Name: Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Poznaj edycję genomu za pomocą kompleksów RNP CRISPR/Cas9 w różnych komórkach i organizmach. Ta metoda zapewnia wyższą wydajność i mniejszą liczbę zdarzeń poza targetem niż plazmid DNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy wielu poprzednim członkom naszych laboratoriów i społeczności edycji genomu z Bay Area za ich wkład w rozwój tych metod. Dziękujemy Rossowi Wilsonowi za krytyczną lekturę tego manuskryptu.
Badania Alexandra Marsona są wspierane przez dar od Jake'a Aronova i grant National Multiple Sclerosis Society (CA 1074-A-21). Alexander Marson otrzymał nagrodę Career Award for Medical Scientists przyznaną przez Burroughs Wellcome Fund i jest badaczem Chan Zuckerberg Biohub. Badania Jacoba E. Corna są wspierane przez Fundację Li Ka Shing, Instytut Medyczny Heritage Medical Research oraz Kalifornijski Instytut Medycyny Regeneracyjnej. Badania Behnoma Farbouda i Barbary J. Meyer są częściowo finansowane z grantu NIGMS R01 GM030702 dla Barbary J. Meyer, która jest badaczem w Instytucie Medycznym Howarda Hughesa. Badania Erin Jarvis i Nipam H. Patel są częściowo finansowane z grantu NSF IOS-1257379, a Erin Jarvis dziękuje za wsparcie ze strony NSF GRFP i Philomathia Graduate Fellowship.

Autorzy, Alexander Marson i Jacob E. Corn, są współzałożycielami Spotlight Therapeutics. Jacob E. Corn jest doradcą Mission Therapeutics, a jego laboratorium otrzymało sponsorowane wsparcie badawcze od firm AstraZeneca i Pfizer. Alexander Marson jest doradcą Juno Therapeutics i PACT Therapeutics, a jego laboratorium otrzymało sponsorowane wsparcie badawcze od Juno Therapeutics, Epinomics i Sanofi. Jego laboratorium złożyło również wnioski o patenty związane z technologią Cas9 RNP.

Ustanowienie solidnego protokołu edycji genomu w linii komórkowej lub organizmie będącym przedmiotem zainteresowania wymaga optymalizacji i empirycznego przetestowania kilku kluczowych parametrów, omówionych w tej sekcji. Gorąco zachęcamy do wypróbowania kilku wariantów przedstawionych tutaj ogólnych podejść. Kluczowym ograniczeniem tego protokołu jest to, że zastosowanie tych metod do innych komórek lub organizmów może prowadzić do różnych wyników w zależności od badanego gatunku, a projekt eksperymentalny, który prowadzi do wysokowydajnego nokautu genu, może nie sprzyjać insercji DNA. Dlatego zalecamy rozpoczęcie od przedstawionych tutaj metod i rozwiązywanie problemów zgodnie z opisem poniżej.
Rozwiązywanie problemów z jakością odczynnika do edycji genomu: Wytwarzanie lub kupowanie wysokiej jakości odczynników jest kluczowym krokiem w każdym protokole edycji genomu. Białko Cas9 można oczyścić w laboratorium lub kupić komercyjnie. Wiele protokołów odnotowuje końcowe stężenie Cas9 w recepturach RNP, ale optymalna aktywność edycji genów będzie zależeć od specyficznej aktywności każdego pojedynczego preparatu białka Cas9, która różni się w zależności od źródła. Gdy przedstawiony tutaj protokół zacznie działać, rozważ optymalizację ilości RNP używanej do miareczkowania poziomów Cas9 w celu ustalenia optymalnego stężenia: takiego, które zapewnia wysoce specyficzne docelowe rozszczepienie DNA bez niepotrzebnego rozszczepienia poza celem spowodowanego nadmiernym Cas940.
Czystość i jednorodność RNA może być również wyznacznikiem sukcesu edycji genomu22. Zakupione sgRNA lub oddzielne składniki crRNA i tracrRNA są na ogół odczynnikami wysokiej jakości, a dostępne są różne modyfikacje chemiczne w celu zwalczania problemów z degradacją RNA lub nadania dodatkowych funkcji RNP91. Podczas gdy chemicznie modyfikowane gRNA mogą nie być konieczne do standardowych eksperymentów edycji genomu, niektóre grupy zaobserwowały znacznie wyższą wydajność edycji takich odczynników, więc mogą być warte wypróbowania po opanowaniu procesu i / lub gdy degradacja gRNA wydaje się być problemem22,91. Transkrypcja in vitro, a następnie oczyszczanie żelu jest niedrogą alternatywą, która może być wystarczająca do rutynowych eksperymentów z edycją genomu 17,21,49,50. Co więcej, kilka podejść, które są powszechnie stosowane do wytwarzania jednorodnych populacji gRNA in vivo, w tym wycinanie poszczególnych przewodników na podstawie rybozymu i tRNA, można rozszerzyć na preparat RNA in vitro w celu wytworzenia czystszych produktów92.
Przewodnik po wskazówkach dotyczących projektowania RNA i DNA dawcy: Przewodnia selekcja RNA jest kluczowym czynnikiem w osiągnięciu wysoce wydajnej edycji na miejscu przy jednoczesnej minimalizacji szans na rozszczepienie poza celem. Aby pomóc w wyborze przewodników, w kilku badaniach wykorzystano wysokoprzepustowe ekrany w połączeniu z sekwencjonowaniem nowej generacji w celu skompilowania cech sekwencji udanych przewodników 47,79,93,94,95,96. Cechy te zostały wykorzystane do opracowania algorytmów predykcyjnych i narzędzi online, które pomagają w wyborze przewodników 44,45,46,47,48. Takie algorytmy są oparte na ekranach wykorzystujących systemy oparte na DNA do prowadzenia ekspresji RNA. Przewodniki są wyrażane za pomocą promotora Pol III, a zatem ich ekspresja jest podatna na ograniczenia związane z transkrypcją Pol III, takie jak przedwczesne zakończenie w przypadku napotkania śladów uracylu 97,98,99. Jednak zastosowanie RNP wykonanych z syntetyzowanych in vitro przewodnikowych RNA omija te obawy i upraszcza ograniczenia dotyczące projektowania przewodników. Wspólną cechą, która wyłoniła się z tych algorytmów i została potwierdzona w licznych badaniach z wysoce skuteczną edycją genomu, jest obecność puryny, w szczególności guaniny, na końcu 3′ sekwencji specyficznej dla celu przewodnika. Ta funkcja przewodnika odniosła duży sukces wśród organizmów, od ssaków po C. elegans, muszki owocowe i danio pręgowane 65,100,101. Ponadto, w przypadku C. elegans, projektowanie przewodników z dinukleotydem GG na końcu 3′ regionu docelowego przewodnika jest skuteczną strategią przewidywania wysoce skutecznych przewodnikowych RNA65. Najlepiej byłoby przetestować wiele prowadnic równolegle, aby określić, który z nich jest najbardziej skuteczny dla danej aplikacji.
Przy próbie wprowadzenia sekwencji DNA do genomu, kluczowe znaczenie ma również projekt DNA dawcy lub matrycy. Jednoniciowe donory oligonukleotydów (ssODN) są wprowadzane bardziej niezawodnie niż inne typowe matryce naprawcze, liniowe dwuniciowe i plazmidowe DNA 54,55,102. W niektórych loci wydajność HDR można poprawić za pomocą ssODN, które są komplementarne do niedocelowej lub przemieszczonej nici DNA i mają ramiona homologiczne o asymetrycznej długości27,55. Ponieważ matryca naprawcza jest wprowadzana w miejscu cięcia i zawiera docelową sekwencję, należy podjąć kroki, aby zapobiec rozszczepieniu DNA dawcy przez Cas9 przed lub po insercji genomu. Osiąga się to poprzez ciche mutacje w sekwencji PAM lub regionie nasiennym, unikając rozpoznania przez Cas9 przy jednoczesnym zachowaniu funkcji wstawionego genu 21,103. Chociaż nawet zmiany pojedynczego nukleotydu w PAM prawdopodobnie zniosą wiązanie104, spróbuj zmienić co najmniej cztery nukleotydy, aby być bezpiecznym.
Znaczenie i przyszłe zastosowania: Edycja genomu za pomocą CRISPR-Cas9 stała się potężną metodą umożliwiającą łatwą manipulację genetyczną dowolnym organizmem. Edycja za pomocą Cas9 RNP na początku wymaga nieco więcej wysiłku, ale jest prosta w użyciu po ustaleniu odczynników i protokołów w laboratorium. Edycja komórek ze wstępnie złożonym RNP zamiast plazmidowego DNA prowadzi do wyższej ogólnej wydajności edycji, w tym trudnej do osiągnięcia insercji genu za pomocą HDR, z mniejszą liczbą efektów poza celem 24,25,26,27,29. Co więcej, eksperymentatorzy unikają problemów z ekspresją genów, degradacją RNA, fałdowaniem białek i związkiem między cząsteczkami gRNA i Cas9 syntetyzowanymi oddzielnie w komórce22,23. Edycja RNP pozwala również obejść obawy dotyczące bezpieczeństwa związane z mutagenezą insercyjną i trwałą ekspresją, które mogą wystąpić, gdy metody dostarczania wirusa są stosowane klinicznie14. Ze względu na te zalety wielu naukowców przeprowadzających przedkliniczne eksperymenty potwierdzające słuszność koncepcji faworyzuje edycję RNP do zastosowań terapeutycznych u ludzi. Zarówno metody edycji genomu oparte na RNP in vivo, jak i ex vivo są opracowywane w celu leczenia, a nawet leczenia różnych schorzeń, od chorób genetycznych, takich jak dystrofia mięśniowaDuchenne'a 105 i niedokrwistość sierpowatokrwinkowa27 po HIV29 i raka11. Co ciekawe, Cas9 RNP jest coraz częściej stosowany jako metoda dostarczania w inżynierii rolniczej, ponieważ umożliwia "wolną od DNA" edycję roślin 33,34,36.

