komórek o końcowym stężeniu 1 - 2 x 107 komórek/ml do zimnej strzykawki o pojemności 1 ml i usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza, przesuwając tłok w górę i w dół. Przymocować igłę 25G do strzykawki i upewnić się, że przestrzeń wewnątrz igły została wypełniona.</li>
	<li>Ostrożnie wprowadzić igłę pod skórę pod kątem 30° do ciała w pobliżu boków, upewniając się, że igła nie przebija jamy otrzewnej ani mięśni kończyn.</li>
	<li>Spłaszcz igłę równolegle do ciała i spłaszcz zmarszczki na skórze. Powoli wstrzyknąć 50 μl zawiesiny komórkowej. Przytrzymać igłę w miejscu wstrzyknięcia przez 10 sekund, aby umożliwić zastygnięcie BMM i zapobiec wyciekom.</li>
	<li>Powoli wycofać igłę, trzymając ją równolegle, bez żadnych ruchów na boki. Delikatnie oczyść miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem i przyłóż mysz do jej obudowy. 
	UWAGA: Jeśli mysz została znieczulona podczas zabiegu, należy monitorować zwierzę, aż odzyska odruchy prostowania.</li>
	<li>Regularnie monitoruj wzrost guza za pomocą suwmiarki, aż osiągnie średnicę 5 mm.</li>
</ol>
4. Indukcja guzów ortotopowych
<ol>
	<li>Przygotuj wymagane materiały. Autoklaw narzędzi chirurgicznych, takich jak nożyczki, skalpele, wkrętaki igłowe oraz kleszcze ze spiczastymi i płaskimi końcówkami. Miej pod ręką sterylne szwy (wchłanialne 6-0 i niewchłanialne 4-0), waciki nasączone alkoholem, maszynki do strzyżenia włosów, krem do depilacji, lubrykant do oczu, gazę bawełnianą, 10% roztwór jodu powidonu, serwety chirurgiczne, poduszki grzewcze, buprenorfinę i środki znieczulające.</li>
	<li>Poddaj eutanazji mysz dawcę (najlepiej o tym samym pochodzeniu, które jest wymagane dla modelu ortotopowego) noszącą guz SQ KPC za pomocą komory CO2 o powolnym napełnianiu. Ostrożnie wytnij guz SQ w sterylnych warunkach w kapturze BSL-2 za pomocą sterylnych kleszczy i mikronożyczek na krótko przed implantacją ortotopową. Podczas wycinania guza należy uważać, aby nie przebić jamy otrzewnej i natychmiast umyć guz za pomocą 2 wymian sterylnego PBS.</li>
	<li>Za pomocą sterylnych skalpeli zmielić wycięty guz na 1 mm3 kawałki, umieścić je na szalce Petriego zawierającej zimne sterylne podłoże podstawowe DMEM i przechowywać na lodzie do momentu implantacji.</li>
	<li>Podać myszowi biorcy 0,05 - 1 mg/kg buprenorfiny przeciwbólowej SQ, 30 minut przed zabiegiem.</li>
	<li>Znieczulić myszy biorcę 2 - 3% izofluranem w tlenie (2 l/min) za pomocą precyzyjnego waporyzatora (lub innych środków znieczulających). Trzymaj myszy na poduszce grzewczej o temperaturze 37 °C przez cały czas trwania zabiegu. Nałóż lubrykant na oczy, aby zapobiec wysuszeniu. Przetestuj głębokość znieczulenia przez brak odruchu zaskoczenia na początku i potwierdź znieczulenie płaszczyzną chirurgiczną przez brak odruchu pedałowania do delikatnego uszczypnięcia palca. Utrzymuj znieczulenie podczas całego zabiegu chirurgicznego.</li>
	<li>Połóż mysz na plecach i delikatnie obróć ją na prawą stronę, tak aby lewa strona brzucha była odsłonięta. Usuń włosy na brzuchu myszy za pomocą kremu do depilacji i wyczyść gazą, aby upewnić się, że żadne wolne włosy nie dostają się do brzucha po nacięciu. Przygotuj lewą jamę brzuszną do zabiegu za pomocą 3 cykli 10% jodowidonu, a następnie chusteczek nasączonych alkoholem w celu dezynfekcji skóry.</li>
