Wykorzystanie końcowego znakowania końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) i testów kaspazy 3/7 do pomiaru śmierci komórek naskórka u żab z chytridiomykozą
16 maja 2018
Określamy ilościowo śmierć komórek naskórka u żab z chytridiomykozą, używając dwóch metod. Po pierwsze, używamy końcowego znakowania końca nacięcia dUTP za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) in situ, aby określić różnice między klinicznie zakażonymi i niezakażonymi zwierzętami. Po drugie, przeprowadzamy analizę szeregów czasowych apoptozy nad infekcją za pomocą analizy białka kaspazy 3/7.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja wpływu patogenu grzybów Batrachochytrium dendrobatidis na apoptozę i śmierć komórek w tkance naskórka żab. Ta metoda może pomóc nam zrozumieć choroby dzikich zwierząt, takie jak to, czy infekcja powoduje śmierć komórki lub odwrotnie, czy istnieją mechanizmy odpornościowe przeciwko infekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać na małych próbkach biopsji tkanek, dzięki czemu małe osoby mogą być wielokrotnie pobierane w trakcie infekcji.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować szkiełka hydrofilowe z próbką tkanki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby odparafinować skrawki tkanki, przemyj szkiełka trzy razy ksylenem przez pięć minut każdy w słoiku z kopeliną. Następnie umyj szkiełka 100% etanolem dwa razy przez pięć minut każde.
Następnie umyj szkiełka 95% etanolem i 70% etanolem przez trzy minuty każde. Następnie umyj szkiełka raz PBS przez pięć minut. Aby przygotować szkiełka do badań eksperymentalnych i kontroli ujemnej, należy poddać tkankę wstępnej obróbce, dodając świeżo rozcieńczoną proteinazę K bezpośrednio do szkiełek.
Inkubuj szkiełka przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka w PBS dwa razy po dwie minuty każde. Aby przygotować szkiełka kontroli pozytywnej, należy wstępnie potraktować tkankę buforem DN, a następnie inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez pięć minut.
Następnie rozpuść DNazę w buforze DN do końcowego stężenia 0,1 mikrograma na mililitr. Dodaj przygotowany roztwór DNazy do szkiełek. Inkubować szkiełka przez 15 minut w temperaturze pokojowej.
Następnie umyj szkiełka wodą destylowaną w słoiku z kopeliną pięć razy po trzy minuty każdy. Schłodzić reakcję w 3% nadtlenku wodoru w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka w PBS dwa razy po dwie minuty każde.
Następnie dodaj bufor równowagi do tkanki na szkiełkach. Inkubować przez 10 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie strzepnij nadmiar płynu wokół sekcji tkanki.
Rozcieńczyć końcowy enzym deoksynukleotydylotransferazy w buforze reakcyjnym. Następnie dodaj go do tkanki na szkiełkach kontrolnych doświadczalnych i kontrolnych. Inkubować w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.
Następnie umieścić szkiełka w słoiku z kopiną zawierającym stężenie robocze buforu zatrzymującego. Mieszać przez 15 sekund, a następnie inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj szkiełka PBS trzy razy przez jedną minutę i strzepnij nadmiar płynu.
Następnie dodaj koniugat anty-digoksygeniny, wstępnie podgrzany do temperatury pokojowej, bezpośrednio na tkankę. Inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej ciemnej komorze. Po zakończeniu inkubacji przemyć szkiełka czterokrotnie PBS przez dwie minuty każde.
Strzepnij nadmiar płynu. Następnie dodaj medium montażowe do szkiełek. Dodać 15 mikrolitrów roztworu DAPI do podłoża montażowego na szkiełkach.
Przykryj każde szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemności. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego obserwuj szkiełka natychmiast po zakończeniu procesu stania.
Rób zdjęcia 400 razy w losowych odstępach wzdłuż każdej sekcji skóry. Policz niebieskie komórki zabarwione DAPI, aby upewnić się, że widocznych jest co najmniej 100 komórek na odcinek skóry na zwierzę. Następnie policz liczbę komórek TUNEL-dodatnich, które pojawiają się jako czerwone pojedyncze komórki z wyraźnymi krawędziami komórek.
Na początek użyj mikroskopu z odwróconym światłem 40 razy, aby zrobić zdjęcie każdego z palców żaby u nogi. Narysuj linie wokół krawędzi klipsa na palce i użyj oprogramowania do obrazowania, aby oszacować obszar w kształcie. Aby ocenić powierzchnię trójwymiarowej próbki skóry, pomnóż szacowaną powierzchnię przez liczbę pi.
Aby wyekstrahować białka z zamrożonej próbki palca żaby, umieść próbkę w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej z nakrętką mikrowirówkową zawierającą 100 mikrolitrów buforu próbki i dwa koraliki ze stali nierdzewnej. Użyj ubijaka do kulek z maksymalną prędkością, aby zlizować komórki. Następnie umieść probówkę na lodzie na trzy minuty.
