Name: Wykorzystanie końcowego znakowania końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) i testów kaspazy 3/7 do pomiaru śmierci komórek naskórka u żab z chytridiomykozą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Poznaj metodę TUNEL i testy kaspazy 3/7 do pomiaru apoptozy w naskórku żab z chytridiomykozą. Technika ta pozwala analizować małe próbki tkanek i badać mechanizmy śmierci komórek wywołane przez grzyba Batrachochytrium dendrobatidis.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy następującym osobom, które pomagały w hodowli i zbieraniu danych: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney i T. Knavel; oraz M. Merces za pomoc przy sekcjach. Chcielibyśmy również podziękować M. McFaddenowi, P. Harlowowi i Taronga Zoo za wyhodowanie L. v. alpina oraz G. Marantelli za wychowanie P. corroboree. Dziękujemy F. Pasmansowi, A. Martelowi za porady dotyczące testów apoptozy, C. Constantine'owi, A. Kladnikowi i R. Webbowi za pomoc w teście TUNEL oraz T. Emeto i W. Weßels za pomoc w protokole i zestawie do testu kaspazy 3/7. Ten manuskrypt i protokół są adaptacją Brannelly et al 2017 Peer J22.

Uniwersytet Jamesa Cooka zatwierdził etykę zwierząt w aplikacjach A1875 dla P. corroboree oraz A1897 i A2171 dla L. v. alpina.
1. Hodowla i monitorowanie zwierząt
<ol>
	<li>Zwierzęta trzymane w domu indywidualnie, w środowisku odpowiednim dla gatunku, z odpowiednim harmonogramem nawadniania, karmienia i sprzątania. Codziennie sprawdzaj zwierzęta.
	<ol>
		<li>Wykorzystać dorosłe osobniki krytycznie zagrożonego gatunku Pseudophryne corroboree (do testu TUNEL, sekcja 4) i zagrożonego Litoria verreauxii alpina (do testu kaspazy 3/7, sekcja 5), pochodzące z obiektów hodowlanych żyjących w niewoli. Utrzymuj zwierzęta w temperaturze 15 - 18 °C, na podłożu z mchu i żwiru, codziennie spryskuj je wodą z odwróconej osmozy i karm 3 razy w tygodniu świerszczami załadowanymi jelitami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieraj dane o każdej osobie raz w tygodniu. Pobrać wymaz od osób pod kątem Bd zgodnie z opisem w kroku 2.1. Zważ każde zwierzę z dokładnością do 0,1 g za pomocą wagi i zmierz długość pyska do otworu wentylacyjnego (SVL) z dokładnością do 0,01 mm za pomocą suwmiarki wybierającej.</li>
	<li>Po zaszczepieniu (zgodnie z opisem w sekcji 3) należy codziennie badać zwierzęta pod kątem klinicznych objawów infekcji (nieregularne złuszczanie się skóry, brak apetytu, zaczerwienienie nóg, letarg lub opóźniony odruch prostowania) zgodnie z wytycznymi etycznymi dla zwierząt. Poddaj zwierzęta eutanazji, jeśli występują objawy kliniczne i zachorowalność.
	<ol>
		<li>Poddać eutanazji z przedawkowaniem metanosulfonianu trikainy (MS222) (0,1% w/v MS222 do pH 6 - 7 z wodorowęglanem sodu w dojrzałej wodzie z kranu). Trzymaj zwierzęta w MS222 przez 10 minut po ustaniu wszelkiego ruchu i nie wykazują one żadnej reakcji na bodźce.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Testy na infekcję Bd 
<ol>
	<li>Wymaz na Bd
	<ol>
		<li>Wymaz z każdego zwierzęcia za pomocą nowego sterylnego wacika ze sztucznego jedwabiu (jeden wacik na zwierzę). Użyj następującej metody pobierania wymazówki: pięć razy na wietrze, pięć razy na każdym udzie, boku i kończynie. Daje to w sumie 45 uderzeń.</li>
		<li>Delikatnie obracaj wacik podczas i między pociągnięciami, aby zapewnić skuteczne wychwytywanie DNA. Rozbij końcówkę wacika do probówek mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowuj w temperaturze -20 °C do momentu ekstrakcji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA i test qPCR
	<ol>
		<li>Ekstrahować genomowe DNA z wacików, dodając 50 μl dostępnego w handlu odczynnika do ekstrakcji DNA z 30 - 40 mg kulek krzemionkowych o średnicy 0,5 mm. Kulki ubijały próbki w bijaku do bijaków z maksymalną prędkością przez 2 minuty. Po etapie ubipania kulek odwirować próbki o masie 2 000 x g przez 1 minutę.</li>
		<li>Próbki inkubować w temperaturze 100 °C przez 10 minut i pozostawić do ostygnięcia. Odwirować próbki o masie 5 000 x g przez 3 minuty, a następnie przenieść supernatant do pojedynczych probówek do mikrowirówek o pojemności 1,5 ml i przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu qPCR.</li>
		<li>Stosuj ilościowy PCR (qPCR) zgodnie z Boyle i wsp. 200418 do analizy obciążenia infekcją. Użyj następujących modyfikacji:
		<ol>
			<li>Rozcieńczyć próbki do ekstrakcji DNA w stosunku 6:100 podwójnie dejonizowaną wodą. Dodaj 0,7 μl albuminy surowicy bydlęcej (BSA) do każdego dołka, aby zapobiec zahamowaniu PCR. Uruchom każdą próbkę pojedynczo. Na każdej płytce należy zastosować kontrolę ujemną (bez szablonu) i kontrolę pozytywną z szeregiem wzorców rozcieńczeń w celu oszacowania obciążenia zoosporami (infekcją).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Szczepienie
<ol>
	<li>Kultura Bd
	<ol>
		<li>Przygotuj bulion hodowlany, dodając 16 g tryptonu, 2 g hydrolizatu żelatyny i 4 g laktozy (TGHL) do 1 l wody dejonizowanej. Autoklaw (121 °C przez 40 min) i pozostawić bulion do ostygnięcia.</li>
		<li>Zaszczepić izolat Bd (w tym przypadku wyizolowany z izolatu Nowej Południowej Walii, AbercrombieR-L.booroologensis-2009-LB1, Passage number 11) w bulionie TGHL i rosnąć przez 7 dni w temperaturze 23 °C, a następnie przenieść kulturę bulionową na płytki agarowe TGHL.</li>
		<li>Aby przygotować płytki, dodaj 16 g tryptonu, 2 g hydrolizatu żelatyny, 4 g laktozy (TGHL) i 10 g agaru bakteriologicznego do 1 l wody dejonizowanej i autoklawu (121 °C przez 40 min). Gdy mieszanina ostygnie na tyle, aby można ją było dotknąć, ale zanim stwardnieje, wlej agar TGHL do płytek hodowlanych o średnicy 92 mm, tak aby były wypełnione w 1/4 do 1/3, w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II.</li>
		<li>Gdy agar zastygnie i całkowicie ostygnie, zaszczepij każdą płytkę 0,5 ml Bd z płynnego bulionu i równomiernie rozprowadz. Pozostaw mieszaninę bulionu Bd do wyschnięcia na talerzu przez około 1 godzinę, a następnie uszczelnij płytki plastikową folią parafinową. Inkubować płytki stroną agarową do dołu w temperaturze 23 °C przez 5 - 7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Płytki zalewowe do roztworu do inokulacji zoospor
	<ol>
		<li>Sprawdzaj ruchliwość zoospor pod mikroskopem odwróconego światła, aby zapewnić żywotność codziennie przed inokulacją. Gdy uwalnianie zoospor jest wysokie, a wiele zoospor pływa poza zarodniami, kultura jest gotowa do zaszczepienia.</li>
		<li>Zalej każdą płytkę 3 ml dojrzałej wody z kranu lub sztucznej wody ze stawu, wlewając wodę do płytki i inkubując w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby umożliwić uwolnienie zoospor do wody. Po okresie inkubacji zdekantować zawiesinę zoospor do nowego sterylnego pojemnika.</li>
		<li>Oszacować stężenie zoospor zgodnie z instrukcjami producenta za pomocą hemocytometru. Gdy znane jest stężenie zawiesiny zoospor, rozcieńczyć zawiesinę do stężenia 1 x 106 zoospor na 3 ml starą wodą z kranu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Szczepienie zwierząt
	<ol>
		<li>Zaszczepić każde zwierzę, wylewając 3 ml mieszaniny inokulum na jego venter19 w oddzielnych pojemnikach o pojemności 50 ml. Pozwolić, aby nadmiar inokulum zebrał się na dnie pojemnika do zaszczepiania. Pozostawić każde zwierzę w indywidualnym pojemniku do zaszczepiania na 24 godziny, aby zapewnić zakażenie, a po 24 godzinach inokulacji zwrócić każdą osobę do zdezynfekowanego terrarium.
		<ol>
			<li>Zdezynfekuj terraria za pomocą dostępnego w handlu roztworu wybielacza o stężeniu 13% objętości/objętości (v/v)20, spłucz co najmniej dwa razy wodą, a następnie pozostaw do wyschnięcia na nie mniej niż 24 godziny.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku kontroli ujemnych Bd, zaszczepić zwierzęta metodą symulacyjną przy użyciu tych samych metod, co w ppkt 3,2 - 3,3, ale zalać płytki agarowe wolne od Bd 5 ml dojrzałej wody z kranu zamiast płytek agarowych zaszczepionych Bd.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Test TUNEL
<ol>
	<li>Poddać eutanazji zwierzęta, które wykazują kliniczne objawy chytridiomykozy, jak opisano w kroku 1.3.1, oraz równą liczbę zwierząt z grupy kontrolnej ujemnej Bd.</li>
