Name: Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 21 s
Description: Poznaj nową metodę testu kulek z perycytami do badania kiełkowania naczyń in vitro. Technika integruje proliferację, migrację i anastomozę, umożliwiając analizę interakcji komórek śródbłonka z perycytami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy doktorom Victorii Bautch i Joshua Boucher za pomocne dyskusje i porady dotyczące optymalizacji standardowych warunków testowania kiełkowania koralików i protokołu barwienia testu kiełkowania. S.H.A. było częściowo wspierane przez grant z National Institute of General Medical Sciences w ramach nagrody 5T32 GM007092.

Dzień 1:
1. Przejściowa transfekcja komórek śródbłonka
<ol>
	<li>W razie potrzeby należy wykonać przejściową transfekcję ludzkich komórek śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) przy użyciu oligonukleotydów regulatorowych genów (np. mikro-RNA lub małego interferującego RNA (siRNA)) i odpowiedniego odczynnika lipofektaminy zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Protokół ten odniósł wielki sukces w wykonywaniu odwrotnych transfekcji z niestandardowymi sekwencjami siRNA i komercyjnym odczynnikiem do transfekcji (patrz tabela materiałów). Autorzy nie testowali innych protokołów transfekcji i odczynników za pomocą tego testu. Kroki odwrotnej transfekcji przy użyciu wymienionych odczynników są następujące:</li>
	<li>Rozpuść liofilizowane siRNA lub mikroRNA w stężeniu 20 μM w wodzie wolnej od nukleaz.</li>
	<li>Przygotować roztwory do transfekcji w następującym stosunku: 1 ml dowolnej pożywki wolnej od surowicy z 9 μl siRNA lub mikroRNA.</li>
	<li>Wymieszać roztwór i pozostawić do inkubacji przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Dodać 18 μl odczynnika do transfekcji do roztworu i wymieszać.</li>
	<li>Pozostawić roztwór do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 20-40 minut, mieszając roztwór co 10 do 15 minut przez cały czas inkubacji.</li>
	<li>Podczas inkubacji roztworu do transfekcji należy odłączyć HUVEC za pomocą roztworu do odrywania komórek (np. Accutase). W przypadku kolby T175 przemyć kolbę 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), a następnie dodać 5 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować kolbę w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
	<li>Dodać 5 ml kompletnej pożywki do kolby T175, usunąć zawiesinę komórek z kolby i odwirować z prędkością 1200 obr./min przez 3 minuty.</li>
	<li>Usunąć supernatant za pomocą aspiratora próżniowego i ponownie zawiesić osad komórek o gęstości 1 X 106 komórek na ml w EGM2. 
	UWAGA: Protokół ten odniósł wielki sukces przy użyciu pożywki do wzrostu komórek śródbłonka (EGM2) zawierającej standardowy zestaw pocisków czynnika wzrostu, a także dodatkowe 10% FBS.</li>
	<li>Po zakończeniu inkubacji roztworu do transfekcji umieść 1 ml roztworu na 10-centymetrowej płytce i dodaj 1 ml zawiesiny HUVEC na wierzch.</li>
	<li>Dodaj dodatkowe 7 ml kompletnej pożywki, aby uzyskać ostateczną objętość na 10-centymetrowej płytce do 9 ml.</li>
	<li>Uzupełnić co najmniej dwie płytki o długości 10 cm komórek dla każdego warunku transfekcji, aby upewnić się, że dostępna jest wystarczająca liczba komórek do dalszych etapów testu. 
	UWAGA: W tych warunkach uzyskuje się końcowe stężenie robocze oligonukleotydu regulatorowego genu wynoszące 20 nM. Autorzy odkryli, że warunki te powodują 60-80% obniżenie ekspresji genów dla ich celów. Inni badacze mogą być zmuszeni do optymalizacji warunków transfekcji zgodnie ze swoimi potrzebami eksperymentalnymi.</li>
	<li>Wymienić pożywkę 4-6 godzin po dodaniu kompleksów siRNA na świeżą kompletną pożywkę. 
	UWAGA: Ten protokół został opracowany przy użyciu przejścia 1 - 2 HUVEC.</li>
</ol>
Dzień 2
2. Powlekanie kulek mikronośnika komórkami śródbłonka
<ol>
	<li>Rozpuść mikrokulki nośne (np. Cytodex 3) w stężeniu 60 000 kulek/ml w PBS i autoklawie. 
	UWAGA: kulki mikronośne występują w stężeniu około 3 x 106 kulek na gram. Rozpuść kulki w proporcji 20 mg kulek na ml PBS, aby uzyskać gęstość kulek około 60 000 kulek/ml.</li>
	<li>Porcję 1 ml kompletnej pożywki do żądanej liczby okrągłodennych probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).</li>
	<li>Odpipetować 20 μl zawiesiny kulek mikronośnika do każdej probówki (należy upewnić się, że roztwór kulki jest dobrze zawieszony przed pipetowaniem). 
	UWAGA: Prawdopodobnie wystąpi dramatyczna zmienność w końcowym stężeniu roboczym kulek obecnych w danej zawiesinie kulek mikronośnika. Koraliki mogą łatwo przylegać do ścianek plastikowych i szklanych pojemników, co może znacznie zmienić stężenie kulek w roztworze. Najbardziej odpowiednia objętość roztworu kulek dodawanego do probówki FACS dla każdej partii zawiesiny kulki mikronośnika będzie musiała zostać określona empirycznie przez badacza. Przedstawione tutaj liczby mają służyć bardziej jako punkt wyjścia. Idealnie byłoby, gdyby warunki były zoptymalizowane tak, aby w żelu fibrynowym na dołek na 24-dołkową płytkę pod koniec testu zanurzonych było 10-20 kulek na studzienkę. Zobacz dalszą dyskusję w sekcji dyskusji poniżej dotyczącą optymalizacji liczby kulek dla testu.</li>
	<li>Odłączyć transfekowany HUVEC 24 godziny po transfekcji za pomocą roztworu do oddzielania komórek w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przemyć każdą 10-centymetrową płytkę komórek 5 ml PBS, a następnie dodać 2 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Zawiesić komórki w stężeniu 1 X 106 komórek/ml w kompletnym pożywce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 1 ml zawiesiny komórek (tj. 1 X 106 HUVEC) do każdej probówki FACS zawierającej kulki.</li>
	<li>Delikatnie mieszać probówki FACS co 20 minut przez 4 godziny w temperaturze 37 °C (w przypadku przejścia do kroku 3.4) lub 2,5 do 3 godzin (w przypadku przejścia do kroku 3.2). 
	UWAGA: Ten czas trwania i częstotliwość mieszania zostały empirycznie określone przez poprzednich badaczy, którzy zoptymalizowali podstawowy test kiełkowania koralików. 4 Inne częstotliwości mieszania i czas trwania etapu powlekania ściegu nie zostały przetestowane przez autorów.</li>
</ol>
