Test oparty na cytometrii przepływowej w celu identyfikacji związków, które zakłócają wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 z receptorem chemokiny CXC 4
10 marca 2018
Opisano test wiązania komórkowego oparty na cytometrii przepływowej, który jest używany głównie jako narzędzie przesiewowe do identyfikacji związków, które hamują wiązanie znakowanego fluorescencyjnie ligandu chemokiny CXC 12 (CXCL12) z receptorem chemokiny CXC 4 (CXCR4).
Ogólnym celem testu komórkowego jest identyfikacja cząsteczek, które wiążą się z receptorem sprzężonym z białkiem G. Na podstawie ich zdolności do konkurowania z ligandem znakowanym fluorescencyjnie w celu wiązania się z receptorem. Test wiązania konkurencji może pomóc w odkrywaniu leków z receptorem sprzężonym z białkiem G.
Jak pokażemy za pomocą tego protokołu dla receptora chemokiny, CXC4. Główną zaletą tej metody jest to, że żywe komórki są wykorzystywane do analizy wiązania receptywnego, a nie preparatów pamięciowych. I że unika się stosowania sond etykietujących radioaktywność.
Chociaż metoda ta została początkowo opracowana w celu zbadania wiązania z receptorem chemokiny CXCR4, można ją również opracować dla innych GPCR, dla których istnieją ligandy znakowane fluorescencyjnie. Na początek dozuj 100 mikrolitrów roztworu złożonego do przezroczystej, 96-dobrze zaokrąglonej płyty dolnej, zgodnie z predefiniowanym układem eksperymentalnym. Dodać 50 mikrolitrów zawiesiny komórkowej ze zbiornika odczynnika do płytki 96-dołkowej za pomocą pipety wielokanałowej.
Inkubuj płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej w ciemności. Po inkubacji dodać 50 mikrolitrów znakowanych fluorescencyjnie 100 nanogramów na mililitr CXCL12 z podobnego zbiornika odczynnika do dołków płytki 96-dołkowej. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w ciemności.
Następnie odwirować 96-dołkową płytkę przy 400-krotności grawitacji przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Usunąć supernatant z granulowanych komórek, odwracając płytkę. Osusz płytkę na chusteczce.
Dodać 200 mikrolitrów świeżego buforu SA ze zbiornika odczynnika do studzienek za pomocą pipety wielokanałowej. Natychmiast przystąp do ponownego odwirowania płytki przez pięć minut przy 400-krotności grawitacji w temperaturze pokojowej. Ponownie usunąć supernatant, odwracając płytkę, a następnie susząc ją na chusteczce.
Na koniec delikatnie ponownie zawieś osad komórkowy w 200 mikrolitrach 1% paraformaldehydu rozpuszczonego w PBS. Ten krok naprawi komórki. Aby przeanalizować próbki za pomocą cytometrii przepływowej, uruchom urządzenie i otwórz odpowiednie oprogramowanie.
Wybierz parametry sieci komórkowej, które mają być wizualizowane w formacie bloku kropkowego, jako obszar rozproszenia do przodu, obszar rozproszenia bocznego, a w widoku histogramu kanał wykrywania fluoro four. Wybierz jedną próbkę. Na przykład ujemną próbkę kontrolną w celu przeprowadzenia bramkowania określonej jednorodnej populacji komórek w oparciu o parametry rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego.
Dostosuj ustawienia ładowania komórek do urządzenia do cytometrii przepływowej. Przed wstrzyknięciem należy wybrać trzy mieszanki. Wybierz automatyczne wstrzykiwanie 100 mikrolitrów utrwalonych komórek i użyj natężenia przepływu próbki 1,5 mikrolitra na sekundę.
Uruchom przykład, wybierając pozycję Pobierz dane. Parametry rozproszenia do przodu i rozproszenia bocznego dla tej próbki, a także detekcja fluoro four pojawią się teraz na ekranie. Teraz wybierz narzędzie do bramkowania oprogramowania.
Na podstawie wizualizacji wykresu punktowego rozproszenia do przodu i bocznego wykresu punktowego wstępnie zdefiniuj jednorodną i żywotną populację komórek przez bramkowanie. Wybierz tę opcję, aby przeanalizować 20 000 zdarzeń na próbkę. Oznacza to, że dla każdej próbki ostatecznie zostanie przeanalizowanych 20 000 komórek, które mieszczą się w predefiniowanych bramkach.
