Mysi model syngenicznego raka trzustki do badania skutków nieodwracalnej elektroporacji

Ogólnym celem tego modelu jest zbadanie wpływu nieodwracalnej elektroporacji lub IRE na raka trzustki u myszy immunokompetentnych. Model ten może pomóc odpowiedzieć na wiele kluczowych pytań dotyczących roli IRE w raku trzustki. Na przykład, w jaki sposób IRE wpływa na lokalne mikrośrodowisko guza?

Główną zaletą tego modelu jest to, że ułatwia on dokładną ocenę wzrostu guza w systemie immunokompetentnym, bez konieczności stosowania modeli myszy z nokautem lub mutacji. Metoda ta może dostarczyć informacji na temat wpływu IRE na układ odpornościowy w immunokompetentnym mysim modelu raka trzustki. W celu podskórnej indukcji guza, najpierw ogol miejsce wstrzyknięcia na znieczulonej sześciotygodniowej, męskiej, czarnej myszy C57 i użyj wacika nasączonego alkoholem, aby dwukrotnie oczyścić to miejsce.

Następnie załaduj zimną strzykawkę o pojemności jednego mililitra z jednym do dwóch razy dziesięć do siedmiu komórek na mililitr i 250 mikrolitrów macierzy membrany podstawnej. Przymocuj igłę o rozmiarze 25 do strzykawki i załaduj igłę zawiesiną komórek nowotworowych. Naciśnij i cofnij tłok kilka razy, aby usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza.

Ostrożnie wprowadzić igłę pod skórę w miejscu wstrzyknięcia, pod kątem 30 stopni. Z igłą równolegle do ciała, powoli wstrzyknij 50 mikrolitrów komórek nowotworowych. Po 10 sekundach powoli wyjmij igłę, trzymając ją równolegle bez żadnych ruchów na boki, a następnie delikatnie oczyść miejsce wstrzyknięcia wacikiem nasączonym alkoholem, zanim włożysz mysz z powrotem do klatki.

Gdy guz osiągnie od pięciu do siedmiu milimetrów, użyj sterylnych kleszczy i mikronożyczek, aby wyciąć guz podskórny, w sterylnych warunkach w kapturze o drugim poziomie bezpieczeństwa biologicznego, uważając, aby nie przebić jamy otrzewnej. Natychmiast umyj wycięty guz, dwa razy, w sterylnym PBS. I użyj sterylnych skalpeli, aby zmielić guz na jeden do dwóch milimetrowych kawałków sześciennych.

Następnie przenieś kawałki guza na szalkę Petriego, zawierającą zimne, sterylne podłoże podstawowe DMEM na lodzie. Aby wszczepić fragmenty guza, po potwierdzeniu braku odpowiedzi na uszczypnięcie palca u nogi, należy nałożyć maść na oczy znieczulonego zwierzęcia biorcy i położyć mysz na jego prawym boku, tak aby lewa strona brzucha była odsłonięta. Usuń włosy na brzuchu kremem do depilacji i usuń krem gazą.

Po zdezynfekowaniu odsłoniętej skóry trzema sekwencyjnymi chusteczkami z 10% powidonem i jodem oraz alkoholem, za pomocą sterylnego skalpela wykonaj 1,5-centymetrowe nacięcie w skórze, jeden centymetr na lewo od linii środkowej, poniżej klatki piersiowej i lekko przyśrodkowo do śledziony. Delikatnie uzewnętrznij śledzionę za pomocą kleszczyków z płaską końcówką i sterylnego bawełnianego aplikatora, a następnie użyj kleszczyków, aby bocznie schować ogon trzustki na dole śledziony. Za pomocą sterylnych kleszczy chwyć jeden drobno rozdrobniony kawałek guza i przełóż przez niego cienką sterylną igłę do szycia 6-O.

