Name: Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Poznaj metodę izolacji komórek wysp trzustkowych myszy do badania indukcji ROS przez ksenobiotyki. Technika umożliwia identyfikację substancji chemicznych o potencjalnym działaniu cukrzycogennym in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant projektu pilotażowego z centrum CREH sponsorowany przez NIEHS i Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 31572626).

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi odpowiednimi wytycznymi, przepisami i agencjami regulacyjnymi. Demonstrowany protokół został przeprowadzony pod kierunkiem i za zgodą Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki nad Zwierzętami i Wykorzystania (IACUC) Instytutu Medycyny Genomowej Texas A&M.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 10x zrównoważony roztwór soli Hanka do 1x podwójnie destylowanymH2Oi przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przygotować roztwór izolacyjny, dodając HEPES (10 mM), MgCl2 (1 mM) i glukozę (5 mM). Dostosuj pH do 7,4 i trzymaj na lodzie.</li>
	<li>Przygotować roztwór kolagenazy z kolagenazy typu 4. 
	nuta: W szczególności kolagenaza typu 4 zawiera 160 U na mg suchej masy. 1 g kolagenazy typu 4 rozcieńcza się w 5 ml podwójnie destylowanegoH2Oo stężeniu 200 mg/ml. 2 ml rozcieńczonej kolagenazy dodaje się do 30 ml lodowatego roztworu izolacyjnego, a 6 ml roztworu kolagenazy przenosi się do probówki o pojemności 50 ml dla każdej myszy.</li>
	<li>Przygotować roztwór do przemywania przez dodanie 1 mM CaCl2 do roztworu izolacyjnego.</li>
	<li>Przygotować roztwór oczyszczający z zimnym roztworem polisacharozy/ditrizoesanu sodu (1,1119 g/ml, 5 ml).</li>
	<li>Przygotuj 500 ml pożywki do hodowli wysp trzustkowych, dodając L-glutaminę (20 mM), penicylinę (100 U/ml), streptomycynę (100 μg/ml) i płodową surowicę bydlęcą (FBS) (10%) do pożywki RPMI.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy DCFH-DA, rozpuszczając proszek w wodzie destylowanej o stężeniu 200 μM i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
	nuta: Roztwór barwiący ROS jest świeżo przygotowany przez rozcieńczenie roztworu podstawowego DCFH-DA do końcowego stężenia 5 μM w RPMI. Ten odczynnik należy chronić przed światłem.</li>
</ol>
2. Przygotowanie chirurgiczne
<ol>
	<li>Dootrzewnowo wstrzyknąć (I.P.) myszy z awertyną (2,5% avertyny, 0,4 ml/20 g). Po tym, jak mysz zostanie całkowicie znieczulona i nie będzie już reagować na szczypanie tylnej stopy, należy ją poddać eutanazji i przenieść do kaptura biologicznego.</li>
	<li>Umieść uśpioną mysz brzuchem skierowaną do góry i spryskaj skórę 70% etanolem w celu sterylizacji.</li>
	<li>Otwórz jamę brzuszną za pomocą 1 cm nacięcia w kształcie litery U na górnej części brzucha i cofnij skórę w kierunku rostralnym nad klatką piersiową, aby odsłonić jamę brzuszną.</li>
</ol>
3. Perfuzja i usuwanie trzustki
<ol>
	<li>Jak pokazano w Rysunek 1, znajdź lokalizację bańki. Użyj pary zakrzywionych kleszczy, aby zacisnąć dwunastnicę blisko pozycji zwieracza Oddi. Użyj innej pary zakrzywionych kleszczy, aby zacisnąć ścianę dwunastnicy, aby zablokować drogę żółciową w dwunastnicy. 
	nuta: Na tym etapie nie została wprowadzona bańka. Ten krok ma na celu zablokowanie drogi żółciowej w dwunastnicy.</li>
	<li>Zmień położenie myszy tak, aby głowa była bliższa, a stopy dystalne w stosunku do badacza.</li>
	<li>Znajdź wspólny przewód żółciowy i powoli wstrzyknij 3 ml roztworu kolagenazy za pomocą igły 30 G i strzykawki 5 ml. Upewnij się, że wspólny przewód żółciowy i trzustka są napełnione po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Usuń rozdętą trzustkę za pomocą zakrzywionych kleszczy i drobnych nożyczek, aby oddzielić ją od zstępującej okrężnicy, jelit, żołądka i śledziony. Umieść trzustkę w 50-mililitrowej probówce zawierającej 3 ml roztworu kolagenazy i trzymaj ją na lodzie.</li>
