Name: Budowa biblioteki Fab Display z syntetycznymi fagami z dostosowaną różnorodnością (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
Description: Poznaj metodę budowy biblioteki syntetycznych przeciwciał z dostosowaną różnorodnością przy użyciu technologii fagowego wyświetlania. Ta technika umożliwia selekcję przeciwciał o wysokim powinowactwie bez konieczności immunizacji zwierząt.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają Dr. Frederica Fellouse'a z laboratorium Sidhu za krytyczne uwagi na temat opartej na metodzie Kunkela konstrukcji biblioteki syntetycznych fagów Fab. Autorzy doceniają panią Alevtinę Pavlenco i innych członków laboratorium Sidhu za cenną pomoc w przygotowaniu wysokowydajnych, elektrokompetentnych komórek E. coli i wysokiej jakości dU-ssDNA. Prace te były wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (grant nr: 81572698, 31771006) dla DW oraz przez ShanghaiTech University (nr grantu: F-0301-13-005) dla Laboratorium Inżynierii Przeciwciał.

<ol><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28799485">Monoclonal Antibodies: A Review.</a> Curr Clin Pharmacol. , (2017).</li>
<li>Reichert, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+watch+in+2017%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Antibodies to watch in 2017.</a> MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).</li>
<li>Kohler, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+cultures+of+fused+cells+secreting+antibody+of+predefined+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity.</a> Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).</li>
<li>Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+hybridoma+revolution%3A+an+offshoot+of+basic+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">The hybridoma revolution: an offshoot of basic research.</a> Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).</li>
<li>Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal-Friendly+Affinity+Reagents%3A+Replacing+the+Needless+in+the+Haystack%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack.</a> Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).</li>
<li>Hutchison, C. A. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutagenesis+at+a+specific+position+in+a+DNA+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence.</a> J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).</li>
<li>Smith, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Filamentous+fusion+phage%3A+novel+expression+vectors+that+display+cloned+antigens+on+the+virion+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface.</a> Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).</li>
<li>Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSidhu%2C+SS+%22Phage+Display+in+Biotechnology+and+Drug+Discovery%22">Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery</a>. , CRC Press. (2005).</li>
<li>Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mapping+of+protein+functional+epitopes+by+combinatorial+alanine+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).</li>
<li>Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display-derived+human+antibodies+in+clinical+development+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy.</a> MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).</li>
<li>Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+therapeutic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic therapeutic antibodies.</a> Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).</li>
<li>Adams, J. J., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antibody+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic antibody technologies.</a> Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).</li>
<li>Kunkel, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+site-specific+mutagenesis+without+phenotypic+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).</li>
<li>Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phage+display+for+selection+of+novel+binding+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Phage display for selection of novel binding peptides.</a> Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).</li>
<li>Persson, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CDR-H3+diversity+is+not+required+for+antigen+recognition+by+synthetic+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies.</a> J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).</li>
