Tworzenie biofilmu wywołanego solą żółciową w patogenach jelitowych: techniki identyfikacji i kwantyfikacji

Ogólnym celem tego protokołu tworzenia i oceny biofilmu jest określenie zdolności patogenów bakterii jelitowych do tworzenia biofilmu, szczególnie w warunkach naśladujących pasaż żołądkowo-jelitowy i narażenie na sole żółciowe. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie patogenezy bakteryjnej, takie jak zdolność patogenów jelitowych do przetrwania w trudnych warunkach soli żółciowych w przewodzie pokarmowym. Główną zaletą tych technik jest to, że połączone wyniki trzech testów wspierają dogłębną charakterystykę tworzenia się biofilmu w odpowiedzi na ekspozycję na sól żółciową dla każdego patogenu.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł metod łączonych, biorąc pod uwagę potrzebę pełnego ilościowego określenia procesu tworzenia biofilmu indukowanego solami żółciowymi u Shigella flexneri. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności, ponieważ aspekty testu mogą ograniczać odtwarzalność. Dlatego należy zwrócić uwagę na krytyczne kroki, aby zapewnić odtwarzalność.

Procedury zademonstrują członkowie mojego laboratorium, Kourtney Nicherson, adiunkt i Alejandro Llanos, pracownik naukowy ds. badań klinicznych. Najpierw oznacz dwie rurki o pojemności 1,5 mililitra jako TSB i TSB plus BS. Następnie dodaj jeden mililitr TSB lub TSB plus BS do odpowiednich probówek. Następnie zaszczepić probówki 20 mikrolitrami nocnej kultury w rozcieńczeniu od jednego do 50.

Następnie dodaj 130 mikrolitrów niezaszczepionej pożywki kontrolnej do każdej z trzech studzienek na sterylnej, przezroczystej, płaskodennej, poddanej kulturze tkankowej, 96-dołkowej płytce. Będzie to pusta kontrolka. Dodaj 130 mikrolitrów zaszczepionej kultury do każdej z trzech studzienek.

Po dodaniu kultury kontrolnej i zaszczepionej w odpowiednich studzienkach, inkubować 96-dołkową płytkę przez cztery do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza, statycznie. Po zakończeniu inkubacji ustawić kontrolkę jako pustą na czytniku płytek. Następnie odessaj pożywkę hodowlaną z każdej studzienki.

Następnie delikatnie umyj studzienki raz 200 mikrolitrami sterylnego PBS. Po umyciu należy odessać PBS, a następnie odwrócić płytkę do wyschnięcia przez około 20 minut. Bardzo ważne jest, aby zapewnić delikatne usuwanie nośnika i delikatne mycie, aby upewnić się, że matryca EPS nie zostanie naruszona.

Następnie dodaj 150 mikrolitrów 0,5% fioletu krystalicznego do każdej z studzienek doświadczalnych i kontrolnych. Następnie inkubuj płytkę przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Po pięciu minutach umyj studzienki 400 mikrolitrami wody destylowanej.

Dodaj 200 mikrolitrów wody destylowanej, aby pięciokrotnie umyć studzienki. Po wszystkich pięciu praniach odwróć talerz i pozostaw go do całkowitego wyschnięcia, chroniony przed światłem. W celu uzyskania spójnych wyników ważne jest, aby próbki zostały dokładnie wysuszone przed kontynuowaniem.

Po całkowitym wyschnięciu płytki użyj 200 mikrolitrów 95% etanolu do odbarwienia studzienek. Następnie pozostaw płytkę na shakerze na 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby uniknąć parowania. Po 30 minutach zapisz OD 540 na czytniku płytek.

Do półilościowego wykrywania EPS należy użyć pipety wielokanałowej, aby przenieść pożywkę hodowlaną na przezroczystą 96-dołkową płytkę. Następnie użyj 200 mikrolitrów odczynnika utrwalającego, aby utrwalić czarną płytkę przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Teraz zapisz odczyt OD 600, ustawiając dobrze kontrolę i ślepą plamę w celu standaryzacji.

Następnie zapisz odczyt pożywki hodowlanej, podczas gdy populacja przylegająca utrwala się. Po zakończeniu utrwalania usuń odczynnik i wyrzuć go do odpadów niebezpiecznych. Następnie użyj 200 mikrolitrów sterylnego PBS, aby delikatnie umyć studzienki dwukrotnie.

Po umyciu odessać PBS. Następnie dodaj 150 mikrolitrów po 25 mikrogramów na mililitr ConA-FITC. Inkubować płytkę w temperaturze pokojowej przez 15 minut.