Włóż igłę zawierającą fragment guza do ogona trzustki, powoli przechodząc szew przez tkankę. Należy uważać, aby uniknąć kontaktu między guzem a mięśniami ściany brzucha i otrzewną, aby zapobiec wysiewowi guza. Po zabezpieczeniu fragmentu guza należy całkowicie usunąć igłę z tkanki i utrzymywać narządy całkowicie uzewnętrznione przez dodatkowe 60 sekund, sprawdzając, czy nie ma żadnych oznak krwotoku.

Jeśli nie obserwuje się krwawienia, użyj kleszczy lub aplikatora z bawełnianą końcówką, aby delikatnie przywrócić śledzionę, trzustkę i guz do jamy brzusznej. Zanim guz osiągnie średnicę sześciu milimetrów, umieść znieczulone zwierzę na prawym boku, aby umożliwić dostęp do guza, i użyj maszynki do strzyżenia i wacika nasączonego alkoholem, aby oczyścić miejsce guza. Za pomocą kleszczy podnieś skórę bezpośrednio pod guzem i wprowadź dwie elektrody igłowe przez skórę, równolegle do ciała, aby zamknąć guz, uważając, aby elektrody nie przeniknęły do jamy otrzewnej.

Ustaw elektroporator tak, aby dostarczał impulsy o długości 100 mikrosekund przy częstotliwości jednego herca, przy napięciu 1500 woltów na centymetr, co daje w sumie 150 impulsów, i użyj pedału nożnego do dostarczania impulsów, oddzielając każdy zestaw 10 impulsów o 10 sekund, aby umożliwić rozpraszanie ciepła między każdym zestawem impulsów. Ponieważ drganie mięśni występuje podczas dostarczania IRE i jest bardziej wyraźne podczas początkowego zestawu impulsów, upewnij się, że elektrody są nadal w pożądanym miejscu i że zwierzę jest nadal uspokojone po każdym zestawie impulsów. Po nie więcej niż 200 sekundach dozowania wyjmij elektrody i zapisz rzeczywiste dostarczone napięcie, zgodnie z wyświetlaniem na elektroporatorze.

Następnie umieść mysz z powrotem w klatce. W przypadku IRE guza ortotopowego, osiem do 10 dni po implantacji guza, użyj kleszczy z nosem, aby uzewnętrznić guz za pomocą kleszczy i mocno uchwyć guz za pomocą platynowych elektrod Pęsety, dostarcz impulsy elektroporacyjne, jak właśnie pokazano, utrzymując guz uzewnętrzniony przez ostatni zestaw impulsów przez co najmniej 60 sekund, w celu monitorowania jakichkolwiek oznak krwotoku. Następnie zwróć guz do jamy brzusznej i zamknij nacięcie, jak pokazano, monitorując zwierzę, aż w pełni wyzdrowieje.

W tym reprezentatywnym eksperymencie guzy podskórne u prawie 50% myszy uległy całkowitej regresji po 150 impulsach IRE, z niewielką regresją po 75 impulsach. Analiza histologiczna tkanki nowotworowej, tydzień po IRE, ujawniła duże obszary centralnej martwicy guza, których nie obserwowano w kontrolnych, nieleczonych guzach i które były otoczone żywą tkanką nowotworową, w przypadkach niepełnej regresji guza. Monitorowanie tempa wzrostu wszczepionych guzów ortotopowych ujawniło stały wzrost guza w czasie u zwierząt biorców, który może być również zakłócony przez IRE, wykazując zdolność tego modelu do symulacji skutków IRE w immunokompetentnym modelu myszy.

Po opanowaniu tej techniki można wykonać w 15 minut na mysz, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby utrzymać rozmiar guza w odległości roboczej dostępnych elektrod IRE, ponieważ większe guzy będą powodować niespójne odpowiedzi z powodu niepełnej ablacji. Inne podejścia do leczenia, takie jak radioterapia lub chemioterapia, mogą być również wykorzystane do udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania dotyczące tego, czy łączenie terapii może poprawić odpowiedź guza na IRE.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ustalić podskórnego i ortotopowego raka trzustki u myszy oraz jak wykonać IRE na tych guzach.