</ol>
4. Trawienie trzustki
<ol>
	<li>Umieścić każdą probówkę o pojemności 50 ml w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Inkubuj przez 15 - 20 minut (czas różni się w zależności od odmiany i wieku myszy).</li>
	<li>Zawibruj rurkę za pomocą wiru.</li>
	<li>Basen 4 - 5 strawionych trzustek w dużym sterylnym sitku do zlewu i użyj miarki, aby trzustka dokładnie się rozpadła. Za pomocą igły 23 G i strzykawki o pojemności 10 ml z roztworem do płukania należy na siłę odpipetować strawione komórki z sita. Zebrać roztwór myjący do probówki o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Odwirować probówki o sile 97 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę i zdekantować supernatant.</li>
	<li>Dodaj 25 ml roztworu myjącego do probówek i ponownie zawiesić tkankę poprzez delikatne wirowanie. Wirować tkanki w temperaturze 97 x g w temperaturze 4 °C przez 1 minutę i zdekantować supernatant. Powtórz 3 razy. Uważaj, aby nie usunąć granulowanej tkanki.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie wysepek
<ol>
	<li>Dodać 10 ml roztworu oczyszczającego do umytego osadu tkankowego i delikatnie zawiesić zawartość.</li>
	<li>Delikatnie nałóż 5 ml roztworu izolacyjnego na roztwór oczyszczający. Uważaj, aby między tymi dwoma roztworami znajdowała się ostra ciecz.</li>
	<li>Odwirować probówkę o sile 560 x g w temperaturze 4 °C przez 15 minut z powolnym przyspieszaniem i bez hamowania. Włóż pipetę do interfejsu i zbierz warstwę wysp trzustkowych do nowych probówek o pojemności 50 ml.</li>
	<li>Umyj wysepki zgodnie z opisem w kroku 3.5.</li>
</ol>
6. Posiewanie i obróbka komórek wysp trzustkowych
<ol>
	<li>Zawiesić wyspy trzustkowe w 10 ml roztworu do hodowli wysp trzustkowych, delikatnie wymieszać i umieścić 100 μl/studzienkę za pomocą pipety wielokanałowej na płytce 96-dołkowej. Umieść około 5 wysepek na 96 dołków.</li>
	<li>Umieścić płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych na 12 godzin.</li>
	<li>Odwirować (112 x g) 96-dołkową płytkę i usunąć pożywkę.</li>
	<li>Rozcieńczyć chemikalia środowiskowe w pożywce hodowlanej wysepek. Dodać 100 μl każdego z rozcieńczalników chemicznych do oddzielnych studzienek płytki. Zawiesić wysepki w każdej studzience i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 °C (stężenie różni się w zależności od różnych substancji chemicznych w środowisku).</li>
</ol>
7. Barwienie i pomiar ROS
<ol>
	<li> Po leczeniu wysp trzustkowych przemyć 1x PBS (200 μL na każde 96 dołków). 
	nuta: Stężenie chemikaliów jest następujące: AFB1: 3 μM, Atrazyna: 100 μM, BaP: 10 μM, BPA: 100 μM, β-estrogen, PCB126: 10 μM, Nonylofenol i BPA: 100 μM.</li>
	<li>Użyj N-acetylocysteiny (NAC) jako przeciwutleniacza do tłumienia ROS. Dodać 5 mM NAC do rozcieńczalników chemicznych indukowanych ROS i inkubować przez 12 godzin w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Odwirować 96-dołkową płytkę przy 112 x g i inkubować z 5 μM roztworem sondy fluorescencyjnej (H2-DCFH-DA rozpuszczony w pożywce RPMI) w temperaturze 37 °C przez 60 minut.</li>
	<li>Przemyć leczone komórki wysp trzustkowych 3 razy PBS i zmierzyć fluorescencję za pomocą czytnika mikropłytek przy 488 nm. 
	nuta: Akumulację DCF w komórkach można zmierzyć poprzez wzrost fluorescencji przy długości fali 530 nm, gdy próbka jest wzbudzana przy długości fali 488 nm.</li>
	<li>Wykonaj test wydzielania insuliny stymulowanej glukozą (GSIS)9 na wyspach trzustkowych i nieleczonych ksenobiotykami indukujących ROS w celu zmierzenia wpływu ksenobiotyków na fizjologiczną funkcję wysp trzustkowych.</li>
</ol>