3. Sekwencyjne powlekanie perycytów na kulkach mikronośnikowych pokrytych HUVEC
<ol>
	<li>Rozpocznij odłączanie komórek 10T1/2 (perycytów) za pomocą roztworu do odrywania komórek (trypsyna) w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przemyć kolbę T175 10 ml PBS, następnie dodać 5 ml trypsyny i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Zawiesić 10T1/2 w stężeniu 2 X 105 komórek/0,5 ml w kompletnej pożywce. 
		UWAGA: Komórki zostały zakupione z American Type Culture Collection (ATCC). 
		UWAGA: Hodowla 10komórek T1/2 w minimalnej pożywce niezbędnej (MEM) uzupełnionej 10% FBS i 1% penicyliny Streptomycyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 2,5 do 3 godzinach mieszania roztworu kulki + HUVEC odczekaj 5 minut, aby kulki i swobodnie unoszący się HUVEC osiadły na dnie rurki.</li>
	<li>Usuń 0,5 ml kompletnego podłoża z każdej probówki za pomocą pipety P1000 i dodaj 2 x 105 10T1/2 w kompletnych pożywkach w objętości 0,5 ml do każdej probówki FAC. Wymieszać roztwór komórki i kulek, a następnie kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C. Kontynuować mieszanie co 20 minut, aż kulki będą mieszane łącznie przez 4 godziny 
	UWAGA: Stosunek 5 HUVEC : 1 perycyt na koralikach jest niezbędny do utrzymania odpowiedniego pokrycia naczyń perycytami. 
	UWAGA: W tym momencie protokołu można wykonać następujące alternatywne kroki:</li>
	<li>Mieszaj koraliki i HUVEC tylko przez 4 godziny.</li>
	<li>Po zakończeniu 4-godzinnego powlekania kulek mikronośnika HUVEC, należy po raz ostatni zamieszać probówki, odczekać 30-60 s, a następnie natychmiast usunąć 1,5-1,75 ml roztworu z probówki FACS. 
	UWAGA: Powinno to dać wystarczająco dużo czasu, aby większość koralików osiadła, podczas gdy wiele swobodnie unoszących się HUVEC w podłożu zostanie usuniętych.
	<ol>
		<li>Dodaj 2 X 105 10T1/2 do kompletnego podłoża i zwiększ objętość probówki FACS do 2 ml.</li>
		<li>Delikatnie mieszaj rurki FACS co 20 minut przez dodatkową godzinę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zakończeniu mieszania delikatnie wymieszaj probówki po raz ostatni i natychmiast usuń cały roztwór (2 ml) i dodaj go do 6-centymetrowej płytki. Dodać dodatkowe 3 ml kompletnej pożywki do każdej płytki i umieścić płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na noc.</li>
</ol>
Dzień 3
4. Przygotowanie roztworów żelu fibrynowego
<ol>
	<li>Przygotować roztwory robocze aprotyniny w stężeniu 1 mg/ml w PBS i trombiny w stężeniu 50 jednostek/ml. 
	UWAGA: Duży zapas każdego z tych roztworów może być przygotowany i przechowywany w temperaturze 4 °C przez co najmniej rok.</li>
	<li>Przygotować świeży roztwór fibrynogenu o stężeniu 2 mg/ml. Przygotować wystarczającą ilość roztworu, aby uzyskać 2,5 ml roztworu na mieszaną probówkę FACS.
	<ol>
		<li>Ogrzewać roztwór w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby cały fibrynogen mógł wejść do roztworu.</li>
		<li>Dodać 37,5 μl roztworu aprotyniny na 1 ml roztworu fibrynogenu.</li>
		<li>Sterylnie przefiltrować roztwór i odstawić na bok w temperaturze pokojowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Przygotowanie koralików do implantacji żelu
<ol>
	<li>Zbadaj szalki zawierające kulki pokryte mikronośnikiem pod mikroskopem za pomocą obiektywu 20X, aby upewnić się, że wszystkie kulki zostały wystarczająco pokryte komórkami śródbłonka.</li>
	<li>Energicznie odpipetować posiany roztwór komórek, aby odłączyć je od płytki o średnicy 6 cm i umieścić roztwór w probówce. Umyj płytkę jeszcze 2 razy pełnym medium i przenieś do tuby, aby zebrać wszystkie resztki kulek, które mogą przykleić się do płytki.
	<ol>
		<li>Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza i użyj pipety p1000, aby zminimalizować naprężenia ścinające na kulkach pokrytych komórkami śródbłonka.</li>
		<li>Jeśli potrzebna jest ocena skuteczności knockdown siRNA w komórkach śródbłonka, w kroku 2 upewnij się, że masz płytkę z kulkami pokrytymi tylko HUVEC. Następnie, podczas tego etapu (5.2), odczepić kulki i zebrać pozostałości HUVEC przyczepione do płytki w celu izolacji RNA i analizy qPCR.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczekaj 3 minuty, aby kulki w roztworze osiadły na dnie probówki.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej supernatantu bez naruszania granulki za pomocą końcówki do pipety p1000 (nie używaj aspiratora próżniowego).</li>
	<li>Dodać 1 ml kompletnej pożywki do każdej probówki i ponownie zawiesić kulki.</li>
	<li>Odczekaj 30-60 sekund, aby koraliki opadły na dno. Następnie usuń jak najwięcej supernatantu za pomocą pipety P1000, nie naruszając osadu kulkowego. Nie używaj aspiratora próżniowego, ponieważ prawdopodobieństwo przypadkowego usunięcia granulki kulki jest znacznie zwiększone.</li>
	<li>Powtórz kroki 5.5 i 5.6 jeszcze dwa razy. Celem jest usunięcie jak największej ilości swobodnie unoszącego się HUVEC, który mógł zostać odłączony od 6-centymetrowej płytki, przy jednoczesnym nie usuwaniu zbyt wielu kulek pokrytych HUVEC, które powinny osadzać się w rurce FACS szybciej niż swobodnie pływające komórki.</li>
	<li>Dodaj 1 ml kompletnego podłoża do kulek.</li>
</ol>
6. Osadzanie powlekanych koralików w żelu fibrynowym
<ol>
	<li>Usuń jak najwięcej pożywki bez naruszania granulki kulki w każdej probówce FACS za pomocą pipety P1000.</li>
	<li>Ponownie zawiesić kulki w 2,5 ml roztworu fibrynogenu.</li>
	<li>Odpipetować 13 μl roztworu trombiny do każdego żądanego dołka na 24-dołkowej płytce ze szklanym dnem. Posiewanie w płytce ze szklanym dnem jest niezbędne do optymalnego obrazowania kiełków. 
	UWAGA: Nie pozostawiaj trombiny w studzience na dłużej niż 5-10 minut przed następnym krokiem.</li>
	<li>Dodaj 0,5 ml roztworu kulek/fibrynogenu do każdej studzienki.
	<ol>
		<li>Należy pamiętać o ponownym zaparzeniu roztworu kulkowego przed każdorazowym pipetowaniem roztworu.</li>
		<li>Należy zachować ostrożność, aby ostrożnie pipetować bezpośrednio do trombiny już obecnej w studzience. Powoli pipetuj w górę i w dół 2-3 razy, aby dokładnie wymieszać roztwór, uważając, aby nie wprowadzić żadnych pęcherzyków powietrza.</li>
		<li>Pamiętaj, aby wymieniać końcówkę pipety między studzienkami.</li>
