Name: Analiza składu ciała i metabolicznego umieszczania w klatkach u myszy karmionych wysokotłuszczowo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Poznaj metodę analizy składu ciała i monitorowania metabolicznego u myszy karmionych wysokotłuszczowo. Techniki te umożliwiają nieinwazyjne pomiary masy tłuszczowej i beztłuszczowej oraz wydatku energetycznego w żywych zwierzętach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy personelowi z zespołu Alfred Medical Research and Education Precinct Animal Services (AMREP AS) za pomoc i opiekę nad myszami wykorzystanymi w tym badaniu oraz za wsparcie programu Wsparcia Infrastruktury Operacyjnej rządu stanu Wiktoria.

Wszystkie opisane eksperymenty zostały zatwierdzone przez Komitet Etyki Zwierząt Alfred Medical Research Precinct (AMREP AEC), a myszom zapewniono humanitarną opiekę zgodnie z wytycznymi Narodowej Rady Zdrowia i Badań Medycznych (NHMRC) Australii dotyczącymi eksperymentów na zwierzętach. Zwierzętom podawano przepisaną dietę i wodę ad libitum i trzymano w środowisku o kontrolowanej temperaturze (~21 - 22 °C) z 12-godzinnym cyklem światła i 12-godzinnym cyklem ciemności. Siedmiotygodniowe samce myszy (na tle C57Bl/6J) były karmione albo zwykłą, normalną dietą (zawartość energii 14,3 MJ/kg, w tym 76% kJ z węglowodanów, 5% tłuszczu, 19% białka; patrz tabela materiałów) lub, w grupie żywionej wysokotłuszczowo, dietą wysokotłuszczową (HFD) (zawartość energii 19 MJ/kg, składająca się w 36% z węglowodanów, 43% tłuszczu, 21% białka, Pasze specjalistyczne) przez 3 tygodnie. Pomiary masy ciała i składu ciała za pomocą aparatu EchoMRI wykonywano co tydzień, natomiast analiza monitorowania metabolizmu odbywała się w CLAMS po 3 tygodniach diety.
1. Procedura analizatora składu ciała
Uwaga: Aby działać optymalnie, EchoMRI 4-w-1 używane w tym protokole powinno znajdować się w pomieszczeniu, w którym temperatura powietrza jest stabilna i nie ulega wahaniom. Idealnie byłoby, gdyby było to stale monitorowane. Jeśli to możliwe, należy również unikać przesuwania maszyny i przerw w zasilaniu. Jeśli zasilanie zostało przerwane i system musi zostać ponownie uruchomiony, odczekaj co najmniej 2-3 godziny, aż urządzenie się rozgrzeje przed ponownym użyciem. Przed rozpoczęciem upewnij się, że nosisz odpowiednie środki ochrony osobistej.
<ol>
	<li>Przed skanowaniem myszy wykonaj test systemu na analizatorze składu ciała. Polega to na użyciu wzorca kalibracyjnego (określanego jako próbka testowa systemu oleju rzepakowego (COSTS)) w celu przetestowania precyzji przyrządu i upewnienia się, że nie wystąpiły żadne odchylenia w jego dokładności.
	<ol>
		<li>Otwórz oprogramowanie systemowe, a następnie kliknij przycisk Test systemu na pasku narzędzi lub naciśnij jednocześnie "Alt + Y".</li>
		<li>Zanim test systemu zostanie przeprowadzony przez komputer, poczekaj na przypomnienie, aby sprawdzić, czy prawidłowe KOSZTY (w tym przypadku KOSZTY specyficzne dla myszy) zostały umieszczone w suwnicy systemu ( Rysunek 1). Po potwierdzeniu, że tak jest w istocie, zaakceptuj kontynuowanie testu, który zajmie kilka minut.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pomyślnym przejściu testu systemu kontynuuj skanowanie.
	<ol>
		<li>Jeśli test systemu zakończy się niepowodzeniem, powtórz test systemu.</li>
		<li>Jeśli maszyna nadal znajduje się poza zakresem (co wskazuje, że wystąpiło odchylenie), może być konieczna kalibracja w celu naprawienia sytuacji. Wykonaj to, postępując zgodnie z instrukcjami lub zgodnie z opisem w instrukcji obsługi dostarczonej w momencie zakupu. Jeśli problem będzie się powtarzał, sprawdź manual3 lub zgłoś problem zespołowi pomocy technicznej producenta i poproś o dalsze instrukcje.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść myszy w uchwycie na próbki małych zwierząt (długi cylinder), aby utrzymać je w środku podczas przebywania w maszynie. Aby to zrobić, umieść uchwyt poziomo, podnieś mysz i najpierw włóż ją do otworu głowicy cylindrów. Powoli i ostrożnie ustaw uchwyt w pozycji pionowej, tak aby mysz znajdowała się na dnie cylindra i była gotowa do analizy.</li>
	<li>Po umieszczeniu w uchwycie włóż ogranicznik, aby ograniczyć ruch myszy w okresie pomiaru. W niektórych okolicznościach, w przypadku wyjątkowo aktywnych myszy, może być konieczne przytrzymanie ogranicznika na miejscu opuszkiem palca. 
	UWAGA: Zapoznaj myszy z umieszczeniem w uchwytach na próbki przed ich wstępną analizą, aby zmniejszyć stres. Użycie uchwytu na próbki zwierząt w kolorze czerwonym może również zmniejszyć potencjalną reakcję na stres, ponieważ myszy czują, że są w ciemności.</li>
	<li>W oprogramowaniu wybierz folder (pasek narzędzi folderu), w którym chcesz zapisać dane i utwórz nazwę pliku.</li>
	<li>Jeśli to konieczne, zmniejsz ilość losowego szumu w pomiarach tkanki tłuszczowej i chudej, zwiększając liczbę pierwotnych nagromadzeń skanu. Po uruchomieniu oprogramowania podstawowe akumulacje są ustawiane na zalecaną wartość domyślną do ogólnego codziennego użytku; O ile nie ma konkretnego powodu do zmiany tych parametrów, ustawienia domyślne zapewnią użytkownikom niezbędny poziom precyzji.</li>
	<li>Jeśli nie jesteś zainteresowany uzyskaniem danych dotyczących wody wolnej i wody całkowitej, wyłącz etap wody, wybierając zakładkę, aby powiedzieć nie. Spowoduje to znaczne skrócenie czasu skanowania i poprawę przepustowości.</li>
	<li>Rozpocznij skanowanie, wybierając opcję "rozpocznij skanowanie" lub naciskając F5 na klawiaturze. Wprowadź wszystkie istotne dane o zwierzęciu (np. identyfikator zwierzęcia, masę ciała itp.) i naciśnij "ok" lub F5, aby rozpocząć skanowanie, które zajmie około 1 minuty.</li>
	<li>Po uzyskaniu danych wyjmij z maszyny uchwyt na zwierzę, w którym znajduje się mysz, i umieść zwierzę z powrotem w klatce. Po zeskanowaniu wszystkich zwierząt wyeksportuj dane do dalszej analizy i zestawienia.</li>
	<li>Przed i po użyciu należy dokładnie wyczyścić uchwyty na zwierzęta zgodnie z instrukcjami producenta. Ponieważ uchwyty te są wykonane z tworzywa akrylowego, należy unikać alkoholu izopropylowego i alkoholu etylowego, ponieważ mogą one powodować pękanie uchwytów i/lub szybkie niszczenie uchwytu, zwiększając w ten sposób prawdopodobieństwo pęknięcia. Zamiast tego użyj ciepłego roztworu wody do mycia naczyń lub, jeśli wymagany jest dodatkowy środek dezynfekujący, użyj F10 (w rozcieńczeniu 1:125) lub innego środka dezynfekującego lub czyszczącego w sprayu (patrz Tabela materiałów), a następnie wytrzyj.</li>
</ol>
2. Procedura Systemu Monitorowania Metabolizmu Zwierząt
UWAGA: System potrzebuje ~2 godzin na rozgrzanie i ustabilizowanie się. Jeśli maszyna została wyłączona, należy ją włączyć, aby umożliwić podgrzanie ogniwa cyrkonu do 725 °C. Zazwyczaj umieszczamy myszy w analizatorze składu ciała na dzień przed wejściem do systemu monitorowania zwierząt, aby uniknąć problemów ze stresem związanym z ograniczeniami.
<ol>
	<li>Upewnij się, że komputer podłączony do systemu monitorowania zwierząt jest włączony i otwórz program sterujący. Wybierz opcję "Oxymax Utility" z menu narzędzi, aby uruchomić pompy.</li>
	<li>Napełnij butelki z wodą odpowiednią wodą, zważ i sprawdź stan zdrowia myszy oraz zorganizuj jedzenie. Jeśli mierzysz spożycie pokarmu w systemie, rozważ sproszkowanie jedzenia. Napełnij pojemniki na żywność, naciskając sprężynową platformę i wsypując żywność do zasobnika. Upewnij się, że pojemnik na żywność i butelka na wodę są całkowicie wypełnione, aby upewnić się, że jest wystarczająco dużo jedzenia i wody, aby przetrwać wyznaczony czas eksperymentu.</li>