Po inkubacji delikatnie umyj studzienki 200 mikrolitrami PBS. Następnie dodaj 150 mikrolitrów PBS do każdej studzienki i zarejestruj fluorescencję przy 488 nanometrach. Po przygotowaniu świeżych odczynników podgrzej PBS, PBS z glukozą, PBS z solami żółciowymi i PBS z glukozą i solami żółciowymi do 27 stopni Celsjusza.

Następnie zapisz wartości OD 600 z płytki biofilmu na noc na czytniku płytek, ustawiając kontrolę dobrze jako ślepą. Następnie odessać pożywkę hodowlaną za pomocą linii próżniowej, nie zakłócając przylegającej populacji na powierzchni tworzywa sztucznego. Delikatnie umyj studzienki dwukrotnie 200 mikrolitrami sterylnego PBS.

Po umyciu PBS dodaj 130 mikrolitrów wstępnie podgrzanego PBS, PBS z glukozą, PBS z solami żółciowymi i PBS z solami żółciowymi i glukozą do każdej z trzech studzienek, a następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut. Po 30 minutach wyjąć płytkę z inkubatora. Odpipetować supernatant na świeżą, sterylną płytkę 96-dołkową.

Na koniec przygotować od jednego do 10 seryjnych rozcieńczeń supernatantu z PBS na płytce 96-dołkowej lub w bloku rozcieńczania. Następnie za pomocą pipety wielokanałowej przenieś pięć mikrolitrów każdego rozcieńczenia na płytki agarowe LB. Inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc.

Następnego dnia policz liczbę kolonii. Wykres słupkowy uzyskuje się w celu ilościowego określenia zależnego od soli żółciowych tworzenia biofilmu w patogenach jelitowych. Odbywa się to poprzez wykreślenie wartości OD 540 poszczególnych szczepów w obecności i braku soli żółciowych w pożywce.

Wykres wykazuje znaczny wzrost tworzenia biofilmu dla większości szczepów patogenów, z wyjątkiem enteroaggrative E.Coli. Następnie EPS wytwarzany podczas tworzenia biofilmu jest wykrywany poprzez określenie ilości ConA-FITC zatrzymanego przez EPS. Wykres słupkowy pokazuje znacznie zwiększony odczyt fluorescencji w obecności soli żółciowych.

Potwierdza to produkcję EPS dla patogenu Shigella flexneri. W tym przypadku zależne od ConA-FITC barwienie matrycy EPS jest znacznie wysokie pod wpływem soli żółciowych. Wskazuje to na tworzenie się biofilmu bakteryjnego, charakteryzującego się bogatą w polisacharydy matrycą EPS.

Jeden X PBS i DAPI służą do pokazania odpowiednio specyficzności zależnej od FITC i obecności bakteryjnego DNA. Na koniec zlicza się liczbę jednostek tworzących kolonie w celu analizy zależnej od soli żółciowej dyspersji bakterii z biofilmu. Wykres pokazuje, że bakterie łatwo rozpraszają się z biofilmów w PBS i PBS z glukozą.

Jednak narażenie bakterii na sole żółciowe drastycznie hamuje ich dyspersję z biofilmów. Testy te zostały opracowane w celu wychwycenia i ilościowego określenia przejściowych zjadliwych biofilmów tworzonych przez patogeny jelitowe, w szczególności Shigella flexneri, w odpowiedzi na ekspozycję na sól żółciową w jelicie cienkim przed zakażeniem okrężnicy. Modyfikacje testów, takie jak podstawowe typy pożywek, skład użytych soli żółciowych i warunki rozwoju bakterii, mogą wymagać dostosowania do różnych patogenów, w zależności od miejsca infekcji w przewodzie pokarmowym.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać każdy z testów, aby dokładnie ocenić tworzenie się biofilmu w interesującym Cię szczepie bakteryjnym lub zmutowanym. Pamiętaj, że praca z patogenami i niektórymi roztworami może być bardzo niebezpieczna. Podczas wykonywania tych testów należy zawsze brać pod uwagę środki ostrożności, takie jak odpowiednie metody obchodzenia się z nimi i usuwania.

Ponadto przygotowanie świeżych pożywek z solą żółciową, odpowiednie kontrole i zapewnienie odtwarzalności eksperymentalnej mają kluczowe znaczenie dla analizy danych i potwierdzenia fenotypu biofilmu wywołanego solą żółciową. Techniki, które są unikalnymi i kreatywnymi, wysokoprzepustowymi zastosowaniami tradycyjnych metod, umożliwią odpowiednie określenie ilościowe wieloaspektowego i dynamicznego procesu tworzenia biofilmu wywołanego solami żółciowymi w patogenach jelitowych.