		<li>Należy zachować ostrożność, aby nie poruszać się ani nie przeszkadzać w płytce w żadnym momencie podczas początkowego krzepnięcia fibryny, ponieważ każdy ruch może zakłócić tworzenie się żelu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pozostaw płytkę w okapie na 30 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Ostrożnie przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C na dodatkowe 1,5-2 godziny, aby żel w pełni zastygł</li>
</ol>
7. Posiewanie fibroblastów na żelu fibrynowym
<ol>
	<li>W ciągu ostatnich 30 minut krzepnięcia żelu należy odłączyć normalne ludzkie fibroblasty płuc (NHLF) w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Przemyć kolbę komórkową T175 10 ml PBS, następnie dodać 5 ml roztworu do oddzielania komórek i inkubować w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Zawiesić NHLF w stężeniu 20 000 komórek/ml w kompletnych pożywkach. 
		UWAGA: Komórki NHLF można hodować za pomocą Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionego 10% FBS i 1% penicyliny Streptomycyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić 1 ml zawiesiny komórek NHLF na żelu z każdej studzienki i umieścić z powrotem w inkubatorze.</li>
	<li>Zmieniaj całe podłoża co drugi dzień przez cały czas trwania testu.</li>
</ol>
8. Obserwuj kiełkowanie w ciągu 2-7 dni po implantacji kulek w żelu fibryny. Czas potrzebny do wykiełkowania będzie zależał od przejścia i numeru partii HUVEC.
9. Utrwalenie testu kiełkowania
<ol>
	<li>Po wystąpieniu wystarczającej ilości kiełkowania, aby móc określić różnicę fenotypową między grupami leczonymi, należy przemyć wszystkie studzienki jeden raz 2 ml PBS.</li>
	<li>Do każdej studzienki dodać 0,5 ml roztworu do oddzielania komórek i umieścić płytkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C na 5 minut.</li>
	<li>Wyjąć płytkę z inkubatora i postukać w boki płytki. 
	UWAGA: Celem tego etapu jest usunięcie jak największej liczby komórek NHLF rosnących na wierzchu żelu fibrynowego, aby ułatwić przenikanie przeciwciał do żelu, a także obrazowanie żelu. Całkowity czas inkubacji z roztworem do odrywania komórek może wymagać dostosowania w celu optymalizacji usuwania NHLF. Naukowcy są ostrzegani, aby nie inkubować żelu przez zbyt długi czas, ponieważ roztwór do odrywania komórek może wniknąć w żel i zacząć zakłócać struktury śródbłonka w środku.</li>
	<li>Po usunięciu wystarczającej ilości komórek NHLF należy zgasić roztwór do oddzielania komórek 1 ml kompletnej pożywki.</li>
	<li>Odessać odłączony NHLF i pożywkę za pomocą aspiratora próżniowego i raz umyć studzienki 1 ml PBS.</li>
	<li>Dodać 300 μl 2% roztworu paraformaldehydu w PBS do każdej studzienki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Usuń 2% roztwór paraformaldehydu i umyj każdą studzienkę 3 razy 1 ml PBS przez 3 minuty w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Należy odpowiednio zutylizować 2% roztwór paraformaldehydu zgodnie z wytycznymi dotyczącymi zdrowia i bezpieczeństwa środowiskowego (EHS).
	<ol>
		<li>Dodać 1 ml PBS do każdej studzienki i przechowywać w temperaturze 4 °C, aż będzie gotowy do barwienia lub obrazowania kiełków.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
10. Barwienie testu kiełkowania
<ol>
	<li>Dodać 300 μl 0,5% Triton-X 100 w PBS do każdego dołka i inkubować przez 30 do 45 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Za pomocą aspiratora próżniowego wyjmij Triton-X100 i umyj 3 razy w PBS przez 5 minut każdy.</li>
	<li>Dodać 500 μl roztworu blokującego do każdego żelu i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Roztwór blokujący składa się z następujących składników: 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 5% FBS, 0,1% tween-20 i 1% surowicy (użyj tego samego gatunku, z którego pochodzą przeciwciała drugorzędowe) w PBS.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący z każdej studzienki i dodać 300 μl roztworu barwiącego zawierającego przeciwciało pierwszorzędowe do każdej studzienki. 
	UWAGA: Roztwór barwiący jest taki sam jak roztwór blokujący, ale bez obecnej surowicy odpornościowej. Autorzy odnieśli sukces w inkubacji z przeciwciałami pierwszorzędowymi w rozcieńczeniach od 1:200 do 1:400.</li>
	<li>Inkubować przeciwciała pierwszorzędowe w roztworze barwiącym przez 24 godziny w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała pierwszorzędowego i przemyć 3 razy w TBS z 0,5% tween przez 20 minut w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem. Po trzecim praniu ponownie zastąp świeży bufor do mycia i przechowuj w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Inkubować z fluorescencyjnym przeciwciałem drugorzędowym rozcieńczonym w stosunku 1:1000 w roztworze barwiącym przez 2 godziny w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usuń wtórny roztwór barwiący przeciwciała i przemyj 5 razy przez 20 minut za pomocą TBS zawierającego 0,5% teen w temperaturze pokojowej z delikatnym kołysaniem.</li>
	<li>Rozcieńczyć barwienie jądrowe w PBS i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. 
	UWAGA: Ten protokół odniósł wielki sukces z Hoechst rozcieńczonym 1:10000 w PBS. 
	UWAGA: Nie ma potrzeby usuwania roztworu do barwienia jądrowego przed obrazowaniem.</li>
	<li>Obraz w ciągu kilku dni od zakończenia barwienia w celu uchwycenia optymalnego sygnału fluorescencyjnego.</li>
</ol>
11. Kwantyfikacja testu kiełkowania
<ol>
	<li>Po zobrazowaniu kiełków zaimportuj pliki obrazów do ImageJ i użyj narzędzia Policz, aby policzyć liczbę kiełków, lub narzędzia Linia, aby zmierzyć długość kiełków. 
	UWAGA: Kiełki definiuje się jako wypukłości śródbłonka o długości większej lub równej średnicy koralika, z którego wyrastają. 11 Długość kiełka może być mierzona jako odległość od punktu, w którym kiełek zaczyna wystawać z koralika, do czubka kiełka. Średnia długość kiełków na koralik i średnia liczba kiełków na koralik są przydatnymi wskaźnikami do oceny fenotypowych efektów wyciszania genów w angiogenezie kiełkowania. Średnia liczba kulek zawierających co najmniej jeden kiełek na grupę poddawaną działaniu substancji może być również wykorzystana jako wskaźnik do oceny odporności kiełkowania.</li>
</ol>