	<li>Sprawdź stan suszarki/środka osuszającego; jeśli używasz kolorowego wskaźnika, powinien być niebieski, a zatem suchy, ale jeśli jest różowy/fioletowy, oznacza to, że ma znaczną absorpcję wilgoci i należy go wymienić lub uzupełnić.</li>
	<li>Sprawdź stan syfonu amoniaku i wapna sodowanego i wymień w razie potrzeby. Jeśli pułapka amoniaku jest podłączona po dwie na raz, gdy druga pułapka wykazuje oznaki zmiany koloru, wymień pierwszą. Zwiększenie kompensacji emisji CO2 może również oznaczać konieczność wymiany wapna sodowanego. 
	UWAGA: Środek osuszający można wysuszyć w piekarniku i ponownie użyć, jednak postępujemy zgodnie z zaleceniami producenta systemu, aby za każdym razem używać go świeżego.</li>
	<li>Zmontuj komory. Aby to zrobić, umieść pojemnik na żywność na wadze, a następnie umieść komorę na górze z perforowaną platformą, która staje się podłogą komory. Ostrożnie umieść mysz w komorze i przymocuj pokrywę systemu za pomocą przednich i tylnych klipsów i zabezpiecz przed umieszczeniem butelki z wodą i zamocowaniem. Na wszelki wypadek ponownie sprawdź wszystkie pokrywy komór, myszy i wodę (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A-D). 
	UWAGA: W zależności od wielkości badanych myszy może być konieczne dostosowanie wysokości przestrzeni nad pojemnikiem na żywność, tak aby myszy miały dostęp do karmy, ale nie miały wystarczająco dużo miejsca, aby mogły spać bezpośrednio na karmniku.</li>
	<li>Ponieważ zaleca się kalibrację czujników gazu przed każdym eksperymentem, należy skalibrować system.
	<ol>
		<li>Użyć gazu o znanym składzie (0,5% CO2, 20,5% O2, azot równoważący). Podłącz zbiornik gazu kalibracyjnego do systemu za pomocą regulatora i węża. Włącz i upewnij się, że ciśnienie wyjściowe w zbiorniku wynosi 5 - 10 psi. 
		Uwaga: Niektóre systemy będą wyposażone w drugi zbiornik, wąż i reduktor do stosowania czystego azotu jako gazu "kompensacyjnego". System, który obsługujemy, wykorzystuje wapno sodowane do wytwarzania powietrza wolnego od CO2 .</li>
		<li>Postępuj zgodnie z procedurami, aby skalibrować zarówno czujnikiO2, jak iCO2. Wybierz "kalibracja" z menu narzędzi i sekwencyjnie skalibruj zarównoO2, jak i CO2. Przed kalibracją upewnij się, że 1) sample i przepływy odniesienia wynoszą 0,400 l/min, 2) temperatura czujnika tlenku cyrkonu O2 wynosi 725 °C (± 1 °C), 3) pompa próbki i osuszacza referencyjnego oraz powietrza są włączone oraz 4) gaz kalibracyjny jest podłączony i włączony.</li>
		<li>W razie potrzeby podczas kalibracji czujnikaO2 nieznacznie wyreguluj regulator przesunięcia z przodu czujnika tlenu cyrkonowego, aby uzyskać wartość współczynnikaO2 1,0000 (± 0,0002). Ma to na celu upewnienie się, że mieści się w akceptowalnych granicach (podświetlonych zieloną czcionką na wyświetlaczu oprogramowania na ekranie komputera).</li>
		<li>Po pomyślnej kalibracji czujnikaO2 i CO2 wyłącz butlę z gazem kalibracyjnym i odłącz wąż od reduktora. Po kalibracjiO2 dla powietrza odniesienia (atmosferycznego) powinno wynosić 20.92 (± 00.02). Jeśli kalibracja wykracza poza tolerancję, powtórz tę czynność i zapoznaj się z przewodnikami rozwiązywania problemów producenta. W przeciwnym razie skontaktuj się z producentem w celu uzyskania dalszych instrukcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj konfigurację eksperymentalną. Wybierz "otwórz plik eksperymentalny" z menu eksperymentu. Wybierz odpowiedni szablon (np. mysz). W sekcji "ustawienia" w menu eksperymentu zdefiniuj parametry eksperymentu, które powinny być rejestrowane (np. identyfikator myszy, waga, grupa itp.) Usuń zaznaczenie wszystkich komór, które nie są używane, i wybierz lokalizację, w której eksperyment ma zostać zapisany.</li>
	<li>Upewnij się, że waga została wytarowana podczas pomiaru spożycia pokarmu i rozpocznij przechwytywanie danych, wybierając "uruchom" w menu eksperymentu. Dane są zbierane przez różny okres czasu w zależności od fenotypu, wytycznych instytucjonalnych dotyczących izolacji zwierząt i wykorzystania systemu. 
	UWAGA: W naszych rękach eksperyment jest rutynowo prowadzony przez 48 godzin, przy czym pierwsze 24 godziny służą na aklimatyzację do nowego środowiska, a drugie 24 godziny na analizę danych. Okres zbierania danych zależy od tego, jak długo badacz chce trzymać swoje myszy w pojedynczym pomieszczeniu i zależy to od zgody etycznej zwierząt. Alternatywnie, jeśli istnieją odpowiednie przepisy, myszy mogą zostać zaaklimatyzowane w komorach przed umieszczeniem w systemie i podłączeniem. Każda komora jest mierzona mniej więcej raz na 13 minut, gdy używany jest system 12-komorowy.</li>
	<li>Regularnie sprawdzaj i monitoruj wyniki uzyskane w czasie, gdy myszy są w systemie, aby zapewnić dobrostan zwierząt i czy gromadzone są odpowiednie dane. Na tym etapie może być możliwe zidentyfikowanie i naprawienie każdego problemu. Sprawdzaj każdą mysz codziennie rano i wieczorem, kiedy są w systemie.</li>
	<li>Sprawdź zakładkę metaboliczną u góry strony pliku danych, aby uzyskać dane zebrane w czasie rzeczywistym dla każdej myszy w odniesieniu do zużycia tlenu, RER i wydatku energetycznego. Tymczasem przerwy w wiązce i dane dotyczące zużycia żywności mogą znajdować się odpowiednio w zakładkach Aktywność i Karmienie. Sprawdź, czy "O2 In" odczytuje około 20,90 - 20,94, "CO2 In" wynosi około 0,040 - 0,050, RER wynosi od 0,7 do 1, a natężenie przepływu jest stałe i wynosi 0,5 - 0,6 l/min.</li>
	<li>W regularnych odstępach czasu sprawdzaj, czy myszy mają dostęp do jedzenia i wody oraz czy spożywają każdy z nich. Upewnij się, że nie wykazują żadnych oznak niepokoju, takich jak kopanie perforowanej podłogi. Monitoruj również wyświetlane wyniki.</li>
	<li>Po zakończeniu przydzielonego czasu eksperymentu wybierz opcję "zatrzymaj" z menu eksperymentu i wyeksportuj wyniki (jako pliki CSV, Plik>Eksport>Generuj CSV tematu) do analizy.</li>
	<li>Sprawdź stan zdrowia myszy, zważ je, a następnie wróć do ich domowych klatek.
	<ol>
		<li>Myszy mogą być wrogo nastawione do siebie po separacji, więc monitoruj, kiedy zostaną ponownie trzymane razem.</li>
		<li>Zdemontuj klatki, usuń nadmiar jedzenia z lejów i wylej kał, mocz i jedzenie z klatek. Zanurz butelki i łyki w rozcieńczonym roztworze T-bac, namocz i wyczyść pozostałe składniki w rozcieńczonym roztworze wybielacza. Spłucz czystą wodą i pozostaw do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Oblicz parametry metaboliczne za pomocą oprogramowania. Oprogramowanie wykorzystuje szereg równań, aby zapewnić końcowe dane wyjściowe4. 
	Do obliczania zużycia tlenu i produkcji dwutlenku węgla: Zużycie tlenu: VO2 (LPM) = ViO2i - VoO2o; Produkcja dwutlenku węgla: VCO2 (LPM)=VoCO2o-V iCO2i 
	gdzie: Vi = współczynnik wentylacji wejściowej (LPM), Vo = stopień wentylacji wyjściowej (LPM), O2i = stężenie O2 na wejściu, O2o = stężenie O2 na wyjściu, CO2i = stężenie CO2 na wejściu, CO2o = stężenie CO2 na wyjściu. 
	Do obliczania RER: RER = VCO2 / VO2. Należy zauważyć, że utlenianie białek nie zostało zmierzone i dlatego RER nie został skorygowany o to. 
	Do obliczania wydatku energetycznego: Wydatek energetyczny: CV = 3,815 + 1,232* RER 
	Ciepło (Kcal/h)) = CV * VO2. gdzie: CV jest wartością opałową (zależność między ciepłem a wielkością zużycia tlenu). Wywodzi się to z "Elementów nauki o żywieniu" określanych jako Tablica Lusk, składającej się z Grahama Luska.</li>
</ol>

