Name: Hepatektomia zrazikowa częściowa: chirurgiczny model morfologicznej regeneracji wątroby (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-31T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 37 s
Description: Poznaj technikę częściowej hepatektomii zrazikowej u myszy noworodków do badania regeneracji wątroby i biologii komórek macierzystych. Ta metoda jest mało inwazyjna i pozwala na precyzyjne badanie odpowiedzi na uszkodzenie narządu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy P. Chu za przeprowadzenie H&E i histologii; oraz C. Wang i A. McCarty za pomocne dyskusje. Badania były wspierane przez fundusze z Virginia and D. K. Ludwig Fund for Cancer Research; Narodowy Instytut Serca, Płuc i Krwi (R01HL058770 i U01HL099999); oraz granty Kalifornijskiego Instytutu Medycyny Regeneracyjnej (RC1 00354) dla I.W. Y.R. były wspierane przez Human Frontier Science Program Career Development Award (CDA00017), Niemiecką Fundację Badawczą (RI 2787/1), Siebel Stem Cell Institute oraz Fundację Thomasa i Stacey Siebel (1119368-104-GHBJI). J.M.T. był wspierany przez NIH (T32GM007365), National Research Service Award (1F30DK108561) oraz Paul and Daisy Soros Fellowship for New Americans.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi określonymi przez Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) oraz Panel Administracyjny Uniwersytetu Stanforda ds. Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (APLAC), (numer protokołu #10266) oraz w Stanach Zjednoczonych, czyli Europejską Ustawę o Dobrostanie Zwierząt, Dyrektywę 2010/63/UE. Protokół został zatwierdzony przez Komitet ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Rządu Bawarii w Niemczech i otrzymał pozwolenie nr: 55.2-1-54-2532-150-2015.
1. Przygotowanie zwierząt
<ol>
	<li>Przygotuj pustą klatkę z odpowiednią ściółką na poduszce grzewczej.</li>
	<li>Przed dotknięciem zwierząt w rękawiczkach wetrzyj pościel matki w rękawiczki.</li>
	<li>Usuń wszystkie szczenięta od matki i umieść je w pustej klatce. Usuń część ściółki matki i umieść ją w pustej klatce ze szczeniętami.</li>
	<li>Umieść matkę w oddzielnej, czystej, suchej klatce z dala od pola operacyjnego.</li>
	<li>Załóż nowe, czyste, sterylne rękawice przed przygotowaniem pola operacyjnego. </li>
</ol>
2. Przygotowanie pola operacyjnego
<ol>
	<li>Za pomocą pipety o pojemności 10 ml dodaj 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do 10-centymetrowej szalki Petriego.</li>
	<li>Odpipetować pipetą 2 ml betadyny lub równoważnego roztworu antyseptycznego na 10-centymetrowej szalce Petriego.</li>
	<li>Umieść lunetę sekcyjną na polu operacyjnym. Włącz lampę lunety sekcyjnej i dostosuj poziom światła do komfortu chirurga. Szczeniaka można umieścić w polu operacyjnym pod lampą prosektoryjną. Odpowiednie światło można potwierdzić przez brak cieni na brzusznej powierzchni młodego.</li>
	<li>Przygotować komorę anestezjoterapeutyczną z izofluranem (patrz Tabela Materiałów) ze stożkiem nosowym. Komorę należy oczyścić bez śladów moczu lub kału. Umieść stożek nosowy i związane z nim rurki pod lunetą sekcyjną w polu operacyjnym. Przekierować przepływ tlenu i izofluranu wyłącznie do stożka nosowego.</li>
	<li>Przygotować obszar rekonwalescencji pooperacyjnej za pomocą poduszki grzewczej ustawionej na około 37 °C. Rekonwalescencja pooperacyjna powinna składać się z 4 kawałków gazy umieszczonych na poduszce grzewczej. Jeśli to możliwe, wcieraj gaziki w pościel, kał i mocz matki, aby zachować zapach matki. 
	UWAGA: Nie zaleca się używania lampy grzewczej, ponieważ utrudnia to kontrolowanie temperatury. Podwyższone temperatury spowodują śmierć nowonarodzonych myszy.</li>
	<li>Przygotuj i wysterylizuj wszystkie narzędzia chirurgiczne w autoklawie. Potrzebne narzędzia to: nożyczki do mikropreparacji, kleszcze do mikropreparacji, gaza, hemostat i dowolny niewchłanialny szew monofilamentowy 6-0. Narzędzia chirurgiczne można sterylizować dowolnym sterylizatorem z kulkami szklanymi. </li>
</ol>
3. Częściowa hepatektomia zrazikowa
<ol>
	<li>Znieczul szczeniaka, umieszczając go w stożku nosowym na plecach i delikatnie przyklejając stopy i dłonie na miejscu. Szczenię powinno otrzymywać 5% izofluranu w tlenie.
	<ol>
		<li>Pozwól szczeniakowi siedzieć przez 5 minut lub do momentu, gdy zostanie odpowiednio znieczulony, co można zweryfikować za pomocą testu szczypania palców u nóg.</li>
		<li>Wstrzyknąć 5 mg/kg karprofenu podskórnie przed nacięciem. 