fSystem CRISPR-Cas9 pozwala naukowcom zmieniać wybrane regiony dowolnego genomu1. Ta szybka i niedroga technologia zrewolucjonizowała badania podstawowe i obiecuje wywrzeć głęboki wpływ na rozwój spersonalizowanych terapii chorób, rolnictwa precyzyjnego i nie tylko2. Edycja CRISPR jest narzędziem demokratyzującym, a wdrożenie systemu w nowym laboratorium nie wymaga szczególnej wiedzy z zakresu inżynierii genomu, a jedynie podstawowych umiejętności z zakresu biologii molekularnej. Naukowcy mogą teraz badać organizmy, które wcześniej były trudne do opanowania, za pomocą kilku alternatywnych metod manipulacji genetycznej3,4. Tylko w ciągu ostatnich pięciu lat edycja genomu CRISPR została wykorzystana do inżynierii ponad 200 różnych gatunków kręgowców, bezkręgowców, roślin i drobnoustrojów.
Dostosowane do prokariotycznego szlaku obronnego CRISPR, podstawowymi elementami wymaganymi do edycji genomu specyficznego dla miejsca są białko Cas9, zazwyczaj pochodzące z S. pyogenes i zoptymalizowane pod kątem kodonów z dodatkowym sygnałem lokalizacji jądrowej (NLS), oraz jego wyspecjalizowany przewodnik RNA5,6. Chociaż nie zostało to tutaj omówione, można również zastosować inne ortologie Cas9 lub endonukleazy CRISPR. Naturalnie występujące gRNA składa się z dwóch oddzielnie transkrybowanych fragmentów, CRISPR RNA (crRNA) i trans-aktywującego crRNA (tracrRNA)7. Te RNA mogą być połączone w pojedynczy transkrypt, znany jako RNA z pojedynczym przewodnikiem (sgRNA)8. Większość edytorów genomu wybiera uproszczony sgRNA9, chociaż regularnie używany jest również podwójny przewodnik10,11. Eksperymentatorzy wybierają cel genomowego DNA składającego się z 20 nukleotydów (nt), upewniając się, że znajduje się on obok krótkiej sygnatury licencyjnej wymaganej do rozpoznania Cas9, zwanej motywem sąsiadującym z protospacerem (PAM), i projektują gRNA, które zawiera komplementarną sekwencję12.
Po wejściu do komórki, kompleks RNP lokalizuje swój genomowy cel, zasada gRNA łączy się z komplementarną nicią DNA, a następnie enzym rozszczepia obie nici DNA, aby wytworzyć dwuniciową przerwę2. Maszyneria naprawy komórek utrwala DSB jedną z co najmniej dwóch dróg: poprzez podatny na błędy szlak niehomologicznego łączenia końców (NHEJ) lub naprawę ukierunkowaną na homologię (HDR), która płynnie włącza DNA zawierające "ramiona" homologii po obu stronach pęknięcia. Pierwszy szlak naprawczy zazwyczaj prowadzi do powstawania indel i w konsekwencji do rozerwania genów, podczas gdy drugi pozwala eksperymentatorom na wstawianie lub zmianę sekwencji DNA1.
Efektywność i dokładność edycji zależą od sposobu, w jaki Cas9 i gRNA dostają się do komórki. Składniki te mogą być dostarczane do hodowanych komórek, zarodków lub organizmów w postaci kwasów nukleinowych lub jako wstępnie złożony kompleks RNP 13,14,15. Typowe metody dostarczania oparte na kwasach nukleinowych obejmują transdukcję, transfekcję lub elektroporację mRNA lub plazmidowego DNA. Białko Cas9 i przewodnik RNA są następnie wytwarzane w komórce i łączą się, tworząc kompleks.
Bezpośrednie dostarczenie RNP wymaga oddzielnego oczyszczania białka Cas9 i prowadzącego RNA. Można to zrobić we własnym zakresie lub można kupić białko i sgRNA od jednego z kilku komercyjnych dostawców. Po pozyskaniu Cas9 i gRNA są mieszane w celu utworzenia enzymatycznie kompetentnego kompleksu RNP i wprowadzane do komórek przez bezpośrednie wstrzyknięcie do zapłodnionych jaj / zarodków, transfekcję na bazie lipidów16 lub elektroporację. Pierwszy raport o edycji RNP dotyczył wstrzyknięcia do gonad C. elegans gonads17. Mikroiniekcja jest nadal preferowanym sposobem wprowadzania RNP do zarodków i całych organizmów, chociaż skuteczność elektroporacji wykazano w zarodkach mouse18,19 i rat20 zarodków. Opisujemy protokoły bezpośredniego wstrzykiwania RNP do zarodków C. elegans gonads i P. hawaiensis i zalecamy specjalistyczny rodzaj elektroporacji w celu dostarczenia RNP podczas edycji pierwotnych komórek ludzkich. Ta metoda, nukleofekcja, obejmuje zoptymalizowane programy elektroporacji i rozwiązania specyficzne dla typu komórki i pozwala RNP wejść zarówno do cytoplazmy, jak i do jądra21.
Edycja genomu za pomocą RNP oferuje kilka wyraźnych korzyści. Ponieważ składniki białka i RNA są wstępnie zmontowane, a jakość można zapewnić przed dostarczeniem, edycja RNP pozwala uniknąć wielu pułapek związanych z dostarczaniem na bazie kwasów nukleinowych. Mianowicie, nie ma ryzyka integracji DNA kodującego Cas9 z genomem gospodarza, mRNA nigdy nie jest narażone na degradację i omija problemy z ekspresją, fałdowaniem i asocjacją gRNA lub białka in vivo22,23. Co więcej, użycie RNP prowadzi do niższej toksyczności i znacznie mniejszej liczby zdarzeń poza celem niż ekspresja oparta na plazmidzie, co jest wynikiem krótszego okresu półtrwania RNP wewnątrz komórki24,25,26,27.
Wreszcie, edycja RNP wyraźnie prowadzi do wysokich wskaźników edycji w różnych ludzkich liniach komórkowych, komórkach pierwotnych, takich jak fibroblasty, embrionalne komórki macierzyste (ESC), indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iSPC), HSPC i limfocyty T16,24,25,26,27,28,29; u bezkręgowców, w tym C. elegans, P. hawaiensis i muszek owocowych3,17,30; u gatunków kręgowców, takich jak danio pręgowany, myszy i szczury31,32; w gatunkach roślin, w tym rzodkiewnik, tytoń, sałata, ryż, winorośl, jabłko, kukurydza i pszenica33,34,35,36; oraz u gatunków Chlamydomonas, Penicillium i Candida37,38,39. Częstotliwość tworzenia indel może być wyższa przy użyciu RNP w porównaniu z dostarczaniem plazmidu, a insercja DNA za pośrednictwem HDR może być łatwiejsza do osiągnięcia25,27,29.
Opisany tutaj protokół wykorzystuje Cas9 RNP i jest skuteczną, łatwo adaptowalną techniką, którą łatwo zastosować do szerokiej gamy systemów biologicznych40,41, szczególnie w komórkach, które są trudne do pracy w inny sposób oraz w organizmach bez dobrze ugruntowanych systemów do precyzyjnej manipulacji genetycznej. Zaczynamy od opisania, jak zaprojektować, uzyskać i złożyć Cas9 RNP, zanim omówimy jego zastosowanie w różnych modelowych typach komórek i organizmach. Hematopoetyczne komórki macierzyste/progenitorowe (HSPC) i limfocyty T są edytowane przy użyciu tej samej metody, nukleofekcji, więc są one omówione razem w krokach 2 i 3 tego protokołu. Procedury edycyjne dla języka C. elegans są opisane w krokach 4 i 5 oraz P. Edycja Hawaiensis została omówiona w krokach 6 i 7. Wreszcie, ponieważ powodzenie eksperymentu z edycją genów w dowolnym organizmie można ocenić za pomocą sekwencjonowania genotypu, w kroku 8 przedstawiono podetapy opisujące możliwe metody analizy dla wszystkich komórek i organizmów opisanych w protokole.