<ol><li>Chen, W., Wilson, J. L., Khaksari, M., Cowley, M. A., Enriori, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abdominal+fat+analyzed+by+DEXA+scan+reflects+visceral+body+fat+and+improves+the+phenotype+description+and+the+assessment+of+metabolic+risk+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Abdominal fat analyzed by DEXA scan reflects visceral body fat and improves the phenotype description and the assessment of metabolic risk in mice.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 303 (5), E635-E643 (2012).</li>
<li>Kovner, I., Taicher, G. Z., Mitchell, A. D. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21152249">Calibration and validation of EchoMRI whole body composition analysis based on chemical analysis of piglets, in comparison with the same for DXA.</a> Int J Body Compos Res. 8 (1), 17-29 (2010).</li>
<li>EchoMRI. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Software+User+Manual%3A+Whole+body+composition+analyzer%22">Software User Manual: Whole body composition analyzer</a>. , (2016).</li>
<li>Columbus Instruments. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Oxymax+for+Windows+User+Manual%22">Oxymax for Windows User Manual</a>. , September (2014).</li>
<li>Tschop, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+analysis+of+mouse+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to analysis of mouse energy metabolism.</a> Nat Methods. 9 (1), 57-63 (2011).</li>
<li>Speakman, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+energy+metabolism+in+the+mouse+-+theoretical%2C+practical%2C+and+analytical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Measuring energy metabolism in the mouse - theoretical, practical, and analytical considerations.</a> Front Physiol. 4, (2013).</li>
<li>Swoap, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vagal+tone+dominates+autonomic+control+of+mouse+heart+rate+at+thermoneutrality%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Vagal tone dominates autonomic control of mouse heart rate at thermoneutrality.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 294 (4), H1581-H1588 (2008).</li>
<li>Tian, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoneutral+housing+accelerates+metabolic+inflammation+to+potentiate+atherosclerosis+but+not+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Thermoneutral housing accelerates metabolic inflammation to potentiate atherosclerosis but not insulin resistance.</a> Cell Metab. 23 (1), 165-178 (2016).</li>
<li>Giles, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermoneutral+housing+exacerbates+nonalcoholic+fatty+liver+disease+in+mice+and+allows+for+sex-independent+disease+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Thermoneutral housing exacerbates nonalcoholic fatty liver disease in mice and allows for sex-independent disease modeling.</a> Nat Med. 23 (7), 829-838 (2017).</li>
<li>Lee, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+type+2+innate+lymphoid+cells+regulate+beige+fat+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Activated type 2 innate lymphoid cells regulate beige fat biogenesis.</a> Cell. 160 (1-2), 74-87 (2015).</li>
<li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MitoNEET-driven+alterations+in+adipocyte+mitochondrial+activity+reveal+a+crucial+adaptive+process+that+preserves+insulin+sensitivity+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">MitoNEET-driven alterations in adipocyte mitochondrial activity reveal a crucial adaptive process that preserves insulin sensitivity in obesity.</a> Nat Med. 18 (10), 1539-1549 (2012).</li>
<li>Judex, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+adiposity+in+small+rodents+using+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Quantification of adiposity in small rodents using micro-CT.</a> Methods. 50 (1), 14-19 (2010).</li>
<li>Chaurasia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+ceramides+regulate+subcutaneous+adipose+browning%2C+inflammation%2C+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipocyte ceramides regulate subcutaneous adipose browning, inflammation, and metabolism.</a> Cell Metab. 24 (6), 820-834 (2016).</li>
<li>Matthews, V. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6-deficient+mice+develop+hepatic+inflammation+and+systemic+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6-deficient mice develop hepatic inflammation and systemic insulin resistance.</a> Diabetologia. 53 (11), 2431-2441 (2010).</li>
<li>Tschop, M., Smiley, D. L., Heiman, M. L. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11057670">Ghrelin induces adiposity in rodents.</a> Nature. 407 (6806), 908-913 (2000).</li>
<li>Garcia, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature-onset+obesity+in+interleukin-1+receptor+I+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Mature-onset obesity in interleukin-1 receptor I knockout mice.</a> Diabetes. 55 (5), 1205-1213 (2006).</li>
<li>Kowalski, G. M., Bruce, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+glucose+metabolism%3A+Implications+and+considerations+for+the+assessment+of+glucose+homeostasis+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">The regulation of glucose metabolism: Implications and considerations for the assessment of glucose homeostasis in rodents.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (10), E859-E871 (2014).</li>
<li>McGuinness, O. P., Ayala, J. E., Laughlin, M. R., Wasserman, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIH+experiment+in+centralized+mouse+phenotyping%3A+the+Vanderbilt+experience+and+recommendations+for+evaluating+glucose+homeostasis+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">NIH experiment in centralized mouse phenotyping: the Vanderbilt experience and recommendations for evaluating glucose homeostasis in the mouse.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 297 (4), E849-E855 (2009).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Kroki krytyczne 
Opisane w niniejszym dokumencie protokoły stanowią przykład sposobów pomiaru składu ciała i różnych parametrów metabolicznych u myszy za pomocą analizatora składu ciała i systemu monitorowania metabolizmu zwierząt. W przypadku obu technik niezwykle ważne jest zapewnienie, że maszyny działają optymalnie, a w tym celu konieczne jest, aby badacz przeprowadził test systemu analizatora składu ciała i skalibrował go do znanego składu gazowego dla systemu monitorowan...