<ol><li>Hanahan, D., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+and+emerging+mechanisms+of+the+angiogenic+switch+during+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis.</a> Cell. 86 (3), 353-364 (1996).</li>
<li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+in+ischemic+and+neoplastic+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders.</a> Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).</li>
<li>Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurorestorative+therapies+for+stroke%3A+underlying+mechanisms+and+translation+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic.</a> Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).</li>
<li>Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+three-dimensional+in+vitro+model+for+the+analysis+of+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis.</a> Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).</li>
<li>Nehls, V., Drenckhahn, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel%2C+microcarrier-based+in+vitro+assay+for+rapid+and+reliable+quantification+of+three-dimensional+cell+migration+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis.</a> Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).</li>
<li>Sims, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pericyte--a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">The pericyte--a review.</a> Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).</li>
<li>Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pericytes%3A+developmental%2C+physiological%2C+and+pathological+perspectives%2C+problems%2C+and+promises%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises.</a> Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).</li>
<li>Tattersall, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+endothelial+interaction+with+macrophages+and+pericytes+demonstrates+Notch+signaling+function+in+the+vascular+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment.</a> Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).</li>
<li>Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normalization+of+tumor+vasculature%3A+an+emerging+concept+in+antiangiogenic+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy.</a> Science. 307 (5706), 58-62 (2005).</li>
<li>Tahergorabi, Z., Khazaei, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+on+angiogenesis+and+its+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Iran+J+Basic+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">A review on angiogenesis and its assays.</a> Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).</li>
<li>Popson, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferon-induced+transmembrane+protein+1+regulates+endothelial+lumen+formation+during+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).</li>
<li>Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cells+and+VEGF+in+vascular+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Endothelial cells and VEGF in vascular development.</a> Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).</li>
<li>Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+requirement+for+fibroblasts+in+angiogenesis%3A+fibroblast-derived+matrix+proteins+are+essential+for+endothelial+cell+lumen+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation.</a> Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten przedstawia metodę charakteryzowania złożonych etapów i heterotypowych interakcji komórkowych angiogenezy kiełkowania, umożliwiając badaczowi zastosowanie podejść genetycznych i obrazowych w celu przeprowadzenia dokładnych badań mechanistycznych. Podczas wykonywania testu ważne jest, aby skuteczne pokrycie śródbłonka kulek miało miejsce podczas etapów mieszania kulek. Słaba powłoka śródbłonka stanie się widoczna, jeśli koraliki nie wydają się mieć szorstkiej powierzchni przypominającej piłkę golfową następne...