	<li>Przeanalizuj próbki skóry (grzbietowej, brzusznej i udowej) od każdego zwierzęcia. Utrwal próbki skóry przez 2 godziny w formaldehydzie buforowanym fosforanem o stężeniu 4% v/v. Krótki i stały czas utrwalania pozwala na pełne utrwalenie tkanek, ale także pozwala na skuteczne i dokładne barwienie immunohistochemiczne. Następnie przenieś do 80% etanolu aż do zatopienia w celu podziału.</li>
	<li>Zanurz skórę w wosku parafinowym w celu przygotowania histologicznego zgodnie ze standardowymi metodami21. W skrócie protokół jest następujący:
	<ol>
		<li>Odwodnić tkanki w stopniowanej serii etanolu i usunąć etanol za pomocą ksylenu. Zanurz tkankę w wosku parafinowym i umieść wszystkie trzy próbki skóry dla każdej osoby w jednym bloku parafiny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyciąć skórę za pomocą mikrotomu zgodnie ze standardowym preparatem histologicznym<klasa sup="xref">21. Tkankę należy podzielić szeregowo na 5 μm, a następnie przymocować do szkiełek hydrofilowych. Umieść cztery seryjne histosekcje dla każdego typu skóry na szkiełku. Wykonaj trzy preparaty na osobę z seryjnymi sekcjami skóry, pamiętaj, że każdy szkiełko ma przymocowane cztery sekcje każdej tkanki.</li>
	<li>Zabejcuj szkiełka w następującej kolejności:
	<ol>
		<li>Wybarwić pierwsze szkiełko hematoksyliną, a następnie przeciwbarwieniem eozyny (H&E). Ten slajd ma na celu wizualizację lokalizacji zarodni Bd w skórze.</li>
		<li>Wybarwić drugi szkiełko po dostępnym w handlu teście TUNEL do przygotowania histologicznego i postępować zgodnie z instrukcjami producenta, które opisano poniżej.
		<ol>
			<li>Najpierw należy odparafinować skrawki tkanek w słoiku z kopeliną, myjąc szkiełka trzema zmianami ksylenu przez 5 minut na pranie, a następnie dwiema zmianami 100% etanolu przez 5 minut każde mycie. Następnie wykonaj jedno płukanie 95% etanolem przez 3 minuty, a następnie 70% etanolem przez 3 minuty. Na koniec nakładaj jedno pranie PBS przez 5 minut.</li>
			<li>Wstępnie potraktować tkankę świeżo rozcieńczonym enzymem trawiącym białka (proteinaza K o stężeniu 20 μg/ml rozcieńczonym w PBS) i dodać bezpośrednio do szkiełka. Pozostawić do inkubacji na 15 minut. Umyć z dwiema zmianami PBS w słoiku z kopeliną przez 2 minuty każda.</li>
			<li>Strzepnąć nadmiar płynu i schować w 3,0% nadtlenku wodoru w PBS w słoiku z kopeliną przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Spłukać dwukrotnie PBS, przez pięć minut przy każdym myciu.</li>
			<li>Stuknąć nadmiar płynu, a następnie nanieść 75 μl/5cm2 buforu równowagi bezpośrednio na tkankę na szkiełku. Inkubować przez 10 s. Strzepnąć nadmiar płynu wokół sekcji i nałożyć 55 μl/5cm2 działającego końcowego enzymu transferazy deoksynukleotydylo-tranferazy (TdT). Inkubować w wilgotnej komorze przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
			<li>Po inkubacji TdT umieścić szkiełko w słoiku z kopinem o sile roboczej buforu zatrzymującym/myjącym, mieszać przez 15 s i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Umyj szkiełko trzema zmianami PBS przez 1 minutę na pranie. Strzepnij nadmiar płynu.</li>
			<li>Nałóż koniugat anty-digoksygeniny (rodamina), który został podgrzany do temperatury pokojowej do tkanki, 65 μl/5 cm2. Inkubować w wilgotnej komorze przez 30 minut w temperaturze pokojowej i unikać ekspozycji na światło. Prać z czterema zmianami PBS przez 2 minuty na pranie. Strzepnij nadmiar płynu.</li>
			<li>Na koniec dodaj 15 μl 0,5 - 1 μg/ml DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindole) w podłożu do mocowania szkiełka do szkiełka, które działa jak przeciwbarwnik. Następnie przykryj szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci lub cementem gumowym. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemności, ponieważ test jest wrażliwy na światło.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Barwienie trzeciego szkiełka jest barwione przy użyciu testu TUNEL i barwienia przeciwstawnego DAPI, ale stosuje się je jako kontrolę dodatnią i ujemną dla każdej próbki. 
		UWAGA: Spośród 4 histosekcji na szkiełkach kontrolnych, pierwsze 2 to kontrpróby kontroli dodatniej, a ostatnie 2 to kontrpróby kontroli ujemnej.
		<ol>
			<li>W przypadku kontroli dodatnich, zamiast kroku 4.5.2.2, należy wstępnie potraktować tkankę buforem DN (zasada trizma 30 mM, pH 7,2, 4 mM MgCl2, 0,1 mM DDT) i pozostawić do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 5 minut. Następnie rozpuść Dnazę I w buforze DN do końcowego stężenia 0,1 ug/ml i nałóż ją bezpośrednio na szkiełko. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyć szkiełko 5 płukaniami dH2O przez 3 minuty przy każdym myciu. Zetrzyj nadmiar płynu. Następnie wznowić test TUNEL zgodnie z zaleceniami w sekcji 4.5.2.3.</li>
			<li>W przypadku kontroli ujemnych nie należy dodawać do tych próbek końcowego enzymu transferazy deoksynukleotydylu (TdT) (jak opisano w sekcji 4.5.2.4).</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obserwować szkiełka TUNEL natychmiast po zakończeniu testu.
	<ol>
		<li>Rób zdjęcia w losowych odstępach czasu wzdłuż każdego odcinka skóry z 200-krotnym powiększeniem za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego, używając filtrów zarówno dla barwienia rodaminy, które ujawnia komórki apoptotyczne i wydaje się czerwone, jak i DAPI, które ujawnia wszystkie jądra i wydaje się niebieskie, aby można było wygenerować nakładkę komórek. Upewnij się, że co najmniej 100 komórek zostało sfotografowanych na każdy fragment skóry na próbkę. Preparaty należy przechowywać w ciemnym pojemniku mikroskopowym w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Policz komórki (zabarwione na niebiesko DAPI) na obrazie. Upewnij się, że na każdy odcinek skóry liczy się co najmniej 100 komórek. Aby osiągnąć 100 komórek, policz wszystkie komórki na obrazie. Jeśli na jednym obrazie znajduje się mniej niż 100 komórek, policz kolejny obraz, aż osiągniesz co najmniej 100 komórek na odcinek skóry na zwierzę.</li>
		<li>Następnie policz liczbę komórek dodatnich TUNEL na tych samych obrazach (barwione na czerwono rodamina). Komórki dodatnie TUNEL, które wskazują na apoptozę, a nie martwicę lub tło, to pojedyncze komórki z wyraźnymi krawędziami komórek (błony są nienaruszone bez lizy). Czasami komórki kurczą się, tworząc ciała apoptotyczne.</li>
		<li>Zlokalizuj obszary zliczone w teście TUNEL i przeanalizuj odpowiadające im regiony na histosekcjach barwionych H&E. Upewnij się, że wybarwione skrawki H&E odpowiadają miejscom zakażenia Bd, co zapewnia, że miejsca zakażone Bd są używane podczas liczenia komórek apoptotycznych w teście TUNEL.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Test kaspazy 3/7
<ol>
	<li>Zbieraj czubki palców u nóg od każdego zwierzęcia (zarówno narażonego na Bd, jak i Bd-ujemnego) raz w tygodniu przez 3 tydzień po szczepieniu i co dwa tygodnie do końca eksperymentu, do 8 palców u nogi na osobę.
	<ol>
		<li>Odciąć czubek palca u nogi w drugim paliczku za pomocą wysterylizowanych płomieniowo nożyczek, umieścić w mikroprobówce o pojemności 1,5 ml i natychmiast zamrozić w temperaturze -80 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrahować białka z zamrożonej próbki palca u nogi.
	<ol>
		<li>Umieścić próbki w 100 μl buforu do próbek (25 mM HEPES pH 7, 5 mM MgCl2) z dwoma kulkami ze stali nierdzewnej (3,2 mm) w mikroprobówce z nakrętką o pojemności 1,5 ml. Próbki należy poddać lizie w 4 cyklach po 1 minutę ubijania kulek z maksymalną prędkością (w tym samym ubijaku do kulek, co w kroku 1.2.1), a następnie 3 minuty na lodzie. Po lizie odwirować próbki w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C przez 5 minut. Zebrać supernatant do użycia w teście.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Określić ilościowo stężenie białka w próbce za pomocą testu Bradforda.
	<ol>