Metabolizm leży u podstaw wielu aspektów normalnej fizjologii komórek, organów i całego ciała. W związku z tym, w przypadku różnych patologii, zmiany w metabolizmie mogą bezpośrednio przyczyniać się do stanu podstawowego lub mogą mieć negatywny wpływ jako efekt uboczny patologii. Tradycyjnie, badania metaboliczne i badania nad bilansem energetycznym koncentrowały się na dziedzinie otyłości i powiązanych schorzeń, takich jak insulinooporność, stan przedcukrzycowy, nietolerancja glukozy, choroby układu krążenia i cukrzyca. Badania te są uzasadnione, biorąc pod uwagę rosnące rozpowszechnienie takich schorzeń na całym świecie oraz indywidualne, społeczne i ekonomiczne koszty, jakie powodują te warunki. W związku z tym opracowywanie strategii zapobiegawczych i nowych terapii ukierunkowanych na otyłość jest stałym celem w laboratoriach badawczych na całym świecie, a przedkliniczne modele myszy są w dużym stopniu wykorzystywane w tych badaniach.
Podczas gdy ważenie myszy dostarcza wiarygodnej oceny przyrostu lub utraty wagi, nie dostarcza podziału na różne składniki składające się na skład całego ciała (masa tłuszczowa, beztłuszczowa masa, wolna woda, a także inne składniki, takie jak sierść i pazury). Ważenie poduszeczek tłuszczowych po zakończeniu badań po śmierci myszy zapewnia dokładny pomiar różnych magazynów tłuszczu, ale może dostarczyć danych tylko dla jednego punktu czasowego. W związku z tym często konieczna jest rekrutacja wielu kohort w celu zbadania rozwoju otyłości w czasie, co znacznie zwiększa liczbę zwierząt, czas i koszty. Zastosowanie absorpcjometrii promieniowania rentgenowskiego o podwójnej energii (DEXA) zapewnia podejście do oceny zawartości tkanki tłuszczowej i beztłuszczowej tkanki oraz pozwala badaczowi uzyskać dane w sposób podłużny. Jednak procedura wymaga znieczulenia myszy1, a powtarzające się ataki znieczulenia mogą wpływać na gromadzenie się tkanki tłuszczowej lub wpływać na inne aspekty regulacji metabolicznej. EchoMRI wykorzystuje relaksometrię magnetycznego rezonansu jądrowego do pomiaru tkanki tłuszczowej i beztłuszczowej masy, wolnej wody i całkowitej zawartości wody. Jest to możliwe do osiągnięcia dzięki stworzeniu kontrastu między różnymi składnikami tkanki, przy czym różnice w czasie trwania, amplitudzie i rozkładzie przestrzennym generowanych częstotliwości radiowych umożliwiają określenie i kwantyfikację każdego typu tkanki. Ta technika jest korzystna, ponieważ jest nieinwazyjna, szybka, prosta, nie wymaga znieczulenia ani promieniowania i, co ważne, została pozytywnie zweryfikowana w analizie chemicznej2.
Kluczowym aspektem otyłości i pokrewnych badań jest równanie bilansu energetycznego. Chociaż akumulacja tłuszczu jest bardziej skomplikowana niż czysta energia wliczana (spożycie pokarmu) w porównaniu z energią na zewnątrz (wydatek energetyczny), są to niezbędne czynniki, które można zmierzyć. Dzienny wydatek energetyczny to suma czterech różnych składników: (1) podstawowy wydatek energetyczny (spoczynkowa przemiana materii); 2) wydatek energetyczny spowodowany efektem termicznym spożycia żywności; (3) energia potrzebna do termoregulacji; oraz (4) energia wydatkowana na aktywność fizyczną. Ponieważ wydatek energetyczny generuje ciepło, pomiar produkcji ciepła przez zwierzę (znany jako kalorymetria bezpośrednia) może być wykorzystany do oceny wydatku energetycznego. Alternatywnie, pomiar wdychanych i wydychanych stężeńO2 i CO2 , pozwalający na określenie zużycia O2 w całym ciele i produkcji CO2 , może być wykorzystany jako sposób pośredniego pomiaru (kalorymetria pośrednia) produkcji ciepła, a w konsekwencji obliczenia wydatku energetycznego. Wzrost spożycia pokarmu lub spadek wydatku energetycznego będzie predysponował myszy do przybierania na wadze, a obserwacje zmian tych parametrów mogą dostarczyć użytecznych informacji na temat prawdopodobnych mechanizmów działania w poszczególnych modelach otyłości. Powiązanym parametrem metabolicznym, który jest przedmiotem zainteresowania, jest współczynnik wymiany oddechowej (RER), wskaźnik proporcji substratu/paliwa (tj. węglowodanów lub tłuszczu), który jest poddawany metabolizmowi i wykorzystywany do produkcji energii. W związku z tym pomiar spożycia pokarmu (zużytej energii) w połączeniu z poziomem aktywności fizycznej, spożyciemO2, RER i wydatkiem energetycznym może zapewnić szerokie zrozumienie profilu metabolicznego organizmu. Jedną z metod gromadzenia takich danych jest wykorzystanie kompleksowego systemu monitorowania zwierząt laboratoryjnych (CLAMS), który opiera się na metodzie kalorymetrii pośredniej do pomiaru wydatku energetycznego i ma dodatkowe możliwości określania poziomu aktywności fizycznej (przerwania wiązki) i spożycia pokarmu za pomocą wag wbudowanych w komorę pomiarową.
W tym protokole podajemy prosty opis użycia analizatora składu ciała do oceny składu ciała u myszy oraz systemu monitorowania metabolizmu zwierząt do pomiaru aspektów metabolizmu. Omówione zostaną rozważania i ograniczenia dotyczące tych technik, a także sugerowane metody analizy, interpretacji i reprezentacji danych.