Angiogeneza jest niezbędna do prawidłowego zarodkowania i gojenia się ran, a także odgrywa kluczową rolę w wielu chorobach, w tym w progresji raka1 i chorobie wieńcowej. 2,3 Lepsze zrozumienie, w jaki sposób angiogeneza zachodzi podczas normalnego rozwoju i jak jest reaktywowana w kontekstach patologicznych, ma kluczowe znaczenie dla rozwoju nowych, skutecznych metod terapeutycznych. Potrzebne są wierne modele in vitro, które podsumowują ważne etapy i typy komórek zaangażowanych w angiogenezę in vivo, aby umożliwić naukowcom lepsze scharakteryzowanie mechanizmów molekularnych napędzających angiogenezę i dokonanie nowych odkryć w zakresie regulacji śródbłonka.
Nakatsu i Hughes zoptymalizowali test kiełkowania kulek, który, jak wykazali, przechodzi wiele znanych etapów angiogenezy kiełkowania. 4,5 Celem przedstawionej tutaj metody jest rozwinięcie testu zoptymalizowanego przez Nakatsu i Hughesa poprzez włączenie perycytów do testu, tak aby rola parakrynny i jukstracryny komórek ściennych w kiełkowaniu komórek śródbłonka mogła zostać włączona do nowych badań angiogenezy. Perycyty to komórki ścienne, które są definiowane przez ich rolę jako komórek, które utrzymują bliski kontakt fizyczny z komórkami śródbłonka ze względu na ich osadzenie w błonie podstawnej naczyń. 6 Perycyty i komórki śródbłonka angażują się w skomplikowane wzajemne rozmowy poprzez szlaki sygnałowe, w tym sygnalizację Notch, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ i wiele innych. 7,8 Modele mysie z niedoborem tych szlaków sygnałowych wykazują słabe pokrycie perycytów rozwijającym się naczyniem w embriogenezie, co prowadzi do słabej przebudowy naczyń i dysfunkcji układu krwionośnego. 7 Ponadto, rola perycytów w patologicznej angiogenezie jest ważna, ale często niedoceniana. Na przykład unikalną cechą unaczynienia guza jest to, że naczynia są bardziej niedojrzałe, nieszczelne i dysfunkcyjne z powodu słabego pokrycia perycytów. 9 Zaproponowano, że obecność lub brak perycytów dramatycznie wpływa na fenotyp naczyń krwionośnych guza i jest ważnym mediatorem odpowiedzi na terapie antyangiogenne i przeciwnowotworowe. 9 Tak więc, uwzględnienie roli perycytów w testach in vitro jest kluczem do pełniejszego uchwycenia ważnych mechanizmów regulacji śródbłonka.
Chociaż obecnie istnieje wiele testów in vitro i ex vivo stosowanych do badania angiogenezy, w każdym z nich są niedociągnięcia, które należy wziąć pod uwagę. Niektóre, takie jak proliferacja śródbłonka i testy migracji śródbłonka, są nadmiernie uproszczone i koncentrują się na jednej funkcji śródbłonka w izolowanym otoczeniu na plastiku do hodowli tkankowej. 10 Inne testy występują w bardziej trójwymiarowym (3D) otoczeniu, takie jak test tworzenia rurki Matrigel,10, ale te testy są nadal nadmiernie uproszczone i skupiają się bardziej na zdolności komórek śródbłonka do migracji i tworzenia struktur naczyniowych de novo, w przeciwieństwie do kiełkowania z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych. Co więcej, żaden z tych testów nie obejmuje typów komórek ściennych. Istnieją modele ex vivo, takie jak test aorty pierścieniowej, które obejmują perycyty obecne w narządzie gospodarza, ale manipulacja genetyczna tych modeli jest znacznie trudniejsza ze względu na konieczność generowania modeli myszy z nokautem lub transgenicznych ścieżek będących przedmiotem zainteresowania. Test kiełkowania kulek jest idealny, ponieważ modeluje kiełkowanie śródbłonka, proliferację, migrację, a nawet zespolenie i tworzenie światła w matrycy 3D. 4 Test wiernie pozwala na mechanistyczną ocenę wielu różnych etapów kiełkowania, jednocześnie pozwalając na bezpośrednią modyfikację genetyczną komórek śródbłonka lub perycytów w bardziej kontrolowanym otoczeniu. Skrzepy fibrynowe zawierające kiełkujące kulki można łatwo utrwalić, wybarwić i zobrazować na różnych etapach kiełkowania; Kiełki te można również umieścić w komorze obrazowania na żywo, aby wykonać obrazowanie kiełkowania w czasie rzeczywistym. Przedstawiona tu metodologia jest idealna do badania podstawowych mechanizmów angiogenezy poprzez dogłębne fenotypowanie i dokładną analizę szlaków aktywowanych podczas angiogenezy.

