Name: Ocena krzepnięcia osocza na tkance wątroby w dużym modelu zwierzęcym in vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Poznaj metodę oceny krzepnięcia osocza w tkance wątroby na modelu świni z wykorzystaniem termografii podczerwieni i dopplerowskiego pomiaru mikrokrążenia. Technika pozwala badać zależność między ustawieniami energii a głębokością koagulacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Przestrzegano zasad regulowanych niemieckim ustawodawstwem dotyczącym badań na zwierzętach, jak również Zasad Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (publikacja National Institutes of Health ed. 8, 2011). Oficjalne zezwolenie wydawane jest przez Państwowy Urząd ds. Opieki nad Zwierzętami (Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Recklinghausen, Niemcy).
1. Zwierzęta
<ol>
	<li>Używać samic niemieckich świń rasy landrace (o wadze 25-30 kg) trzymanych w otwartych klatkach.</li>
	<li>Użyj 5 zwierząt w grupie (argon i hel).</li>
	<li>Pozwól zwierzętom zaaklimatyzować się w otoczeniu przez co najmniej tydzień przed eksperymentami. Zwierzęta szybkie przez 24 h przed zabiegiem ze swobodnym dostępem do wody.</li>
</ol>
2. Znieczulenie
<ol>
	<li>Poddaj zwierzęta premedykacji za pomocą domięśniowego wstrzyknięcia ketaminy (15 mg/kg masy ciała]), ksylazyny (10 mg/kg masy ciała) i atropiny (0,1 mg/kg masy ciała) na 10 minut przed indukcją znieczulenia.</li>
	<li>Obwodowy dostęp żylny ustala się poprzez umieszczenie kaniuli o rozmiarze 22 w żyle usznej.</li>
	<li>Wywołać znieczulenie ogólne przez dożylne wstrzyknięcie propofolu w dawce 2 mg/kg masy ciała.</li>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i wykonaj podłużne nacięcie skóry w rowku szyjnym na długości 2 cm. Zlokalizuj żyłę poprzez przygotowanie tkanki podskórnej. Włóż kaniulę, a następnie drut Seldingera.</li>
	<li>Wycofaj kaniulę i włóż 14 Fr. cewnik przez drut doprowadzający. Wsuń przewód doprowadzający. Podłącz cewnik do przedłużenia i przymocuj cewnik za pomocą paska lub szwu.</li>
	<li>Wyciągnij język i włóż prosty laryngoskop. Użyj końcówki laryngoskopu, aby pociągnąć nagłośnię w dół. Przełóż rurkę przez struny głosowe. Umieść mankiet pod głośnią i napompuj.</li>
	<li>Wentylować 40% tlenem przy 20-26 oddechach/min i objętości oddechowej 10 ml/kg, aby utrzymać częściowe ciśnienie dwutlenku węgla w okresie od 36 do 42 mm Hg.</li>
	<li>Utrzymuj znieczulenie izofluranem w stężeniu 1-1,5% i fentanylem w stężeniu 3-4 μg/kg/h.</li>
	<li>Roztwór mleczanu Ringera należy dostarczyć w początkowej dawce 4 ml/kg mc./godz. i zwiększyć po laparotomii do stałej szybkości infuzji 8 ml/kg/godz.</li>
</ol>
3. Chirurgia i koagulacja osocza
<ol>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na standardowym stole operacyjnym.</li>
	<li>Zdezynfekuj skórę, nakładając standardowy chirurgiczny środek dezynfekujący (2-Propanol 45 g / 100 g, 1-Propanol 10 g / 100 g, Biphenyl-2-ol 0,2 g / 100 g) za pomocą wacika chirurgicznego 3 razy.</li>
	<li>Wykonaj laparotomię w szerokiej linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do kości łonowej za pomocą skalpela i zainstaluj retraktory chirurgiczne.</li>
	<li>Włączyć urządzenie do koagulacji plazmowej, otwartą butlę z argonem lub helem, w zależności od użytego gazu nośnego. Wyreguluj przepływ gazu na 3 l/min. Wybierz moc wyjściową urządzenia koagulacyjnego zgodnie z potrzebami. 
	UWAGA: Oba gazy szlachetne, argon lub hel, mogą być używane do koagulacji plazmowej. Efekty krzepnięcia są porównywalne. Zobacz reference7, aby uzyskać szczegółowe informacje.</li>
	<li>Wykonaj koagulację osocza na lewym płacie wątroby, jak opisano wcześniej7. Użyj tytanowej formy (kwadratowy otwór 1 x 1 cm2), aby ustandaryzować strefę krzepnięcia. Koaguluj przez 5 s z odległością sondy 1 cm. Koagulacje o różnych ustawieniach mocy mogą być wykonywane obok siebie z niewielką odległością między koagulacjami wynoszącą 5 mm (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Do pobrania wątroby należy podzielić wszystkie połączenia więzadłowe z wątrobą. Odizoluj i podziel szypułkę wątroby powyżej zgięcia dwunastnicy górnego, pozostawiając długie fragmenty żyły wrotnej i wspólnego przewodu żółciowego. Podziel żyłę jamy głównej powyżej i poniżej wątroby i odzyskaj narząd.</li>
	<li>Po pobraniu wątroby świnie poddano eutanazji poprzez podanie dożylnie 0,16 g/kg pentobarbitalu w masie ciała.</li>
	<li>W eksperymentach z ciśnieniem rozrywającym wytnij połowę lewego przyśrodkowego płata wątroby ostrymi nożyczkami. Koagulacja plazmowa powierzchni cięcia (moc wyjściowa 100 W) lub uszczelnienie powierzchni cięcia za pomocą uszczelniacza fibrynowego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2).</li>
</ol>
4. Pomiar mikrokrążenia
UWAGA: Laserowa spektroskopia dopplerowska może określić przepływ krwi w tkance poprzez pomiar przesunięcia dopplerowskiego spowodowanego ruchem erytrocytów. Sygnał laserowy koreluje z liczbą poruszających się erytrocytów. Laserowa spektroskopia dopplerowska jest w użyciu klinicznym (np. w medycynie transplantacyjnej) i została wielokrotnie zwalidowana15.