<li>Lefranc, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IMGT+unique+numbering+for+immunoglobulin+and+T+cell+receptor+variable+domains+and+Ig+superfamily+V-like+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Comp+Immunol%22%5BJournal%5D)">IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.</a> Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).</li>
<li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+between+Peptostreptococcus+magnus+protein+L+and+a+human+antibody+reveals+structural+convergence+in+the+interaction+modes+of+Fab+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins.</a> Structure. 9 (8), 679-687 (2001).</li>
<li>Graille, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Staphylococcus+aureus+protein+A+domain+complexed+with+the+Fab+fragment+of+a+human+IgM+antibody%3A+structural+basis+for+recognition+of+B-cell+receptors+and+superantigen+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).</li>
<li>Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvements+to+the+Kunkel+mutagenesis+protocol+for+constructing+primary+and+secondary+phage-display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries.</a> Methods. 58 (1), 10-17 (2012).</li>
<li>Chen, G., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+generation+of+synthetic+antibody+libraries+for+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display.</a> Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).</li>
<li>Padlan, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+of+the+antibody+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Anatomy of the antibody molecule.</a> Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).</li>
<li>Virnekas, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trinucleotide+phosphoramidites%3A+ideal+reagents+for+the+synthesis+of+mixed+oligonucleotides+for+random+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis.</a> Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).</li>
<li>Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFellouse%2C+FA+%22Making+and+Using+Antibodies%3A+A+Practical+Handbook%22">Making and Using Antibodies: A Practical Handbook</a>. , Second Edition, CRC Press. 157-180 (2006).</li>
<li>Fantini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+antibody+library+diversity+through+next+generation+sequencing+and+technical+error+compensation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation.</a> PLoS One. 12 (5), e0177574(2017).</li>
<li>Glanville, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+sequencing+in+library+selection+projects%3A+what+insight+does+it+bring%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?</a> Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).</li>
<li>Perelson, A. S., Oster, G. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+studies+of+clonal+selection%3A+minimal+antibody+repertoire+size+and+reliability+of+self-non-self+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination.</a> J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).</li>
<li>Miersch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+high+throughput+selection+from+phage-displayed+synthetic+antibody+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries.</a> J Vis Exp. (95), e51492(2015).</li>
<li>Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+affinity%2C+developability+and+functional+size%3A+the+holy+grail+of+combinatorial+antibody+library+generation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation.</a> Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).</li>
<li>Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+therapeutics+-+the+evolving+patent+landscape%5BTitle%5D)+AND+%22N+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Antibody therapeutics - the evolving patent landscape.</a> N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Aby skonstruować biblioteki Fab o wysokiej różnorodności, wyświetlane na fagach, potrzebne są punkty kontroli jakości do monitorowania różnych etapów procesu budowy, w tym kompetencji komórek elektrokompetentnych, jakości matrycy dU-ssDNA, wydajności syntezy CCC-dsDNA, miana po elektroporacji, fałdowania Fab oraz różnorodności aminokwasów CDR poprzez analizę sekwencji klonów Fab-phage.
Wysoka wydajność i czystość dU-ssDNA jest niezbędna do wysokiego współczynnika mutagenezy. Z naszego doświadc...