<table><tbody><tr><td>Sterylne końcówki do pipet</td><td>Pipety VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Complete EGM2 Media Bullet Kit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>HUVEC Media</td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11095114</td><td>10T1/2 Media</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965118</td><td>NHLF Media</td></tr><tr><td>PBS do hodowli tkankowych klasy PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td>Nie zawiera magnezu i wapnia</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A1110501</td><td>Do liftingu HUVEC</td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Life Technologies</td><td>15050065</td><td>Do podnoszenia 10T 1/2 i NHLF</td></tr><tr><td>Customs siRNA</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMax</td><td>Life Technologies</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>HUVEC</td><td>Lonza</td><td>C2517A</td><td></td></tr><tr><td>10T 1/2</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHLF</td><td>ATCC Cytodex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 kulki mikronośnikowe</td><td>Sigma</td><td>C3275</td><td></td></tr><tr><td>Płytki 6 i 10 cm powlekane kulturami tkankowymi</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen z osocza bydlęcego</td><td>Sigma</td><td>F8630</td><td></td></tr><tr><td>Trombin</td><td>Sigma</td><td>t9549</td><td></td></tr><tr><td>Aprotynina</td><td>Sigma</td><td>a3428</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Probówki z okrągłym dnem</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator do hodowli tkankowych z kapturem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe szklane płytki denne</td><td>MatTek</td><td>P24G1.513F</td><td>Płytki ze szklanym dnem są potrzebne tylko wtedy, gdy kiełki mają być obrazowane. Jeśli nie, dopuszczalne jest również stosowanie plastiku z kultur tkankowych.</td></tr><tr><td>Sterylne urządzenie</td><td></td><td></td><td></td> filtracyjne</tr></tbody></table>

włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka

Incorporating Pericytes into an Endothelial Cell Bead Sprouting Assay

Angiogeneza to wzrost nowych naczyń krwionośnych z wcześniej istniejących naczyń krwionośnych i jest ważnym składnikiem wielu procesów biologicznych, w tym embriogenezy i rozwoju, gojenia się ran, wzrostu guza i przerzutów oraz chorób oczu i układu krążenia. Potrzebne są skuteczne modele in vitro, które podsumowują biologię angiogenezy, aby odpowiednio zbadać ten proces i zidentyfikować mechanizmy regulacji, które mogą być ostatecznie ukierunkowane na nowe strategie terapeutyczne. Wcześniej wykazano, że test angiogenezy kulek podsumowuje wiele etapów kiełkowania śródbłonka in vitro. Jednak ograniczeniem tego testu jest brak interakcji śródbłonek – komórki ścienne, które są kluczowe dla molekularnej i fenotypowej regulacji funkcji komórek śródbłonka in vivo. Podany tutaj protokół przedstawia metodologię włączania komórek ściennych do testu angiogenezy perełkowej i wykazuje ścisły związek komórek śródbłonka i perycytów podczas kiełkowania in vitro. Protokół szczegółowo opisuje również metodologię skutecznego wyciszania genów docelowych przy użyciu siRNA w komórkach śródbłonka do badań mechanistycznych. Podsumowując, protokół ten zapewnia test in vitro, który w bardziej odpowiedni sposób modeluje różne typy komórek zaangażowanych w kiełkowanie angiogenezy i zapewnia bardziej fizjologicznie istotną platformę do oceny terapeutycznej i odkrycia nowych mechanizmów regulacji angiogenezy.

Niniejszy protokół umożliwia ścisłe powiązanie dwóch typów komórek in vitro, a obecność perycytów uzupełnia zjawisko kiełkowania (Rycina 1A, B). Protokół ten pozwala również na efektywne wyciszenie (np. poprzez interferencję RNA) wybranego genu w konkretnym typie komórek (na przykład VEGFA specyficznie w komórkach śródbłonka lub PDGFRβ w perycytach)7,12 w trakcie bad...

Ten protokół przedstawia nowatorski test kulkowy in vitro, który bardziej odpowiednio modeluje proces angiogenezy kiełkowania in vivo poprzez włączenie perycytów. Ta modyfikacja umożliwia testowi kulkowemu dokładniejsze odwzorowanie heterotypowych interakcji komórkowych między komórkami śródbłonka a komórkami ściennymi, które mają kluczowe znaczenie dla angiogenezy.

Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka

Angiogenesis is the growth of new vessels from pre-existing vasculature and is an important component of many biological processes, including ...

Ogólnym celem tego testu jest włączenie heterotypowych interakcji komórkowych in vitro, które zawierają złożoność angiogenezy in vivo. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii naczyniowej dotyczące znaczenia interakcji komórek śródbłonka pericytów podczas angiogenezy. Główną zaletą tej techniki jest to, że integruje ona różne etapy angiogenezy kiełkowania, w tym proliferację, migrację i zespolenie, jednocześnie umożliwiając badanie interakcji komórek śródbłonka z pericytami.Rozpocznij od odtworzenia kulek mikronośnika w stężeniu sześć razy 10 do czwartego na mililitr w PBS, a następnie sterylizacji w autoklawie zawiesiny kulek mikronośnika. Następnie podniec jeden mililitr kompletnego podłoża do odpowiedniej liczby probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS) i dodaj 20 mikrolitrów chłodzonej w temperaturze pokojowej, sterylizowanej w autoklawie zawiesiny mikronośnika do każdej probówki. Dodaj jeden mililitr komórek do każdej probówki.Mieszać probówki i inkubować probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 2 1/2 do trzech godzin z delikatnym mieszaniem co 20 minut. Pod koniec inkubacji umieść komórki w kulkach w temperatu

incorporating-pericytes-into-an-endothelial-cell-bead-sprouting-assay

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy film prezentuje protokół testu angiogenezy in vitro, który odtwarza kilka etapów angiogenezy. Przedstawiono obrazy time-lapse ukazujące kiełkowanie, formowanie światła naczyń, rozgałęzianie oraz anastomozę – kluczowe cechy angiogenezy.