<ol>
	<li>Włącz laserowy przepływomierz dopplerowski i spektrofotometr. Użyj płaskiej sondy.</li>
	<li>Wykonaj podstawowe pomiary przepływu i prędkości. Zapisz lub zanotuj wartości.</li>
	<li>Przeprowadzić koagulację zgodnie z opisem w ppkt 3.5.</li>
	<li>Umieść płaską sondę w miejscach krzepnięcia i zmierz przepływ oraz prędkość. Ponownie zapisz lub zanotuj wartości.</li>
	<li>Powtórz te czynności dla wszystkich ustawień mocy urządzenia koagulatora.</li>
</ol>
5. Pomiar temperatury
<ol>
	<li>Włącz system (kamerę termowizyjną, notebook i termometr na podczerwień) i pozwól mu pracować przez co najmniej 1 godzinę przed wykonaniem pomiarów.</li>
	<li>Dostosuj ostrość i ramkę widoku w kamerze termowizyjnej w miejscu krzepnięcia. Sekwencje w podczerwieni mogą być wykrywane z rozdzielczością przestrzenną 1024 x 768 pikseli przy rozdzielczości temperatury większej niż 20 mK. Weź pod uwagę, że obszar krzepnięcia i otaczająca go tkanka — na którą ma wpływ wymiana ciepła — znajduje się w środku widoku. 
	UWAGA: Powinien zawierać jak najwięcej pikseli ramki, aby uzyskać optymalną rozdzielczość przestrzenną.</li>
	<li>Rejestruj proces krzepnięcia za pomocą koagulatora plazmowego na powierzchni wątroby za pomocą kamery termowizyjnej przez okres 2 minut.</li>
	<li>Analizuj sekwencje obrazów za pomocą oprogramowania do analizy termograficznej: Zdefiniuj obszary zainteresowania. 
	UWAGA: Oprogramowanie oblicza przebieg odpowiedniej średniej temperatury w czasie.</li>
</ol>
6. Pomiar głębokości krzepnięcia
<ol>
	<li>Zbierz lewy przyśrodkowy płat wątroby ostrymi nożyczkami.</li>
	<li>Wyciąć miejsca krzepnięcia o grubości 1 cm. Pociąć na podłużne segmenty o grubości 3 mm do dalszej obróbki.</li>
	<li>Utrwal próbki tkanek w temperaturze 4 ° C przez noc za pomocą neutralnej 10% buforowanej formaliny. Podgrzej parafinę 2 °C do temperatury topnienia i zatodź plastry. Przetwarzaj przez noc.</li>
	<li>Wykonaj barwienie Hematoxylin/Eozyny.
	<ol>
		<li>Deparafinizować i uwodnić tkankę, a następnie zanurzyć ją w 2x Ksylenie, 100% etanolu (EtOH), 95% EtOH, 70% EtOH, dejonizowanymH2Oprzez 2 minuty każdy.</li>
		<li>Próbkę tkanki należy barwić roztworem hematoksyliny Meyera przez 3 minuty.</li>
		<li>Teraz płucz w wodzie z kranu przez 5 minut.</li>
		<li>Barwić tkankę roztworem Eozyny przez 3 minuty.</li>
		<li>Płukać 2x EtOH 95%, a następnie Ksylen przez 3 minuty każdy. Zamontować za pomocą standardowego medium montażowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Włącz system (kamera podłączona do mikroskopu, oprogramowanie do obrazowania). Przeglądaj wszystkie sekcje w 40-krotnym powiększeniu.</li>
	<li>Zrób zdjęcie mikrometru obiektu w powiększeniu 40X. Naciśnij przycisk Ponowna kalibracja w oknie Cele. Wybierz kalibrację ręczną. Narysuj linię na obrazie mikrometrycznym o średnicy 100 μm. Wprowadź 0,1 mm w oknie dialogowym i naciśnij OK.</li>
	<li>Wybierz opcję Długość w oknie Widok>Kontrolki analizy>Adnotacje i pomiary. Zmierz myszą od powierzchni wątroby do marginesu krzepnięcia. Wyeksportuj lub zanotuj wynik. Powtórz pomiar w innym miejscu na tym samym szkiełku. 
	UWAGA: Głębokość krzepnięcia można łatwo odróżnić od normalnej tkanki wątroby po ostrym marginesie między normalnymi sznurami hepatocytów a strefą martwicy ze skurczoną cytoplazmą, jądrami piknotycznym i strefami krwotoku.</li>
	<li>Oblicz średnią z dwóch pomiarów.</li>
</ol>
7. Pomiar ciśnienia rozrywającego
<ol>
	<li>Włączyć system (pompy automatyczne, miernik ciśnienia). Przygotować próbki wątroby zgodnie z krokiem 3.7. 
	UWAGA: Użyj dwóch równoległych pomp połączonych za pomocą 3-drogowego kurka. Maksymalne ciśnienie 1 500 mm Hg nie może być osiągnięte za pomocą jednej pompy.</li>
	<li>Odizoluj żyłę wrotną, tętnicę wątrobową wspólną i przewód żółciowy nożyczkami w szypułce dotykowej. Zacisnąć żyłę wrotną za pomocą kleszczy overholt i podwiązać szwem monofilowym 4-0. Zacisnąć wspólną tętnicę wątrobową za pomocą kleszczyków overholt i podwiązać szwem monofilowym 4-0.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik Ch-16 do wspólnego przewodu żółciowego i podwiązać za pomocą jedwabnego szwu 2-0. Podłącz cewnik do pomp automatycznych, zainstaluj 3-drogowy kran z miernikiem ciśnienia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3).</li>
	<li>Napełnij strzykawkę perfuzyjną solą fizjologiczną.</li>
	<li>Uruchom pompy automatyczne z wydajnością 99 ml/h.</li>
	<li>Monitoruj powierzchnię cięcia wątroby i miernik ciśnienia pod kątem wycieku i rejestruj ciśnienie rozrywające. 
	UWAGA: Dla łatwiejszego rozpoznania wycieku błękit patentowy można dodać do soli fizjologicznej (2 ml błękitu patentowego + 18 ml soli fizjologicznej). Łatwiej jest zaobserwować ciśnienie rozrywające, zauważając czas utraty ciśnienia na ciśnieniomierzu.</li>
</ol>