<table><tbody><tr><td>Reagent/Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNA oligonukleotydy</td><td>Integrated DNA</td> <td>Technologies-IDT</td> <td>dostarczy niestandardowe sekwencje DNA, w tym te z Tabeli 1</td></tr><tr><td>Przewodnikowe RNA</td><td>Synthego-Synthego</td><td></td> <td>dostarczy wysokiej jakości sgRNA dla S. pyogenes Cas9, w tym niestandardowe sgRNA zawierające sekwencje docelowe zawarte w Tabeli 1</td></tr><tr><td>Oczyszczone białko Cas9 (EnGen&nbsp; Cas9 NLS,&nbsp;S. pyogenes)</td><td>New England Biosciences</td><td>M0646T</td><td>Jeśli to możliwe, oczyszczanie Cas9 we własnym zakresie lub zakup w lokalnych ośrodkach jest tańszą opcją</td></tr><tr><td>Normalne komórki macierzyste/progenitorowe CD34+ krwi obwodowej</td><td>AllCells</td><td>PB032-2</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>09650</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan CC110</td><td>StemCell Technologies</td><td>02697</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 Medium, z wodorowęglanem sodu, bez L-glutaminy, płyn</td><td>Sigma</td><td>R0883-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Zestaw do izolacji ludzkich limfocytów T Stemcell</td><td></td><td>17951</td><td></td></tr><tr><td>płytka do hodowli komórek, 96 dołków, okrągła</td><td>Fisher Scientific</td><td>3799</td><td></td></tr><tr><td>CTS (systemy terapii komórkowej) Dynabeads CD3/CD28</td><td>Life Tech</td><td>40203D&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Reombinant Human IL-2</td><td>UCSF Pharmacy</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>SepMate-50 500-pack IVD</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85460</td><td></td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td>OP-50</td><td>https://cgc.umn.edu/</td></tr> <tr><td>Agar z pożywką do wzrostu nicieni na szalkach Petriego</td><td>-</td><td>-</td><td>Zobacz Stiernagle, T (ref. 59)</td></tr><tr><td>Standardowe kapilary ze szkła borokrzemianowego z żarnikiem:&nbsp; 4 cale (100 mm), 1/0,58 OD/ID</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Standardowe kapilary ze szkła borokrzemianowego z pojedynczą lufą: 6 cali (152 mm), 2/1,12 OD/ID&nbsp;</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne</td><td>1B200-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe; 24 & razy; 50 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-544E</td><td></td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe; 22 & razy; 22 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12-518-105K</td><td></td></tr><tr><td>Apex LE agaroza</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Olej halowęglowy 700</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>H8898-100ML</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pCFJ90</td><td>Addgene</td><td>19327</td><td></td></tr><tr><td>Sprężony</td><td></td> azot-60 <td></td><td></td></tr><tr><td>mM Naczynia hodowlane</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki kapilarne z żarnikiem: 4 cale (1,0 mm)&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>T2100F-4</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 Szalki</td> Petriego <td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(100 & razy; 15 mm)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drut wolframowy (średnica 0,005 cala)</td><td>Ted Pella</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfluoroalkoksyalkowy (PFA)</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sól morska-9</td><td></td><td></td><td></td></tr>-<tr><td>" pipety Pasteura</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr>Czerwień <td></td><td></td><td></td><td>fenolowa</td></tr> <tr><td>bez nukleazy woda</td><td>-</td><td></td><td></td></tr><tr><td><silny>Sprzęt</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1002X</td><td></td></tr><tr><td>MZ75&nbsp; Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica&nbsp;</td><td>Poza produkcją. Obecny model to mikroskop fluorescencyjny</td><td></td>M80</tr><tr><td>Axio Vert35 z odwróconym kontrastem fazowym</td><td>Zeiss</td>, <td>nieprodukowany. Obecny model to laserowy ściągacz do mikropipet Axio VertA.1</td><td></td></tr><tr><td>(dla protokołu C. elegans)</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>FG-P2000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz pikoliter (do protokołu C. elegans)</td><td>Warner Instruments</td><td>PLI-100A Trójosiowy</td><td></td></tr><tr><td>mikromanipulator hydrauliczny oleju z joystickiem</td><td>Narishige International</td><td>MO-202U</td><td></td></tr><tr><td>Manipulator zgrubny</td><td>Narishige International</td><td>MMN-1</td><td></td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet (do protokołu P. hawaiensis)</td><td>Sutter Instrument&nbsp;</td><td>Mikroiniektor P-80/PC</td><td></td></tr><tr><td>(do protokołu P. hawaiensis)</td><td>Narishige</td><td>IM300</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td></td></tr><tr><td>NG-agar</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny cas9 w różnych komórkach i organizmach