	<li>Za pomocą sterylnego skalpela wykonaj 1,5-centymetrowe poprzeczne lub ukośne nacięcie w skórze, 1 cm na lewo od linii środkowej, poniżej klatki piersiowej, lekko przyśrodkowo do śledziony. Następnie przedłuż nacięcie przez mięśnie brzucha, odzwierciedlając leżące nad nim powierzchowne nacięcie.</li>
	<li>Zlokalizuj śledzionę za pomocą kleszczy z płaską końcówką i delikatnie uzewnętrznij ją z jamy brzusznej. Cofnij śledzionę za pomocą sterylnego bawełnianego aplikatora i znajdź ogon trzustki przymocowany do dolnej części śledziony.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy z płaską końcówką cofnij ogon trzustki na boki.</li>
	<li>Podnieś jeden drobno zmielony kawałek guza od myszy dawcy za pomocą końcówki cienkiej (6-0) sterylnej igły do szycia i ustaw go za pomocą sterylnych kleszczy.</li>
	<li>Delikatnie cofając ogon/trzon trzustki na boki, włóż igłę szwu zawierającego fragment guza do ogona trzustki. Przełóż szew powoli przez tkankę, utrzymując guz w kontakcie z ogonem trzustki. Założyć jeden lub dwa dodatkowe szwy w zależności od ułożenia fragmentu w stosunku do tkanki.</li>
	<li>Całkowicie usunąć igłę z tkanki i utrzymywać trzustkę/śledzionę w eksternalizacji przez dodatkowe 60 sekund, sprawdzając, czy nie ma oznak krwotoku lub wycieku. Następnie delikatnie zinternalizuj je w jamie brzusznej za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Zamknij mięśnie brzucha za pomocą wchłanialnego szwu 6-0 z ciągłym lub przerywanym szwem i zamknij leżącą nad nim skórę za pomocą niewchłanialnego szwu przerywanego 3-0 do 6-0. W tym momencie należy przerwać znieczulenie.</li>
	<li>Pozwól myszy dojść do siebie w klatce domowej ze swobodnym dostępem do jedzenia i wody. Umieść klatkę na poduszce grzewczej, aby ułatwić regenerację. Monitoruj parametry życiowe, takie jak oddychanie, perfuzja itp., podczas procesu rekonwalescencji.</li>
	<li>Potwierdź oznaki odruchu prostowania, gdy mysz wyzdrowieje, a następnie przywróć klatkę do zwykłej obudowy.</li>
	<li>Buprenorfinę podawać w dawce 0,05 - 0,1 mg/kg 8 - 12 godzin po zabiegu i co 8 - 12 godzin po zabiegu w razie potrzeby w przypadku objawów bólu.</li>
	<li>Monitoruj wzrost guza za pomocą systemu obrazowania bioluminescencyjnego in vivo (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Śledź wzrost guza poprzez obrazowanie, zaczynając od 4 dnia po implantacji ortotopowej i wykonuj obrazowanie dwa razy w tygodniu.</li>
		<li>W dniu obrazowania należy podać (wstrzyknięcie dootrzewnowe) 30 mg/kg D-lucyferyny znieczulonej (2 - 3% izofluranu w tlenie (2 l/min)) myszy biorcy 10 minut przed obrazowaniem.</li>
		<li>Obraz aktywności lucyferazy przy użyciu ustawienia luminescencji bez żadnych filtrów emisyjnych przez co najmniej 5 s ekspozycji w obrazie luminescencyjnym z podgrzewanym stopniem wolnym od autofluorescencji i przy jednoczesnym zachowaniu znieczulenia dla myszy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. IRE guzów SQ
<ol>
	<li>Przygotuj wymagane materiały: elektroporator fali prostokątnej, nożny wyłącznik bezpieczeństwa, elektrody (igła kontra pęseta) i adaptery. W pobliżu trzymaj sterylne szwy (niewchłanialne 4-0), waciki nasączone alkoholem, maszynkę do strzyżenia włosów, krem do depilacji, lubrykant do oczu, gazę bawełnianą, buprenorfinę i środki znieczulające.</li>
	<li>Wysterylizuj pęsetę lub elektrody igieł za pomocą sterylizacji gazowej. Autoklawowanie nie jest zalecane. Użyj sterylizatora z kulkami szklanymi, aby wysterylizować elektrody między zwierzętami.</li>