<ol><li>Link, W. J., Incropera, F. P., Glover, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasma+scalpel%3A+comparison+of+tissue+damage+and+wound+healing+with+electrosurgical+and+steel+scalpels%5BTitle%5D)+AND+%22ArchSurg%22%5BJournal%5D)">A plasma scalpel: comparison of tissue damage and wound healing with electrosurgical and steel scalpels.</a> ArchSurg. 111, 392-397 (1976).</li>
<li>Kwon, A. H., Inui, H., Kamiyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Successful+laparoscopic+haemostasis+using+an+argon+beam+coagulator+for+blunt+traumatic+splenic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22EurJSurg%22%5BJournal%5D)">Successful laparoscopic haemostasis using an argon beam coagulator for blunt traumatic splenic injury.</a> EurJSurg. 167, 316-318 (2001).</li>
<li>Frilling, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effectiveness+of+a+new+carrier-bound+fibrin+sealant+versus+argon+beamer+as+haemostatic+agent+during+liver+resection%3A+a+randomised+prospective+trial%5BTitle%5D)+AND+%22Langenbecks+ArchSurg%22%5BJournal%5D)">Effectiveness of a new carrier-bound fibrin sealant versus argon beamer as haemostatic agent during liver resection: a randomised prospective trial.</a> Langenbecks ArchSurg. 390, 114-120 (2005).</li>
<li>Raiser, J., Zenker, M. <a target="_blank" href="http://iopscience.iop.org/article/10.1088/0022-3727/39/16/S10/pdf">Argon plasma coagulation for open surgical and endoscopic applications: state of the art.</a> J Phys Appl Phys. 39 (16), 3520-3523 (2006).</li>
<li>Farin, G., Grund, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+of+argon+plasma+coagulation+with+particular+regard+to+endoscopic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22EndoscSurgAllied+Technol%22%5BJournal%5D)">Technology of argon plasma coagulation with particular regard to endoscopic applications.</a> EndoscSurgAllied Technol. 2, 71-77 (1994).</li>
<li>Grund, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+plasma+coagulation+%28APC%29%3A+ballyhoo+or+breakthrough%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Endoscopy%22%5BJournal%5D)">Argon plasma coagulation (APC): ballyhoo or breakthrough?</a> Endoscopy. 29, 196-198 (1997).</li>
<li>Glowka, T. R., Standop, J., Paschenda, P., Czaplik, M., Kalff, J. C., Tolba, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+and+helium+plasma+coagulation+of+porcine+liver+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Int+Med+Res%22%5BJournal%5D)">Argon and helium plasma coagulation of porcine liver tissue.</a> J Int Med Res. , (2017).</li>
<li>Dowling, R. D., Ochoa, J., Yousem, S. A., Peitzman, A., Udekwu, A. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Argon+beam+coagulation+is+superior+to+conventional+techniques+in+repair+of+experimental+splenic+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JTrauma%22%5BJournal%5D)">Argon beam coagulation is superior to conventional techniques in repair of experimental splenic injury.</a> JTrauma. 31, 717-720 (1991).</li>
<li>Go, P. M., Goodman, G. R., Bruhn, E. W., Hunter, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+argon+beam+coagulator+provides+rapid+hemostasis+of+experimental+hepatic+and+splenic+hemorrhage+in+anticoagulated+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22JTrauma%22%5BJournal%5D)">The argon beam coagulator provides rapid hemostasis of experimental hepatic and splenic hemorrhage in anticoagulated dogs.</a> JTrauma. 31, 1294-1300 (1991).</li>
<li>Brand, C. U., Blum, A., Schlegel, A., Farin, G., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+argon+plasma+coagulation+in+skin+surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Dermatology%22%5BJournal%5D)">Application of argon plasma coagulation in skin surgery.</a> Dermatology. 197, 152-157 (1998).</li>
<li>Carus, T., Rackebrandt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collateral+tissue+damage+by+several+types+of+coagulation+%28monopolar%2C+bipolar%2C+cold+plasma+and+ultrasonic%29+in+a+minimally+invasive%2C+perfused+liver+model%5BTitle%5D)+AND+%22ISRNSurg%22%5BJournal%5D)">Collateral tissue damage by several types of coagulation (monopolar, bipolar, cold plasma and ultrasonic) in a minimally invasive, perfused liver model.</a> ISRNSurg. , 518924(2011).</li>
<li>Bludau, M., Vallbohmer, D., Gutschow, C., Holscher, A. H., Schroder, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+measurement+of+gastric+mucosal+microcirculation+using+a+combined+laser+Doppler+flowmeter+and+spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22DisEsophagus%22%5BJournal%5D)">Quantitative measurement of gastric mucosal microcirculation using a combined laser Doppler flowmeter and spectrophotometer.</a> DisEsophagus. , (2008).</li>
<li>Beckert, S., Witte, M. B., Konigsrainer, A., Coerper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+the+Micro-Lightguide+O2C+for+the+quantification+of+tissue+ischemia+in+diabetic+foot+ulcers%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">The impact of the Micro-Lightguide O2C for the quantification of tissue ischemia in diabetic foot ulcers.</a> Diabetes Care. 27, 2863-2867 (2004).</li>
<li>Erdogan, D., de Graaf, W., van Gulik, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+strength+of+fibrinogen-coated+collagen+patch+or+liquid+fibrin+sealant+in+an+experimental+liver+resection+model+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+Surg+Res+Eur+Chir+Forsch+Rech+Chir+Eur%22%5BJournal%5D)">Adhesive strength of fibrinogen-coated collagen patch or liquid fibrin sealant in an experimental liver resection model in pigs.</a> Eur Surg Res Eur Chir Forsch Rech Chir Eur. 41 (3), 298-302 (2008).</li>
<li>Knobloch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcirculation+of+the+sternum+following+harvesting+of+the+left+internal+mammary+artery%5BTitle%5D)+AND+%22ThoracCardiovascSurg%22%5BJournal%5D)">Microcirculation of the sternum following harvesting of the left internal mammary artery.</a> ThoracCardiovascSurg. 51, 255-259 (2003).</li>
<li>Kanzler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recommendation+for+severity+assessment+following+liver+resection+and+liver+transplantation+in+rats%3A+Part+I%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Recommendation for severity assessment following liver resection and liver transplantation in rats: Part I.</a> Lab Anim. 50 (6), 459-467 (2016).</li>
<li>Pehböck, D., Dietrich, H., Klima, G., Paal, P., Lindner, K. H., Wenzel, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+in+swine+optimizing+a+laboratory+model+to+optimize+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Anaesthesist%22%5BJournal%5D)">Anesthesia in swine optimizing a laboratory model to optimize translational research.</a> Anaesthesist. 64 (1), 65-70 (2015).</li>
<li>Nykonenko, A., Vávra, P., Zonča, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomic+Peculiarities+of+Pig+and+Human+Liver%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Clin+Transplant+Off+J+Middle+East+Soc+Organ+Transplant%22%5BJournal%5D)">Anatomic Peculiarities of Pig and Human Liver.</a> Exp Clin Transplant Off J Middle East Soc Organ Transplant. 15 (1), 21-26 (2017).</li>
<li>Fechner, G., von Pezold, J., Luzar, O., Hauser, S., Tolba, R. H., Müller, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+spectrometry+%28O2C+device%29+of+intraoperative+microperfusion+predicts+organ+function+after+kidney+transplantation%3A+a+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant+Proc%22%5BJournal%5D)">Modified spectrometry (O2C device) of intraoperative microperfusion predicts organ function after kidney transplantation: a pilot study.</a> Transplant Proc. 41 (9), 3575-3579 (2009).</li>
<li>Patterson, E. J., Scudamore, C. H., Owen, D. A., Nagy, A. G., Buczkowski, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiofrequency+ablation+of+porcine+liver+in+vivo%3A+effects+of+blood+flow+and+treatment+time+on+lesion+size%5BTitle%5D)+AND+%22AnnSurg%22%5BJournal%5D)">Radiofrequency ablation of porcine liver in vivo: effects of blood flow and treatment time on lesion size.</a> AnnSurg. 227, 559-565 (1998).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Modele gryzoni do chirurgii wątroby są ustalane od dawna16. Niemniej jednak duże modele zwierzęce mają pewne zalety: nie jest potrzebny żaden sprzęt mikrochirurgiczny, ponieważ można zastosować standardowy sprzęt operacyjny dla ludzi, techniki chirurgiczne są porównywalne z zastosowaniem klinicznym, a standardowe metody oceny klinicznej można przenieść do eksperymentów. Na przykład standardowe kliniczne badania krwi można przeprowadzić bez konieczności stosowania specjalnych metod badań laboratory...