		UWAGA: Cały zabieg nie powinien trwać dłużej niż 30 minut. Gorsze wyniki można zaobserwować u noworodków, które są w znieczuleniu ogólnym przez ponad 30 minut. Podejmij środki ostrożności, aby zminimalizować czas trwania operacji poprzez dokładne przygotowanie terenu i zwilżenie skóry przed zamknięciem, aby zminimalizować rozdarcia skóry wywołane szwami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delikatnie oczyść tylną ścianę brzucha małym gazikiem zwilżonym betadyną. Pozostaw betadynę do wyschnięcia na 1 minutę.</li>
	<li>Wykonaj lewe nacięcie pośrodkowe obojczyka 0,5 cm bezpośrednio pod klatką piersiową za pomocą nożyczek do mikropreparowania i kleszczy. Delikatnie oddziel skórę za pomocą kleszczy i wykonaj drugie głębsze nacięcie w jamie otrzewnej (patrz rysunek 1C, po lewej i pośrodku)</li>
	<li>Delikatnie wywieraj boczny nacisk z obu stron brzucha za pomocą tylnych, końców nożyczek do mikropreparowania i kleszczy, aby wypchnąć wierzchołek lewego płata z jamy otrzewnej. Lewy wierzchołek lewego płata powinien być łatwo widoczny (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C, po prawej).</li>
	<li>Z wierzchołka amputuj i zważ ilość tkanki do usunięcia.
	<ol>
		<li>Za pomocą nożyczek do mikropreparacji delikatnie amputuj żądaną ilość tkanki z wierzchołka lewego płata.</li>
		<li>Umieść amputowaną tkankę w probówce o pojemności 1,5 ml wypełnionej PBS. Zważyć amputowaną tkankę za pomocą wagi analitycznej (patrz tabela materiałów). 
		UWAGA: Połóż kawałek gazy lub papieru na wadze i wytaruj go. Następnie umieść amputowaną tkankę na gazie lub papierze i zmierz jej masę.</li>
		<li>Utrwalić amputowany obszar w 2% paraformaldehydzie w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę i umieścić w związku o optymalnej temperaturze cięcia (OCT) na suchym lodzie w celu analizy zamrożonych sekcji. Analizuj zamrożone sekcje, wycinając odcinki o wielkości 7-10 μm za pomocą dowolnego standardowego kriostatu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą zwiniętego kawałka gazy delikatnie włóż lewy płat do jamy otrzewnej. Pozostaw gazę w jamie do momentu ustania krwawienia.</li>
	<li>Zdjąć gazę i zwilżyć pole operacyjne oraz okolice gazą nasączoną PBS.</li>
	<li>Zamknij pole operacyjne monofilamentowymi, niewchłanialnymi szwami 6-0 ze ściegiem biegowym. Otrzewną i skórę należy zamykać oddzielnie. 
	UWAGA: Delikatne zwilżenie skóry gazą nasączoną PBS może zminimalizować rozdarcia wywołane szwami.</li>
	<li>Delikatnie, ale dokładnie oczyść szczenię gazą nasączoną PBS i upewnij się, że nie ma pozostałości krwi ani betadyny. Zwiń nasączony gazik i delikatnie wyszoruj ślad rany, aby usunąć krew lub betadynę. 
	UWAGA: Jest to szczególnie ważne, ponieważ matka może kanibalizować młode, jeśli zostaną one nieodpowiednio oczyszczone.</li>
	<li>Usuń szczenię ze stożka nosowego i umieść je w obszarze odzyskiwania, który obejmuje gaziki wystawione na kał i mocz matki. Gdy szczenię wyzdrowieje, zastąp szczenię w pustej klatce ściółką matki. 
	UWAGA: Nie używaj lampy grzewczej. Użycie lampy grzewczej może spowodować przegrzanie noworodka.</li>
	<li>Powtórz procedurę na żądanej liczbie szczeniąt. Chociaż wszystkie szczenięta mogą być wykorzystane, ogólnie zaleca się pozostawienie kilku młodych, które nie są operowane, aby zostały zastąpione razem z operowanymi szczeniętami.</li>
	<li>Zastąp wszystkie szczenięta jednocześnie ściółką matki w klatce matki.</li>
</ol>
4. Odzyskiwanie i analiza
<ol>
	<li>Codziennie obserwuj myszy.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy rana pozostaje zamknięta i usuń wszelkie martwe szczenięta, jeśli są obecne.</li>
		<li>Jeśli rana otworzy się ponownie, przygotuj miejsce operacji i obszar rekonwalescencji zgodnie z wcześniejszym opisem i powtórz kroki od 3.8 do 3.12.</li>
		<li>Wstrzyknąć podskórnie 5 mg/kg karpofenu 24 i 48 godzin po zabiegu.</li>
		<li>Obserwuj szczenięta przez 56 dni lub dłużej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddać zwierzęta eutanazji po pożądanej liczbie dni po operacji poprzez narażenie na dwutlenek węgla (CO2) i zwichnięcie szyjki macicy.
	<ol>
		<li>Umieść myszy w komorze indukcyjnej / eutanazyjnej i włącz CO2 , aż myszy przestaną oddychać.</li>
		<li>Zapewnić eutanazję przez zwichnięcie szyjki macicy. Naciśnij grzbietową szyję myszy za pomocą palca wskazującego i kciuka, a drugą ręką pociągnij w dół za ogon.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń całą wątrobę en bloc i zważ ją.
	<ol>
		<li>Ostrożnie oddziel każdy płat i zważ osobno. 
		UWAGA: Usuń wątrobę, ostrożnie preparując przeponę oraz naczynia wątrobowe i wrotne. Oddziel płaty od siebie, ostrożnie preparując każdy płat w jego bliższym przyczepie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określ zakres regeneracji, porównując masę amputowanego lewego płata z masą całej wątroby. Nieuszkodzony lewy płat stanowi około 30% całej wątroby.</li>
</ol>

