Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Ogólnym celem tej mikroskopowej procedury preparacji jest wyizolowanie dyskretnych segmentów żywej tkanki nerkowej z nienaruszoną architekturą nerek do zastosowań w inżynierii tkankowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak: czy całe segmenty izolowanej tkanki narządu pierwotnego mogą być pobierane w sposób sterylny i utrzymywane przy życiu w hodowli? Główną zaletą tej techniki jest to, że segmenty zawierają nienaruszoną architekturę nerek, w przeciwieństwie do wykorzystania linii komórkowych do odtworzenia złożonego narządu z ponad 26 różnymi typami komórek.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię schyłkowej niewydolności nerek, ponieważ konstrukty te poprawią filtrację i mogą pomóc pacjentom uniknąć dializy. Podczas operacji należy nosić odpowiedni sprzęt chirurgiczny, w tym maskę i czepek, aby zminimalizować ryzyko zakażenia. Podobnie, dołóż wszelkich starań, aby zachować sterylność przez cały czas.

Przygotowania rozpocznij od udrapowania stołu operacyjnego. Następnie otwórz paczkę z autoklawowanymi narzędziami na sterylnych obłożach. Muszą zawierać trzy małe hemostatyki, cienkie kleszcze z zębami, cienkie kleszcze bez zębów i proste nożyczki do tęczówki.

Przykryj środek stołu operacyjnego drugą obłożką chirurgiczną bez okienka. Przed ustawieniem sali operacyjnej należy przygotować 50 mililitrów DBPS uzupełnionych antybiotykiem i podać pięć mililitrów do 15-mililitrowej probówki. Teraz znieczul ośmio- do 12-tygodniową mysz C57 Black Six i okresowo monitoruj poziom znieczulenia, oceniając jej odruch pedałowania za pomocą mocnego uszczypnięcia palca.

Następnie użyj kremu do depilacji, aby usunąć wszystkie włosy z brzusznej części tułowia i spłucz krem i włosy wodą destylowaną. Następnie przenieś mysz na stół operacyjny i umieść ją na wznak pod zasłoną bez okien. Teraz wytnij dwucentymetrową kwadratową stolarkę okienną w zasłonie nad odwłokiem myszy.

Następnie wyszoruj odsłoniętą skórę jodonem powidonu, a następnie trzykrotnie 70% etanolem, aby wysterylizować skórę i zakończyć przygotowania do zabiegu. Rozpocznij operację od użycia cienkich kleszczy z zębami i nożyczek do tęczówki. Wykonaj trzy- lub czterocentymetrowe nacięcie skóry równolegle do linii środkowej, pół centymetra na lewo od linii środkowej.

Następnie chwyć otrzewną za pomocą cienkich kleszczy bez zębów i naciąć nożyczkami do tęczówki, aby wejść do jamy brzusznej. Następnie nałóż hemostatyki na górne i dolne boczne krawędzie skóry i otrzewnej, aby bocznie wytworzyć napięcie i zwiększyć ekspozycję. Teraz delikatnie przesuń treść jelitową na prawo od brzucha, aby odsłonić lewą nerkę.

Następnie delikatnie umieść trakcję na nerce, aby wysunąć ją z brzucha. Teraz umieść hemostat w poprzek wnęki nerki i użyj nożyczek tęczówki, aby przeciąć moczowód i naczynia nerkowe. Następnie przenieść nerkę do probówki z 1% paciorkowcowym DBPS na lodzie.

Zabierz tę probówkę do sterylnego okapu hodowlanego w celu przetworzenia. Tam przenieś nerkę na 60-milimetrową szalkę Petriego i przepłucz ją dwukrotnie świeżymi pięciomililitrami DPBS zawierającego wapń i magnez. Po drugim umyciu zawiesić nerkę w świeżych pięciu mililitrach DBPS w nowym 60-milimetrowym naczyniu.

Następnie przygotuj dodatkową szalkę Petriego zawierającą tylko pięć mililitrów DBPS do późniejszego wykorzystania. Kontynuuj stosowanie sterylnych technik, w tym sterylnych rękawiczek, maski chirurgicznej i bouffantu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia. Następnie udrapuj obszar sceny i obszar otaczający mikroskop stereoskopowy.

Następnie umieść plastikowe arkusze samoprzylepne na pokrętłach ostrości mikroskopu i spryskaj je 70% etanolem. Następnie włącz podwójny oświetlacz na gęsiej szyi, aby oświetlić scenę. Przejdźmy teraz do sterylnych zasłon, otwórz paczkę wysterylizowanych narzędzi zawierających cienkie kleszcze bez zębów, rękojeść skalpela, ostrze skalpela numer 15, dwa proste hemostatyki i dwie igły o wydrążonym otworze 30,5.