Koagulacja plazmą argonową (APC) jest powszechnie stosowanym narzędziem w chirurgii jamy brzusznej od ponad trzech dekad1,2. Jest to standardowa technika osiągania wtórnej hemostazy po dużej hepatektomii poprzez uszczelnienie powierzchni cięcia wątroby, aby zapobiec późniejszym krwotokom3. Koagulacja plazmowa jest wyspecjalizowaną formą elektrokoagulacji o częstotliwości radiowej, która dostarcza energię elektryczną przez łuk zjonizowanego gazu. Zapewniając monopolarną hemostazę elektrotermiczną, ta bezkontaktowa technika ma tę zaletę, że zapobiega przywieraniu elektrody do tkanki4. Wiązka zjonizowanego gazu jest automatycznie kierowana na obszar o najniższym oporze elektrycznym i jest odwracana, gdy opór wzrasta z powodu wysuszenia do innych obszarów, które nie są jeszcze wysuszone. W ten sposób uzyskuje się jednolitą, ograniczoną głębokość krzepnięcia5,6. Czynnikami wpływającymi na efekt krzepnięcia są czas aktywacji, ustawienie mocy urządzenia do krzepnięcia oraz odległość od sondy do tkanki. Hel to kolejny gaz nośny, który może być używany do koagulacji plazmowej7. Ostatnie badania kliniczne koncentrowały się na wynikach klinicznych, a nie na wynikach histologicznych i funkcjonalnych3,8,9, podczas gdy badania eksperymentalne koncentrowały się na badaniach in vitro10 lub eksperymentach na izolowanych perfundowanych narządach11.
Podstawowy protokół pozwala na badanie efektów krzepnięcia osocza w dużym modelu zwierzęcym zbliżonym do zastosowania klinicznego przy użyciu standardowego sprzętu dla ludzi na świniach: Mikrokrążenie jest oceniane nieinwazyjnie za pomocą laserowego przepływomierza dopplerowskiego i spektrofotometru, który jest standardowym narzędziem klinicznym dla tego wskazania12,13. Zmiany temperatury podczas koagulacji są monitorowane za pomocą termometru na podczerwień i kamery termowizyjnej. Głębokość krzepnięcia mierzy się na histologicznych skrawkach barwionych hematoksyliną/eozyną po pobraniu próbek tkanek. W celu porównania z innymi środkami do hemostazy wtórnej przeprowadza się eksperymenty z ciśnieniem rozrywającym. W przeciwieństwie do wcześniej opisanych technik14, są one przeprowadzane na eksplantowanych narządach, aby wykluczyć efekty związane z ciśnieniem krwi. Oprócz opisanych badań nad miejscowymi skutkami krzepnięcia osocza, standardowe badania krwi mogą być również wykonywane na modelu świńskim.