<ol><li>Maruthur, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+prevalence+of+type+2+diabetes%3A+increased+incidence+or+improved+survival%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Current+diabetes+reports%22%5BJournal%5D)">The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?</a> Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
<li>Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+beta-cell+failure+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Diabetes+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus.</a> Exp Diabetes Res. , 703538(2012).</li>
<li>Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biomarkers+of+oxidative+stress+in+aquatic+organisms+in+relation+to+toxic+environmental+pollutants%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology+and+environmental+safety%22%5BJournal%5D)">Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants.</a> Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).</li>
<li>Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+toxicity+in+%CE%B2-cells%3A+type+2+diabetes%2C+good+radicals+gone+bad%2C+and+the+glutathione+connection%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection.</a> Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).</li>
<li>Kaneto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+p21+expression+in+pancreatic+islet+cells%3A+possible+implication+in+beta-cell+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction.</a> Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).</li>
<li>Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogen+peroxide+alters+mitochondrial+activation+and+insulin+secretion+in+pancreatic+beta+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).</li>
<li>Gao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+palmitate+on+hepatic+insulin+resistance+are+mediated+by+NADPH+Oxidase+3-derived+reactive+oxygen+species+through+JNK+and+p38MAPK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).</li>
<li>Efendić, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreastatin+and+islet+hormone+release%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pancreastatin and islet hormone release.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).</li>
<li>Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ah+receptor+and+NF-%CE%BAB+interactions%2C+a+potential+mechanism+for+dioxin+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).</li>
<li>Cui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+X+receptor+regulates+the+AhR%2FCyp1A1+pathway+and+protects+liver+cells+from+benzo-%5B%CE%B1%5D-pyrene-induced+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+Letters%22%5BJournal%5D)">Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage.</a> Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).</li>
<li>Li, L. A., Wang, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCB126+induces+differential+changes+in+androgen%2C+cortisol%2C+and+aldosterone+biosynthesis+in+human+adrenocortical+H295R+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%22%5BJournal%5D)">PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells.</a> Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).</li>
<li>Asahi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bisphenol+A+induces+endoplasmic+reticulum+stress-associated+apoptosis+in+mouse+non-parenchymal+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Life+sciences%22%5BJournal%5D)">Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes.</a> Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2565847/">Murine pancreatic islet isolation.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255(2007).</li>
<li>Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+endothelium+in+the+modulation+of+isoflurane-induced+vasodilatation+in+rat+thoracic+aorta%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+anaesthesia%22%5BJournal%5D)">Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta.</a> British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).</li>
<li>Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+can+cause+sustained+hyperglycemia+in+C57%2FBL6J+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Visual+neuroscience%22%5BJournal%5D)">Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice.</a> Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).</li>
<li>Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+analogs+and+precursors%3A+rotarod+and+lethal+dose+studies+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).</li>
<li>Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+mouse+pancreatic+islet+isolation+and+intracellular+cAMP+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Coraz więcej dowodów sugeruje, że narażenie na chemikalia środowiskowe odgrywa ważną rolę w rozwoju cukrzycy typu 2. ROS indukowany ksenobiotykami został uznany za potencjalny czynnik etiologiczny przyczyniający się do rozwoju cukrzycy typu 2. Ludzie są narażeni na działanie szerokiej gamy ksenobiotycznych substancji chemicznych i istnieje ogromne zapotrzebowanie na nowatorskie techniki badawcze, aby skutecznie zidentyfikować substancje toksyczne dla trzustki i zbadać mechanizm toksyczności specyficzny dla komórek trzust...