<ol><li>Michalopoulos, G. K., DeFrances, M. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2701258/">Liver Regeneration.</a> Science. 276 (80), 60-66 (1997).</li>
<li>Ponfick, V. A. Surgery of the Liver. Lancet. 1, 881(1890).</li>
<li>Higgins, G., Anderson, R. M. <a target="_blank" href="https://www.scienceopen.com/document?vid=57858414-5eff-4c8d-a028-ccb3fc1c44a6">Experimental Pathology of the liver. Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal.</a> Arch. Pathol. 12, 186-202 (1931).</li>
<li>Miyaoka, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypertrophy+and+unconventional+cell+division+of+hepatocytes+underlie+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Hypertrophy and unconventional cell division of hepatocytes underlie liver regeneration.</a> Curr. Biol. 22, 1166-1175 (2012).</li>
<li>Miyaoka, Y., Miyajima, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+divide+or+not+to+divide%3A+revisiting+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Div%22%5BJournal%5D)">To divide or not to divide: revisiting liver regeneration.</a> Cell Div. 8, 8(2013).</li>
<li>Tsai, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+hepatic+lobular+regeneration+by+central-vein-associated+lineage-restricted+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Localized hepatic lobular regeneration by central-vein-associated lineage-restricted progenitors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 114, 3654-3659 (2017).</li>
<li>Porrello, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+regenerative+potential+of+the+neonatal+mouse+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transient regenerative potential of the neonatal mouse heart.</a> Science. 331, 1078-1080 (2011).</li>
<li>Shyh-Chang, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lin28+enhances+tissue+repair+by+reprogramming+cellular+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Lin28 enhances tissue repair by reprogramming cellular metabolism.</a> Cell. 155, 778-792 (2013).</li>
<li>Yin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+tumor+necrosis+factor+alpha+in+alcohol-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Essential role of tumor necrosis factor alpha in alcohol-induced liver injury in mice.</a> Gastroenterology. 117, 942-952 (1999).</li>
<li>Gao, B., Bataller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+liver+disease%3A+pathogenesis+and+new+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Alcoholic liver disease: pathogenesis and new therapeutic targets.</a> Gastroenterology. 141, 1572-1585 (2011).</li>
<li>Uesugi, T., Froh, M., Arteel, G. E., Bradford, B. U., Thurman, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toll-like+receptor+4+is+involved+in+the+mechanism+of+early+alcohol-induced+liver+injury+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Toll-like receptor 4 is involved in the mechanism of early alcohol-induced liver injury in mice.</a> Hepatology. 34, 101-108 (2001).</li>
<li>Coen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+metabonomic+investigation+of+acetaminophen+toxicity+in+the+mouse+using+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Res.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">An integrated metabonomic investigation of acetaminophen toxicity in the mouse using NMR spectroscopy.</a> Chem. Res. Toxicol. 16, 295-303 (2003).</li>
<li>Oz, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+antioxidants+protect+against+acetaminophen+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biochem.+Mol.+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Diverse antioxidants protect against acetaminophen hepatotoxicity.</a> J. Biochem. Mol. Toxicol. 18, 361-368 (2004).</li>
<li>Ruepp, S. U., Tonge, R. P., Shaw, J., Wallis, N., Pognan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+proteomics+analysis+of+acetaminophen+toxicity+in+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Genomics and proteomics analysis of acetaminophen toxicity in mouse liver.</a> Toxicol. Sci. 65, 135-150 (2002).</li>
<li>Gunawan, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((c-Jun+N-terminal+kinase+plays+a+major+role+in+murine+acetaminophen+hepatotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">c-Jun N-terminal kinase plays a major role in murine acetaminophen hepatotoxicity.</a> Gastroenterology. 131, 165-178 (2006).</li>
<li>Manibusan, M. K., Odin, M., Eastmond, D. a <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postulated+carbon+tetrachloride+mode+of+action%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Environ.+Sci.+Health.+C.+Environ.+Carcinog.+Ecotoxicol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Postulated carbon tetrachloride mode of action: a review.</a> J. Environ. Sci. Health. C. Environ. Carcinog. Ecotoxicol. Rev. 25, 185-209 (2007).</li>
<li>Recknagel, R. O., Glende, E. a, Dolak, J. a, Waller, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+carbon+tetrachloride+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of carbon tetrachloride toxicity.</a> Pharmacol. Ther. 43, 139-154 (1989).</li>
<li>Sell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+and+plasticity+of+hepatocyte+lineage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity and plasticity of hepatocyte lineage cells.</a> Hepatology. 33, 738-750 (2001).</li>
<li>Malato, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+tracing+of+mature+hepatocytes+in+mouse+liver+homeostasis+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Fate tracing of mature hepatocytes in mouse liver homeostasis and regeneration.</a> J. Clin. Invest. 121, 4850-4860 (2011).</li>
<li>Greene, A. K., Puder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hepatectomy+in+the+mouse%3A+technique+and+perioperative+management%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Surg%22%5BJournal%5D)">Partial hepatectomy in the mouse: technique and perioperative management.</a> J. Invest. Surg. 16, 99-102 (2003).</li>
<li>Kan, N. G., Junghans, D., Belmonte, J. C. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compensatory+growth+mechanisms+regulated+by+BMP+and+FGF+signaling+mediate+liver+regeneration+in+zebrafish+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Compensatory growth mechanisms regulated by BMP and FGF signaling mediate liver regeneration in zebrafish after partial hepatectomy.</a> FASEB J. 23, 3516-3525 (2009).</li>
<li>Red-Horse, K., Ueno, H., Weissman, I. L., Krasnow, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+arteries+form+by+developmental+reprogramming+of+venous+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coronary arteries form by developmental reprogramming of venous cells.</a> Nature. 464, 549-553 (2010).</li>
<li>Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Global+Double-Fluorescent+Cre+Reporter+Mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">A Global Double-Fluorescent Cre Reporter Mouse.</a> Genesis. 605, 593-605 (2007).</li>
<li>Poley, W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.3758/BF03199187">Emotionality related to maternal cannibalism in BALB and C57BL mice.</a> Anim. Learn. Behav. 2, 241-244 (1974).</li>
<li>Smotherman, W. P., Bell, R. W., Starzec, J., Elias, J., Zachman, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+responses+to+infant+vocalizations+and+olfactory+cues+in+rats+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behav.+Biol%22%5BJournal%5D)">Maternal responses to infant vocalizations and olfactory cues in rats and mice.</a> Behav. Biol. 12, 55-66 (1974).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Ostre uszkodzenie wątroby było tradycyjnie badane przy użyciu modeli chemicznych (paracetamol, etanol, czterochlorek węgla) lub chirurgicznych (70% częściowa hepatektomia). Odpowiedź regeneracyjna po 70% częściowej hepatektomii została scharakteryzowana jako obejmująca globalny przerost hepatocytów i wiele rund podziału komórek 4,5. Aby jednak zatrzymać krwotok, model ten jest ograniczony, ponieważ główne naczynia muszą zostać podwiązane, pozostawiając nienormaln...