<table><tbody><tr><td>Ksylazyna 20 mg/ml</td><td>Vetoquinol GmbH</td><td>Xylapan</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina 100 mg/ml</td><td>Ceva GmbH</td><td>Ceva Ketamina do wstrzykiwań Atropina</td><td></td></tr><tr><td>100 mg / 10 mL</td><td>Dr. Franz K&ouml; hler Chemie GmbH</td><td>Atropinsulfat K&ouml; hler 100mg Amp.</td><td></td></tr><tr><td>Propofol</td><td>Fresenius Kabi GmbH</td><td>Propofol 1% MCT Fresenius</td><td></td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>KG Rotexmedica GmbH</td><td>Fentanyl 0,5mg Rotexmedica</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbot GmbH</td><td>Forene 100% (V/V) 250 mL</td><td></td></tr><tr><td>Mleczan Ringera</td><td>Baxter Deutschland GmbH</td><td></td><td>sód 131mmol/l, potas 5 mmol/l, wapń 2 mmol/l, kloryd 111 mmol/l, mleczan 29 mmol/l</td></tr><tr><td>Dezynfaktant chirurgiczny</td><td>Sch&uuml; lke & Mayr GmbH</td><td>Kodan Tinktur forte gef&auml; rbt 1l 104804</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop z napędem silnikowym</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>Eclipse TE2000-E</td><td></td></tr><tr><td>Kamera mikroskopowa</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>Digitalsight DS-Qi1Mc</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do obrazowania</td><td>Nikon Instruments Europe</td><td>NIS elements Vers. 4.40</td><td></td></tr><tr><td>Koagulator plazmowy</td><td>S&ouml; ring GmbH</td><td>CPC-1000</td><td></td></tr><tr><td>Gaz argonowy</td><td>Linde AG</td><td>Argon 4.8&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Hel gazowy</td><td>Linde AG</td><td>Hel 4.8</td><td></td></tr><tr><td>O2C</td><td>LEA Medizintechnik GmbH</td><td>O2C Wersja 1212</td><td>z sondą LF-2 lub LF-3</td></tr><tr><td>Termometr na podczerwień</td><td>Voltcraft</td><td>VOLTCRAFT IR 260-8S</td><td></td></tr><tr><td>Kamera termowizyjna</td><td>InfraTec GmbH</td><td>Głowica VarioCAM HD 820</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy termograficznej</td><td>InfraTec GmbH</td><td>IRBIS 3</td><td></td></tr><tr>Roztwór <td></td><td>Hematoksyliny Mayera</td><td>Merck 1.09249</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór Eozyny</td><td>VWR International GmbH</td><td>Merck 1.09844</td><td></td></tr><tr><td>Pompa rolkowa Masterflex L/S easy Load</td><td>Cole-Parmer Instrument Model firmy</td><td>7518-10</td><td></td></tr><tr><td>Pompa perfuzorowa</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>Perfusor secura FT</td><td></td></tr><tr><td>Cyfrowy miernik ciśnienia</td><td>Greisinger elektroniczny</td><td>GMH 3161</td><td></td></tr><tr><td>Pierścień perfuzorowy, 50 ml</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>REF 8728810 F</td><td></td></tr><tr><td>Linia perfuzorowa, Typ IV Standard, PVC Luer lock</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>REF 8722960</td><td></td></tr><tr><td>3-drogowy kran odcinający, Dicofix C35C</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td>REF 16494 C</td><td></td></tr><tr><td>Silk 2-0. 3 metryczne</td><td>Resorba</td><td>REF H5F</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl 4-0 Sutupak</td><td>Ethicon</td><td>V1224H</td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0,9 %</td><td>B. Braun Melsungen AG</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena krzepnięcia osocza na tkance wątroby w dużym modelu zwierzęcym in vivo