Enhanced Genome Editing with Cas9 Ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms

Specyficzna dla miejsca edycja genomu eukariotycznego za pomocą systemów CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (związanych z CRISPR) szybko stała się powszechna wśród badaczy zajmujących się różnorodnymi zagadnieniami biologicznymi. Użytkownicy najczęściej wykorzystują białko Cas9 pochodzące ze Streptococcus pyogenes w kompleksie z łatwym do przeprogramowania przewodnikiem RNA (gRNA). Składniki te są wprowadzane do komórek, a poprzez parowanie zasad z komplementarnym regionem genomu dwuniciowego DNA (dsDNA), enzym rozszczepia obie nici, aby wygenerować pęknięcie dwuniciowe (DSB). Późniejsza naprawa prowadzi albo do losowych zdarzeń insercji lub delecji (indels), albo do włączenia DNA dostarczonego przez eksperymentatora w miejscu pęknięcia.
Użycie oczyszczonego, jednoprowadnicowego RNA i białka Cas9, wstępnie złożonego w RNP i dostarczonego bezpośrednio do komórek, jest skutecznym podejściem do osiągnięcia wysoce efektywnej edycji genów. Edycja RNP szczególnie zwiększa szybkość insercji genów, co często jest trudne do osiągnięcia. W porównaniu z dostarczaniem za pośrednictwem plazmidu, krótsza trwałość Cas9 RNP w komórce prowadzi do mniejszej liczby zdarzeń poza celem. 
Pomimo jej zalet, wielu przypadkowych użytkowników edycji genów CRISPR jest mniej zaznajomionych z tą techniką. Aby obniżyć barierę wejścia, przedstawiamy szczegółowe protokoły wdrażania strategii RNP w różnych kontekstach, podkreślając jej wyraźne korzyści i różnorodne zastosowania. Zajmujemy się edycją w dwóch typach pierwotnych komórek ludzkich, limfocytach T i krwiotwórczych komórkach macierzystych/progenitorowych (HSPC). Pokazujemy również, w jaki sposób edycja Cas9 RNP umożliwia łatwą manipulację genetyczną całych organizmów, w tym klasycznego modelu glisty Caenorhabditis elegans i niedawno wprowadzonego modelowego skorupiaka Parhyale hawaiensis.