		<li>Na płytce 384-dołkowej wymieszaj 10 μl ekstraktu białkowego z 10 μl odczynnika Bradford i inkubuj przez 2 minuty w temperaturze pokojowej. Każdą próbkę należy wykonać w dwóch egzemplarzach, wraz z serią 5-krotnych wzorców rozcieńczenia BSA. Odczytać absorbancję przy 595 nm na płytce czytnika absorbancji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Alternatywnie, jeśli próbki czubków palców u nóg są zbyt małe (stężenie białka jest bliskie najniższej normie określonej w teście Bradforda w kroku 4.3.1 lub jeśli żaby, z których pobiera się próbki, mają masę całkowitą poniżej 3 g), należy standaryzować próbki, szacując powierzchnię skóry za pomocą zdjęć, zamiast testu Bradforda.
	<ol>
		<li>Przed ekstrakcją białek z próbki do testu kaspazy należy sfotografować każdy palec u nogi w 40-krotnym powiększeniu za pomocą mikroskopu światła odwróconego.</li>
		<li>Przeanalizuj próbkę palca u nogi za pomocą komputerowego oprogramowania do obrazowania, szacując obszar palca. W tym celu narysuj linię wokół krawędzi zacisku na palce i poproś oprogramowanie do obrazowania o oszacowanie obszaru w kształcie. Następnie pomnóż ten obszar przez liczbę pi (3.14), co w przybliżeniu przybliży pole powierzchni trójwymiarowej próbki skóry (ponieważ długość x pole przekroju poprzecznego (pi x średnica) daje zewnętrzną powierzchnię probówki).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj test kaspazy 3/7.
	<ol>
		<li>Do 384-dołkowej płytki luminescencyjnej dodać 10 μl dostępnego w handlu odczynnika kaspazy 3/7 i 10 μl ekstraktu białkowego. Zbadaj każdą próbkę w trzech egzemplarzach.</li>
		<li>Wymieszać odczynniki, potrząsając powoli płytką przez 15 s. Inkubować płytkę z dala od światła przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Zmierz luminescencję za pomocą czytnika płytek luminescencyjnych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Stuart, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Status+and+trends+of+amphibian+declines+and+extinctions+worldwide%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide.</a> Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).</li>
<li>Skerratt, L. F., et al. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s10393-007-0093-5">Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs.</a> EcoHealth. 4, 125-134 (2007).</li>
<li>Voyles, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+chytridiomycosis%2C+a+cause+of+catastrophic+amphibian+declines%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines.</a> Science. 326 (5952), 582-585 (2009).</li>
<li>Woodhams, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Population+trends+associated+with+skin+peptide+defenses+against+chytridiomycosis+in+Australian+frogs%5BTitle%5D)+AND+%22Oecologia%22%5BJournal%5D)">Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs.</a> Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).</li>
<li>Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicted+disease+susceptibility+in+a+Panamanian+amphibian+assemblage+based+on+skin+peptide+defenses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Wildlife+Diseases%22%5BJournal%5D)">Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses.</a> Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).</li>
<li>Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1469-1795.2007.00150.x/full">Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more.</a> Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).</li>
<li>Savage, A. E., Zamudio, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+genotypes+associate+with+resistance+to+a+frog-killing+fungus%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus.</a> PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).</li>
<li>Bataille, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Susceptibility+of+amphibians+to+chytridiomycosis+is+associated+with+MHC+class+II+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceeding+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation.</a> Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127(2015).</li>
<li>Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+local+immune+responses+by+the+frog-killing+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).</li>
<li>Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+chytridiomycosis+on+hematopoietic+tissue+in+the+spleen%2C+kidney+and+bone+marrow+in+three+diverse+amphibian+species%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens+and+Disease%22%5BJournal%5D)">Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species.</a> Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069(2016).</li>
<li>Brutyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Batrachochytrium+dendrobatidis+zoospore+secretions+rapidly+disturb+intercellular+junctions+in+frog+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Genetics+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin.</a> Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).</li>
<li>Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+cycle+stages+of+the+amphibian+chytrid+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).</li>
<li>Pasmans, F., et al. <a target="_blank" href="https://biblio.ugent.be/publication/1077693/file/1077694.pdf">Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium.</a> Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).</li>
<li>Ellison, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((More+than+skin+deep%3A+Functional+genomic+basis+for+resistance+to+amphibian+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis.</a> Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).</li>
<li>Fites, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+invasive+chytrid+fungus+of+amphibians+paralyzes+lymphocyte+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses.</a> Science. 342 (6156), 366-369 (2013).</li>
<li>Galluzzi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+cell+death+in+higher+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+and+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes.</a> Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).</li>
<li>Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+specificity+and+sensitivity+of+the+TUNEL+reaction+in+the+quantitation+of+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis.</a> American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).</li>
<li>Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+quantitative+detection+of+chytridiomycosis+%28Batrachochytrium+dendrobatidis%29+in+amphibian+samples+using+real-time+Taqman+PCR+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).</li>
<li>Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amphibians+with+infectious+disease+increase+their+reproductive+effort%3A+evidence+for+the+terminal+investment+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis.</a> Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).</li>
<li>Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Additional+disinfectants+effective+against+the+amphibian+chytrid+fungus+Batrachochytrium+dendrobatidis%5BTitle%5D)+AND+%22Diseases+of+Aquatic+Organisms%22%5BJournal%5D)">Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis.</a> Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).</li>
<li>Woods, A., Ellis, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWoods%2C+A+%22Laboratory+Histopathology%3A+A+Complete+Reference%22">Laboratory Histopathology: A Complete Reference</a>. , Churchill Livingstone: Edinburgh. (1994).</li>
<li>Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+cell+death+in+frogs+with+chytridiomycosis%5BTitle%5D)+AND+%22PeerJ%22%5BJournal%5D)">Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis.</a> PeerJ. 5, e2925(2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Badaliśmy apoptozę naskórka i śmierć komórek jako potencjalny mechanizm patologii śmiertelnej choroby chytridiomykozy lub mechanizm oporności na choroby u gatunków wrażliwych na Bd . Zastosowaliśmy dwie metody oceny śmierci komórek w naskórku, test TUNEL do analizy śmierci komórek naskórka in situ oraz test kaspazy 3/7 do monitorowania śmierci komórek naskórka przez cały postęp infekcji. Odkryliśmy, że śmierć komórki i apoptoza są skorelowane z obciążeniem infekcją, a śmierć komórki jest znacznie wyższa...