Następnie odwirować probówkę, aby zebrać supernatant. Aby przeprowadzić test kaspazy 3/7 na 384-dołkowej płytce, dodaj 10 mikrolitrów buforu próbki jako ślepą próbę i 10 mikrolitrów ekstraktu białkowego w trzech powtórzeniach. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów dostępnego w handlu odczynnika kaspazy 3/7 do ekstraktu białkowego i ślepych studzienek.
Następnie delikatnie potrząsaj płytką przez 15 sekund, aby wymieszać dwa odczynniki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Na koniec użyj czytnika płytek luminescencyjnych, aby zmierzyć luminescencję próbki.
W tym badaniu zakażone zwierzęta wykazują znacznie więcej komórek TUNEL-dodatnich w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, co ilustrują komórki zabarwione na czerwono lub różowo. U zwierząt kontrolnych jest niewiele komórek TUNEL-dodatnich i nie są one skoncentrowane w naskórku. U zakażonych zwierząt komórki TUNEL-dodatnie występują częściej w naskórku.
Komórki TUNEL-dodatnie są bardziej skoncentrowane w pobliżu i bezpośrednio przylegają do widoków zainfekowanych komórek. Ponadto nad naskórkiem i w warstwach naskórka znajdują się bardziej rozpowszechnione komórki TUNEL-dodatnie, które są głębsze niż miejsce, w którym znajdował się patogen grzybiczy. U zakażonych zwierząt we wszystkich trzech typach skóry występuje więcej komórek TUNEL-dodatnich, ze szczególnie wysokim poziomem w skórze ud i skóry.
W teście kaspazy intensywność infekcji jest dodatnio skorelowana z aktywnością kaspazy 3/7. Ponadto aktywność kaspazy 3/7 u zwierząt zakażonych i niezakażonych różniła się w czasie. Aktywność kaspazy 3/7 zmniejszyła się w ciągu pierwszych kilku tygodni po inokulacji, a następnie wzrosła pod koniec siódmego tygodnia u zakażonych zwierząt.
Aktywność kaspazy 3/7 pozostała stała u osób niezakażonych. Podczas próby wykonania procedury testu TUNEL ważne jest, aby przeczytać szkiełka tego samego dnia, w którym przeprowadzono test, aby uniknąć utraty czułości i przechowywać szkiełka w chłodnym, ciemnym miejscu w celu ochrony barwników. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykryć apoptozę i śmierć komórki przy użyciu dwóch różnych metod wykrywania w małych próbkach tkanek, takich jak skóra.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie analizuje wpływ grzybiczego patogenu płazów Batrachochytrium dendrobatidis na apoptozę i śmierć komórek w tkance naskórka żaby. Dzięki zastosowaniu histologii in situ metodą TUNEL oraz analizy białek kaspazy 3/7, badanie ma na celu wyjaśnienie związku między infekcją a śmiercią komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Choroby dzikich zwierząt
- Biologia komórki
Wprowadzenie
- Chytrydiomikoza stanowi istotne zagrożenie dla populacji płazów.
- Zrozumienie mechanizmów śmierci komórkowej może wesprzeć działania z zakresu ochrony przyrody.
- Apoptoza może odgrywać rolę w odpowiedzi na infekcje grzybicze.
- Małe próbki tkanek umożliwiają wielokrotną analizę w trakcie przebiegu infekcji.
Cel badania
- Ilościowe określenie śmierci komórek naskórka u żab zainfekowanych chytridiomikozą.
- Określenie różnic w poziomie apoptozy między żabami zainfekowanymi a niezainfekowanymi.
- Analiza przebiegu czasowego apoptozy podczas infekcji.
Zastosowane metody
- Metoda TUNEL (znakowanie końców nacięć dUTP za pośrednictwem transferazy terminalnej) do analizy histologicznej.
- Analiza białka kaspazy 3/7 do oceny serii czasowej.
- Przygotowanie hydrofilowych szkiełek przedmiotowych z próbkami tkanek.
- Deparafinizacja przekrojów tkankowych przy użyciu przemywania ksylenem i etanolem.
Główne wyniki
- Zaobserwowano różnice w tempie apoptozy pomiędzy żabami zakażonymi a niezakażonymi.
- Analiza serii czasowych ujawniła trendy w obumieraniu komórek w przebiegu infekcji.
- Zastosowane metody wykazały skuteczność w analizie małych próbek tkanek.
- Uzyskane informacje mogą przyczynić się do zrozumienia odpowiedzi immunologicznej na zakażenie.
Wnioski
- Badanie dostarcza cennych danych na temat wpływu chytridiomikozy na komórki naskórka żab.
- Zrozumienie apoptozy w tym kontekście może pomóc w opracowaniu strategii ochrony dzikiej przyrody.