<table><tbody><tr><td>System 4 w 1</td><td>System EchoMRI</td><td>System 4 w 1</td><td>Analizator składu całego ciała Próbka</td></tr><tr><td>testowa oleju rzepakowego (KOSZTY)</td><td>EchoMRI</td><td>Specyficzny dla myszy (skontaktuj się z firmą w celu uzyskania numeru kota)</td><td></td></tr><tr><td>Uchwyt na próbki zwierząt&nbsp;</td><td>Ogranicznik EchoMRI</td><td>103-E56100R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>12-komorowy <td>system EchoMRI</td><td>600-E56100D</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Columbus Instruments</td><td>Specjalnie zbudowany</td><td>system klatek metabolicznych; zawiera program sterujący</td></tr><tr><td>Drierite</td><td>Fisher Scientific</td><td>238988</td><td>materiały eksploatacyjne CLAMS</td></tr><tr><td>Zbiornik gazu kalibracyjnego</td><td>Air Liquide</td><td>Mieszany na zamówienie</td><td>Kalibracja gazu (0,5% CO2, 20,5% O2, azot równoważący).& nbsp;</td></tr><tr><td>Karma normalna Karma</td><td>specjalistyczna</td><td>Napromieniowana dieta</td><td></td>myszy i szczurów</tr><tr><td>Dieta wysokotłuszczowa</td><td>Pasze specjalistyczne</td><td>SF04-001</td><td></td></tr><tr><td>Waga</td><td>Mettler Toledo</td><td>PL202-S</td><td>Waga do ważenia myszy</td></tr><tr><td>TexQ Spray dezynfekujący</td><td>TexWipe</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Roztwór czyszczący z nadtlenkiem wodoru</td><td>TexWipe</td><td>TX684</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza składu ciała i metabolicznego umieszczania w klatkach u myszy karmionych wysokotłuszczowo