doświadczają obecnie jednej z największych strat w globalnej różnorodności biologicznej spośród wszystkich taksonów kręgowców1. Główną przyczyną tych spadków jest śmiertelna choroba skóry chytridiomykoza, wywoływana przez patogen grzybiczy Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Patogen powierzchownie infekuje naskórek, co może prowadzić do zaburzenia funkcji skóry, skutkującego poważną utratą elektrolitów, zatrzymaniem akcji serca i śmiercią3. Obecnie badane są różne potencjalne mechanizmy odpornościowe gospodarza przeciwko Bd, takie jak peptydy przeciwdrobnoustrojowe4,5, flora bakteryjna skóry6, receptory komórek odpornościowych7,8 i aktywność limfocytów9,10. Jednak niewiele badań sprawdza, czy apoptoza naskórka i śmierć komórki są mechanizmem immunologicznym przeciwko temu śmiertelnemu patogenowi.
Śmierć komórki, czy to przez apoptozę (programowana śmierć komórki) lub martwicę (niezaprogramowana śmierć), w naskórku może być patologią infekcji Bd. Wcześniejsze badania sugerują, że zakażenie Bd może indukować apoptozę, ponieważ zakłócenie połączeń wewnątrzkomórkowych obserwuje się, gdy eksplantaty skóry są wystawione na działanie supernatantów zoospor in vitro11. Dodatkowo zwyrodnieniowe zmiany naskórka u żab zakażonych Bd obserwuje się za pomocą mikroskopii elektronowej12,13. Analizy transkryptomiczne wskazują, że szlaki apoptozy są regulowane w górę w zakażonej skórze14, a splenocyty ulegają apoptozie, gdy są wystawione na działanie supernatantów Bd in vitro15. Pomimo rosnącej liczby dowodów sugerujących, że Bd może indukować apoptozę i śmierć komórek gospodarza in vitro, brakuje badań in vivo, które badałyby lub określały ilościowo mechanizmy apoptozy poprzez postęp infekcji. Co więcej, nie wiadomo, czy gospodarz używa apoptozy jako obronnej strategii immunologicznej do zwalczania infekcji Bd, czy też apoptoza jest patologią choroby.
W tym badaniu chcieliśmy wykryć śmierć i apoptozę komórek naskórka u zakażonych zwierząt in vivo za pomocą dwóch metod: testu białka kaspazy 3/7 oraz testu in situ z końcowym transferazą (TUNEL) na końcu nacięcia. Ponieważ każdy test wykrywa różne aspekty śmierci komórki16, razem te metody zapewniają pełne zrozumienie mechanizmów związanych ze śmiercią komórki i zapewniają dokładny pomiar efektu. Test kaspazy 3/7 określa ilościowo aktywność kaspaz efektorowych 3 i 7, co umożliwia ilościowe określenie zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych szlaków apoptozy. Natomiast test TUNEL wykrywa fragmentację DNA, która jest spowodowana mechanizmami śmierci komórki, w tym apoptozą, martwicą i piroptozą17. Używamy testu TUNEL do zbadania lokalizacji śmierci komórek w naskórku zarówno klinicznie zakażonych, jak i niezakażonych zwierząt przy użyciu trzech różnych odcinków skóry: grzbietu, brzucha i uda Pseudophryne corroboree. Metoda ta identyfikuje anatomiczne miejsce śmierci komórki, a także rozróżnia jej lokalizację w obrębie określonych warstw naskórka. Następnie używamy testu kaspazy 3/7 do przeprowadzenia ilościowej oceny szeregów czasowych apoptozy podczas 8-tygodniowej infekcji w Litoria verreauxii alpina. Pobieramy próbki czubków palców u nóg co dwa tygodnie od tych samych zwierząt i jesteśmy w stanie skorelować obciążenie infekcją patogenem z aktywnością kaspazy 3/7.