mAb mają szerokie zastosowanie, począwszy od badań podstawowych, a skończywszy na diagnostyce chorób i terapii. Od 2016 roku ponad 60 mAb zostało zatwierdzonych przez Amerykańską Agencję ds. Żywności i Leków (USFDA) do klinicznego leczenia chorób autoimmunologicznych, nowotworów i chorób zakaźnych1,2.
W 1975 roku Kohler i Milstein opisali technikę ciągłego generowania przeciwciał o pojedynczej swoistości klonalnej ze źródła komórkowego, określaną jako 'hybrydoma', a następnie technika ta stała się kamieniem węgielnym w medycynie i przemyśle3,4. Wytwarzanie mAb tą metodą wymaga różnych etapów, w tym produkcji antygenu, immunizacji myszy, ekstrakcji limfocytów B, fuzji komórek B z komórkami szpiczaka w celu utworzenia nieśmiertelnych komórek hybrydoma, selekcji klonów, a do zastosowań terapeutycznych wymagana jest humanizacja, aby uniknąć ludzkiego przeciwciała anty-mysiego (HAMA)4,5. Jednak w przypadku tej technologii antygeny, w tym toksyny, patogeny i wysoce konserwatywne białka, są stosunkowo nieskuteczne w wywoływaniu odpowiedzi immunologicznej in vivo na produkcję mAb5.
W 1978 roku Hutchison et al. poinformowali o użyciu oligonukleotydu do kierowania mutagenezą reszty w jednoniciowym wirusie bakteriofagowym6. W 1985 roku Smith poinformował, że obce fragmenty genów mogą być łączone w ramce z genem kodującym białko płaszcza fagowego III, a tym samym mogą być wyświetlane na powierzchni faga bez uszczerbku dla jego zakaźności7. Te pionierskie prace położyły podwaliny pod późniejszą konstrukcję bibliotek przeciwciał wyświetlanych przez fagi w formach immunologicznych, naiwnych i syntetycznych z formatami jednołańcuchowego zmiennego fragmentu (scFv) i fragmentu wiążącego antygen (Fab) do terapeutycznego rozwoju mAb8,9. Z technicznego punktu widzenia, rozwój przeciwciał opartych na wyświetlaczu fagów oferuje uzupełniające podejście do rozwoju mAb opartego na hybrydomie, które może pomóc w obejściu ograniczeń, jakie mogą stwarzać niektóre antygeny, oraz procesu humanizacji, którego często wymagają przeciwciała pochodzące z hybrydomy5. Od 2016 r. na rynku zatwierdzono 6 mAb pochodzących z wyświetlacza fagowego, w tym Humira, jeden z najbardziej udanych mAb stosowanych w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów, a wielu kandydatów na przeciwciała pochodzące z fagów jest obecnie na różnych etapach badań klinicznych10.
Dla bibliotek przeciwciał fagowych odpornych i naiwnych, różnorodność regionów determinujących komplementarność (CDR) w łańcuchu lekkim i ciężkim wynika z naturalnego repertuaru immunologicznego (tj. z limfocytów B). W przeciwieństwie do tego, różnorodność CDR w bibliotekach syntetycznych przeciwciał fagowych jest całkowicie sztuczna. Syntetyczne podejścia do budowy bibliotek zapewniają precyzyjną kontrolę nad projektowaniem różnorodności sekwencji i oferują możliwości mechanistycznych badań struktury i funkcji przeciwciał11,12. Co więcej, struktura dla bibliotek syntetycznych może być zoptymalizowana przed budową biblioteki, aby ułatwić dalszy rozwój przemysłowy na dużą skalę11,12.
W 1985 roku Kunkel opisał metodę mutagenezy opartej na szablonach jednoniciowego DNA (ssDNA), aby skutecznie wprowadzić mutacje ukierunkowane na miejsce do bakteriofaga M1313. Podejście to zostało następnie szeroko wykorzystane do budowy bibliotek wyświetlanych za pomocą fagów. Chemicznie syntetyzowane oligonukleotydy DNA zaprojektowane w celu wprowadzenia różnorodności do Fab CDR są włączane do fagamidu z matrycą szkieletową przeciwciała. W tym procesie fagiamid ulega ekspresji jako ssDNA zawierający uracyl (dU-ssDNA), a oligonukleotydy są wyżarzane na CDR i wydłużane w celu syntezy dwuniciowego DNA (dsDNA) w obecności polimerazy DNA T7 i ligazy DNA T4. Wreszcie, wygenerowany ds-DNA może zostać wprowadzony do Escherichia coli przez elektroporację.
Dla wysokiej różnorodności, budowa biblioteki wyświetlanej na podstawie fagów, wysokonapięciowa elektroporacja dwuskładnikowej mieszaniny elektrokompetentnych komórek i kowalencyjnie zamkniętego kolistego dsDNA (CCC-dsDNA) powinna być starannie przygotowana. Sidhu i in. zmodyfikowali przygotowanie elektrokompetentnych komórek i DNA z tradycyjnych metod i znacznie poprawili różnorodność bibliotek14.
W tym protokole opisujemy metodę budowy bibliotek Fab wyświetlanych z syntetycznymi fagami o różnorodności 109-10 10 możliwych do uzyskania za pomocą pojedynczej elektroporacji. Rysunek 1 pokazuje przegląd budowy biblioteki, w tym: 1) wysokowydajne przygotowanie ogniw elektrokompetentnych; 2) ekstrakcja dU-ssDNA; 3) Metoda Kunkela oparta na mutagenezie ukierunkowanej oligonukleotydami; 4) elektroporacja i obliczanie wielkości biblioteki; 5) test ELISA oparty na białku A/L do oceny fałdowania i różnorodności funkcjonalnej; oraz 6) analiza sekwencji DNA różnorodności. Wszystkie odczynniki, szczepy i sprzęt są wymienione w Tabeli Materiałów. Tabela 1 przedstawia konfigurację odczynników.