Uważano, że zdolność do regeneracji organu, czyli przywracania formy i funkcji, została w większości utracona w czasie ewolucji. Stwierdzono, że potencjał regeneracyjny wątroby dorosłego ssaka po ostrym urazie chemicznym lub fizycznym obejmuje mobilizację wszystkich pozostałych hepatocytów, co skutkuje falami przerostu i kilkoma rundami podziału komórek, co skutkuje funkcjonalnym, ale architektonicznie odmiennym narządem1,2,3,4,5. Ostatnio rozpoczęły się badania charakteryzujące regeneracyjną reakcję narządów noworodków ssaków na uraz w ciągu pierwszego tygodnia życia6,7,8. Badania te wykazały, że w przypadku uszkodzenia podczas rozwoju noworodka, niektóre narządy ssaków reagują regeneracją morfologiczną zamiast wzrostu kompensacyjnego lub zwłóknienia7,8.
Ostatnie badania wykazały, że regeneracja zarówno globalnej struktury, jak i funkcji zachodzi we wczesnym okresie noworodkowym6,7,8. Ustalone protokoły uszkodzenia wątroby obejmują uszkodzenie chemiczne lub podanie etanolu9,10,11, acetaminofen12,13,14,15, tetrachlorek węgla16,17,18,19, 70% częściowa hepatektomia4,20,21, czyli usunięcie lewego i środkowego płata. Podawanie chemiczne prowadzi do śmierci komórek hepatocytów, ale często pozostawia nienaruszone mikro- i makrostruktury. Regeneracja morfologiczna nie może być łatwo badana w tym kontekście, ponieważ ogólna architektura wątroby nie została zatarta. Hepatektomia częściowa w 70% polega na podwiązaniu szwem głównych naczyń, co jest konieczne do zatrzymania krwawienia, ale pozostawia niefizjologiczne środowisko z trwałym zaburzeniem naczyń krwionośnych. Co więcej, metoda ta była stosowana tylko na dorosłych gryzoniach, a jej zastosowanie u noworodków jest technicznie niezwykle trudne. Mając to na uwadze, opracowaliśmy metodę, w której 20-30% wierzchołka lewego płata jest usuwane u nowonarodzonej myszy P0 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-1B). Metoda ta jest chirurgicznie zachowawcza, mało inwazyjna, nie stanowi wyzwania technicznego i prowadzi do całkowitej utraty morfologii bez podwiązania naczyń krwionośnych, pozostawiając miejsce na regenerację. Powstały w ten sposób protokół krok po kroku, opisany poniżej, pozwala każdemu badaczowi na wykonanie częściowej hepatektomii zrazikowej na nowonarodzikowych myszach w celu zbadania regeneracji noworodków ssaków we wczesnych stadiach życia poporodowego. Metoda ta ma również wyraźne zastosowanie w badaniach porównawczych z zakresu medycyny regeneracyjnej i biologii komórek macierzystych, ponieważ może być stosowana w wątrobie na późniejszych etapach życia.
Najczęstsze badania nad ostrym uszkodzeniem wątroby to uszkodzenia wywołane chemicznie, amputacja wątroby u dorosłych lub 70% częściowa hepatektomia. Uszkodzenia chemiczne często obejmują dożylne, dootrzewnowe lub doustne podanie paracetamolu, czterochlorku węgla lub etanolu i są stosunkowo łatwym i nieinwazyjnym modelem urazu. Jak wspomniano wcześniej, uszkodzenie chemiczne powoduje śmierć komórek hepatocytów, ale często pozostawia nienaruszone struktury zrębu i miąższu, co utrudnia twierdzenie o regeneracji morfologicznej. Uszkodzenia chemiczne często koncentrują się na naczyniach wątrobowych, co sprawia, że jest to przydatna technika do badania uszkodzeń specyficznych dla miejsca i komórek, ale także utrudnia badanie, na poziomie całego narządu, innych populacji, które mogą znajdować się dalej od naczyń i które mogą przyczyniać się do regeneracji. Pomimo tych ograniczeń, uszkodzenia chemiczne nadal pozostają użytecznym i wysoce fizjologicznie istotnym modelem urazu.
Częściowa hepatektomia u dorosłych 70% polega na usunięciu lewego i środkowego płata po podwiązaniu naczyń krwionośnych wątroby. Reakcja na hepatektomię została dobrze scharakteryzowana: amputowana wątroba 14 dni po 70% częściowej hepatektomii rozwija znacznie inną architekturę niż pierwotny nieuszkodzony płat, ponieważ hepatocyty pozostałego prawego i ogoniastego płata ulegają przerostowi i kilku rundom podziału komórkowego4,5. Uzupełnia to utraconą masę i funkcję, ale nie regeneruje dwóch amputowanych płatów, a zatem nie zastępuje morfologii ogólnej. W rezultacie, reakcja na uraz po częściowej hepatektomii w 70% jest przydatna do badania kompensacyjnych mechanizmów wzrostu przy ograniczonej regeneracji.
Tutaj w pełni opisujemy protokół częściowej hepatektomii zrazikowej u noworodków. Procedura obejmuje odpowiednią selekcję i przygotowanie zwierząt, przygotowanie pola operacyjnego, operację i rekonwalescencję. Optymalizacja i adaptacja każdego z tych kroków może być wymagana dla różnych zastosowań protokołu.
Przeprowadziliśmy szeroko zakrojone prace i zoptymalizowaliśmy ten protokół na dzikich szczeniętach C57BL/6J (JAX 000664), jednak do badania różnych populacji komórek i mechanizmów regeneracji, użyliśmy również różnych transgenicznych zwierząt, w tym myszy posiadających różne transgeny Cre i CreERT2 i/lub knock-iny (Axin2CreERT2 JAX 018867 i Sox9CreERT2 JAX 018829) w połączeniu z reporterami fluorescencyjnymi, takimi jak systemy Rainbow i mTmG (R26VT2/GK3, R26mT/mG)22,23. Nie stwierdziliśmy potrzeby zmiany tej metodologii dla różnych szczepów myszy, ponieważ nie zaobserwowano żadnych różnic w wynikach przeżycia ani potencjale regeneracyjnym.
Oprócz używania różnych szczepów zwierzęcych, przeprowadziliśmy również częściową hepatektomię zrazikową na noworodkach myszy leczonych małymi cząsteczkami, takimi jak 4-hydroksy-tamoksyfen i 5-etynylo-2′-deoksyurydyna (EdU). Jako rozpuszczalniki stosowano dimetylosulfotlenek (DMSO) i etanol, ponieważ stwierdzono, że olej kukurydziany był istotną przyczyną zachorowalności. Poza tym stwierdziliśmy, że dootrzewnowe podawanie małych cząsteczek nie wpływało na przeżycie ani wyniki regeneracji. Przewidujemy, że protokół ten zostanie zaadaptowany do stosowania z innymi małymi cząsteczkami w celu zbadania różnych aspektów regeneracji.
Operacje na noworodkach na myszach mogą być technicznie trudne i mogą wymagać specjalistycznej wiedzy w zakresie obchodzenia się ze zwierzętami i mikroskopijnego preparowania. Wiedza specjalistyczna w zakresie hodowli zwierząt jest niezbędna, aby uniknąć kanibalizmu u matki po operacji i w okresie rekonwalescencji.