	<li>Buprenorfinę należy podawać myszom z nowotworem w dawce 0,05 - 0,1 mg/kg na 30 minut przed zabiegiem.</li>
	<li>Wykonaj kroki 4.4 - 4.5, aby skutecznie wywołać znieczulenie u myszy, gdy implant nowotworowy SQ osiągnie średnicę 5 mm.</li>
	<li>Umieść znieczuloną mysz na boku, aby uzyskać dostęp do guza SQ na boku. Usuń włosy za pomocą maszynki do strzyżenia i oczyść skórę za pomocą wacika nasączonego alkoholem.</li>
	<li>W przypadku guzów SQ należy użyć elektrod 2-igłowych. Podnieś skórę bezpośrednio pod miejscem guza za pomocą kleszczy i wprowadź elektrody przez skórę równolegle do ciała, upewniając się, że nie przenikają do jamy otrzewnej. Po przejściu przez skórę umieść elektrody w taki sposób, aby obejmowały guz.</li>
	<li>Zaprogramuj elektroporator tak, aby dostarczał impulsy 100 μs z częstotliwością 1 Hz przy 1 500 V/cm, co daje łącznie 150 impulsów. Dostarczaj impulsy za pomocą pedału nożnego. Oddziel każdy zestaw 10 impulsów przez 10 s, aby umożliwić rozproszenie ciepła i potwierdzić prawidłowe położenie elektrod. 
	UWAGA: Bez użycia środków paraliżujących myszy będą doświadczać skurczów mięśni z IRE, które mogą powodować przemieszczenie elektrod, chyba że zostaną ręcznie zabezpieczone.</li>
	<li>Wyjmij elektrody po całkowitym dozowaniu, które nie powinno przekraczać 200 s. Zapisz rzeczywiste dostarczone napięcie, które jest wyświetlane na elektroporatorze. Pozwól myszom odzyskać sprawność po IRE zgodnie z krokami 4.14 - 4.16.</li>
</ol>
6. IRE guzów ortotopowych
UWAGA: IRE guzów ortotopowych wymaga drugiej operacji przeżycia na tej samej myszy, co wymaga specjalnej zgody lokalnego IACUC przed rozpoczęciem.
<ol>
	<li>Przygotuj wymagane materiały: autoklaw narzędzi chirurgicznych, takich jak nożyczki, skalpele, wkrętaki do igieł, spiczaste kleszcze i kleszcze z płaską końcówką. Trzymaj również w pobliżu: sterylne szwy (wchłanialne 6-0 i niewchłanialne 4-0), waciki nasączone alkoholem, maszynki do strzyżenia włosów, krem do depilacji, lubrykant do oczu, gaza bawełniana, 10% roztwór jodu powidonu, serwety chirurgiczne, poduszki grzewcze, elektroporator fali prostokątnej, nożny wyłącznik bezpieczeństwa, elektrody i ich adaptery, buprenorfina i środki znieczulające.</li>
	<li>Oceń myszy pod kątem ortotopowego wzrostu guza za pomocą obrazowania in vivo (patrz krok 4.17), wstrzykując 30 mg/kg D-Lucyferyny dootrzewnowo. 
	UWAGA: Guzy ortotopowe są idealne do leczenia IRE od 8 do 10 dni po implantacji, kiedy guzy są wyraźnie widoczne i nadal ograniczone do trzustki, jak widać na obrazach luminescencji lucyferazy (patrz Reprezentatywne wyniki).</li>
	<li>Wykonaj kroki 4.4 - 4.9, aby zlokalizować wszczepiony guz. Jeśli guz nie jest łatwy do zlokalizowania, użyj kleszczy z nosem, aby delikatnie przesunąć żołądek i śledzionę, aby zidentyfikować guz.</li>
	<li>Uzewnętrznij guz za pomocą kleszczy z nosem i mocno uchwyć guz za pomocą platynowych elektrod pęsety. Dostarczaj impulsy elektroporacyjne zgodnie z programowaniem w kroku 5.7 za pomocą elektroporatora fali prostokątnej w zestawach po 10 impulsów sterowanych przełącznikiem nożnym.</li>
	<li>Utrzymuj guz uzewnętrzniony przez co najmniej 60 s po IRE, aby monitorować wszelkie oznaki krwotoku. Włóż guz z powrotem do jamy brzusznej i zamknij nacięcie, jak opisano wcześniej (kroki 4.13 - 4.16) i monitoruj mysz, aż wyzdrowieje.</li>
	<li>Monitoruj wpływ IRE na wzrost guza za pomocą obrazowania lucyferazy in vivo, jak opisano w kroku 4.17.</li>
</ol>