<table><tbody><tr><td>POLARstar Omega</td><td>BMG Labtech</td><td></td><td>Czytnik płytek luminescencyjnych</td></tr><tr><td>384-dołkowa płaska przezroczysta płyta dolna</td><td>Corning</td><td>3707</td><td></td></tr><tr><td>384 well z niskim kołnierzem biała płaska płyta dolna</td><td>Corning</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Agar bakteriologiczny (oxoid)</td><td>Fisher</td><td>OXLP0011B</td><td></td></tr><tr><td>Formal-Fixx 10% neutralna buforowana formalina</td><td>Fisher</td><td>6764254</td><td></td></tr><tr><td>Rosół laktozowy (Oxoid)</td><td>Fisher</td><td>OXCM0137B</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>Fisher</td><td>BP328-500</td><td></td></tr><tr><td>Tricane-S (MS-222)</td><td>Fisher</td><td>NC0872873</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>BP1421-500</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca Albumina</td><td>Invitrogen</td><td>15561020</td><td></td></tr><tr><td>Sterylny wacik ze sztucznego jedwabiu</td><td>Drut medyczny i Sprzęt</td><td>MW-113</td><td></td></tr><tr><td>ApopTag Czerwony zestaw do wykrywania apoptozy in situ Odczynnik</td><td>Merck Millipore</td><td>S7165</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Bradford</td><td>Pierce</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>Caspase Glo&nbsp; 3/7</td><td>Promega</td><td>G8090</td><td></td></tr><tr><td>Bufor HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887-20ML</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1374248-1G</td><td></td></tr><tr><td>Hydrolizat żelatyny Enzymatyczny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0262</td><td></td></tr><tr><td>PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), pH 7,2 (1X)</td><td>Thermo/Life</td><td>20-012-043</td><td></td></tr><tr><td>Prepman</td><td>Thermo/Life</td><td>4318930</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Fast Advanced Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4444556</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM996</td><td></td></tr><tr><td>Wybielacz Clorox</td><td>Clorox</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol, 200 proof, klasa molekularna</td><td>Fisher</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny Carl Zeiss Mikroskop</td><td>fluorescencyjny</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>Koraliki ze stali nierdzewnej 3,2 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079132SS</td><td></td></tr><tr><td>Primer ITSI-3 Chytr (5&prime;-CCTTGAT ATAATACAGTGTGCCATATGTC-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Indywidualny projekt dla podkładów i sondy</td></tr><tr><td>Podkład 5.8S Chytr (5&prime;-TCGGTT CTCTAGGCAACAGTTT-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Indywidualny projekt dla podkładów i sondy</td></tr><tr><td>Sonda do spoiwa z mniejszym rowkiem Chytr MGB2(5&prime;-CGAGTCGAAC-3&prime;)</td><td>Taqman</td><td></td><td>Indywidualny projekt starterów i sondy</td></tr><tr><td>Rotor-Gene qPCR Instruments</td><td>Qiagen</td><td></td><td>qPCR Maszyna</td>do</tr><tr><td>mikrowirówek 1,5ml</td><td>Fisher</td><td>02-681-372</td><td></td></tr><tr><td>Płytki Petriego do hodowli komórkowych</td><td>Nunc</td><td>263991</td><td></td></tr><tr><td>Mini-beadBeater Koraliki cyrkorowo-krzemianowe, 0,5 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079105Z</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie końcowego znakowania końca dutp nick za pośrednictwem transferazy końcowej (tunel) i testów kaspazy 3/7 do pomiaru śmierci komórek naskórka u żab z chytridiomykozą

