Protokół MPLEx do analiz multiomicznych próbek gleby

Metoda ta jest stosowana w dziedzinie proteomiki, metabolomiki i lipidomiki, pomagając uzyskać kompleksowe informacje na temat zmian molekularnych zachodzących w zbiorowiskach mikroorganizmów związanych z glebą w wyniku perturbacji środowiskowych. Główną zaletą tej techniki jest to, że uzyskanie wielu analitów z jednej próbki gleby zwiększa precyzję i dokładność, jednocześnie skracając czas i wysiłek związany z przygotowaniem próbki. Na początek dla każdej 20-gramowej próbki gleby zważ 10 gramów w dwóch oddzielnych 50-mililitrowych probówkach kompatybilnych z metanolem/chloroformem.

Używaj plastikowych rurek wykonanych z PTFE, ponieważ chloroform wypłukuje większość tworzyw sztucznych, zanieczyszczając próbki. Dodaj około 10 mililitrów stali nierdzewnej mytej chloroformem i kulek granatu do każdej tuby. Następnie, będąc na lodzie, dodaj cztery mililitry zimnej, ultraczystej wody do każdej probówki i przenieś próbki w wiadrze na lód do dygestorium.

Używając 25-mililitrowej szklanej pipety serologicznej, szybko dodaj 20 mililitrów lodowatego chloroformu dwa do jednego do jednego do objętości metanolu do probówek. Dokręć pokrywki i przemieszaj mieszaninę gleby do roztworu. Chloroform-metanol pomaga rozbijać ścianę komórkową prokariontów, a także dezaktywuje aktywność enzymatyczną.

Następnie przymocuj rurki do 50-mililitrowych nasadek wirowych i jeśli to możliwe, wiruj poziomo przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza w lodówce. Następnie umieść próbki w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza na około 15 minut, aby całkowicie je schłodzić. Następnie, używając sonikatora sondy umieszczonej w okapie oparowym, poddaj sonikację każdej próbki za pomocą sześciomilimetrowej sondy 1/4 cala o amplitudzie 60% przez 30 sekund na lodzie.

Po sonikacji umieść próbki w zamrażarce o temperaturze ujemnej 80 stopni Celsjusza, ponieważ sonikacja może generować dużo ciepła. Po powtórzeniu etapów poziomego wirowania, sonikacji i zamrażania, odwiruj próbki w temperaturze 4 000 razy większej niż grawitacja i w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. W tym momencie próbka zostanie rozdzielona na górną warstwę metabolitu, warstwę pośrednią białka i dolną warstwę lipidową.

Umieścić próbki na lodzie. Następnie, wewnątrz dygestoria, użyj 10-mililitrowej szklanej pipety serologicznej, aby przenieść górne warstwy metabolitów z dwóch 50-mililitrowych probówek do jednej dużej szklanej fiolki. Teraz lekko przechyl 50-mililitrową rurkę, aby uwolnić warstwę pośrednią białka, tak aby swobodnie unosiła się na dolnej warstwie lipidowej.

Następnie, używając czystej szpatułki laboratoryjnej z płaską główką ze stali nierdzewnej, ostrożnie zgarnij obie międzywarstwy białka i umieść je razem w jednej nowej 50-mililitrowej tubce. Za pomocą szklanej pipety serologicznej o pojemności 25 mililitrów przenieś dolne warstwy lipidów do jednej dużej szklanej fiolki. Dodaj 20 mililitrów lodowatego metanolu do dwóch probówek z zanieczyszczeniami i do jednej probówki z międzywarstwą białkową.

Krótko zawiruj probówki i odwiruj granulki gruzu i warstwę pośrednią białka pod ciśnieniem 4000 razy grawitacji i czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Następnie przelać metanol do pojemnika na odpady niebezpieczne w dygestorium. Zamroź granulki białka i zanieczyszczeń w ciekłym azocie i wysusz je w liofilizatorze przez około dwie godziny.

Dodaj 20 mililitrów buforu do solubilizacji białek w 50-milimolowym buforze tris o pH 8,0 do każdej z granulek zanieczyszczeń i 10 mililitrów do probówki międzywarstwowej białka. W dygestorium sonda sonikuje próbki o amplitudzie 20% przez 30 sekund, aby wprowadzić je do roztworu. Wirować próbki przez dwie minuty.

Następnie umieść próbkę międzywarstwy białka w rotatorze probówki laboratoryjnej w temperaturze 50 stopni Celsjusza na 30 minut, aby rozpuścić białko. Wiruj poziomo próbki szczątków przez dodatkowe 10 minut, aby zlizować wszelkie pozostałe nienaruszone komórki. Następnie obracaj się z próbkami międzywarstwy białkowej przez pozostałe 20 minut.