<ol><li>Rahib, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projecting+cancer+incidence+and+deaths+to+2030%3A+the+unexpected+burden+of+thyroid%2C+liver%2C+and+pancreas+cancers+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Projecting cancer incidence and deaths to 2030: the unexpected burden of thyroid, liver, and pancreas cancers in the United States.</a> Cancer Res. 74 (11), 2913-2921 (2014).</li>
<li>Howlader, N., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHowlader%2C+N+%22SEER+Cancer+Statistic+Review%2C+1975-2013%22">SEER Cancer Statistic Review, 1975-2013</a>. , 
 <a target="_blank" href="http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/">http://seer.cancer.gov/csr/1975_2013/</a> (1975).</li>
<li>Clark, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+immune+reaction+to+pancreatic+cancer+from+inception+to+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the immune reaction to pancreatic cancer from inception to invasion.</a> Cancer Res. 67 (19), 9518-9527 (2007).</li>
<li>Lee, E. W., Loh, C. T., Kee, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+guided+percutaneous+irreversible+electroporation%3A+ultrasound+and+immunohistological+correlation%5BTitle%5D)+AND+%22Technol+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Imaging guided percutaneous irreversible electroporation: ultrasound and immunohistological correlation.</a> Technol Cancer Res Treat. 6 (4), 287-294 (2007).</li>
<li>Charpentier, K. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irreversible+electroporation+for+the+ablation+of+liver+tumors%3A+are+we+there+yet%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Surg%22%5BJournal%5D)">Irreversible electroporation for the ablation of liver tumors: are we there yet?</a> Arch Surg. 147 (11), 1053-1061 (2012).</li>
<li>Narayanan, G. <a target="_blank" href="https://www.thieme-connect.com/products/ejournals/abstract/10.1055/s-0035-1564706">Irreversible Electroporation.</a> Seminars in Interventional Radiology. 32 (4), 349-355 (2015).</li>
<li>Martin, R. C. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+200+locally+advanced+%28stage+III%29+pancreatic+adenocarcinoma+patients+with+irreversible+electroporation%3A+safety+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg%22%5BJournal%5D)">Treatment of 200 locally advanced (stage III) pancreatic adenocarcinoma patients with irreversible electroporation: safety and efficacy.</a> Ann Surg. 262 (3), 486-494 (2015).</li>
<li>Belfiore, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Percutaneous+CT-guided+irreversible+electroporation+followed+by+chemotherapy+as+a+novel+neoadjuvant+protocol+in+locally+advanced+pancreatic+cancer%3A+Our+preliminary+experience%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Surg%22%5BJournal%5D)">Percutaneous CT-guided irreversible electroporation followed by chemotherapy as a novel neoadjuvant protocol in locally advanced pancreatic cancer: Our preliminary experience.</a> Int J Surg. 21 Suppl 1, S34-S39 (2015).</li>
<li>Belfiore, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+chemotherapy+alone+versus+irreversible+electroporation+followed+by+chemotherapy+on+survival+in+patients+with+locally+advanced+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Oncol%22%5BJournal%5D)">Concurrent chemotherapy alone versus irreversible electroporation followed by chemotherapy on survival in patients with locally advanced pancreatic cancer.</a> Med Oncol. 34 (3), 38(2017).</li>
<li>Chu, K. F., Dupuy, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+ablation+of+tumours%3A+biological+mechanisms+and+advances+in+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Thermal ablation of tumours: biological mechanisms and advances in therapy.</a> Nat Rev Cancer. 14 (3), 199-208 (2014).</li>
<li>Wissniowski, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+tumor-specific+T+lymphocytes+by+radio-frequency+ablation+of+the+VX2+hepatoma+in+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activation of tumor-specific T lymphocytes by radio-frequency ablation of the VX2 hepatoma in rabbits.</a> Cancer Res. 63 (19), 6496-6500 (2003).</li>
<li>Eros de Bethlenfalva-Hora, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiofrequency+ablation+suppresses+distant+tumour+growth+in+a+novel+rat+model+of+multifocal+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Sci+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Radiofrequency ablation suppresses distant tumour growth in a novel rat model of multifocal hepatocellular carcinoma.</a> Clin Sci (Lond). 126 (3), 243-252 (2014).</li>
<li>Zerbini, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiofrequency+thermal+ablation+for+hepatocellular+carcinoma+stimulates+autologous+NK-cell+response%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Radiofrequency thermal ablation for hepatocellular carcinoma stimulates autologous NK-cell response.</a> Gastroenterology. 138 (5), 1931-1942 (2010).</li>
<li>Ali, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+dendritic+cells+by+local+ablation+of+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Activation of dendritic cells by local ablation of hepatocellular carcinoma.</a> J Hepatol. 43 (5), 817-822 (2005).</li>
<li>Fietta, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+inflammatory+response+and+downmodulation+of+peripheral+CD25%2BFoxp3%2B+T-regulatory+cells+in+patients+undergoing+radiofrequency+thermal+ablation+for+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Immunol%22%5BJournal%5D)">Systemic inflammatory response and downmodulation of peripheral CD25+Foxp3+ T-regulatory cells in patients undergoing radiofrequency thermal ablation for lung cancer.</a> Hum Immunol. 70 (7), 477-486 (2009).</li>
<li>Jiang, C., Davalos, R. V., Bischof, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+basic+to+clinical+studies+of+irreversible+electroporation+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">A review of basic to clinical studies of irreversible electroporation therapy.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 62 (1), 4-20 (2015).</li>
<li>Neal, R. E. 2nd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+local+and+systemic+anti-tumor+efficacy+for+irreversible+electroporation+in+immunocompetent+versus+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Improved local and systemic anti-tumor efficacy for irreversible electroporation in immunocompetent versus immunodeficient mice.</a> PLoS One. 8 (5), e64559(2013).</li>
<li>Hingorani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trp53R172H+and+KrasG12D+cooperate+to+promote+chromosomal+instability+and+widely+metastatic+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Trp53R172H and KrasG12D cooperate to promote chromosomal instability and widely metastatic pancreatic ductal adenocarcinoma in mice.</a> Cancer Cell. 7 (5), 469-483 (2005).</li>
<li>Safran, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+reporter+strain+for+noninvasive+bioluminescent+imaging+of+cells+that+have+undergone+Cre-mediated+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Imaging%22%5BJournal%5D)">Mouse reporter strain for noninvasive bioluminescent imaging of cells that have undergone Cre-mediated recombination.</a> Mol Imaging. 2 (4), 297-302 (2003).</li>
<li>Martin, R. C. 2nd, McFarland, K., Ellis, S., Velanovich, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Irreversible+electroporation+in+locally+advanced+pancreatic+cancer%3A+potential+improved+overall+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Irreversible electroporation in locally advanced pancreatic cancer: potential improved overall survival.</a> Ann Surg Oncol. 20 Suppl 3, S443-S449 (2013).</li>
<li>Neal, R. E., Garcia, P. A., Robertson, J. L., Davalos, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+Characterization+and+Numerical+Modeling+of+Tissue+Electrical+Conductivity+during+Pulsed+Electric+Fields+for+Irreversible+Electroporation+Treatment+Planning%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Transactions+on+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Experimental Characterization and Numerical Modeling of Tissue Electrical Conductivity during Pulsed Electric Fields for Irreversible Electroporation Treatment Planning.</a> IEEE Transactions on Biomedical Engineering. 59 (4), 1076-1085 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie posiadają żadnych istotnych informacji finansowych.