Wzrost częstości występowania cukrzycy typu 2 stał się globalnym kryzysem zdrowotnym w ostatnich latach, stanowiąc poważne zagrożenie dla zdrowia publicznego1. Stwierdzono, że wiele czynników jest przyczynowo związanych z rozwojem T2DM, wśród których powtarzające się wyniki sugerują, że jednym z powszechnych punktów zbieżnych dla tych czynników jest indukcja stresu oksydacyjnego, który prowadzi do generowania nadmiernej ilości ROS2,3. 
Stwierdzono, że szerokie spektrum chemikaliów środowiskowych, w tym PCB, dioksyny i BaP, wywołuje stres oksydacyjny, który może upośledzać funkcję komórek β trzustki i prowadzić do insulinooporności i T2DM4. Chociaż fizjologiczny poziom ROS odgrywa ważną rolę w funkcjach komórkowych, narażenie na ROS, które przekracza zdolność systemu antyoksydacyjnego, powoduje uszkodzenie komórek/tkanek i prowadzi do chorób5. Komórki β trzustki wyrażają niski poziom enzymu przeciwutleniającego, a zatem są wrażliwym celem dla uszkodzeń wywołanych stresem oksydacyjnym6,7. Wykazano, że przewlekłe narażenie na wysokie poziomy ROS powoduje wywołaną stresem dysfunkcję komórek trzustki5, a także insulinooporność wątroby i tkanki tłuszczowej8. 
Ogólnym celem tego projektu jest opracowanie testu opartego na komórkach do badania substancji chemicznych pod kątem ich potencjału cukrzycowego na podstawie indukcji ROS w komórkach trzustki. Trzustka nie ma detoksykacji metabolicznej i jest wrażliwym celem dla uszkodzeń wywołanych przez ksenobiotyki6,7. W związku z tym, poprzez bezpośredni pomiar ROS generowanych w komórkach trzustki, test ten powinien zapewnić bezpośrednie przybliżenie uszkodzenia trzustki wywołanego substancją chemiczną. Aby opracować tę metodę, wyizolowaliśmy mysie wyspy trzustkowe, wyhodowaliśmy izolowaną wyspę trzustkową w warunkach hodowli komórkowej za pomocą chemikaliów i wykorzystaliśmy indukowaną chemicznie generację ROS jako odczyt. Procedura ta jest prosta i skuteczna w identyfikacji substancji chemicznych indukujących ROS w izolowanej wysepce; Można go dalej rozwijać w celu zbadania mechanizmów toksyczności, które są specyficzne dla trzustki in vitro.

<table><tbody><tr><td>10 i razy; Hank' s Zrównoważony roztwór soli&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 4</td><td>Worthington Biochemical Corporation</td><td>CLS-4</td><td></td></tr><tr><td>roztwór polisarozy/diatrizoinianu sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>2',7'-dichlorofluoresceina (DCFH-DA)</td><td>Sigma</td><td>D6883-50MG</td><td></td></tr><tr><td>czytnik mikropłytek fluorescencyjnych&nbsp;</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>streptomycyna</td><td>GIBCO</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>avertin</td><td>Sigma</td><td>T48402-25G</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw ELISA insuliny dla szczurów/myszy</td><td>Millipore</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Sorval</td><td>Sorval RT7</td><td>do wirówki płytkowej 96-dołkowej</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>Biotek</td><td>Epoch 2</td><td>do odczytu fluorescencji</td></tr></tbody></table>

badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Stwierdzono, że narażenie na pewne chemikalia środowiskowe u ludzi i zwierząt powoduje uszkodzenia komórek β trzustki, co prowadzi do rozwoju cukrzycy typu 2 (T2DM). Chociaż mechanizmy indukowanego przez chemikalia β uszkodzenia komórek były niejasne i prawdopodobnie złożone, jednym z powtarzających się odkryć jest to, że te chemikalia wywołują stres oksydacyjny prowadzący do generowania nadmiernej ilości reaktywnych form tlenu (ROS), które indukują uszkodzenie komórki β. Aby zidentyfikować potencjalne cukrzycotwórcze chemikalia środowiskowe, wyizolowaliśmy komórki wysp trzustkowych od myszy C57BL / 6 i hodowaliśmy komórki wysp trzustkowych na 96-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych; następnie komórkom wysp trzustkowych dozowano chemikalia, a wytwarzanie ROS wykryto za pomocą barwnika fluorescencyjnego 2',7'-dichlorofluoresceiny (DCFH-DA). Korzystając z tej metody, odkryliśmy, że bisfenol A (BPA), benzo[a]piren (BaP) i polichlorowane bifenyle (PCB) mogą indukować wysoki poziom ROS, co sugeruje, że mogą potencjalnie indukować uszkodzenia w komórkach wysp trzustkowych. Ta metoda powinna być przydatna do badań przesiewowych ksenobiotyków cukrzycowych. Ponadto hodowane komórki wysp trzustkowych mogą być również przystosowane do analizy in vitro toksyczności indukowanej chemicznie w komórkach trzustki.