Niniejsze eksperymenty pokazują, w jaki sposób wstępnie złożone kompleksy RNP Cas9 mogą być wykorzystane do manipulacji genomami komórek pierwotnych oraz całych organizmów. Badacze oczyszczają lub kupują białko Cas9 oraz sgRNA, łączą oba komponenty w celu wstępnego sformowania kompleksu, a następnie wprowadzają RNP do wybranych komórek lub organizmów. Po odczekaniu czasu niezbędnego do zajścia edycji i narodzin potomstwa następnego pokolenia (jeśli dotyczy), należy sprawdzić fenotypy i/lub zebrać komórki do genotypowania. Fenotypy można obserwować za pomocą testów funkcjonalnych, analiz ekspresji, wizualizacji (gołym okiem lub przy użyciu mikroskopii) lub innych metod, w zależności od eksperymentu.
Na przykład HSPC, w których dokonano edycji w celu korekcji mutacji β-globiny odpowiedzialnej za anemię sierpowatą, mogą zostać zróżnicowane do erytrocytów, a następnie poddane analizie pod kątem produkcji zdrowej hemoglobiny lub hemoglobiny sierpowatej27,87 (Rysunek 1A). Limfocyty T, w których zedytowano gen wysokopowinowatego receptora IL-2, CD25 (IL2RA), w celu jego wyciszenia (knock-out), mogą być analizowane za pomocą barwienia powierzchniowego i cytometrii przepływowej8, a także analizowane funkcjonalnie w celu wykrycia odpowiedzi sygnałowej na stymulację IL-2 (Rysunek 1B). Limfocyty T mogą być również przeprogramowane na wiele istotnych klinicznie sposobów, co wymaga oceny różnych fenotypów, w tym skuteczności infekcji HIV89 oraz przeciwnowotworowej skuteczności komórek CAR-T in vivo1.
Stosując podejście przesiewowe oparte na co-CRISPR/co-konwersji, nicienie C. elegans poddawane są edycji jednocześnie w dwóch loci62. HDR w genie referencyjnym dpy-10 z użyciem ssODN jako matrycy naprawczej prowadzi do łatwego do oceny dominującej mutacji typu gain-of-function dpy-10. Heterozygotyczne zwierzęta F1dpy-10(gof) wykazują fenotyp roller (Rol), a homozygotyczne zwierzęta dpy-10(gof) fenotyp dumpy (Dpy). Obecność tego fenotypu wskazuje, że w tych zwierzętach doszło do edycji przez Cas9 i zwiększa szanse na zidentyfikowanie zdarzenia edycji w drugim locus u zwierząt F1 o fenotypie Rol lub Dpy. Udany eksperyment edycji powinien doprowadzić do tego, że 3-50% wstrzykniętych nicieni P0 da 20 lub więcej potomstwa F1 o fenotypie Rol lub Dpy90. Można następnie wybrać zwierzęta nie-Rol, aby przywrócić gen dpy-10 do typu dzikiego i wyselekcjonować homozygotyczną edycję interesującego nas genu. Jako ogólną zasadę przyjmuje się, że stężenie crRNA celującego w referencyjny gen co-CRISPR powinno wynosić połowę stężenia crRNA celującego w gen docelowy. Jeśli nie uda się odzyskać edycji w genie docelowym, można dostosować proporcje obu CRISPR RNA, aby zwiększyć prawdopodobieństwo uzyskania pożądanej mutacji. Na przykład zwiększenie ilości crRNA dla genu docelowego w stosunku do crRNA genu referencyjnego zwiększy odsetek nicieni posiadających edycje w genie docelowym w populacji nicieni, które posiadają również edycje w locus genu referencyjnego. Częstotliwości co-konwersji są zmienne, ale stawki zazwyczaj wynoszą 20-60%, często prowadząc do uzyskania edycji homozygotycznych w pokoleniu F1 (Rysunek 1C).
P. hawaiensis wyklute osobniki, u których dokonano edycji w celu wyłączenia genu Abdominal-B (Abd-B), wykazują wyraźne anomalie morfologiczne3 (Rysunek 1D). Gen ten jest niezbędny do prawidłowego kształtowania odwłoka, a jego zaburzenie prowadzi do zastąpienia nóg pływających i kotwiczących, które zazwyczaj występują na odwłoku, nogami skaczącymi i chodzącymi o typie klatkowym.
Wyznaczanie wyników edycji genomu na poziomie genotypowym wymaga sekwencjonowania lub przeprowadzenia testu in vitro wykrywającego zmiany w sekwencji. Poniżej przedstawiamy reprezentatywne dane z sekwencjonowania dla naszych modelowych typów komórek i organizmów, ilustrujące różne podejścia do ilościowego określania stopnia edycji. Należy zauważyć, że etykiety na rysunkach są uogólnione, ponieważ wszystkie przedstawione tutaj metody mogą być zastosowane w dowolnym systemie biologicznym.
Metody oparte na sekwencjonowaniu różnią się pod względem złożoności technicznej i szczegółowości wyników. W przypadku populacji klonalnie edytowanych lub łatwo rozdzielnych osobniczych organizmów, osobniki edytowane można sekwencjonować po ekstrakcji genomowego DNA. Standardowe wyniki sekwencjonowania metodą Sangera ujawnią zmianę sekwencji w miejscu cięcia przez Cas9 u danego osobnika, z hipotetycznymi przesunięciami ramki odczytu, które zakłóciłyby jego funkcję (Rycina 2A). Narzędzie online wykorzystywane do sekwencjonowania to kolejne podejście oparte na sekwencjonowaniu metodą Sangera, które można zastosować do populacji mieszanych, a nie tylko do poszczególnych mutantów78. Sekwencje są analizowane za pomocą narzędzia online, które pozwala oszacować ogólną wydajność edycji oraz dominujące wyniki sekwencyjne. Reprezentatywne dane przedstawiono na Rycynie 2B.