Odwirować wszystkie próbki przy 4 500-krotności grawitacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut i zebrać supernatant z każdej probówki na próbkę do dwóch 50-mililitrowych probówek. Dodaj 10 mililitrów buforu do rozpuszczania do osadu białkowego międzywarstwowego. Następnie poddać sonikacji i zmieszać osad z powrotem do roztworu.

Po odwirowaniu równo połącz supernatanty w dwóch 50-mililitrowych probówkach z supernatantami z osadów gruzu i odwiruj probówki w wirniku kubełkowym o stałym kącie nachylenia pod kątem 8 000 razy grawitacji i czterech stopniach Celsjusza przez 10 minut, aby zebrać pozostałe zanieczyszczenia. Podzielić supernatanty na dwie 50-mililitrowe probówki. Następnie, za pomocą 10-mililitrowej szklanej pipety serologicznej, dodaj 7,5 mililitra TCA do każdej probówki.

Zwirować próbki do roztworu. Następnie umieść próbki w zamrażarce o temperaturze ujemnej 20 stopni Celsjusza na dwie godziny do nocy. Aby granulować wytrącone białko, odwirować próbkę pod ciśnieniem 4 500 razy większym niż grawitacja i cztery stopnie Celsjusza przez 10 minut, a następnie zdekantować supernatant do odpadów.

Dodaj 10 mililitrów 100% lodowatego acetonu do każdej granulki białka. Zwiruj rurki i połącz jak granulki w jedną rurkę. Odwirować, a następnie zdekantować aceton.

Używając mniejszej objętości acetonu, umyj granulkę dwukrotnie i przenieś zawiesinę do 1,5 lub dwumililitrowej rurki na ostatnie wirowanie. Zdekantować supernatant do odpadów i pozostawić granulkę do wyschnięcia odwróconą na papierowej chusteczce w dygestorium przez około 20 minut. W zależności od wielkości osadu dodać od 100 do 200 mikrolitrów buforu do solubilizacji białek.

Sonikować i wirować osad do roztworu. Należy zauważyć, że próbka może być lepka z powodu substancji humusowych wytrącających się wraz z białkiem, które zostaną usunięte przy kolejnym odwirowaniu. Na koniec wstrząsnąć próbką w inkubatorze lub wytrząsarce z prędkością 300 obr./min i w temperaturze 40 stopni Celsjusza przez 30 minut, aby rozpuścić białko do roztworu przed przystąpieniem do trawienia białka lub szybkiego zamrażania w celu przyszłego przetwarzania.

Korzystając z protokołu MPLEx pokazanego w tym filmie, wyekstrahowano 3 376 peptydów, 105 lipidów i 102 metabolity polarne z rodzimej gleby preriowej Kansas, a ekstrakcja białek w protokole jest porównywana z zestawami do ekstrakcji białek i ekstrakcjami SDS przy użyciu LC-MS / MS z odwróconą fazą. Początkowe porównanie trzech powtórzeń komercyjnego zestawu do ekstrakcji białek i metod SDS wykazało, że tylko 12% peptydów pokrywało się między tymi dwiema technikami, co pokazuje złożoność społeczności drobnoustrojów i różne efekty ekstrakcji. Po porównaniu MPLEx z komercyjnym zestawem do ekstrakcji białek i ekstraktami SDS, około 38% peptydów zaobserwowanych przy użyciu metody MPLEx wykryto również podczas stosowania SDS i/lub komercyjnych ekstrakcji zestawowych.

Biorąc pod uwagę liczbę gatunków w społeczności bakterii glebowych w Kansas i jej metagenom, nakładanie się identyfikacji peptydów jest uzasadnione. Jak pokazano tutaj, szerokie zastosowanie podejścia MPLEx zostało wcześniej ocenione przy użyciu archeonu S. acidocaldarius, konsorcjum unicyanobakteryjnego, tkanki kory mózgowej myszy, ludzkiego moczu i liści A.thaliana. We wszystkich przypadkach liczba białek zaobserwowanych metodą MPLEx była podobna do tej dla kontroli, co wskazuje na jej użyteczność dla wielu różnych typów próbek.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać białka, metabolity i lipidy z pojedynczej próbki gleby. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby być elastycznym, ponieważ wszystkie rodzaje gleby są różne. Na przykład wielkość międzywarstwy białkowej będzie się różnić w zależności od biomasy glebowej i substancji humusowych obecnych w glebie.

Nie zapominaj, że praca z chloroformem może być bardzo niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak praca pod wyciągiem.