Zoptymalizowany test kulek z żelu fibrynowego do badania angiogenezy

Ten film przedstawia zmodyfikowany test oparty na kulkach mikronośnika, obejmujący perycyty w celu zbadania kiełkowania śródbłonka we wczesnych stadiach angiogenezy. Test zapewnia eksperymentalny model in vitro w celu zrozumienia molekularnych mechanizmów angiogenezy i wpływu terapii antyangiogenetycznej.

Test kiełkowania kulek do oceny angiogenezy we wczesnym stadium: model oparty na kulkach in vitro do badania kiełkowania śródbłonka w obecności perycytów

Przedstawiamy protokół do badania interakcji między ludzkim śródbłonkiem a perycytami u myszy za pomocą wariantu testu angiogenezy z zatyczką żelową macierzy.

In vivo (in vivo) Badanie interakcji śródbłonka człowieka z perycytami za pomocą testu Matrix Gel Plug u myszy

Utrzymanie zasięgu bariery krew-mózg jest kluczowe dla homeostazy ośrodkowego układu nerwowego. Protokół ten opisuje techniki in vitro w celu nakreślenia podstawowych i patologicznych procesów, które modulują pokrycie bariery krew-mózg.

In vitro Testy oceniające tworzenie i rozrywanie naczyń przypominających siatkę bariery krew-mózg

Protokół opisuje, jak zaprojektować perfuzyjną sieć naczyniową w sferoidzie. Mikrośrodowisko otaczające sferoidę jest zaprojektowane tak, aby indukować angiogenezę i łączyć sferoidę z mikrokanałami w urządzeniu mikroprzepływowym. Metoda pozwala na perfuzję sferoidy, co jest długo oczekiwaną techniką w kulturach trójwymiarowych.

Perfuzyjna sieć naczyniowa z modelem tkankowym w urządzeniu mikroprzepływowym

Progenitorzy śródbłonka pochodzący z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC-EPs) mają potencjał, aby zrewolucjonizować leczenie chorób sercowo-naczyniowych i umożliwić tworzenie bardziej wiernych modeli chorób sercowo-naczyniowych. W artykule opisano enkapsulację iPSC-EP w trójwymiarowych (3D) mikrośrodowiskach kolagenu oraz analizę ilościową potencjału naczyniowego tych komórek.

Model 3D in vitro i potok obliczeniowy do ilościowego określenia potencjału naczyniopochodnego progenitorów śródbłonka pochodzących z iPSC

Ta metoda opisuje hodowlę komórek śródbłonka pochodzących z iPSC jako 40 perfundowanych mikronaczyń 3D w standaryzowanej platformie mikroprzepływowej. Platforma ta umożliwia badanie angiogennego kiełkowania sterowanego gradientem w 3D, w tym zespolenia i stabilizacji kiełków angiogennych w sposób skalowalny i wysokoprzepustowy.

Standaryzowany i skalowalny test do badania perfundowanego angiogennego kiełkowania 3D komórek śródbłonka pochodzących z iPSC in vitro

Trójwymiarowy system testowania angiogenezy sferoidalnej w kokulturze został zaprojektowany tak, aby naśladować fizjologiczną angiogenezę. Sferoidy kohodowlane są tworzone przez dwa prekursory ludzkich komórek naczyniowych, ECFC i MSC, i zatopione w żelu kolagenowym. Nowy system jest skuteczny w ocenie modulatorów angiogennych i dostarcza bardziej istotnych informacji do badania in vivo.

Trójwymiarowy system oznaczania angiogenezy wykorzystujący sferoidy współhodowlane utworzone przez komórki tworzące kolonie śródbłonka i mezenchymalne komórki macierzyste

Ten test wykorzystuje embrionalne komórki macierzyste myszy zróżnicowane w ciała embrionalne hodowane w żelu 3D-collagen do analizy procesów biologicznych, które kontrolują angiogenezę kiełkowania in vitro. Technika ta może być stosowana do testowania leków, modelowania chorób oraz do badania określonych genów w kontekście delecji, które są śmiertelne dla zarodka.

In vitro Trójwymiarowy test angiogenezy w kiełkowaniu przy użyciu embrionalnych komórek macierzystych myszy do modelowania chorób naczyniowych i testowania leków

To badanie przedstawia dwuwymiarowy (2D) test migracji ran drapanych i trójwymiarowy (3D) test kiełkowania sferoidów, wraz z odpowiednimi metodami analizy, w tym ekstrakcją RNA i immunocytochemią, jako odpowiednie testy do badania angiogenezy in vitro.

Badanie angiogenezy na poziomie funkcjonalnym i molekularnym poprzez wykorzystanie testu migracji ran drapanych i testu kiełkowania sferoidalnego

Poznaj nową metodę testu kulek z perycytami do badania kiełkowania naczyń in vitro. Technika integruje proliferację, migrację i anastomozę, umożliwiając analizę interakcji komórek śródbłonka z perycytami.

Włączenie perycytów do testu kiełkowania kulek komórek śródbłonka

Przeglądaj więcej filmów