Najdokładniejszą opisaną tutaj metodą sekwencjonowania jest sekwencjonowanie głębokie (czasami nazywane wysokoprzepustowym lub sekwencjonowaniem następnej generacji). Metoda ta dostarcza sekwencji DNA z poszczególnych genomów w populacji mieszanej. Takie dane można przedstawić na różne sposoby. W tym przypadku sklasyfikowano poszczególne odczyty sekwencjonowania z edytowanych komórek na podstawie wyniku edycji (Rycina 2C). Większość komórek jest edytowana poprzez ścieżkę NHEJ, co zazwyczaj prowadzi do przerwania genu. W innych przypadkach gen docelowy został zastąpiony alternatywną wersją poprzez HDR27.
<img alt="Tabela metod edycji genów; HSPC, limfocyty T, C. elegans, P. hawaiensis; sekwencjonowanie i analiza." src="/files/ftp_upload/57350/57350tbl1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Tabela 1"> 
Tabela 1: Kontrole pozytywne dla wstępnych eksperymentów edycji genomu. W poniższej tabeli przedstawiono kluczowe informacje niezbędne do przeprowadzenia pierwszego eksperymentu z edycji genomu w każdej z komórek i organizmów opisanych w niniejszym protokole. Przestrzeganie tych parametrów prawdopodobnie pozwoli uzyskać pomyślny wynik, który może posłużyć do przetestowania protokołu lub jako punkt odniesienia do porównań, gdy badacz zacznie celować w geny będące przedmiotem własnych zainteresowań. F: forward (przednia), R: reverse (odwrotna), HDR: homology-directed repair (naprawa sterowana homolgią). <a href="/files/ftp_upload/57350/Farboud_et_al_Table_1.xlsx" target="_blank">Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.</a>
<img alt="Schemat oceny fenotypu HSPC HBB, limfocytów T CD25, C. elegans yfg oraz P. hawaiensis Abd-B." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1Reprezentatywne wyniki fenotypowe edycji pierwotnych ludzkich komórek i organizmów za pomocą kompleksów RNP Cas9. (A) Jest to chromatogram HPLC wykazujący, że po udanej edycji genomu HSPC zróżnicowane do erytroblastów na późnym etapie rozwoju produkują więcej funkcjonalnej hemoglobiny niż hemoglobiny sierpowej. Erytrocyty zmutowane produkują hemoglobinę sierpową (HbS), natomiast komórki poddane udanej edycji będą produkować hemoglobinę prawidłową (HbA i HbA2) oraz hemoglobinę płodową (HbF). Absorbancja została przedstawiona w jednostkach arbitralnych (au). Ten panel został opublikowany po raz pierwszy w pracy DeWitta ei wsp.27Tekst został przedrukowany za zgodą American Association for the Advancement of Science. (B) Po lewej stronie, dla każdego stanu, panel ten przedstawia dane z cytometrii przepływowej wykazujące, że limfocyty T barwione powierzchniowo nie wykazują ekspresji CD25 po CD25 gen został wyłączony za pomocą RNP. Zawartość CD25 przedstawiono na osi x, a wielkość komórek na osi y. Po prawej stronie, dla każdego stanu doświadczalnego, ten panel przedstawia ilościowe oznaczenie fosfo-Stat5 (pStat5) po indukcji IL-2. Sygnalizacja jest zmniejszona w przypadku braku receptora IL-2 (CD25 KO). Zawartość pStat5 naniesiono na oś X, a dane uzyskane dla trzech różnych poziomów stymulacji IL-2 porównano w pionie. (C) Ten panel przedstawia Caenorhabditis elegans celowanie w screening co-CRISPR/co-konwersji dpy-10 jako marker współkonwersji. Dwa gRNA celują w dwa loci, dpy-10 or Twój ulubiony gen (yfg), w tej samej P0-wstrzyknięte zwierzę. HDR w dpy-10 wynikiem jest fenotyp Rol lub Dpy. Wybór Rol- lub Dpy-F1 zwierzęta zwiększają szanse na zidentyfikowanie edycji w drugim locus. (D) Ten panel pokazuje, że typ dziki Parhyale hawaiensis wylęgły mają prawidłowo rozwinięte odwłoki z odnóżami pływakowymi i kotwiczącymi. Abd-B wyklute osobniki z nokautem (F0 osobniki) wykształcają odwłok przekształcony w klatkę piersiową. W rezultacie odnóża pływające i kotwiczące zanikają, a ich miejsce zajmują odnóża skaczące i chodzące, charakterystyczne dla prawidłowo rozwiniętej klatki piersiowej. <a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig1large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza edycji genów; obejmuje sekwencjonowanie metodą Sangera, TIDE, głębokie sekwencjonowanie; wyniki edycji CRISPR Cas9." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57350/57350fig2v2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2Typowe wyniki metod analizy efektów edycji. (A) Ten panel przedstawia przykłady wyników sekwencjonowania metodą Sangera dla poszczególnych F1 P. hawaiensis organizmy, w tym sekwencja typu dzikiego oraz trzy różne insercje/delecje (indele), które zaburzają funkcję genu poprzez przesunięcie ramki odczytu. (B) Wyniki analizy TIDE pokazują zakres insercji i delecji, które wystąpiły w miejscu docelowym Cas9 w puli sekwencjonowanych limfocytów T. Oś x wskazuje długość danej insercji lub delecji w nukleotydach. (C) Wyniki sekwencjonowania głębokiego wykazują brak edycji genomu bez nukleofekcji lub gRNA oraz skuteczną edycję z zastosowaniem nienaruszonych kompleksów RNP Cas9, pogrupowane według wyników naprawy DNA w HSPC. <a href="/files/ftp_upload/57350/57350fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej figury.</a>