Assessment of Plasma Coagulation on Liver Tissue in a Large Animal Model In Vivo

Koagulacja plazmowa jako forma elektrokoagulacji jest stosowana w chirurgii wątroby od dziesięcioleci w celu uszczelnienia dużej powierzchni cięcia wątroby po dużej hepatektomii, aby zapobiec krwotokom na późniejszym etapie. Dokładny wpływ krzepnięcia osocza na tkankę wątroby jest słabo zbadany. W naszym modelu wieprzowym efekty krzepnięcia można badać w pobliżu zastosowania klinicznego. Połączony laserowy przepływomierz dopplerowski i spektrofotometr nieinwazyjnie dokumentuje zmiany mikrokrążenia podczas krzepnięcia na głębokości tkanki 8 mm, dostarczając wymiernych informacji na temat hemostazy wykraczających poza subiektywne wrażenie kliniczne. Temperaturę w miejscu krzepnięcia ocenia się termometrem na podczerwień przed i po koagulacji oraz kamerą termowizyjną podczas koagulacji, pomiar temperatury wiązki gazowej nie jest możliwy ze względu na górny próg urządzeń. Głębokość krzepnięcia jest mierzona mikroskopowo na skrawkach barwionych hematoksyliną/eozyną po kalibracji za pomocą mikrometru obiektowego i daje dokładne informacje o zależności między ustawieniem mocy a głębokością koagulacji. Bada się działanie uszczelniające na drogi żółciowe, ponieważ koagulator osocza nie jest w stanie uszczelnić większych naczyń krwionośnych. Eksperymenty z ciśnieniem rozrywającym przeprowadza się na eksplantowanych narządach, aby wykluczyć skutki związane z ciśnieniem krwi.

Mikrokrążenie: Wykorzystanie urządzenia diagnostycznego do hemostazy po koagulacji osocza można zademonstrować poprzez zmiany w mikrokrążeniu. Przepływ krwi kapilarnej (wyrażony w jednostkach arbitralnych (AU)) spada z wartości bazowej 142,7 ± 76,08 AU do 57,78 ± 49,57 AU przy mocy wyjściowej urządzenia 25 W, do 48,5 ± 7,26 AU przy 50 W oraz do 5,04 ± 1,31 AU przy 100 W (Rycina 4).
...

Tutaj prezentujemy protokół eksperymentalnej oceny krzepnięcia osocza w tkance wątroby in vivo. W modelu świńskim mikrokrążenie jest badane za pomocą laserowego Dopplera, głębokość krzepnięcia jest mierzona histologicznie, temperatura w miejscu krzepnięcia za pomocą termometru na podczerwień i kamery termograficznej, a efekt uszczelnienia kanałów jest dokumentowany za pomocą eksperymentów z ciśnieniem rozrywającym.