<table><tbody><tr><td>Zwierzęta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matka z miotem 0 nowonarodzonych szczeniąt dnia 0 (dowolny szczep)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matka zastępcza i miot zastępczy (opcjonalnie)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Standardowe odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosforanowa surowica buforowana (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prowidyna-jod lub równoważny roztwór</td><td></td><td></td><td></td> antyseptyczny</tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Sprzęt chirurgiczny</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td><td>Zeiss</td><td>ZEMSDV4L MFR # 435421-9901-000</td><td></td></tr><tr><td>Mikronożyczki sprężynowe proste 3 mm</td><td>Vannas</td><td>72932-01</td><td></td></tr><tr><td>5SF Kleszcze</td><td>Dumont</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Proste kleszcze Kelly</td><td>Grainger</td><td>17-050G</td><td></td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Sunbeam</td><td>000771-810-000</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs</td><td>0044-5260-05</td><td></td></tr><tr><td>System znieczulenia gryzoni</td><td>Kent Scientific</td><td>1205S</td><td></td></tr><tr><td>Gaza, 10,16 x 10,16 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Wyposażenie standardowe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówka do mikrowirówek</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Nici monokrylowe</td><td>Ethicon</td><td>MCP489G</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego</td><td>Fisher Scientific</td><td>S35839</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid, Gładki, 110V</td><td>Drummond</td><td>4-000-110</td><td></td></tr><tr><td>Wagi analityczne Mettler Toledo NewClassic ME</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-912-402</td><td></td></tr><tr><td>Niska komora indukcyjna</td><td>Kent Scientific</td><td>SOMNO-0730</td><td></td></tr></tbody></table>