Mikrograf zdrowego wyizolowanego wysepki widoczny jest na Rysunku 2, gdzie wysepki mają kształt okrągły lub owalny i stosunkowo jednolity rozmiar (choć jednorodność rozmiaru może różnić się w zależności od szczepu). Następnie zbadaliśmy funkcje wysepek trzustkowych w teście in vitro, izolując wysepki i stymulując wydzielanie insuliny w hodowlach tych wysepek. Rysunek 3 przedstawia naszą typową analizę testu GSIS z wyizol...

Tutaj prezentujemy protokół izolacji komórek wysp trzustkowych myszy w celu badania indukcji ROS przez ksenobiotyki w celu zidentyfikowania potencjalnych cukrzycopochodnych ksenobiotycznych substancji chemicznych.

Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

Komórki trzustki są wrażliwym celem dla uszkodzeń wywołanych przez ROS, co jest związane z rozwojem cukrzycy typu 2. Testy oparte na komórkach trzustki pomogą zidentyfikować substancje chemiczne indukujące ROS. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie izolowanych komórek wysp trzustkowych do prostej i skutecznej identyfikacji substancji chemicznych indukujących ROS, które mogą mieć dodatkowy potencjał cukrzycowy.Metoda ta może być również stosowana do analizy in vitro wpływu substancji chemicznych na fizjologiczne funkcje trzustki, takie jak stymulowane glukozą wydzielanie insuliny. Użyj pary zakrzywionych kleszczy, aby zacisnąć dwunastnicę blisko pozycji zwieracza Oddi. Za pomocą kolejnej pary zakrzywionych kleszczy zaciśnij ścianę dwunastnicy, aby zablokować drogę żółciową.Znajdź wspólny przewód żółciowy i za pomocą igły o rozmiarze 30 G i pięciomililitrowej strzykawki powoli wstrzyknij trzy mililitry roztworu kolagenazy. Następnie zmień pozycję myszy tak, aby głowa była bliższa, a stopy dystalne. Upewnij się, że wspólny przewód żółciowy i trzustka są napompowane po wstrzyknięciu.Za pomocą zakrzywionych kleszczy i cienkich nożyczek usuń rozdętą trzustkę, aby oddzielić ją od zstępującej okrężnicy, jelit, żołądka i śledziony. Następnie umieść narząd w 50-mililitrowej probówce zawierającej trzy mililitry roztworu kolagenazy i trzymaj go na lodzie. Umieść każdą 50-mililitrową probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza i inkubuj je przez 15 do 20 minut.Zmieszaj rurki, a następnie zbierz cztery do pięciu strawionych narządów w dużym sterylnym sitku do zlewu i użyj miarki, aby dokładnie rozbić trzustkę. Za pomocą igły o rozmiarze 23 G i dziesięciomililitrowej strzykawki zawierającej roztwór do mycia, energicznie odpipetuj strawione komórki z sita. Następnie zbierz roztwór myjący w 50-mililitrowej probówce.Odwirować probówki o ciśnieniu 97 g i temperaturze czterech stopni Celsjusza przez jedną minutę i zdekantować supernatant. Dodaj 25 mililitrów roztworu myjącego do probówek i ponownie zawieś tkankę, delikatnie wirując. Następnie odwirować tkankę i zdekantować supernatant.Powtórz pranie trzy razy, uważając, aby nie usunąć granulowanej chusteczki. Aby oczyścić wysepki, dodaj dziesięć mililitrów roztworu oczyszczającego do umytego osadu tkankowego i delikatnie ponownie zawieś zawartość. Delikatnie nałóż pięć mililitrów roztworu izolacyjnego na roztwór oczyszczający.Upewnij się, że między tymi dwoma roztworami zachowana jest ostra granica cieczy. Odwirować probówkę o masie 560 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut, z powolnym przyspieszaniem i bez przerwy. Następnie włóż pipetę do interfejsu i zbierz warstwę wysepki.Przenieś roztwór do nowych 50-mililitrowych probówek przed umyciem wysepki, jak pokazano. Po usunięciu końcowego płukania dodaj dziesięć mililitrów roztworu do hodowli