<table><tbody><tr><td>Reodczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M H3PO4</td><td>Fisher</td><td>AC29570</td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tris, pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>15568-025</td><td></td></tr><tr><td>10 mM ATP</td><td>Invitrogen</td><td>18330-019</td><td></td></tr><tr><td>100 mM ditiotreitol</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>100 mM dNTP </td><td>zmieszać roztwór GE Healthcare</td><td>28-4065-60</td><td>zawierający po 25 mM dATP, dCTP, dGTP i dTTP.</td></tr><tr><td>3,3',5,5'-tetrametylobenzydyna (TMB)</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-76-02</td><td></td></tr><tr><td>50X TAE</td><td>Invitrogen</td><td>24710030</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fisher</td><td>BP160</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina, węglowodan</td><td>Sigma</td><td>C1389</td><td>100 mg / ml w wodzie,&nbsp; 0,22 &mu; m filtr-sterylizacja, stężenie robocze: 100 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Chloramfenikol, cmp</td><td>Sigma</td><td>C0378</td><td>100 mg/ml w etanolu, 0,22 &mu; m filtr-sterylizacja, stężenie robocze: 10 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9620G</td><td></td></tr><tr><td>Agar granulowany</td><td>VWR</td><td>J637-500G</td><td></td></tr><tr><td>H2O2 sub peroksydazy</td><td>Kirkegaard & Perry Laboratories Inc</td><td>50-65-02</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna, AC61129</td><td>Fisher</td><td></td><td>50 mg/ml w wodzie,&nbsp; 0,22 &mu; m Filtr-sterylizacja, stężenie robocze: 50 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>94046</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Alfa Aesar</td><td>U19C015</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Fisher</td><td>ND2000C</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Fisher</td><td>SS256</td><td>! UWAGA NaOH powoduje oparzenia.</td></tr><tr><td>Mleko beztłuszczowe w proszku</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600669</td><td></td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Fisher</td><td>BP233</td><td></td></tr><tr><td>Koniugat białka A-HRP</td><td>Invitrogen</td><td>101123</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw QIAprep Spin M13</td><td>Qiagen</td><td>22704</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do ekstrakcji żelu</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Zestaw do oczyszczania PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowane białko L</td><td>Fisher</td><td>77679</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA</td><td>T4 New England Biolabs</td><td>M0203S</td> Kinaza polinukleotydowa <td></td></tr><tr><td>T4</td><td>New England Biolabs</td><td>M0201S</td><td></td></tr><tr><td>Polimeraza DNA T7</td><td>New England Biolabs</td><td>M0274S</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyklina, tet</td><td>Sigma</td><td>T7660</td><td>50 mg/ml w wodzie, 0. 22 &mu; m filtr-sterylizacja, stężenie robocze: 10 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Fisher</td><td>0123-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Ultraczysty glicerol</td><td>Invitrogen</td><td>15514-011</td><td></td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigma</td><td>U3750</td><td>25 mg / ml w etanolu, stężenie robocze: 0,25 &mu; g/ml.</td></tr><tr><td>Ekstrakt drożdżowy</td><td>VWR</td><td>DF0127-08</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Szczepy</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>E.coli CJ236</td><td>New England Biolabs</td><td>E4141</td><td>Genotyp: dut-&nbsp; ung-&nbsp; thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Służy do przygotowania dU-ssDNA.</td></tr><tr><td>E.coli SS320</td><td>Lucigen</td><td>60512</td><td>Genotyp: [F'proAB+lacIq lacZ&Delta; M15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 &Delta; (araABC-leu)7679 &Delta; lacX74 galUgalK rpsL thi. Zoptymalizowany pod kątem wysokowydajnej elektroporacji i produkcji bakteriofagów nitkowatych.</td></tr><tr><td>M13KO7</td><td>New England Biolabs</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Sprzęt</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,2 cm szczelina kuweta do elektroporacji</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa 2mL Płytki głębokostudzienkowe</td><td>Fisher</td><td>278743</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowe płytki immunologiczne Maxisorp</td><td>Kolby Nunc</td><td>151759</td><td></td></tr><tr><td>z przegrodami</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirówka stołowa</td><td>Eppendorf</td><td>5811000096</td><td></td></tr><tr><td>Butelki wirówkowe</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ECM-630 Elektroporator</td><td>BTX</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetyczny mieszadła</td><td>Wirówka Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermo Fisher</td><td>Wytrząsarka</td> szybkoobrotowa Fisher <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>TAITEK</td><td>MBR-034P</td><td></td></tr><tr><td>Wytrząsarka do mikropłytek</td><td>QILINBEIER</td><td>QB-9002</td><td></td></tr><tr><td>Ładowarka do cieczy do 96 i 384 dołków</td><td>Pipeta kanałowa RAININ</td> Mutil RAININ <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>E4XLS</td><td></td></tr><tr><td>Amicon koncentrator</td><td>Merck</td><td>UFC803096</td><td></td></tr></tbody></table>