Using Terminal Transferase-mediated dUTP Nick End-labelling (TUNEL) and Caspase 3/7 Assays to Measure Epidermal Cell Death in Frogs with Chytridiomycosis

doświadczają na całym świecie ogromnych strat w różnorodności biologicznej, a jedną z głównych przyczyn jest choroba zakaźna – chytridiomykoza. Choroba ta jest wywoływana przez patogen grzybowy Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), który infekuje i niszczy naskórek żaby; Jednak zmiany patologiczne nie zostały jednoznacznie scharakteryzowane. Apoptoza (zaprogramowana śmierć komórki) może być wykorzystywana przez patogeny do uszkadzania tkanki gospodarza, ale może być również mechanizmem odporności gospodarza na choroby w celu usunięcia patogenu. W tym badaniu określamy ilościowo śmierć komórek naskórka zakażonych i niezakażonych zwierząt za pomocą dwóch różnych testów: znakowania końca nacięcia dUTP za pośrednictwem końcowej transferazy (TUNEL) i kaspazy 3/7. Wykorzystując tkankę skóry brzusznej, grzbietowej i udowej w teście TUNEL, obserwujemy śmierć komórek w komórkach naskórka in situ klinicznie zakażonych zwierząt i porównujemy śmierć komórek z niezakażonymi zwierzętami za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej. Aby określić, jak zmienia się poziom apoptozy w naskórku w trakcie infekcji, usuwamy próbki z czubków palców co dwa tygodnie przez okres 8 tygodni i używamy testu kaspazy 3/7 z wyekstrahowanymi białkami w celu ilościowego określenia aktywności w próbkach. Następnie korelujemy aktywność kaspazy 3/7 z obciążeniem infekcją. Test TUNEL jest przydatny do lokalizacji śmierci komórki in situ, ale jest kosztowny i czasochłonny w przeliczeniu na próbkę. Test kaspazy 3/7 jest skuteczny w przypadku dużych próbek i eksperymentów w czasie. Jednak ze względu na to, że biopsje czubka palca żaby są małe, dostępny jest ograniczony ekstrakt do standaryzacji próbek za pomocą metod kwantyfikacji białek, takich jak test Bradforda. Dlatego sugerujemy oszacowanie powierzchni skóry poprzez analizę fotograficzną biopsji palców u nóg, aby uniknąć spożywania ekstraktów podczas standaryzacji próbki.

Test TUNEL
W grupie zwierząt zainfekowanych stwierdzono więcej komórek wykazujących pozytywny wynik testu TUNEL niż w grupie kontrolnej zwierząt niezainfekowanych. in situ lokalizacja komórek TUNEL-dodatnich różniła się u zwierząt zainfekowanych i w grupie kontrolnej. U zwierząt kontrolnych odnotowano równomierny rozkład komórek TUNEL-dodatnich na niskim poziomie w całych warstwach skóry właściwej i naskórka (p...

Określamy ilościowo śmierć komórek naskórka u żab z chytridiomykozą, używając dwóch metod. Po pierwsze, używamy końcowego znakowania końca nacięcia dUTP za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) in situ, aby określić różnice między klinicznie zakażonymi i niezakażonymi zwierzętami. Po drugie, przeprowadzamy analizę szeregów czasowych apoptozy nad infekcją za pomocą analizy białka kaspazy 3/7.

Wykorzystanie końcowego znakowania końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) i testów kaspazy 3/7 do pomiaru śmierci komórek naskórka u żab z chytridiomykozą