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Zmiany w składzie ciała (tłuszcz lub beztłuszczowa masa), parametry metaboliczne, takie jak zużycie tlenu w całym ciele, wydatek energetyczny i wykorzystanie substratu, a także zachowania, takie jak przyjmowanie pokarmu i aktywność fizyczna, mogą dostarczyć ważnych informacji na temat mechanizmów leżących u podstaw choroby. Biorąc pod uwagę znaczenie składu ciała i metabolizmu dla rozwoju otyłości i jej późniejszych następstw, konieczne jest dokonanie dokładnych pomiarów tych parametrów w warunkach badań przedklinicznych. Postęp technologiczny w ciągu ostatnich kilku dekad umożliwił wyprowadzenie tych środków w modelach gryzoni w sposób nieinwazyjny i podłużny. W związku z tym te miary metaboliczne okazały się przydatne przy ocenie reakcji na manipulacje genetyczne (na przykład myszy nokautujące lub transgeniczne, nokaut wirusowy lub nadekspresja genów), eksperymentalne badania przesiewowe leków/związków oraz interwencje dietetyczne, behawioralne lub związane z aktywnością fizyczną. W niniejszym artykule opisujemy protokoły stosowane do pomiaru składu ciała i parametrów metabolicznych za pomocą systemu monitorowania zwierząt u myszy karmionych karmą i wysokotłuszczowych.