hepatektomia zrazikowa częściowa: chirurgiczny model morfologicznej regeneracji wątroby

Partial Lobular Hepatectomy: A Surgical Model for Morphologic Liver Regeneration

Morfologiczna regeneracja narządów po ostrej utracie tkanek jest powszechna wśród niższych kręgowców, ale rzadko obserwowana w życiu pourodzeniowym ssaków. Regeneracja wątroby u dorosłych osób po częściowej hepatektomii w 70% powoduje przerost hepatocytów z pewną replikacją w pozostałych płatach z przywróceniem aktywności metabolicznej, ale z trwałą utratą morfologii i architektury uszkodzonego płata. W tym artykule szczegółowo opisujemy nową metodę chirurgiczną u noworodka, która pozostawia środowisko fizjologiczne sprzyjające regeneracji. Model ten obejmuje amputację wierzchołka lewego płata, a następnie zachowawczy schemat leczenia i nie ma konieczności podwiązywania głównych naczyń wątroby lub uszkodzenia chemicznego, pozostawiając środowisko fizjologiczne, w którym może nastąpić regeneracja. Rozszerzamy ten protokół na amputacje u młodych myszy (P7-14), podczas których uszkodzona wątroba przechodzi od regeneracji narządów do wzrostu kompensacyjnego przez hipertrofię. Przedstawiony, krótki, trwający 30 minut protokół stanowi ramy do badania mechanizmów regeneracji, jej spadku związanego z wiekiem u ssaków oraz charakterystyki przypuszczalnego pnia wątroby lub komórek progenitorowych.

Rysunek 1A przedstawia ogólny harmonogram noworodkowej częściowej lobektomii wątroby (schemat na Rysunku 1B) oraz przewidywany czas oczekiwania do momentu zaobserwowania regeneracji. Subtelna regeneracja lewego płata może być widoczna od 7 do 14 dni po operacji. Pełną regenerację często obserwowano po 56 dniach od zabiegu. Myszy nie powinny wykazywać żadnych oznak nieprawidłowości fizjologicznych po operacji.
<p class="jove_c...

Tutaj prezentujemy nową metodę częściowej resekcji lewego płata wątroby u noworodków (dzień 0) myszy. Ten nowy protokół jest odpowiedni do badania ostrego uszkodzenia wątroby i reakcji na uraz u noworodków.

Hepatektomia zrazikowa częściowa: chirurgiczny model morfologicznej regeneracji wątroby

Morphological organ regeneration following acute tissue loss is common among lower vertebrates, but is rarely observed in mammalian postnatal life. Adult ...