Amphibians are experiencing a great loss in biodiversity globally and one of the major causes is the infectious disease chytridiomycosis. This disease is ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest obserwacja wpływu patogenu grzybów Batrachochytrium dendrobatidis na apoptozę i śmierć komórek w tkance naskórka żab. Ta metoda może pomóc nam zrozumieć choroby dzikich zwierząt, takie jak to, czy infekcja powoduje śmierć komórki lub odwrotnie, czy istnieją mechanizmy odpornościowe przeciwko infekcji. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją wykonać na małych próbkach biopsji tkanek, dzięki czemu małe osoby mogą być wielokrotnie pobierane w trakcie infekcji.Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować szkiełka hydrofilowe z próbką tkanki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby odparafinować skrawki tkanki, przemyj szkiełka trzy razy ksylenem przez pięć minut każdy w słoiku z kopeliną. Następnie umyj szkiełka 100% etanolem dwa razy przez pięć minut każde.Następnie umyj szkiełka 95% etanolem i 70% etanolem przez trzy minuty każde. Następnie umyj szkiełka raz PBS przez pięć minut. Aby przygotować szkiełka do badań eksperymentalnych i kontroli ujemnej, należy poddać tkankę wstępnej obróbce, dodając świeżo rozcieńczoną proteinazę K bezpośrednio do szkiełek.Inkubuj szkiełka przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka w PBS dwa razy po dwie minuty każde. Aby przygotować szkiełka kontroli pozytywnej, należy wstępnie potraktować tkankę buforem DN, a następnie inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez pięć minut.Następnie rozpuść DNazę w buforze DN do końcowego stężenia 0,1 mikrograma na mililitr. Dodaj przygotowany roztwór DNazy do szkiełek. Inkubować szkiełka przez 15 minut w temperaturze pokojowej.Następnie umyj szkiełka wodą destylowaną w słoiku z kopeliną pięć razy po trzy minuty każdy. Schłodzić reakcję w 3% nadtlenku wodoru w PBS przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie umyj szkiełka w PBS dwa razy po dwie minuty każde.Następnie dodaj bufor równowagi do tkanki na szkiełkach. Inkubować przez 10 sekund w temperaturze pokojowej. Następnie strzepnij nadmiar płynu wokół sekcji tkanki.Rozcieńczyć końcowy enzym deoksynukleotydylotransferazy w buforze reakcyjnym. Następnie dodaj go do tkanki na szkiełkach kontrolnych doświadczalnych i kontrolnych. Inkubować w wilgotnej komorze przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.Następnie umieścić szkiełka w słoiku z kopiną zawierającym stężenie robocze buforu zatrzymującego. Mieszać przez 15 sekund, a następnie inkubować szkiełka w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Następnie umyj szkiełka PBS trzy razy przez jedną minutę i strzepnij nadmiar płynu.Następnie dodaj koniugat anty-digoksygeniny, wstępnie podgrzany do temperatury pokojowej, bezpośrednio na tkankę. Inkubuj szkiełka przez 30 minut w temperaturze pokojowej w wilgotnej ciemnej komorze. Po zakończeniu inkubacji przemyć szkiełka czterokrotnie PBS przez dwie minuty każde.Strzepnij nadmiar płynu. Następnie dodaj medium montażowe do szkiełek. Dodać 15 mikrolitrów roztworu DAPI do podłoża montażowego na szkiełkach.Przykryj każde szkiełko szkiełkiem nakrywkowym i uszczelnij lakierem do paznokci. Pozostaw szkiełka do wyschnięcia w ciemności. Za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego obserwuj szkiełka natychmiast po zakończeniu procesu stania.Rób zdjęcia 400 razy w losowych odstępach wzdłuż każdej sekcji skóry. Policz niebieskie komórki zabarwione DAPI, aby upewnić się, że widocznych jest co najmniej 100 komórek na odcinek skóry na zwierzę. Następnie policz liczbę komórek TUNEL-dodatnich, które pojawiają się jako czerwone pojedyncze komórki z wyraźnymi krawędziami komórek.Na początek użyj mikroskopu z odwróconym światłem 40 razy, aby zrobić zdjęcie każdego z palców żaby u nogi. Narysuj linie wokół krawędzi klipsa na palce i użyj oprogramowania do obrazowania, aby oszacować obszar w kształcie. Aby ocenić powierzchnię trójwymiarowej próbki skóry, pomnóż szacowaną powierzchnię przez liczbę pi.Aby wyekstrahować białka z zamrożonej próbki palca żaby, umieść próbkę w 1,5-mililitrowej probówce wirówkowej z nakrętką mikrowirówkową zawierającą 100 mikrolitrów buforu próbki i dwa koraliki ze stali nierdzewnej. Użyj ubijaka do kulek z maksymalną prędkością, aby zlizować komórki. Następnie umieść probówkę na lodzie na trzy minuty.Następnie odwirować probówkę, aby zebrać supernatant. Aby przeprowadzić test kaspazy 3/7 na 384-dołkowej płytce, dodaj 10 mikrolitrów buforu próbki jako ślepą próbę i 10 mikrolitrów ekstraktu białkowego w trzech powtórzeniach. Następnie odpipetować 10 mikrolitrów dostępnego w handlu odczynnika kaspazy 3/7 do ekstraktu białkowego i ślepych studzienek.Następnie delikatnie potrząsaj płytką przez 15 sekund, aby wymieszać dwa odczynniki. Inkubować w temperaturze pokojowej w ciemności przez 30 minut. Na koniec użyj czytnika płytek luminescencyjnych, aby zmierzyć luminescencję próbki.W tym badaniu zakażone zwierzęta wykazują znacznie więcej komórek TUNEL-dodatnich w porównaniu ze zwierzętami kontrolnymi, co ilustrują komórki zabarwione na czerwono lub różowo. U zwierząt kontrolnych jest niewiele komórek TUNEL-dodatnich i nie są one skoncentrowane w naskórku. U zakażonych zwierząt komórki TUNEL-dodatnie występują częściej w naskórku.Komórki TUNEL-dodatnie są bardziej skoncentrowane w pobliżu i bezpośrednio przylegają do widoków zainfekowanych komórek. Ponadto nad naskórkiem i w warstwach naskórka znajdują się bardziej rozpowszechnione komórki TUNEL-dodatnie, które są głębsze niż miejsce, w którym znajdował się patogen grzybiczy. U zakażonych zwierząt we wszystkich trzech typach skóry występuje więcej komórek TUNEL-dodatnich, ze szczególnie wysokim poziomem w skórze ud i skóry.W teście kaspazy intensywność infekcji jest dodatnio skorelowana z aktywnością kaspazy 3/7. Ponadto aktywność kaspazy 3/7 u zwierząt zakażonych i niezakażonych różniła się w czasie. Aktywność kaspazy 3/7 zmniejszyła się w ciągu pierwszych kilku tygodni po inokulacji, a następnie wzrosła pod koniec siódmego tygodnia u zakażonych zwierząt.Aktywność kaspazy 3/7 pozostała stała u osób niezakażonych. Podczas próby wykonania procedury testu TUNEL ważne jest, aby przeczytać szkiełka tego samego dnia, w którym przeprowadzono test, aby uniknąć utraty czułości i przechowywać szkiełka w chłodnym, ciemnym miejscu w celu ochrony barwników. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykryć apoptozę i śmierć komórki przy użyciu dwóch różnych metod wykrywania w małych próbkach tkanek, takich jak skóra.

using-terminal-transferase-mediated-dutp-nick-end-labelling-tunel

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Obrazowanie żywych komórek w celu analizy apoptozy pośredniczonej przez kaspazę-3 w unieśmiertelnionych kulturach komórek oligodendrocytów N19 z wykorzystaniem substratu kaspazy-3 NucView 488. Technika ta znajduje zastosowanie w testach programowanej śmierci komórki w czasie rzeczywistym w różnych typach komórek i tkanek.