W tym badaniu zademonstrowaliśmy immunokompetentny mysi model PC, który można wykorzystać do badania wpływu IRE na wzrost guza. Obecnie IRE jest stosowany jako technika ablacji nietermicznej tylko u wysoce wyselekcjonowanych, miejscowo zaawansowanych pacjentów z PC, u których po miesiącach terapii przedoperacyjnej nie występuje progresja choroby na odległość. W związku z tym jego zastosowanie jest ograniczone, ponieważ u większości pacjentów z miejscowo zaawansowaną PC rozwija się choroba z odległymi przerzutami<sup clas...

Gruczolakorak przewodowy trzustki (PC) ma stać się drugą najczęstszą przyczyną zgonów z powodu raka w USA około 2020 roku1. Zdecydowana większość pacjentów, u których zdiagnozowano PC, ostatecznie umrze z powodu choroby z odległymi przerzutami2. Mikrośrodowisko PC jest notorycznie immunosupresyjne i chemooporne. Jego zrąb desmoplastyczny zawiera niedobór efektorowych (przeciwnowotworowych) limfocytów T i dużą liczbę leukocytów immunosupresyjnych, w tym makrofagów związanych z nowotworem (TAM), komórek supresorowych pochodzenia szpikowego (MDSC) i regulatorowych limfocytów T (Tregs)3. Leżą one u podstaw potrzeby opracowania strategii multimodalnych, które przeciwdziałają tym skutkom mikrośrodowiska.
IRE został opracowany jako nietermiczna metoda ablacji nowotworów. W przeciwieństwie do technik ablacji termicznej, IRE nie powoduje szybkiej martwicy koagulacyjnej, ale zamiast tego powoduje stopniową apoptozę komórki 4. Co ważne w przypadku guzów trzustki, IRE nie jest podatny na efekty "radiatora" i może być wykonywany tuż obok naczyń krwionośnych5. Technologia ta posiada zezwolenie 510(k) od klasy FDA<sup='xref'>6 i jest obecnie stosowana klinicznie u wybranych pacjentów z miejscowo zaawansowanym lub granicznym resekcyjnym rakiem trzustki. W największej opublikowanej serii IRE dla PC7, mediana przeżycia pacjentów poddawanych IRE była w przybliżeniu dwukrotnie większa niż przeżycie pacjentów leczonych samą nowoczesną chemioterapią bez resekcji8,9. 
Kilka badań wykazało, że ablacja termiczna wywołuje ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną w innych typach nowotworów (recenzowane w Chu et al.10). Ablacja prądem o częstotliwości radiowej (RFA) w modelach nowotworów zwierzęcych prowadzi do zwiększonego nacieku limfocytów T11,12, w tym wzrost aktywowanych komórek NK u pacjentów z rakiem wątrobowokomórkowym13,14 oraz spadek immunosupresyjnych limfocytów Treg u pacjentów z rakiem płuc15. Znacznie mniejsza liczba badań dotyczyła reakcji immunologicznych, mikrośrodowiskowych i urazowych na IRE16. Wykazano, że IRE stymuluje ogólnoustrojową odpowiedź immunologiczną w immunokompetentnych modelach mysich, w których wzrost wtórnych (przeciwstronnych) alloprzeszczepów komórek nerki został zmniejszony lub uniemożliwiony przez IRE guza pierwotnego dwa tygodnie wcześniej17. Zaobserwowali również, że myszy immunokompetentne wymagały mniejszego napięcia do całkowitej regresji niż myszy z obniżoną odpornością. Wysunięto hipotezę, że IRE może powodować lepszą prezentację antygenu w porównaniu z martwicą koagulacyjną ablacji termicznej, ale nie zostało to specjalnie zbadane.
Opracowaliśmy syngeniczny mysi model PC z linii komórkowej KPC-Luc 4580 (prezent od J.J. Yeh z University of North Carolina), który pochodził z nowotworu, który rozwinął się u samca LSL-KrasG12D/+; LSL-TRP53R172H/+; PDX1Cre/+; Mysz LSL-ROSA26 Luc/+, do badania miejscowych i ogólnoustrojowych skutków IRE18,19. Ta linia komórkowa eksprymująca lucyferazy jest immunogenna, a także rakotwórcza u immunokompetentnych myszy C57BL / 6 po wstrzyknięciu SQ lub ortotopowo i niezawodnie wytwarza przerzuty do wątroby po wstrzyknięciu do śledziony. Wykorzystaliśmy programowalny generator impulsów fali prostokątnej do dostarczania impulsów elektrycznych o wielkości 100 μs przy stosunku napięcia do odległości 1500 V/cm za pomocą dwuigłowej sondy (oddalonej od siebie o 5 mm) lub platynowej pęsety do guzów SQ lub ortotopowych odpowiednio u myszy, aby modelować efekty IRE u małego zwierzęcia.