- Przyszłe badania mogłyby zgłębić mechanizmy odpornościowe przeciwko infekcjom grzybiczym.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsze badanie demonstruje, w jaki sposób testy apoptozy mogą być wykorzystywane do oceny uszkodzeń tkanek indukowanych przez patogeny w modelach chorób dzikich zwierząt, zapewniając ramy dla mechanistycznej redukcji ryzyka we wczesnej fazie walidacji celu. Poprzez kwantyfikację śmierci komórek naskórka u żab zainfekowanych Batrachochytrium dendrobatidis, podejście to zwiększa pewność prognostyczną w ocenie interakcji gospodarz-patogen i dostarcza informacji niezbędnych do odkrywania translacyjnych biomarkerów. Zastosowanie małych biopsji tkankowych umożliwia pobieranie próbek wzdłużnych, co jest kluczowe dla monitorowania progresji choroby oraz interwencji terapeutycznych w systemach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez odróżnienie apoptozy wywołanej przez patogen od mechanizmów obronnych gospodarza w tkance naskórkowej.
- Wartość operacyjna: Dostarcza danych o śmierci komórek z rozdzielczością przestrzenną za pomocą barwienia TUNEL, co pozwala wyjaśnić mechanizmy uszkodzenia tkanki w modelach chorób zakaźnych.
- Wartość prognostyczna: Zwiększa pewność co do wybranego celu poprzez korelację aktywności kaspazy 3/7 z ładunkiem infekcji w czasie, umożliwiając profilowanie czasowe oraz analizę zależności dawka-odpowiedź.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Ustanawia zstandaryzowane protokoły wykrywania apoptozy w małych próbkach tkanek, umożliwiając powtarzalny screening związków w warunkach ograniczonej ilości materiału.
- Wartość operacyjna: Test kaspazy 3/7 zapewnia kompatybilność z wysokoprzepustowością w eksperymentach zależnych od czasu, natomiast metoda TUNEL pozwala na walidację przestrzennych wzorców apoptozy.
- Gotowość testu: Mikroskopia fluorescencyjna i odczyty luminescencyjne generują wyniki ilościowe odpowiednie do optymalizacji testu i powtarzalności między laboratoriami.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Łączy apoptozę naskórka z ciężkością choroby, wspierając dopasowanie biomarkerów pomiędzy odczytami molekularnymi a klinicznym postępem infekcji.
- Wartość operacyjna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji badań w oparciu o analizę ryzyka poprzez śledzenie dynamiki kaspazy 3/7 w poszczególnych stadiach infekcji w badaniach podłużnych.
- Ciągłość translacyjna: Wykazuje, w jaki sposób histologiczne i biochemiczne testy apoptozy mogą być łączone w celu wzmocnienia trafności przedklinicznej w modelach chorób zakaźnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z wczesnymi etapami procesów badawczych (discovery workflows), dostarczając odczytów apoptozy, które pomagają w walidacji celu oraz identyfikacji związków wiodących, szczególnie w badaniach, w których dostępność tkanek ogranicza zastosowanie konwencjonalnej histologii.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących tego, czy ekspozycja na patogen indukuje lub hamuje apoptozę w tkance gospodarza, co pozwala wyjaśnić mechanizmy uszkodzeń tkankowych.
- Przesiewanie: Test kaspazy 3/7 umożliwia skalowalne, ilościowe przesiewanie modulatorów wpływających na apoptozę w małych próbkach biopsji.
- Analityka: Wyniki luminescencyjne i fluorescencyjne dostarczają mierzalnych, znormalizowanych pomiarów do porównywania apoptozy w różnych warunkach i punktach czasowych.
- Badania translacyjne: Pozwala na korelację molekularnej aktywności apoptozy ze zmianami histopatologicznymi, co wspiera kwalifikację biomarkerów w modelach przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Połączone podejście z wykorzystaniem metody TUNEL oraz testu kaspazy 3/7 tworzy platformę profilowania apoptozy, którą można ponownie wykorzystać w badaniach nad chorobami zakaźnymi i toksykologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez rozróżnienie lokalizacji i kinetyki apoptozy w tkankach zakażonych w stosunku do kontrolnych.
- Wartość operacyjna: Standaryzowane protokoły przygotowania preparatów i obrazowania zapewniają powtarzalność między laboratoriami i partiami próbek.
- Wartość strategiczna: Umożliwia wcześniejsze podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) dzięki dostarczeniu wczesnych biomarkerów stresu tkankowego i wpływu patogenu.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację celów w oparciu o ryzyko poprzez kwantyfikację apoptozy jako funkcjonalnego odczytu mechanizmu choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy specjalistycznej z zakresu histologii, mikroskopii fluorescencyjnej oraz ekstrakcji białek z ograniczonych próbek tkanek.
- Zależne od dostępu do kriotomu, mikroskopu fluorescencyjnego oraz luminescencyjnego czytnika płytek do analiz TUNEL oraz kaspazy 3/7.
- Wymaga standaryzacji między użytkownikami w zakresie krojenia tkanek, czasu barwienia i ustawień obrazowania w celu zachowania czułości analizy.
- Adaptacja do innych systemów modelowych wymaga walidacji penetracji przeciwciał i dostępności enzymów w różnych typach tkanek.
- Ograniczenie praktyczne: Małe biopsje z końcówek palców ograniczają wydajność białka, co wymusza zastosowanie alternatywnych metod normalizacji, takich jak szacowanie powierzchni skóry za pomocą obrazowania, aby uniknąć nadmiernego zużycia ekstraktu.