Ocena krzepnięcia osocza na tkance wątroby w dużym modelu zwierzęcym in vivo

Plasma coagulation as a form of electrocautery is used in liver surgery for decades to seal the large liver cut surface after major hepatectomy to prevent ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu klinicznej chirurgii wątroby dotyczące relacji głębokości ustawienia energii koagulacji argonu i helu w plazmie oraz samego procesu krzepnięcia osocza. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że duży model zwierzęcy jest podobny do zastosowania klinicznego i nie jest potrzebny żaden specjalny sprzęt. Termografia w podczerwieni może być wykorzystywana do monitorowania rozkładu temperatury i spadku temperatury, ale także do monitorowania częstości oddechów i ciast.Ponadto procesy zapalne można monitorować za pomocą termografii w podczerwieni. Procedurę zademonstruje Pascal Paschenda, technik z naszej grupy. Co najmniej godzinę przed rozpoczęciem zabiegu włącz kamerę termowizyjną, notebook i termometr na podczerwień.Gdy sprzęt jest gotowy, umieść znieczuloną samicę świni rasy niemieckiej Landrace o wadze od 25 do 30 kilogramów w pozycji leżącej na standardowym stole operacyjnym i użyj standardowego wacika chirurgicznego, aby trzykrotnie zdezynfekować obszar operacyjny standardowym chirurgicznym środkiem dezynfekującym. Następnie za pomocą skalpela wykonaj laparotomię w szerokiej linii środkowej od wyrostka mieczykowatego do kości łonowej i zainstaluj retraktory chirurgiczne, aby odsłonić tkankę wątroby. Aby uzyskać podstawowe pomiary mikrokrążenia, włącz laserowy przepływomierz dopplerowski i spektrofotometr i użyj płaskiej sondy do pomiaru przepływu i prędkości.Następnie włącz urządzenie do koagulacji plazmowej, otwórz odpowiednią butlę z gazem nośnym i dostosuj przepływ gazu do trzech litrów na minutę. Wybierz odpowiednią moc wyjściową urządzenia do koagulacji i użyj tytanowej formy z kwadratowym otworem jeden na jeden centymetr kwadratowy, aby ustandaryzować strefę krzepnięcia. Następnie użyj sondy na odległość jednego centymetra, aby skoagulować obszar przez pięć sekund.Aby zmierzyć mikrokrążenie po koagulacji, umieść płaską sondę w każdym miejscu krzepnięcia, aby zmierzyć przepływ i prędkość w każdym miejscu. Aby zmierzyć temperaturę w każdym miejscu, wyreguluj ostrość kamery termowizyjnej i ustaw ramkę nad pierwszym miejscem krzepnięcia tak, aby obszar koagulacji i otaczająca tkanka, na którą ma wpływ wymiana ciepła, znajdowały się pośrodku pola widzenia. Rejestruj proces krzepnięcia za pomocą koagulatora plazmowego na powierzchni wątroby za pomocą kamery termowizyjnej przez okres dwóch minut.Następnie przeanalizuj sekwencje obrazów za pomocą odpowiedniego oprogramowania do analizy termograficznej. Aby zmierzyć ciśnienie rozrywające, najpierw włącz pompy automatyczne i miernik ciśnienia. Następnie podziel wszystkie połączenia więzadłowe z wątrobą i podziel szypułkę wątroby powyżej zgięcia dwunastnicy górnego, pozostawiając nienaruszone długie fragmenty żyły wrotnej i przewodu żółciowego wspólnego.Następnie podziel żyłę główną powyżej i poniżej wątroby, aby umożliwić pobranie narządu. Za pomocą ostrych nożyczek wyciąć połowę lewego przyśrodkowego płata wątroby, a osocze skoagulować powierzchnię cięcia. Odizoluj żyłę wrotną, tętnicę wątrobową wspólną i przewód żółciowy w szypułce wątroby.Za pomocą kleszczy przytrzymujących zaciśnij żyłę wrotną. Następnie użyj szwu monofil 4.0 do podwiązania naczynia. Zacisnąć wspólną tętnicę wątrobową za pomocą drugiej pary kleszczy podtrzymujących i podwiązać tętnicę za pomocą innego szwu monofilowego 4.0.Wprowadzić francuski cewnik 16 do wspólnego przewodu żółciowego, podwiązując przewód za pomocą jedwabnego szwu 2,0. I podłącz cewnik do pomp automatycznych. Zamontuj trójdrożny kran z miernikiem ciśnienia i napełnij strzykawkę obfitości solą fizjologiczną.Uruchom pompy automatyczne z wydajnością 99 mililitrów na godzinę. Następnie monitoruj powierzchnię cięcia wątroby i miernik ciśnienia pod kątem wycieku i zarejestruj ciśnienie rozrywające. W tym reprezentatywnym eksperymencie przepływ krwi w naczyniach włosowatych zmniejszył się o około 60% w stosunku do wartości wyjściowej przy 25 watach mocy wyjściowej urządzenia, o 66% przy 50 watach i prawie 100% przy 100 watach.Nie zaobserwowano zmian temperatury w trakcie ani po krzepnięciu osocza. Koagulacja osocza tworzy powierzchowną strefę martwicy, którą można łatwo odróżnić od normalnego miąższu wątroby. Po koagulacji plazmą helową głębokość koagulacji znacznie wzrasta w bezpośredniej korelacji z zastosowaną mocą wyjściową urządzenia plazmowego.Należy zauważyć, że pomiary ciśnienia rozrywającego przeprowadzone na powierzchni cięcia eksplantowanego lewego przyśrodkowego płata wątroby nie wykazują różnicy po koagulacji plazmą helową lub argonową. Korzystając z tych technik, ostatnia z nich ma na celu ilościowe określenie miejscowego efektu krzepnięcia i oszacowanie efektu krzepnięcia osocza na uszczelnienie dróg żółciowych. Techniki te mogą być również wykorzystywane do porównywania różnych średnich bilio i hemostazy w warunkach chirurgicznych podobnych do tych u ludzi.Co więcej, hemo- i biliostatyczne efekty koagulacji osocza można zastosować po dużych hepatektomii w tym samym modelu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić główne efekty koagulacji plazmą argonową i helową w dużym modelu zwierzęcym.

assessment-plasma-coagulation-on-liver-tissue-large-animal-model

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Ten film opisuje procedurę perfuzji wątroby myszy przez żyłę wrotną za pomocą roztworu kolagenazy przed izolacją komórek wątroby.