Wykorzystanie wstępnie złożonego kompleksu rybonukleoproteinowego Cas9 (RNP) to potężna metoda precyzyjnej, efektywnej edycji genomu. W tym miejscu podkreślamy jego użyteczność w szerokim zakresie komórek i organizmów, w tym pierwotnych komórek ludzkich oraz zarówno klasycznych, jak i powstających organizmów modelowych.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Site-specific eukaryotic genome editing with CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas (CRISPR-associated) systems has ...

Ogólnym celem tego protokołu jest dokonanie ukierunkowanych zmian genomowych w różnych komórkach i organizmach przy użyciu kompleksów rybonukleoproteinowych CRISPR/Cas9. Metoda ta może pomóc w rozwiązaniu podstawowych problemów biologicznych, dając naukowcom możliwość generowania specjalnie zaprojektowanych insercji, delecji i podstawień w inaczej niezmodyfikowanych genomach organizmów modelowych i niemodelowych. Główną zaletą stosowania kompleksów rybonukleoproteinowych lub RNP zamiast plazmidowego DNA jest to, że wydajność jest wyższa, a zdarzenia poza celem są zmniejszone.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapie ex vivo w celu zwalczania takich rzeczy, jak rak, HIV lub choroby genetyczne. Dzieje się tak, ponieważ edycja genomu może być wykorzystana do korygowania szkodliwych mutacji, a nawet do zwiększenia zdolności komórek do zwalczania szkodliwych chorób. Tak więc ta metoda może dostarczyć wglądu w pierwotne komórki ludzkie, C.elegans i Parhyale hawaiensis.Może być stosowany do wprowadzania zmian genetycznych w setkach innych systemów, w tym w organizmach wcześniej trudnych do opanowania. Rozpocznij tę procedurę od zaprojektowania i przygotowania przewodnika RNA zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Złóż kompleks RNP, mieszając jedno- lub dwukrotnie molową ilość prowadzącego RNA z 200 komolami białka Cas9 w całkowitej objętości 10 mikrolitrów.Bardzo powoli dodawaj skoncentrowany Cas9 do prowadzącego RNA przez około 30 sekund, wykonując szybkie ruchy pipetą. Doprowadzenie końcowego stężenia Cas9 do 20 mikromolów. Następnie dodaj 10 mikrolitrów RNP do każdej studzienki kuwety.Po przygotowaniu HSPC zgodnie z opisem w protokole tekstowym, należy policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przenieść od 150 000 do 200 000 komórek na kuwetę, które mają być elektroporowane do probówki wirówkowej. Obracaj rurkę pod 100-krotnością grawitacji przez 10 minut, aby granulować komórki. Odessać supernatant pipetą lub odkurzaczem, usuwając wszelkie pęcherzyki.Delikatnie ponownie zawiesić ogniwa za pomocą 20 mikrolitrów buforu elektroporacyjnego na studzienkę kuwety. Następnie dodaj 20 mikrolitrów komórek, które zawierają od 150 000 do 200 000 HSPC, do każdej studzienki kuwetowej, która zawiera już 10 mikrolitrów RNP i dobrze wymieszaj, pipetując w górę iw dół bez tworzenia pęcherzyków. Na koniec należy naelektryzować kuwety po umieszczeniu ich w Nucleofectorze.W przypadku HSPC użyj kodu impulsu ER-100. Rozpocznij od przygotowania C.elegans w płatkach agarozowych, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieścić nakładkę do wstrzykiwań z agarozą i szkiełko nakrywkowe na lunecie preparacyjnym.Użyj wykałacza ślimakowego, aby położyć mały ślad oleju halowęglowego wzdłuż jednej krawędzi podkładki. Następnie użyj szpikulca pokrytego olejem, aby podnieść kilka robaków z płytki agarowej NG na ścieżkę oleju. Za pomocą cienkiego włoska przymocowanego do pipety, takiej jak wąs do rzęs lub kota, ustaw robaki równolegle, delikatnie wpychając robaki do podkładki agarozowej.Dopóki nie zaznajomisz się z procedurą mikroiniekcji, należy wstrzykiwać tylko jednego robaka na raz. Po ustawieniu na miejscu i przymocowaniu do podkładki pokryj robaki kolejnymi kilkoma kroplami oleju halowęglowego z końcówki kilofa. Umieścić szkiełko nakrywkowe z zamontowanymi ślimakami na mikroskopie iniekcyjnym.W małym powiększeniu należy ustawić robaki prostopadle do igły iniekcyjnej, która została wypełniona roztworem RNP, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przełącz się na duże powiększenie i zmień położenie igły przylegającej do ramienia gonady, odpowiadającej obszarowi w pobliżu jąder w środkowym i późnym pachytenie. Za pomocą mikromanipulatora przysuń igłę do robaka, lekko dociskając naskórek.Następnie jedną ręką dotknij boku stolika mikroskopu, aby przebić igłę przez naskórek. Wcisnąć łopatkę lub przycisk do wstrzykiwań, powoli napełnić ramię gonady mieszanką do wstrzykiwań i wyjąć igłę. Powtórz ten krok z drugim ramieniem gonady.Po wstrzyknięciu robaków usuń szkiełko nakrywkowe i podkładkę agarozową i umieść je pod mikroskopem preparacyjnym. Za pomocą wyciągniętej pipety kapilarnej usunąć olej z robaków, pipetując na nie bufor M9. Wykonaj ten zabieg, aby uwolnić robaki z agaru.Po 10 minutach, gdy robaki będą się miotać w buforze, przenieś je na płytkę agarową NG z bakteriami OP50 za pomocą wyciągniętej pipety kapilarnej. Umieść płytkę w temperaturze 20 stopni Celsjusza na dwie do trzech godzin, aż robaki zregenerują się i zaczną się poruszać. Po odzyskaniu należy indywidualnie przenieść robaki na płytki agarowe NG z OP50.Następnie przenieś płytki do inkubatora o temperaturze 25 stopni Celsjusza. Zbierz jednokomórkowe zarodki Parhyale od zera do czterech godzin po zapłodnieniu, najpierw znieczulając ciężarne samice 0,02% olejkiem goździkowym i wodą morską. Delikatnie zeskrob zarodki z jej brzusznej torby lęgowej za pomocą ciągniętej płomieniem i zaokrąglonej szklanej pipety oraz pary kleszczy numer trzy.Używając sprężonego azotu, wstrzyknąć zarodki Parhyale pod mikroskopem preparacyjnym za pomocą mikrowstrzykiwacza i mikromanipulatora. Załaduj 1,5 mikrolitra mieszanki iniekcyjnej do tylnej części ciągniętej rurki kapilarnej za pomocą końcówki pipety do mikroładowarki. Po umieszczeniu igły na aparacie iniekcyjnym należy złamać końcówkę igły za pomocą kleszczy pod lunetą sekcyjną.Skalibruj dostarczoną objętość, wstrzykując do oleju Halocarbon 700 i mierząc średnicę pęcherzyka. Wytnij koryto z utwardzacza za pomocą żyletki. Napełnij go do połowy wysterylizowaną wodą morską z filtrem i ułóż zarodki Parhyale w korycie do wstrzyknięcia.Wstrzyknąć zarodki za pomocą zestawu do mikroiniekcji, stabilizując każdy zarodek za pomocą kleszczy podczas wstrzyknięcia. Po wstrzyknięciu użyj szklanej pipety transferowej, aby przenieść zarodki do świeżego 60-milimetrowego naczynia hodowlanego wypełnionego do połowy wysterylizowaną wodą morską z filtrem, a następnie wypreparuj i utrwal zarodki na różnych etapach. Wykonaj igły do rozwarstwiania, nawlekając wygięty kawałek drutu wolframowego o długości około 0,5 cala w koniec igły insulinowej.Użyj jednomililitrowej strzykawki jako uchwytu igły do preparowania i naostrz igłę w wodorotlenku sodu pod prądem. Napełnij jedną studzienkę szklanego naczynia z trzema dołkami do połowy świeżo przygotowanym roztworem składającym się z dziewięciu części buforu PEM, jednej części 10X PBS i jednej części 32% PFA. Umieść od trzech do pięciu zarodków w naczyniu i wbij mały otwór w każdym zarodku za pomocą ostrej igły wolframowej do wbicia i lekko stępionej do ustabilizowania, pozwalając żółtku wypłynąć i utrwalić się do środka.Za pomocą pary zaostrzonych igieł wolframowych delikatnie oderwij dwie zewnętrzne błony otaczające zarodek Parhyale. Rozdziel je na utrwalacz, aby zarodki były bardziej wytrzymałe, ale pracuj szybko, aby błona nie przylgnęła do zarodka, co utrudnia usunięcie błony. Pozwól zarodkom utrwalić się w sumie przez 15 do 20 minut w przypadku barwienia przeciwciał lub 40 do 50 minut w przypadku hybrydyzacji in situ.Czasami wyniki eksperymentu edycyjnego najlepiej ocenić za pomocą testu eksperymentalnego. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki zarówno limfocytów T typu dzikiego, jak i komórek nokautujących CD25. Cytometria przepływowa pokazuje, że komórki, które nie były edytowane za pomocą Cas9 RNP, wyrażają CD25.Jednak komórki, w których CD25 został znokautowany, nie wykazują ekspresji białka. W przypadku perturbacji na dużą skalę, wyniki edycji mogą mieć wyraźne fenotypy wizualne. Na przykład dziki typ Parhyale hawaiensis ma normalne brzuchy z nogami do pływania i kotwicy.Zaburzenie genu Abd-B powoduje zastąpienie pływania w jamie brzusznej i nóg kotwicznych nogami skaczącymi i chodzącymi, które zwykle są związane tylko z klatką piersiową. Oprócz sprawdzania fenotypów, eksperymentatorzy powinni również analizować genotyp, aby ocenić ogólną wydajność edycji i wykryć określone zmiany genetyczne. W przypadku pojedynczych klonów można to osiągnąć poprzez proste sekwencjonowanie Sangera.W mieszanych populacjach komórek zalecana jest bardziej zaawansowana analiza sekwencjonowania. Na przykład TIDE może mapować wszystkie różne indele, które wystąpiły w poszczególnych komórkach w puli edytowanej przez RNP. Przy pierwszej próbie tej procedury spróbuj użyć jednej z kontroli pozytywnych, które wymieniliśmy w tabeli pierwszej.Korzystanie z wypróbowanego i prawdziwego przewodnika RNA może pomóc Ci zapoznać się z edycją za pomocą RNP przed zaprojektowaniem własnego eksperymentu.