budowa biblioteki fab display z syntetycznymi fagami z dostosowaną różnorodnością

Construction of Synthetic Phage Displayed Fab Library with Tailored Diversity

Zapotrzebowanie na przeciwciała monoklonalne (mAb) w badaniach podstawowych i medycynie rośnie z roku na rok. Technologia Hybridoma jest dominującą metodą rozwoju przeciwciał monoklonalnych od czasu pierwszego raportu w 1975 roku. Jako technologia alternatywna, metody wyświetlania fagów w celu rozwoju mAb stają się coraz bardziej atrakcyjne, ponieważ Humira, pierwsze przeciwciało pochodzące z fagów i jedno z najlepiej sprzedających się przeciwciał mAb, zostało zatwierdzone do klinicznego leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów w 2002 roku. Jako technologia rozwoju mAb nieoparta na zwierzętach, wyświetlanie fagów omija immunogenność antygenu, humanizację i utrzymanie zwierząt, które są wymagane przy opracowywaniu przeciwciał opartych na tradycyjnej technologii hybrydoma. W niniejszym protokole opisujemy metodę budowy syntetycznych bibliotek Fab wyświetlanych z fagami o rozmaitościach 109-10 10 możliwych do uzyskania za pomocą pojedynczej elektroporacji. Protokół ten składa się z: 1) wysokowydajnego przygotowania ogniw elektrokompetentnych; 2) ekstrakcja jednoniciowego DNA zawierającego uracyl (dU-ssDNA); 3) Metoda Kunkela oparta na mutagenezie ukierunkowanej oligonukleotydami; 4) elektroporacja i obliczanie wielkości biblioteki; 5) test immunoenzymatyczny na bazie białka A/L (ELISA) do oceny fałdowania i różnorodności funkcjonalnej; oraz 6) analiza sekwencji DNA różnorodności.

Postępując zgodnie ze schematem konstrukcji biblioteki Fab (patrz Rysunek 1), przygotowano elektrokompetentne komórki E. coli SS320 uprzednio zainfekowane fagiem pomocniczym M13KO7. Wydajność tych komórek elektrokompetentnych oszacowano na 2 X 109 cfu/µg przy zastosowaniu szkieletu fagemidu Fab do konstrukcji biblioteki (Rysunek 4).
Sprawdzono wydajn...

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę budowy biblioteki syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi z dostosowaną różnorodnością. Przeciwciała syntetyczne mają szerokie zastosowanie, od badań podstawowych po diagnostykę chorób i terapię.

Budowa biblioteki Fab Display z syntetycznymi fagami z dostosowaną różnorodnością

Demand for monoclonal antibodies (mAbs) in basic research and medicine is increasing yearly. Hybridoma technology has been the dominant method for mAb ...

Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie czytelnikom szczegółowego, praktycznego doświadczenia w konstruowaniu biblioteki syntetycznych przeciwciał ludzkich wyświetlanych na podstawie fagów o dostosowanej różnorodności. Biblioteki przeciwciał syntetycznych opartych na fagach mają ogromny potencjał w zakresie zastąpienia tradycyjnych technik opartych na hybrydomie w terapeutycznym opracowywaniu przeciwciał monoklonalnych poprzez ominięcie potrzeby immunizacji zwierząt i późniejszej humanizacji przeciwciał. Zaletą biblioteki przeciwciał syntetycznych jest to, że dostosowana różnorodność jest wprowadzana do struktury przeciwciał na podstawie wglądu w różnorodność pozycyjną, która wspiera interakcję o wysokim powinowactwie i pożądane właściwości białka.Poza praktyczną użytecznością, biblioteki przeciwciał syntetycznych mogą być również wykorzystywane do eksperymentalnego badania roli określonych aminokwasów w interakcjach biomolekularnych, wspierając w ten sposób ich ciągłe doskonalenie. Procedura ta zostanie zademonstrowana przez doktoranta o imieniu Zhenwei Zhong i doktora Shin-chen Hou z naszego laboratorium. Być

construction-synthetic-phage-displayed-fab-library-with-tailored

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

W tym filmie demonstrujemy technikę wyświetlania fagów w celu wyizolowania wstępnie zaprojektowanych fagów wyrażających białka o wysokim powinowactwie do docelowego białka.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do wyboru białek o wysokim powinowactwie do białka docelowego

Wyświetlanie fagów to potężna technika do wychwytywania białek lub ugrupowań białkowych, które oddziałują z unieruchomioną cząsteczką będącą przedmiotem zainteresowania. Po podjęciu decyzji o rodzaju biblioteki cDNA fagów, którą należy utworzyć i przebadać, opisany tutaj protokół pozwala na skuteczną selekcję powinowactwa prowadzącą do identyfikacji interaktorów.

Protokół wyświetlania fagów i selekcji powinowactwa przy użyciu rekombinowanych przynęt białkowych

Metoda jest opisana z wizualnym akompaniamentem do przeprowadzania skalowalnych, wysokoprzepustowych selekcji z kombinatorycznych bibliotek syntetycznych przeciwciał wyświetlanych przez fagi przeciwko setkom antygenów jednocześnie. Stosując to równoległe podejście, wyizolowaliśmy fragmenty przeciwciał, które wykazują wysokie powinowactwo i swoistość dla różnych antygenów, które są funkcjonalne w standardowych testach immunologicznych.