Ogólnym celem tego zabiegu chirurgicznego jest wywołanie morfologicznej regeneracji wątroby poprzez częściową hepatektomię zrazikową. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórek macierzystych i medycyny regeneracyjnej dotyczące morfologicznej regeneracji wątroby i komórek macierzystych specyficznych dla wątroby. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest minimalnie inwazyjna i nie wymaga chemicznych obelg ani kauteryzacji.Przed dotknięciem zwierząt należy wetrzeć ściółkę z klatki matki w rękawiczki. Następnie przenieś wszystkie szczenięta i trochę ściółki z klatki matki do pustej klatki na poduszce grzewczej. Następnie umieść szczenię pod mikroskopem preparacyjnym.Po stwierdzeniu odpowiedniego poziomu uspokojenia przez brak reakcji na uszczypnięcie palca, należy użyć małego gazika, aby zdezynfekować tylną ścianę brzucha zwierzęcia za pomocą betadyny. Użyj mikronożyczek preparacyjnych i kleszczy, aby wykonać lewe półcentymetrowe nacięcie śródobojczykowe bezpośrednio pod klatką piersiową. Użyj kleszczy, aby delikatnie oddzielić skórę.Następnie wykonaj drugie, głębsze nacięcie w jamie otrzewnej i użyj tylnej krawędzi mikronożyczek preparacyjnych i kleszczy, aby delikatnie wywrzeć boczny nacisk po obu stronach brzucha, wypychając wierzchołek lewego płata z jamy otrzewnej. Gdy lewy wierzchołek lewego płata jest widoczny, amputuj odpowiednią eksperymentalną ilość tkanki z płata i umieść tkankę w 1,5-mililitrowej probówce PBS na lodzie. Za pomocą zwiniętego kawałka gazy delikatnie przywróć lewy płat do jamy otrzewnej.Usuń gazę, gdy krwawienie ustanie i zwilż pole operacyjne i okolice gazą nasączoną PBS. Zamknij pole operacyjne za pomocą szwów i ściegu biegowego. Następnie delikatnie, ale dokładnie zwiń gazę nasączoną PBS po szczenię i miejscu rany, upewniając się, że nie pozostała krew ani betadyna.Pozwól szczenięciu dojść do siebie w pobliżu gazików wystawionych na kał i mocz matki. Kiedy wszystkie szczenięta zostaną poddane hepatektomii, wszystkie zwierzęta i ściółka powinny zostać przeniesione do klatki matki. Po zważeniu płatów utrwal próbki tkanek w 2% paraformaldehydzie przez godzinę w temperaturze pokojowej.Pod koniec utrwalania przenieś tkanki do indywidualnych form zamrażających zawierających pożywkę o optymalnej temperaturze cięcia do zamrażania nad suchym lodem. I pozyskaj 7-10 mikrometrycznych odcinków każdego płata za pomocą dowolnego standardowego kriostatu. Sprawdzaj szczenięta codziennie przez co najmniej 56 dni, aby upewnić się, że ich rany pozostają zamknięte i wstrzyknij środek przeciwbólowy 24 i 48 godzin po operacji.W odpowiednim eksperymentalnym punkcie końcowym zbierz i zważ wątrobę każdego szczeniaka na bloku. Następnie ostrożnie oddziel każdy płat z osobna w jego bliższym przyczepie i porównaj masę amputowanego lewego płata z masą całej wątroby, aby określić zakres regeneracji w każdym płacie. Subtelną regenerację lewego płata można zaobserwować 7-14 dni po zabiegu, a pełną regenerację często obserwuje się po 56 dniach.Brak istotnej różnicy w obszarach hepatocytów w zregenerowanej wątrobie ujawnionej przez analizę histologiczną. Co więcej, wstrzyknięcia EdU u noworodków u myszy wskazują na znaczny wzrost liczby proliferujących komórek w uszkodzonym regenerującym się lewym płacie w porównaniu z nieuszkodzonymi kontrolami, co sugeruje, że proliferacja komórek przyczynia się do regeneracji lewego płata u noworodków. Hepatektomia u młodocianych myszy po urodzeniu w 14. dniu powoduje jednak zmniejszoną regenerację lewego płata ze zwiększoną kompensacją ze strony nieuszkodzonych płatów.Wskazuje to, że po 14 dniach reakcja na uraz na ostrą resekcję zmienia się z regeneracji specyficznej dla płata na globalną kompensację. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby zachować jak największą ostrożność, aby nie powodować dodatkowego stresu u matki lub szczeniąt.Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak seryjne hepatekomie lub przewlekłe uszkodzenia wątroby, aby dokładniej ocenić potencjał regeneracyjny wątroby. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych do zbadania regeneracji wątroby u nowonarodzonych myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić kontrolowaną amputację wątroby noworodka myszy specyficznej dla płata.Nie zapominaj, że praca z izofluranem jest niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak maska na twarz i rękawiczki.

partial-lobular-hepatectomy-surgical-model-for-morphologic-liver

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Wysoka częstość nawrotów nowotworu po resekcji przerzutów do wątroby pozostaje nierozwiązanym problemem. Ilustrowany model myszy może być przydatny do zbadania przyczyn takich nawrotów. Po raz pierwszy łączy model resekcji wątroby z wstrzyknięciem komórek nowotworowych do wątroby.