Wyniki przedstawione na Rysunku 3 obrazują typową zmianę parametrów składu ciała po podaniu diety wysokotłuszczowej, zmierzoną za pomocą EchoMRI. W punkcie wyjściowym nie odnotowano różnic w żadnym z mierzonych parametrów (Rysunek 3A-F). Jednak już po 1 tygodniu żywienia dietą wysokotłuszczową w grupie HFD nastąpił istotny wzrost masy ciała, masy tłuszczowej oraz procentowej zawartości tkanki tłuszczowej (<strong...

Ten protokół opisuje użycie analizatora składu ciała i systemu monitorowania metabolizmu zwierząt do charakteryzowania składu ciała i parametrów metabolicznych u myszy. Jako przykład zastosowania tych technik podaje się model otyłości wywołanej przez żywienie wysokotłuszczowe.

Analiza składu ciała i metabolicznego umieszczania w klatkach u myszy karmionych wysokotłuszczowo

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Celem tej procedury jest zebranie od myszy pomiarów składu ciała i metabolizmu, takich jak procentowa zawartość tłuszczu i beztłuszczowej masy ciała oraz wydatek energetyczny. Te metody mogą pomóc odpowiedzieć na ważne pytania dotyczące metabolizmu myszy, takie jak: jak grube są moje myszy? I dlaczego moje myszy są takie grube?Główną zaletą tych technik jest to, że można je wykonać u żywych, świadomych myszy, a zatem można je wielokrotnie powtarzać w trakcie badania. Przed skanowaniem myszy wykonaj test systemu na analizatorze składu ciała, gdy urządzenie rozgrzeje się przez kilka godzin. Skorzystaj ze standardów zwanych próbką testową systemu oleju rzepakowego lub KOSZTY.Otwórz oprogramowanie systemowe, a następnie kliknij przycisk Test systemu na pasku narzędzi lub naciskając Alt+Y na klawiaturze. Przed rozpoczęciem testu należy umieścić odpowiedni standard w suwnicy systemu. Następnie uruchom test diagnostyczny, postępując zgodnie z instrukcjami systemu, jeśli to konieczne.Po pozytywnym przejściu testu systemu przystąp do diagnozy myszy. Teraz umieść mysz w uchwycie. Czerwony, nieprzezroczysty uchwyt jest najmniej stresujący.Ustaw uchwyt pod kątem 45 stopni i włóż mysz. Następni