Zbieranie danych będzie kontynuowane do momentu osiągnięcia tej liczby zdarzeń. Rozpocznij przebieg, wybierając najpierw studnie do analizy. Następnie wybiera studnie biegowe.
Urządzenie do cytometrii przepływowej będzie teraz analizować te próbki jedna po drugiej, rejestrując średnią intensywność fluorescencji dla każdej próbki. Co odpowiada średniemu sygnałowi fluorescencyjnemu z 20 000 komórek, które mieszczą się w predefiniowanej bramce. Na koniec przeprowadź analizę danych zgodnie z opisem w protokole.
Po wstępnej inkubacji komórek jurkata z wysokimi stężeniami AMD3100, nieustalonym i swoistym antagonistą CXCR4. Średnia intensywność fluorescencji, która odzwierciedla wiązanie znakowanego CXCL12, jest prawie całkowicie zredukowana do poziomów tła. Pokazuje to wysoce specyficzne wiązanie CXCL12 z CXCR4 ulegające ekspresji na komórkach jurkata.
Związki, które nie są w stanie konkurować ze znakowanym CXCL12 w zakresie wiązania się z receptorem CXCR4, takie jak antagonista CCR5 Marawirok, nie będą miały wpływu na średnią intensywność fluorescencji. W przeciwieństwie do tego, wysoce aktywne związki zrobią to w sposób zależny od dawki. Po obejrzeniu filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać konkursowy test receptywnego wiązania przy użyciu żywych komórek i cytometrii przepływowej.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje oparty na cytometrii przepływowej test wiązania komórkowego, mający na celu identyfikację związków hamujących wiązanie CXCL12 do CXCR4. Metoda ta wykorzystuje żywe komórki do analizy wiązania receptorów, co pozwala uniknąć stosowania znaczników radioaktywnych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Analizy wiązania komórkowego
- Receptory sprzężone z białkiem G
- Odkrywanie leków
Wprowadzenie
- CXCL12 jest chemokiną, która wiąże się z CXCR4, receptorem sprzężonym z białkiem G.
- Identyfikacja inhibitorów tego wiązania może pomóc w opracowywaniu leków.
- Tradycyjne metody często wiążą się z wykorzystaniem radioaktywności, czego niniejszy test ma pozwolić uniknąć.
- Wykorzystanie żywych komórek zapewnia dokładniejszą reprezentację oddziaływań biologicznych.
Cel badania
- Opracowanie narzędzia przesiewowego do identyfikacji związków hamujących wiązanie CXCL12 z CXCR4.
- Wykazanie zalet stosowania żywych komórek w testach wiązania.
- Wsparcie działań w zakresie poszukiwania leków oddziałujących na receptory sprzężone z białkiem G.
Zastosowane metody
- Cytometria przepływowa do analizy wiązania komórkowego.
- Zastosowanie ligandów znakowanych fluorescencyjnie w celu oceny konkurencji w wiązaniu.
- Testy na żywych komórkach do oceny oddziaływań receptorowych.
- Unikanie znakowania radioaktywnego w schemacie doświadczalnym.
Główne wyniki
- Test pomyślnie identyfikuje związki hamujące wiązanie CXCL12.
- Analiza żywych komórek dostarcza bardziej istotnych danych w porównaniu z metodami tradycyjnymi.
- Metoda jest skuteczna w przesiewaniu potencjalnych kandydatów na leki.
- Wyniki potwierdzają możliwość zastosowania tego testu w procesie odkrywania leków.
Wnioski
- Test oparty na cytometrii przepływowej jest cennym narzędziem do identyfikacji inhibitorów CXCR4.
- Wykorzystanie żywych komórek zwiększa dokładność badań wiązania.
- Unikanie radioaktywności upraszcza proces eksperymentalny.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla sektora przemysłowego
Ten test wiązania konkurencyjnego oparty na cytometrii przepływowej umożliwia zespołom biofarmaceutycznym identyfikację małych cząsteczek zakłócających oddziaływania CXCL12-CXCR4, które są kluczowym celem w badaniach nad nowotworami i chorobami zapalnymi. Dzięki zastosowaniu żywych komórek i fluorescencyjnych ligandów metoda ta pozwala uniknąć wykorzystania radioaktywności, dostarczając jednocześnie fizjologicznie istotnych danych dotyczących wiązania. Wspiera ona wczesną walidację celu oraz identyfikację związków wiodących, dostarczając ilościowych i powtarzalnych wyników niezbędnych do priorytetyzacji związków.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez pomiar bezpośredniego wpływu związków na wiązanie receptor-ligand w natywnym kontekście komórkowym.