wysp trzustkowych i delikatnie i dokładnie wymieszaj, aby ponownie zawiesić wyspy. Następnie, za pomocą pipety wielokanałowej, przenieś 100 mikrolitrów na studzienkę do dołków płytki 96-dołkowej.Inkubować płytkę w inkubatorze do hodowli tkankowych przez 12 godzin. Następnie odwirować płytkę o wadze 112 g i usunąć pożywkę. Rozcieńczyć chemikalia środowiskowe w pożywce do hodowli wysp trzustkowych.Dodaj 100 mikrolitrów każdego z rozcieńczalników chemicznych do oddzielnych studzienek płytki. Ponownie zawiesić wysepki w każdej studzience i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Po poddaniu wysepek obróbce chemicznej, należy użyć 1x PBS do przemycia próbek.Następnie dodaj do studzienek pięć milimolowych N-acetylocysteiny lub NAC jako przeciwutleniacz do gaszenia ROS i inkubuj płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 12 godzin. Odwirować 96-dołkową płytkę o masie 112 g, następnie dodać pięciomikromolowy roztwór sondy fluorescencyjnej i inkubować płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 60 minut. Użyj PBS do trzykrotnego przemycia leczonych komórek wysp trzustkowych i użyj czytnika mikropłytek o długości 480 nanometrów, aby zmierzyć fluorescencję.Na koniec wykonaj test wydzielania insuliny stymulowany glukozą lub test GSIS na wyspach trzustkowych leczonych i nieleczonych ROS indukujących ROS, aby zmierzyć wpływ ksenobiotyków na fizjologiczną funkcję wysp trzustkowych. Pokazane tutaj są zdrowe wyspy trzustkowe, wyizolowane z myszy C57 Black / 6, które mają okrągły lub owalny kształt i są stosunkowo jednolite pod względem wielkości. W tym teście GSIS, przy użyciu izolowanych wysp trzustkowych stymulowanych glukozą do wydzielania insuliny, zaobserwowano odpowiedź zależną od dawki.Kiedy izolowane wysepki zostały potraktowane wymienionymi tutaj ksenobiotykami, kilka substancji chemicznych, w tym atrazyna, BaP, BPA i PCB, spowodowało znaczną indukcję reaktywnych form tlenu. Jednak dodanie NAC było w stanie wygasić produkcję ROS przez obróbkę chemiczną. Ponadto wyspy trzustkowe wstępnie leczone PCB126 i BPA wykazały znaczny spadek wydzielania insuliny w porównaniu z grupą kontrolną, co potwierdza ważną rolę ROS w powodowaniu uszkodzeń fizjologicznych funkcji komórek beta trzustki, co prowadzi do cukrzycy typu 2.Po opanowaniu izolację wysp trzustkowych można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby użyć wirowania gradientowego w celu oczyszczenia wysp trzustkowych z innych zanieczyszczeń trzustki. Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak wydzielanie insuliny stymulowane glukozą, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak wpływ substancji chemicznych na fizjologiczne funkcje wysp trzustkowych.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się toksykologią do zbadania cukrzycotwórczego potencjału substancji chemicznych w środowisku w izolowanych komórkach wysp trzustkowych myszy. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować wysepki trzustkowe myszy i używać tych komórek wysp trzustkowych do identyfikacji.

a-murine-pancreatic-islet-cell-based-screening-for-diabetogenic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Izolacja wysepek trzustkowych myszy

Badanie in vitro funkcji komórek β przy użyciu izolowanych mysich wysepek Langerhansa jest ważnym elementem badań nad patofizjologią i terapią cukrzycy. Chociaż dostępnych jest wiele dalszych zastosowań, protokół ten szczegółowo opisuje pomiar wewnątrzkomórkowego cyklicznego monofosforanu adenozyny (cAMP) jako podstawowego parametru określającego funkcję komórek β.