<table><tbody><tr><td>Elektroporator prostokątny ECM 830</td><td>Aparat Harvarda</td><td>BTX # 45-0002 ( 58018-004 )</td><td></td></tr> <tr><td>2 elektroda igłowa</td><td>Aparat Harvard</td><td>45-0167</td><td></td></tr><tr><td>Stopowy wyłącznik bezpieczeństwa</td><td>Aparat Harvarda</td><td>45-0211</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa pęseta</td><td>Aparat Harvarda</td><td>&nbsp; 45-0486</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-F12 pożywka</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td><td>płodu ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td></td>792632</tr><tr><td>Lacrilube</td><td>Fisher Naukowy&nbsp;</td><td></td><td></td>19090646</tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>NC1292810</tr><tr><td>D-luciferrin</td><td>Perkin Elmer</td><td>122799</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&nbsp; System obrazowania Spectrum In Vivo</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>Szczep myszy C57BL/6J</td><td>Laboratorium Jacksona&nbsp;</td>Linia <td>000664/Black 6</td><td></td></tr><tr><td>Cell (KPC-Luc 4580)</td><td>J.J. Yeh Lab na Uniwersytecie Karoliny</td><td></td><td></td>Północnej</tr><tr><td>Igły strzykawkowe BD Precisionglide</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.</td><td></td><td>Wacik nasączony alkoholem Z192406</td></tr><tr><td>(70% alkoholu izopropylowego)</td> <td>BD</td><td>326895</td><td></td></tr><tr><td>Suwmiarka cyfrowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-648-17</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe, sterylne</td><td>Aplikatory VWR</td><td>21909</td><td></td></tr><tr><td>z końcówką bawełnianą</td><td>VWR</td><td>89198</td><td></td></tr><tr><td>Igła do szwów, 45 cm, rozmiar 6-0</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-3308</td><td></td></tr><tr><td>Igła do szycia, 45 cm, rozmiar 4-0</td><td>Aparat Harvard</td><td>72-3314</td><td></td></tr><tr><td>Powidon-jod 10%</td><td>BD</td><td>29900-404</td><td></td></tr><tr><td>Jednorazowa podkładka rozgrzewająca&nbsp;</td><td>KORPORACJA NAUKOWA KENT</td><td>TP-3E</td><td></td></tr><tr><td>MASZYNKA DO STRZYŻENIA WŁOSÓW MYSZ</td><td>KENT SCIENTIFIC CORP.</td><td>CL8787</td><td></td></tr><tr><td>Serweta chirurgiczna</td><td>Aparat Harvard</td><td>59-7421</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr></tbody></table>