Monitorowanie aktywności rozszczepionej kaspazy-3 i apoptozy unieśmiertelnionych komórek oligodendroglialnych z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek oraz rozszczepialnych fluorescencyjnych substratów barwiących po indukowanej potasem depolaryzacji błony

Przedstawiamy prosty protokół wizualizacji obszarów programowanej śmierci komórek (PCD) w embrionach myszy oraz w hodowlach różnicujących się embrionalnych komórek macierzystych (ES) przy użyciu wysoce rozpuszczalnego barwnika o nazwie LysoTracker.

Zastosowanie LysoTracker do wykrywania programowanej śmierci komórki w embrionach i różnicujących się embrionalnych komórkach macierzystych

W tym filmie test TUNEL jest wykonywany w celu wykrycia obecności komórek apoptotycznych w próbce. Badanie polega na użyciu specjalnej polimerazy DNA - końcowej deoksynukleotydylotransferazy - która katalizuje dodawanie znakowanych dUTP do końca 3' fragmentowanego DNA, który można obserwować i identyfikować pod mikroskopem fluorescencyjnym.

Końcowe znakowanie końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej — test TUNEL: metoda in situ do wykrywania fragmentacji DNA w komórkach apoptotycznych

Ten film opisuje test luminescencyjny in vitro kaspazy-3/7 do ilościowego określenia śmierci komórki lub apoptozy. Test mierzy luminescencję wytwarzaną po rozszczepieniu kaspazy-3/7 proluminescencyjnego substratu DEVD. Generowana luminescencja jest proporcjonalna do aktywności kaspazy-3/7.

Test kaspazy-3/7: Test oparty na luminescencji do ilościowego określania apoptozy poprzez pomiar aktywności kaspazy-3/7 w eksplantatach skóry żaby

Pewne zaburzenia genetyczne lub narażenie na toksyny mogą zakłócić normalne procesy rozwojowe, prowadząc do śmierci określonych typów komórek. Analiza aktywowanej kaspazy 3 metodą immunofluorescencji całej góry w zarodkach danio pręgowanego ujawnia specyficzną dla etapu i tkanki lokalizację komórek specyficznie ulegających apoptozie.

Analiza apoptozy w zarodkach danio pręgowanego za pomocą immunofluorescencji całego wierzchowca w celu wykrycia aktywowanej kaspazy 3

Zakażenie Batrachochytrium dendrobatidis u można wyeliminować za pomocą zmniejszonego stężenia (0,0025%) i krótszego czasu trwania (pięciominutowe kąpiele przez sześć dni) itrakonazolu niż jest to zwykle stosowane. Mniejszą śmiertelność i mniej negatywnych skutków ubocznych zaobserwowano przy użyciu tego zmodyfikowanego protokołu leczenia.

Zmniejszone stężenie itrakonazolu i czas jego trwania są skuteczne w leczeniu zakażenia Batrachochytrium dendrobatidis u

Testy multipleksowe mogą dostarczyć korzystnych informacji dla podstawowych mechanizmów komórkowych i wyeliminować marnotrawstwo odczynników oraz niepotrzebne powtarzalne eksperymenty. Opisujemy tutaj multipleksowy test aktywności kaspazy-3/7, przy użyciu metod fluorescencyjnych i luminescencyjnych, w celu określenia żywotności komórek w modelu podwzgórza in vitro po prowokacji oksydacyjnej kwasem palmitynowym.

Zastosowanie testu multipleksowania kaspazy w celu określenia apoptozy w modelu komórkowym podwzgórza

Ten film opisuje preparację, przetwarzanie tkanek, cięcie i fluorescencyjne znakowanie TUNEL mięśni szkieletowych myszy. Opisano w nim również metodę półautomatycznej analizy etykietowania TUNEL.

Wykrywanie i analiza uszkodzeń DNA w mięśniach szkieletowych myszy in situ metodą TUNEL

Anastasis jest technicznie trudne do wykrycia in vivo, ponieważ komórki, które odwróciły proces śmierci komórki, mogą być morfologicznie nie do odróżnienia od normalnych zdrowych komórek. Poniżej opisujemy protokoły wykrywania i śledzenia komórek, które ulegają anastazie u żywych zwierząt, przy użyciu naszego nowo opracowanego systemu biosensorów CaspaseTracker in vivo.

Wykrywanie anastazy in vivo za pomocą biosensora CaspaseTracker

Opisujemy wysokoprzepustowy test kolorymetryczny mierzący aktywność β-galaktozydazy w trzech etapach cyklu życia Trypanosoma cruzi, czynnika wywołującego chorobę Chagasa. Ten test może być używany do identyfikacji związków trypanobójczych w łatwy, szybki i powtarzalny sposób.

In vitro Badania przesiewowe leków przeciwko wszystkim etapom cyklu życia Trypanosoma cruzi przy użyciu pasożytów eksprymujących β-galaktozydazę

Poznaj metodę TUNEL i testy kaspazy 3/7 do pomiaru apoptozy w naskórku żab z chytridiomykozą. Technika ta pozwala analizować małe próbki tkanek i badać mechanizmy śmierci komórek wywołane przez grzyba Batrachochytrium dendrobatidis.

Wykorzystanie końcowego znakowania końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) i testów kaspazy 3/7 do pomiaru śmierci komórek naskórka u żab z chytridiomykozą (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie końcowego znakowania końca dUTP Nick za pośrednictwem transferazy końcowej (TUNEL) i testów kaspazy 3/7 do pomiaru śmierci komórek naskórka u żab z chytridiomykozą

Przeglądaj więcej filmów