Perfuzja wątroby myszy in vivo: metoda podawania roztworu do wątroby gryzoni przez żyłę wrotną

Stabilne przyżyciowe obrazowanie komórek odpornościowych w wątrobie w wysokiej rozdzielczości jest wyzwaniem. W tym miejscu zapewniamy wysoce czułą i wiarygodną metodę badania migracji i interakcji komórka-komórka komórek odpornościowych w wątrobie myszy przez długi czas (około 6 godzin) za pomocą wielofotonowej laserowej mikroskopii skaningowej w połączeniu z monitorowaniem intensywnej terapii.

Długoterminowe przyżyciowe obrazowanie mikroskopii wielofotonowej komórek odpornościowych w zdrowej i chorej wątrobie przy użyciu myszy reporterowych CXCR6.Gfp

Niekontrolowany krwotok, ważna przyczyna śmiertelności wśród pacjentów po urazach, może być modelowany za pomocą standardowego uszkodzenia wątroby w modelu mysim. Model ten skutkuje konsekwentną utratą krwi, przeżywalnością i pozwala na testowanie środków hemostatycznych. Ten artykuł zawiera krok po kroku proces wykonywania tego cennego modelu.

Niekontrolowany wstrząs krwotoczny modelowany za pomocą uszkodzenia wątroby u myszy z monitorowaniem hemodynamicznym w czasie rzeczywistym

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół inwazyjnych pomiarów parametrów hemodynamicznych, w tym ciśnienia wrotnego, splanchnicznego przepływu krwi i hemodynamiki ogólnoustrojowej, aby scharakteryzować zespół nadciśnienia wrotnego u szczurów.

Inwazyjna charakterystyka hemodynamiczna zespołu wrotno-nadciśnieniowego u szczurów z marskością wątroby

Istnieje znaczny niedobór dawców wątroby, a kryteria dla dawców wątroby zostały rozszerzone. Normothermic ex vivo liver perfusion (NEVLP) został opracowany w celu oceny i modyfikacji funkcji narządów. Badanie to demonstruje szczurzy model NEVLP i testuje zdolność pegylowanej katalazy do łagodzenia uszkodzeń wątroby.

Mały zwierzęcy model normacyjnej perfuzji wątroby ex vivo

Ustanawiamy nowatorską technikę chirurgiczną dla modelu perfuzji pojedynczego płata wątroby in vivo u szczurów jako warunek wstępny do dalszych badań in vivo częściowej inżynierii wątroby w przyszłości.

Nowatorska technika chirurgiczna jako podstawa częściowej inżynierii wątroby in vivo u szczurów

Ten protokół zapewnia prostą i niezawodną metodę produkcji żywotnych, precyzyjnie wyciętych plastrów wątroby od myszy. Próbki tkanek ex vivo mogą być utrzymywane w laboratoryjnych warunkach hodowli tkankowej przez wiele dni, zapewniając elastyczny model do badania patobiologii wątroby.

Precyzyjnie wycięte plastry wątroby jako model biologii wątroby ex vivo

Wyrafinowany model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej (TVT) u znieczulonych myszy jest czułą metodą in vivo do oceny krwawienia hemofilowego. Ten zoptymalizowany model krwawienia TVT wykorzystuje utratę krwi i czas krwawienia jako punkty końcowe, udoskonalając inne modele i unikając śmierci jako punkt końcowy.

Model krwawienia z przecięcia żyły ogonowej u myszy z hemofilią A w pełni znieczuloną

Opisano szczegółową metodologię tworzenia minimalnie inwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi. Podano również dodatkowe metody ilościowego określania obszaru zawału i wizualizacji drzewa tętnicy płucnej.

Opracowanie małoinwazyjnego szczurzego modelu zatorowości płucnej przy użyciu autologicznych skrzepów krwi

Większość badań z udziałem aparatu Langendorffa wykorzystuje małe modele zwierzęce ze względu na zwiększoną złożoność systemów dla większych ssaków. Opisujemy system Langendorffa dla dużych modeli zwierzęcych, który pozwala na zastosowanie go u różnych gatunków, w tym ludzi, i stosunkowo łatwe pozyskiwanie danych.

Izolowany działający system serca dla dużych modeli zwierzęcych

Poznaj metodę oceny krzepnięcia osocza w tkance wątroby na modelu świni z wykorzystaniem termografii podczerwieni i dopplerowskiego pomiaru mikrokrążenia. Technika pozwala badać zależność między ustawieniami energii a głębokością koagulacji.

Ocena krzepnięcia osocza na tkance wątroby w dużym modelu zwierzęcym in vivo

Przeglądaj więcej filmów