Wpływ resekcji wątroby na wzrost guza wewnątrzwątrobowego

Wywołanie szybkiego przerostu wątroby za pomocą Kojarzenia Partycji Wątroby i Podwiązania Żyły Wrotnej dla etapowej hepatektomii (ALPPS) zostało zaproponowane do resekcji granicznych resekcyjnych guzów wątroby. Model ten może wyjaśnić mechanizmy związane z szybką hipertrofią i umożliwia testowanie leków, które promują lub blokują przyspieszenie regeneracji.

Szczurzy model skojarzenia partycji wątroby i podwiązania żyły wrotnej do etapowej procedury hepatektomii (ALPPS)

Opisaliśmy protokół wykonywania częściowej hepatektomii (PHx) i przeszczepu komórek przez śledzionę w NOD. SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/J) myszy. W tym protokole wykonuje się nacięcie w celu odsłonięcia i wycięcia lewego płata wątroby, a następnie kolejne nacięcie w celu dośledziony przeszczepu komórek.

Wewnątrzśledzionowe przeszczepienia hepatocytów po częściowej hepatektomii w NOD. Myszy SCID

Ustanawiamy nowatorską technikę chirurgiczną dla modelu perfuzji pojedynczego płata wątroby in vivo u szczurów jako warunek wstępny do dalszych badań in vivo częściowej inżynierii wątroby w przyszłości.

Nowatorska technika chirurgiczna jako podstawa częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów

Ten protokół opisuje procedurę usuwania brzusznego płata wątroby u dorosłego danio pręgowanego, aby umożliwić badanie regeneracji wątroby.

Częściowa hepatektomia u dorosłych danio pręgowanego

Hepatocyty bogate w lipidy są nieodłącznym elementem regeneracji wątroby, ale zazwyczaj są tracone po odwirowaniu w gradiance gęstości. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół izolacji komórek, który zachowuje stłuszczeniowe hepatocyty, uzyskując reprezentatywne populacje regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy.

Izolacja regenerujących się hepatocytów po częściowej hepatektomii u myszy

Liczne badania wykazały zalety anatomicznej resekcji. Niemniej jednak to, czy resekcja anatomiczna może zwiększyć wskaźniki resekcji R0, pozostaje kontrowersyjne. W związku z tym w niniejszej pracy opisano innowacyjną procedurę wykorzystującą koncepcję en bloc połączoną z anatomiczną resekcją w laparoskopowej hepatektomii, która może zmniejszyć ryzyko nawrotów pooperacyjnych i przerzutów.

Zastosowanie koncepcji en bloc w połączeniu z resekcją anatomiczną w laparoskopowej hepatektomii

Wykazano, że powiązanie podziału wątroby i podwiązania żyły wrotnej w przypadku etapowej hepatektomii (ALPPS) powoduje niezwykłą regenerację wątroby po kilku tygodniach od operacji pierwszego etapu. Modele zwierzęce, które przeszły ALPPS, zostały opracowane w celu zbadania potencjalnej zdolności regeneracji wątroby i osiągnięcia korzystnych wyników klinicznych.

Mysi model skojarzonej partycji wątroby i podwiązania żyły wrotnej do etapowego zabiegu hepatektomii wspomaganego mikroskopią

Organoidy generowane z guzów pacjenta są ortotopowo wstrzykiwane do wątroby myszy. Resekcja nienowotworowej tkanki wątroby prowadzi do środowiska regeneracyjnego w tkance wątroby, w której znajduje się guz.

Model ksenoprzeszczepu organoidalnego uzyskany od pacjenta z rakiem wątrobowokomórkowym w celu zbadania wpływu regeneracji wątroby na wzrost guza

Mysi model częściowej 2/3 (66%) hepatektomii jest dobrze opisany w literaturze, ale rzadko stosowano bardziej rozbudowane hepatektomie naśladujące zespół małego dla rozmiaru po przeszczepie wątroby. Opisujemy rozszerzoną 78% procedurę hepatektomii w modelu mysim, która powoduje około 50% śmiertelności pooperacyjnej u zdrowych myszy.

Rozszerzona 78% hepatektomia w mysim modelu chirurgicznym

Poznaj technikę częściowej hepatektomii zrazikowej u myszy noworodków do badania regeneracji wątroby i biologii komórek macierzystych. Ta metoda jest mało inwazyjna i pozwala na precyzyjne badanie odpowiedzi na uszkodzenie narządu.

Hepatektomia zrazikowa częściowa: chirurgiczny model morfologicznej regeneracji wątroby

Przeglądaj więcej filmów