body-composition-and-metabolic-caging-analysis-in-high-fat-fed-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Analiza zawartości tłuszczu jest rutynowo przeprowadzana w badaniach z wykorzystaniem mysich modeli otyłości. Nowoczesne metody obrazowania i analizy tomografii komputerowej (CT) małych zwierząt umożliwiają szczegółową, podłużną analizę zawartości tłuszczu. W niniejszej pracy szczegółowo opisujemy procedury krok po kroku dotyczące wykonywania obrazowania CT, analizy oraz wizualizacji u małych zwierząt.

Segmentacja i pomiar objętości tkanki tłuszczowej w mysich modelach otyłości z wykorzystaniem komputerowej tomografii rentgenowskiej

Prezentujemy solidne metody biochemiczne i mikroskopowe do badania zapasów lipidów Caenorhabditis elegans. Szybka, prosta procedura barwienia utrwalającego do fluorescencyjnego obrazowania kropelek lipidów wykorzystuje właściwości spektralne lipofilowego barwnika czerwieni nilowej. Następnie przedstawiono pomiar biochemiczny triglicerydów i fosfolipidów z wykorzystaniem ekstrakcji do fazy stałej i chromatografii gazowej ze spektrometrią mas.

Biochemiczna i wysokoprzepustowa ocena mikroskopowa masy tłuszczowej w Caenorhabditis elegans

Tutaj opisane są zoptymalizowane metody generowania in vivo i in vitro modeli stłuszczenia wątroby oraz analizy fenotypów stłuszczeniowych i związanych z nimi parametrów fizjologicznych.

Zoptymalizowana analiza stłuszczenia wątroby in vivo i in vitro

Obecny artykuł opisuje szczegółowy protokół przerywanego postu izokalorycznego 2:1 w celu ochrony i leczenia przed otyłością i upośledzonym metabolizmem glukozy u myszy typu dzikiego i ob/ob.

Ocena skutków metabolicznych izokalorycznego postu przerywanego 2:1 u myszy

Ten protokół opisuje użycie bardzo smacznej diety stołówkowej w stylu zachodnim do modelowania przejadania się i otyłości u gryzoni. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy zarys selekcji, przygotowania i pomiaru żywności oraz wyjaśniamy czynniki metodologiczne, które pomagają w generowaniu solidnego i powtarzalnego fenotypu.

Smaczna dieta stołówkowa w stylu zachodnim jako niezawodna metoda modelowania otyłości wywołanej dietą u gryzoni

Ten artykuł zawiera trzy łatwe i łatwo dostępne testy do oceny metabolizmu lipidów u myszy.

Ocena zdolności całego organizmu do obsługi lipidów u myszy

Ten manuskrypt opisuje protokół do pomiaru podstawowej przemiany materii i zdolności oksydacyjnej termogenicznych adipocytów u otyłych myszy.

Określanie podstawowego wydatku energetycznego i zdolności adipocytów termogenicznych do wydatkowania energii u otyłych myszy

Model myszy choroby wątroby związanej z zaburzeniami metabolicznymi (MASLD) z zaburzeniami metabolicznymi, zmianami ekspresji genów wątroby oraz zmianami histologicznymi przypominającymi ludzkie MASLD, w tym zwłóknieniem przechodzącym do zaawansowanego stadium 3. Model ten może być wykorzystywany w badaniach patofizjologii MASLD oraz w przedklinicznych badaniach nowych terapii.

Model myszy dotyczący zaburzenia metabolicznego związane ze steatotyczną chorobą wątroby z włóknieniem

Za pomocą modelu eksplantacji ex vivo, małe fragmenty części rostralnej tkanki tłuszczowej białej trzewnej od szczupłych myszy są hodowane przez 7–10 dni, co umożliwia indukcję i badanie zapalenia tkanki tłuszczowej, jak to ma miejsce podczas karmienia dietą wysokotłuszczową.

Ex vivo model myszy na zapaleniu tkanki tłuszczowej podobnym do diety wysoko tłuszczowej

Niniejszy film przedstawia skuteczną technikę różnicowania i preparowania poszczególnych półprzezroczystych struktur ciała szklistego ludzkiego oka w materiale pośmiertnym.

Disekcja elementów ludzkiego ciała szklistego do analizy proteomicznej

Poznaj metodę analizy składu ciała i monitorowania metabolicznego u myszy karmionych wysokotłuszczowo. Techniki te umożliwiają nieinwazyjne pomiary masy tłuszczowej i beztłuszczowej oraz wydatku energetycznego w żywych zwierzętach.

Analiza składu ciała i metabolicznego umieszczania w klatkach u myszy karmionych wysokotłuszczowo

Przeglądaj więcej filmów