Umieść ostrze numer 15 na uchwycie skalpela i przymocuj jeden hemostat do każdej piasty adaptera igły, aby stworzyć narzędzia do preparowania igieł. Teraz przenieś dwie szalki, jedną z nerką w DPBS, a drugą tylko DPBS, do obszaru mikroskopu. Zdejmij pokrywkę z szalki nerkowej i ustaw ostrość mikroskopu na przedniej lub tylnej powierzchni nerki w powiększeniu od 3,2 do 4x.

Następnie, ręką niedominującą, użyj cienkich kleszczy bez zębów, aby przekłuć i przycisnąć nerkę do naczynia na dolnym i górnym biegunie nerki. Następnie dominującą ręką użyj ostrza numer 15, aby usunąć półprzezroczystą włóknistą warstwę torebki z odsłoniętej powierzchni. Ogolić najbardziej powierzchowne 0,5 milimetra od odsłoniętej powierzchni nerki, aby usunąć pozostałą część kapsułki.

Kontynuuj, używając ostrza numer 15, aby wyciąć odwróconą piramidę tkanki z obszaru pozbawionego kapsuły, który ma około dwóch milimetrów kwadratowych. Następnie przenieś tkankę do czystego naczynia DBPS i wyrzuć pozostałą część nerki. Teraz skup się na wypreparowanej tkance i zmniejsz powiększenie do 1,5 do 2,0X.

Używając dwóch narzędzi igłowych hemostatu jako narzędzi tnących, pokrój fragment tkanki na stopniowo mniejsze kawałki, aż segmenty tkanki będą wielkości końcówek igły lub mniejsze. Należy wyprodukować około 50 segmentów. Jest to krytyczna część procedury.

Każdy segment musi być ściśle zbliżony do średnicy końcówki igły o rozmiarze 30-1/2, aby uniknąć dużych segmentów, które mogłyby utrudniać dyfuzję. Włóż tkankę z powrotem do kaptura do hodowli tkankowej i wyjmij DPBS za pomocą mikropipety P1000. Następnie dodaj z powrotem pięć milimetrów DMEM uzupełnionego 10% płodową surowicą bydlęcą i 1% paciorkowcem.

Następnie natychmiast należy wyhodować tkankę lub wszczepić ją do konstruktów komórkowych. Żywotność nienaruszonych odcinków nerki wytworzonych w wyniku opisanej procedury badano przez trzy dni w hodowli za pomocą testu żywotności. Zielony fluorescencyjny wapń AM jest obecny z wewnątrzkomórkową aktywnością esterazy wskazującą na żywe komórki.

Czerwony fluorescencyjny homodimer-1 etydyny jest obserwowany z utratą integralności błony plazmatycznej. Kiedy segmenty nerkowe zostały osadzone w pozbawionych rusztowania konstruktach fibroblastów śródbłonka, w trzecim dniu zostały włączone do konstruktów komórkowych, tworząc nienaruszone struktury. Konstrukty utrzymywały swoją sieć śródbłonka przednaczyniowego, pokazaną przez znakowanie czynnikiem von Willebranda.

Komórki nabłonka nerek są oznaczone na zielono przez cytokertain-18. Aby przetestować funkcjonalność nerek in vitro, konstrukty inkubowano z albuminą znakowaną FITC. Podczas gdy resztkowe albuminy znajdowały się z dala od segmentów osadzonej tkanki nerkowej, istniały również hotspoty w komórkach nabłonka kanalików nerkowych.

Te hotspoty to albumina, która przechodzi śródświetlne, co uważa się za wychwyt zwrotny albuminy w konstrukcie komórkowym segmentu nerki. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować segmenty nerkowe od mysich nerek do zastosowań w inżynierii tkankowej. Po opanowaniu tę procedurę można wykonać w ciągu jednej do 1-1/2 godziny.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, w tym wysiewanie konstruktów komórkowych, aby odpowiedzieć na inne pytania dotyczące wytwarzania i charakterystyki konstruktów nerkowych. Nie zapominaj, że praca z narzędziami chirurgicznymi i butlami z tlenem pod ciśnieniem może być bardzo niebezpieczna. Zachowaj ostrożność podczas pracy z ostrymi przedmiotami i pamiętaj o zakotwiczeniu butli z tlenem do stołu laboratoryjnego.