- Wartość operacyjna: Zapewnia funkcjonalny odczyt, który minimalizuje ryzyko związane z CXCR4 jako celem terapeutycznym poprzez mechanistyczne potwierdzenie aktywności związku.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez identyfikację związków o profilach hamowania zależnych od dawki, co wskazuje na zaangażowanie celu.
Przesiew i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie ilościowych danych dotyczących inhibicji wiązania poprzez pomiar średniej intensywności fluorescencji, co umożliwia analizę zależności struktura-aktywność.
- Wartość operacyjna: Możliwość adaptacji do formatu płytek 96-dołkowych, co zwiększa wydajność kampanii screeningowych przy zachowaniu spójności testu.
- Możliwość ponownego wykorzystania: Tworzy zstandardowaną platformę stosowalną w przypadku innych receptorów GPCR, o ile dostępne są ligandy fluorescencyjne, co ogranicza nakłady pracy na ponowne opracowanie metody.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wykorzystanie żywych komórek Jurkat w celu odzwierciedlenia fizjologicznej ekspresji receptorów i dynamiki wiązania, co zwiększa istotność translacyjną.
- Wartość operacyjna: Generowanie danych kompatybilnych z późniejszą oceną przedkliniczną poprzez potwierdzenie efektów związków specyficznych dla celu.
- Minimalizacja ryzyka: Redukcja wyników fałszywie dodatnich poprzez odróżnienie specyficznych inhibitorów CXCR4 od związków niespecyficznych (np. Maraviroc nie wykazuje efektu).
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w proces odkrywania leków, od walidacji celu po identyfikację wiodących cząsteczek, dostarczając danych o wiązaniu, które pomagają w procesie optymalizacji hit-to-lead. Uzupełnia ona przesiewy fenotypowe, nadając głębię mechanistyczną charakterystyce związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez ilościowe określanie stopnia zaburzenia wiązania CXCL12 z CXCR4 indukowanego przez związki w żywych komórkach.
- Screening: Umożliwia przygotowanie do analizy dzięki standaryzowanym etapom inkubacji, przemywania i fiksacji, które są kompatybilne z odczytami z cytometrii przepływowej.
- Analityka: Dostarcza średnią intensywność fluorescencji jako ilościowy wynik służący do porównywania mocy i skuteczności związków w różnych dawkach.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje linię komórkową istotną dla danej choroby (Jurkat) wykazującą ekspresję CXCR4, łącząc dane o wiązaniu z potencjalnym wpływem terapeutycznym w nowotworach i stanach zapalnych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako modułowa platforma wiązania, którą można przenieść na inne cele GPCR, co maksymalizuje zwrot z inwestycji (ROI) w rozwój testów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w zakresie oddziaływania na cel poprzez wykazanie swoistego, możliwego do zniesienia wiązania CXCL12 z CXCR4.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji obchodzenia się z komórkami, czasów inkubacji oraz protokołów bramkowania w cytometrii przepływowej.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez wczesne odfiltrowywanie związków pozbawionych swoistej aktywności wobec celu w procesie odkrywania.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia dostosowanie postępów do ryzyka poprzez identyfikację związków o wyraźnych profilach hamowania zależnego od dawki.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymagana jest biegłość w obsłudze cytometrii przepływowej, kompensacji oraz strategii bramkowania dla żywych populacji komórek.
- Metoda zależy od dostępu do cytometrów przepływowych zdolnych do wykrywania sygnałów fluorescencyjnych w odpowiednim kanale (np. FITC lub odpowiedniku).
- Konieczna jest standaryzacja przygotowania komórek, rozcieńczania związków oraz warunków inkubacji w obrębie serii przesiewowych.
- Adaptacja do innych GPCR wymaga opracowania lub pozyskania ligandów znakowanych fluorescencyjnie, specyficznych dla docelowego receptora.
- Ograniczenia praktyczne obejmują czas trwania analizy (~90 minut plus czas analizy) oraz konieczność optymalizacji stężenia ligandu w celu zapewnienia wysokiego stosunku sygnału do szumu.