Skalowalny wybór przeciwciał syntetycznych o wysokiej przepustowości z bibliotek przeciwciał syntetycznych wyświetlanych przez fagi

Nowa generacja bezkomórkowych platform transkrypcyjno-translacyjnych została zaprojektowana do budowy systemów biochemicznych in vitro poprzez wykonywanie obwodów genowych. W tym artykule opisujemy, w jaki sposób bakteriofagi, takie jak MS2, ΦΧ174 i T7, są syntetyzowane z ich genomu przy użyciu systemu TXTL wolnego od komórek E. coli.

Synteza zakaźnych bakteriofagów w bezkomórkowym systemie ekspresji opartym na E. coli

Opisane protokoły pozwalają na budowę, charakterystykę i selekcję (w stosunku do wybranego celu) biblioteki "domenomowej" wykonanej z dowolnego źródła DNA. Jest to możliwe dzięki procesowi badawczemu, który łączy różne technologie: wyświetlanie fagów, składany reporter i sekwencjonowanie nowej generacji z narzędziem internetowym do analizy danych.

Interactome-Seq: Protokół do budowania, walidacji i wyboru bibliotek domenomowych poprzez wyświetlanie fagów i sekwencjonowanie nowej generacji

Tworzenie chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek o pożądanym powinowactwie i specyficzności dla dowolnego ligandu małych cząsteczek miałoby wiele zastosowań w biologicznym wykrywaniu i uruchamianiu. W tym miejscu opisujemy wydajną, uogólnioną metodę inżynierii de novo chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji poprzez krokowy wybór kombinatorycznej biblioteki przeciwciał jednodomenowych wyświetlanej przez fagi.

Tworzenie wysoce specyficznych, chemicznie indukowanych systemów dimeryzacji białek poprzez stopniową selekcję fagów w kombinatorycznej bibliotece przeciwciał jednodomenowych

Ubikwitynacja jest krytyczną modyfikacją potranslacyjną białka, której dysregulacja jest przyczyną wielu chorób ludzkich. Protokół ten szczegółowo opisuje, w jaki sposób można wykorzystać wyświetlanie fagów do izolowania nowych wariantów ubikwityny, które mogą wiązać i modulować aktywność ligazów E3, które kontrolują specyficzność, wydajność i wzorce ubikwitynacji.

Wykorzystanie wyświetlacza fagowego do opracowania modulatorów wariantów ubikwityny dla ligaz E3

Prostą metodą identyfikacji priorytetowych patogenów bakteryjnych jest zastosowanie genetycznie zmodyfikowanych fagów reporterowych. Fagi reporterowe te, specyficzne dla konkretnych gatunków gospodarzy, są zdolne do szybkiej transdukcji sygnału bioluminescencyjnego w komórkach gospodarza. W niniejszej pracy opisujemy zastosowanie fagów reporterowych do detekcji Yersinia pestis.

„Bioluminescencyjny” fagi raportujący do detekcji bakteryjnych patogenów kategorii A

Niniejszy protokół przedstawia szczegółową procedurę monitorowania zachowania pojedynczych komórek różnych bakterii w czasie, z wykorzystaniem zautomatyzowanej fluorescencyjnej mikroskopii poklatkowej. Ponadto przedstawiamy wytyczne dotyczące analizy uzyskanych obrazów mikroskopowych.

Obrazowanie żywych komórek Bacillus subtilis i Streptococcus pneumoniae z wykorzystaniem zautomatyzowanej mikroskopii poklatkowej

Opisujemy wydajną metodę oddzielania jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz cząsteczek RNA z wirusowych społeczności środowiskowych. Kwasy nukleinowe są frakcjonowane przy użyciu chromatografii na hydroksyapatycie z zastosowaniem rosnących stężeń buforów zawierających fosforany. Metoda ta umożliwia izolację wszystkich typów wirusowych kwasów nukleinowych z próbek środowiskowych.

Wyodrębnianie jednoniciowego DNA, dwuniciowego DNA oraz RNA z środowiskowej populacji wirusów z wykorzystaniem chromatografii na hydroksyapatycie

Poznaj metodę budowy biblioteki syntetycznych przeciwciał z dostosowaną różnorodnością przy użyciu technologii fagowego wyświetlania. Ta technika umożliwia selekcję przeciwciał o wysokim powinowactwie bez konieczności immunizacji zwierząt.

Budowa biblioteki Fab Display z syntetycznymi fagami z dostosowaną różnorodnością

Przeglądaj więcej filmów