enhanced-genome-editing-with-cas9-ribonucleoprotein-diverse-cells

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Ostatnie osiągnięcia w zakresie genetycznego manipulowania liniami komórek somatycznych mają ogromny potencjał dla badań podstawowych i stosowanych. W tym miejscu przedstawiamy dwa podejścia do produkcji nokautu generowanego przez CRISPR/Cas9 i badań przesiewowych w liniach komórkowych ssaków, z użyciem i bez użycia selektywnych markerów.

Zależne od selekcji i niezależne generowanie nokautów genów za pośrednictwem CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków

Ten protokół opisuje przebieg pracy systemu edycji genów opartego na CRISPR/Cas9 do naprawy mutacji punktowych w komórkach ssaków. W tym przypadku stosujemy kombinatoryczne podejście do edycji genów ze szczegółową strategią eksperymentalną do pomiaru powstawania indel w miejscu docelowym - w istocie, analizując mutagenezę na miejscu.

Standardowa metodologia badania mutagenności na miejscu w funkcji naprawy mutacji punktowej katalizowanej przez CRISPR/Cas9 i SsODN w komórkach ludzkich

Ukierunkowana edycja genów za pomocą CRISPR/Cas9 znacznie ułatwiła zrozumienie biologicznych funkcji genów. W tym przypadku wykorzystujemy metodologię CRISPR/Cas9 do modelowania mutacji kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin w celu zbadania ich aktywności onkogennej.

Wykorzystanie edycji genów CRISPR/Cas9 do zbadania onkogennej aktywności zmutowanej kalretykuliny w komórkach krwiotwórczych zależnych od cytokin

Tutaj prezentujemy metodę inżynierii genomu C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR-Cas9 i szablonów naprawy zależnych od homologii.

Szybki i łatwy proces generowania punktowych mutantów genomowych u C. elegans przy użyciu rybonukleoprotein CRISPR/Cas9

CRISPR-Cas to potężna technologia do inżynierii złożonych genomów roślin i zwierząt. W tym miejscu szczegółowo opisujemy protokół skutecznej edycji ludzkiego genomu przy użyciu różnych endonukleaz Cas. Zwracamy uwagę na ważne kwestie i parametry projektowe, aby zoptymalizować wydajność edycji.

Edycja genomu w liniach komórkowych ssaków przy użyciu CRISPR-Cas

Prezentowany jest tutaj protokół do efektywnej edycji genów za pośrednictwem rybonukleoproteiny CRISPR/Cas9 w komórkach ssaków za pomocą elektroporacji rurkowej.

CRISPR/Cas9 Precyzyjna edycja genów za pośrednictwem rybonukleoprotein za pomocą elektroporacji rurkowej

Bezpośrednie dostarczanie wstępnie złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych Cas9/przewodnikowego RNA to szybki i skuteczny sposób na edycję genomu w komórkach krwiotwórczych. Tutaj wykorzystujemy to podejście do usunięcia tłumika intronowego RUNX1 i zbadania odpowiedzi transkrypcyjnych w komórkach białaczkowych OCI-AML3.

Badanie transkrypcyjnej roli tłumika intronowego RUNX1 przez rybonukleoproteinę CRISPR/Cas9 w komórkach ostrej białaczki szpikowej

Tutaj opisujemy szczegółową metodę bezproblemowej edycji genów w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych przy użyciu plazmidu dawcy opartego na piggyBac i mutanta nickazy Cas9. Do eksonu 8 locus czynnika jądrowego hepatocytów 4 alfa (HNF4α) w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych (hESC) wprowadzono dwie mutacje punktowe.

Wprowadzenie mutacji punktowych do ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu płynnej edycji genomu

System edycji genomu CRISPR-Cas9 to łatwy w użyciu edytor genomu, który był używany w gatunkach modelowych i niemodelowych. Tutaj prezentujemy białkową wersję tego systemu, która została wykorzystana do wprowadzenia przedwczesnego kodonu stop do genu kojarzenia niemodelowego nitkowatego grzyba workowca.

Edycja genomu za pośrednictwem CRISPR-Cas9 u nitkowatego workowca Huntiella omanensis

Celem tego protokołu jest umożliwienie bezproblemowej edycji genomu C. elegans za pomocą CRISPR/Cas9 przy użyciu złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych i markera co-CRISPR dpy-10 do badań przesiewowych. Protokół ten może być stosowany do dokonywania różnych modyfikacji genetycznych u C. elegans, w tym insercji, delecji, wymiany genów i podstawiania kodonów.

Edycja CRISPR/Cas9 genu rbm-3.2 C. elegans przy użyciu markera przesiewowego dpy-10 Co-CRISPR i złożonych kompleksów rybonukleoproteinowych.

Poznaj edycję genomu za pomocą kompleksów RNP CRISPR/Cas9 w różnych komórkach i organizmach. Ta metoda zapewnia wyższą wydajność i mniejszą liczbę zdarzeń poza targetem niż plazmid DNA.

Ulepszona edycja genomu za pomocą rybonukleoproteiny Cas9 w różnych komórkach i organizmach

Przeglądaj więcej filmów