mysi model syngenicznego raka trzustki do badania skutków nieodwracalnej elektroporacji

A Syngeneic Pancreatic Cancer Mouse Model to Study the Effects of Irreversible Electroporation

Rak trzustki (PC), choroba, która zabija około 40 000 pacjentów rocznie w USA, skutecznie unika kilku podejść terapeutycznych, w tym obiecujących strategii immunoterapeutycznych. Nieodwracalna elektroporacja (IRE) to nietermiczna technika ablacji, która indukuje śmierć komórek nowotworowych bez niszczenia sąsiednich struktur kolagenowych, umożliwiając w ten sposób wykonanie zabiegu w guzach znajdujących się bardzo blisko naczyń krwionośnych. W przeciwieństwie do technik ablacji termicznej, IRE powoduje stopniową apoptozę komórek wraz z natychmiastową martwicą wywołaną ablacją i jest obecnie stosowany klinicznie u wybranych pacjentów z miejscowo zaawansowanym PC. Ablacyjna, niespecyficzna dla celu procedura, taka jak IRE, może wywołać niezliczone reakcje w mikrośrodowisku guza. Kilka badań dotyczyło wpływu IRE na wzrost guza w innych typach nowotworów, ale żadne nie koncentrowało się na PC. Opracowaliśmy syngeniczny mysi model PC, w którym guzy podskórne (SQ) i ortotopowe mogą być skutecznie leczone IRE w wysoce kontrolowanych warunkach, co ułatwia różne badania podłużne po zabiegu. Ten model zwierzęcy służy jako solidny system do badania skutków IRE i sposobów poprawy skuteczności klinicznej IRE.

Postępowano zgodnie z opisaną powyżej procedurą i wywołano guzy podskórne (SQ) u 5–6 tygodniowych myszy szczepu C57BL/6 typu dzikiego, którym wstrzyknięto 1 x 106 komórek w 50% BMM. Gdy średnica guza osiągnęła 5–6 mm, część myszy uśmiercono, a ich guzy wycięto i wszczepiono ortotopowo myszom biorcom C57BL/6. Zabieg IRE wykonano 10 dni po implantacji, zgodnie z harmonogramem przedstawionym na Rysunku 1. IRE wykonano również u pozostałych myszy z guz...

Nieodwracalna elektroporacja (IRE) to technika ablacji nietermicznej stosowana w leczeniu miejscowo zaawansowanego raka trzustki. Będąc stosunkowo nową techniką, wpływ IRE na wzrost guza jest słabo poznany. Opracowaliśmy syngeniczny model myszy, który ułatwia badanie wpływu IRE na raka trzustki.

Mysi model syngenicznego raka trzustki do badania skutków nieodwracalnej elektroporacji

Pancreatic cancer (PC), a disease which kills approximately 40,000 patients each year in the US, has successfully evaded several therapeutic approaches ...

Ogólnym celem tego modelu jest zbadanie wpływu nieodwracalnej elektroporacji lub IRE na raka trzustki u myszy immunokompetentnych. Model ten może pomóc odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań dotyczących roli IRE w raku trzustki. Na przykład, w jaki sposób IRE wpływa na lokalne mikrośrodowisko guza?Główną zaletą tego modelu jest to, że ułatwia on dokładną ocenę wzrostu guza w systemie immunokompetentnym, bez konieczności stosowania modeli myszy z nokautem lub mutacji. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat wpływu IRE na układ odpornościowy w immunokompetentnym mysim modelu raka trzustki. W celu podskórnej indukcji guza, najpierw ogol miejsce wstrzyknięcia na znieczulonej sześciotygodniowej, męskiej, czarnej myszy C57 i użyj wacika nasączonego alkoholem, aby dwukrotnie oczyścić to miejsce.Następnie załaduj zimną strzykawkę o pojemności jednego mililitra z jednym do dwóch razy dziesięć do siedmiu komórek na mililitr i 250 mikrolitrów macierzy membrany podstawnej. Przymocuj igłę o rozmiarze 25 do strzykawki i załaduj igłę zawiesiną komórek nowotworowych. Naciśnij i cofnij tłok kilka razy, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.Ostrożnie wprowadzić igłę pod skórę w miejscu wstr

a-syngeneic-pancreatic-cancer-mouse-model-to-study-effects

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Film wyjaśnia krokową metodę chirurgiczną do ortotopowego wszczepienia fragmentu guza od dawcy nowotworowego do trzustki myszy z nienowotworowym biorcą w celu rozwoju raka trzustki. Ortotopowo wszczepiony PDAC może dokładniej uchwycić mikrośrodowisko tkanek ludzkiego raka trzustki niż konwencjonalne modele podskórne (SC).

Ortotopowy przeszczep guza homograftu: technika generowania mysich modeli guza trzustki

Ten film opisuje procedurę wykonywania nieodwracalnej elektroporacji (IRE) do nietermicznej ablacji guzów trzustki u myszy. Zarówno guzy podskórne (SQ), jak i ortotopowe mogą być skutecznie leczone IRE w ściśle kontrolowanych warunkach, co ułatwia różne badania po zabiegu.