Metoda izolacji wysp trzustkowych myszy i wewnątrzkomórkowego oznaczania cAMP

Prezentujemy tutaj protokół izolacji wysp trzustkowych z mysiego modelu cukrzycy typu 2, Leprdb oraz szczegóły testu żywych komórek do pomiaru wydzielania insuliny z nienaruszonych wysp trzustkowych, który wykorzystuje mikroskopię 2-fotonową.

Mysi model cukrzycy typu 2 Leprdb: izolacja wysp trzustkowych i obrazowanie 2-fotonowe żywych komórek nienaruszonych wysp trzustkowych

Testy kolonii in vitro do wykrywania samoodnawiania i różnicowania komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej trzustki mysiej zostały opracowane. W tych testach komórki progenitorowe trzustki powodują powstawanie kolonii komórkowych w przestrzeni trójwymiarowej w półstałym podłożu zawierającym metylocelulozę. Opisano protokoły postępowania z pojedynczymi komórkami i charakterystyki poszczególnych kolonii.

In vitro Testy kolonijne do charakteryzowania trójpotencjałowych komórek progenitorowych wyizolowanych z dorosłej mysiej trzustki

Kluczowe wyzwania dla dziedziny badań nad cukrzycą to zrozumienie mechanizmów molekularnych regulujących replikację komórek β wysp trzustkowych oraz opracowanie metod stymulowania regeneracji komórek β. W niniejszym artykule przedstawiono metodę badań przesiewowych o wysokiej zawartości w celu identyfikacji i oceny aktywności małych cząsteczek wspomagającej replikację komórek β.

Platforma odkrywania replikacji β komórek wysp trzustkowych o wysokiej zawartości in vitro

Opisujemy metodę izolacji komórek endokrynnych z embrionalnej, noworodkowej i postnatalnej trzustki, a następnie sekwencjonowania RNA pojedynczych komórek. Metoda ta pozwala na analizę rozwoju linii endokrynnej trzustki, heterogeniczności komórek i dynamiki transkryptomicznej.

Jednokomórkowe analizy transkryptomiczne komórek endokrynnych trzustki myszy

Badanie to opracowało uproszczoną metodę efektywnego wyodrębniania funkcjonalnych wysetek pierwotnych i komórek acynarnych z trzustki myszy, co stanowi cenne narzędzie do badania komunikacji międzykomórkowej w patogenezie ostrej cukrzycy indukowanej zapaleniem trzustki.

Prosta i szybka metoda jednoczesnej izolacji pierwotnych wysp i pierwotnych komórek acinowych trzustki od myszy

Oferujemy minimalnie inwazyny protokół do domięśniowej transplantacji wyspików komórek macierzystych trzustki pochodzących z ludzkich komórek macierzystych do szczurów immunodeficytarnych w celu in vivo implantacji i dalszej analizy.

Przeszczep domięśniowy ludzkich pluripotentnych komórek macierzystych pochodzenia trzustkowego do szczurów

Protokół ten opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgicznego pobierania brań, trawienia enzymatycznego oraz oczyszczania wysetek trzustkowych szczurów Lewisa w gęście, umożliwiając przygotowania o wysokiej wydajności i wysokiej czystości do bezpośredniego zastosowania w przeszczepach lub badaniach in vitro .

Izolacja i oczyszczanie wysepek trzustkowych od szczurów Lewisa za pomocą trawienia enzymatycznego i rozdzielania gęstościowo-gradientowego

Opracowano nową metodę ewolucji kierowanej, specyficzną dla dziedziny inżynierii termostabilności, a następnie zwalidowano ją dla enzymów bakteriolitycznych. Po zaledwie jednej rundzie mutagenezy losowej ewoluowany enzym bakteriolityczny, PlyC 29C3, wykazał ponad dwukrotnie wyższą aktywność resztkową w porównaniu z białkiem typu dzikiego po inkubacji w podwyższonej temperaturze.

Nowa metoda przesiewowa dla ewolucji sterowanej termostabilnych enzymów bakterio();tycznych

Poznaj metodę izolacji komórek wysp trzustkowych myszy do badania indukcji ROS przez ksenobiotyki. Technika umożliwia identyfikację substancji chemicznych o potencjalnym działaniu cukrzycogennym in vitro.

Badania przesiewowe oparte na komórkach wysp trzustkowych trzustki pod kątem cukrzycopochodnych substancji chemicznych

Przeglądaj więcej filmów