Nieodwracalna elektroporacja: technika ablacji guza trzustki u myszy

Ten film demonstruje protokół ortotopowego wszczepiania komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji do trzustki myszy. Ortotopowy model myszy pomaga w badaniu skuteczności nowych terapii w przypadku guzów pierwotnych i przerzutowych.

Fluorescencyjny ortotopowy model myszy: wszczepianie GFP z ekspresją komórek rakowych do myszy w celu oceny progresji guza in vivo

Ten film demonstruje ortotopowy model raka trzustki, który wykorzystuje Matrigel do miejscowego dostarczania komórek i obrazowania bioluminescencji in vivo do nieinwazyjnego monitorowania progresji guza. Model ortotopowy jest odpowiedni zarówno dla modeli syngenicznych, jak i ksenoprzeszczepów i może być wykorzystany w badaniach przedklinicznych w celu zbadania wpływu nowych terapii przeciwnowotworowych na wzrost pierwotnego guza trzustki i przerzuty.

Bioluminescencyjny ortotopowy model myszy raka trzustki: nieinwazyjna technika monitorowania progresji raka u myszy

Przedkliniczny, mysi model przerzutów do wątroby wykonany techniką iniekcji hemispleen.

Przedkliniczny mysi model przerzutów do wątroby

Celem tego protokołu jest zastosowanie dynamicznego rezonansu magnetycznego wzmocnionego kontrastem (DCE-MRI) dla ortotopowych ksenoprzeszczepów guza trzustki u myszy. DCE-MRI jest nieinwazyjną metodą analizy mikrokrążenia w tkance docelowej i przydatną do oceny odpowiedzi naczyniowej w guzie po nowej terapii.

Obrazowanie rezonansu magnetycznego z kontrastem dynamicznym ortotopowego modelu myszy z rakiem trzustki

Procedura ortotopowego wszczepienia komórek raka trzustki z ekspresją białka zielonej fluorescencji (PANC-1 GFP) do trzustki myszy Balb-c Ola Hsd-Fox1nu w celu oceny progresji guza i przerzutów jest przedstawiona tutaj.

Fluorescencyjny ortotopowy model raka trzustki u myszy

Opisujemy protokół implantacji pod kontrolą ultrasonograficzną linii komórkowych rdzeniakoraka przewodowego trzustki pochodzących od myszy bezpośrednio do natywnego miejsca guza. Takie podejście spowodowało guzy trzustki wykrywalne za pomocą skanowania ultrasonograficznego w ciągu 2-4 tygodni od wstrzyknięcia i znacznie zmniejszyło odsetek wysiewu komórek nowotworowych na ścianie otrzewnej w porównaniu z chirurgiczną implantacją ortotopową.

Ortotopowa implantacja mysiego gruczolakoraka przewodowego trzustki pod kontrolą USG

W kontekście klinicznym, pacjenci z zlokalizowanym rakiem trzustki zostaną poddani pankreatektomii, a następnie leczeniu uzupełniającemu. Przedstawiony tutaj protokół ma na celu ustanowienie bezpiecznej i skutecznej metody modelowania tego scenariusza klinicznego u nagich myszy, poprzez ortotopową implantację raka trzustki, a następnie dystalną pankreatektomię i splenektomię.

Ortotopowy resekcyjny mysi model raka trzustki

Syngeneic mysie ortotopowe alloprzeszczepy gruczolakoraka przewodowego trzustki (PDAC) podsumowują biologię, fenotypy i reakcje terapeutyczne podtypów choroby. Ze względu na szybką, powtarzalną progresję nowotworu są szeroko stosowane w badaniach przedklinicznych. Tutaj pokazujemy powszechne praktyki generowania tych modeli, wstrzykiwania syngenicznych mysich kultur PDAC do trzustki.

Syngeniczne ortotopowe alloprzeszczepy myszy do modelowania raka trzustki

Niniejszy protokół opisuje nowatorskie podejście do modelowania przewlekłego obturacyjnego zapalenia trzustki, które polega na wizualizacji przewodu trzustkowego oraz elektrokrzepnięciu przewodu trzustkowego w celu spowoduje jego niedrożności.

Model obturacyjnego przewlekłego zapalenia trzustki ustanowiony poprzez elektrokoagulację

Poznaj nieodwracalną elektroporację w leczeniu raka trzustki przy użyciu syngenicznego modelu mysziego. Ta metoda pozwala badać wpływ IRE na mikrośrodowisko nowotworowe i odpowiedź immunologiczną.

Mysi model syngenicznego raka trzustki do badania skutków nieodwracalnej elektroporacji

Przeglądaj więcej filmów