Name: Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Poznaj metodę mikrodysekcji nerek myszy w celu izolacji segmentów kory i rdzenia z zachowaniem architektury nerkowej. Technika ta umożliwia tworzenie innowacyjnych konstruktów tkanek bez rusztowań dla zastosowań w inżynierii tkankowej nerek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Grant na Instytucjonalne Szkolenie Podoktoranckie NIH, NIH-HL-007260

Wszystkie opisane poniżej procedury chirurgiczne na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie Medycznym Południowej Karoliny przed jakimikolwiek operacjami na zwierzętach lub użyciem jakichkolwiek tkanek zwierzęcych.
1. Mysia nefrektomia
<ol>
	<li>Załóż maskę chirurgiczną i czepek bouffant, aby zminimalizować ryzyko zakażenia. Zachowaj sterylność podczas ustawiania pola operacyjnego.
	<ol>
		<li>Na stole operacyjnym umieść obłożenia chirurgiczne bez okienek.</li>
		<li>Otwórz opakowanie z autoklawowanymi narzędziami na sterylnych obłożach. Narzędzia wymagane do nefrektomii obejmują 3 małe hemostatyki, cienkie kleszcze z zębami, cienkie kleszcze bez zębów i proste nożyczki do tęczówki.</li>
		<li>Umieść kolejną serwetę chirurgiczną bez okien na środku stołu operacyjnego.</li>
		<li>Przygotuj 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (DPBS) firmy Dulbecco z wapniem i magnezem, uzupełnionych 1% penicyliną/streptomycyną w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 15 ml. Umieść ten roztwór na lodzie obok stołu operacyjnego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdobądź 8-12-tygodniową mysz C57BL/6 (samca lub samicę) z kompleksu pomieszczeń dla zwierząt.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze indukcyjnej znieczulenia i indukuj 3,5% wziewnym izofluranem. Umieść stożek nosowy na myszy, używając 2% izofluranu do znieczulenia podtrzymującego.
	<ol>
		<li>Okresowo monitoruj odpowiednią głębokość znieczulenia przez cały zabieg chirurgiczny, oceniając odruch pedałowania (mocne uszczypnięcie palca</li>).
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń wszystkie włosy z brzusznej części tułowia za pomocą kremu do depilacji. Spłucz ten obszar wodą destylowaną, aby upewnić się, że wszystkie włosy zostały usunięte z brzucha.</li>
	<li>Przenieś mysz na sterylny stół operacyjny w pozycji leżącej na plecach pod górną zasłoną bez okien. Wytnij okienko o wymiarach 2 x 2 cm2 w serwecie tuż nad brzuchem myszy.</li>
	<li>Nałóż powidon-jod, a następnie 70% etanol na brzuch za pomocą sterylnej gazy lub wacików.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczyków z zębami i nożyczkami do tęczówki wykonaj pionowe nacięcie skóry brzucha o długości 3 - 4 cm równolegle do linii środkowej, 0,5 cm na lewo od linii środkowej 
	nuta: W przypadku próby usunięcia prawej nerki będzie to nacięcie 0,5 cm na prawo od linii środkowej.
	<ol>
		<li>Chwyć otrzewną cienkimi kleszczami bez zębów i naciąć nożyczkami do tęczówki, aby dostać się do jamy brzusznej. Nałóż hemostatyki na górne i dolne boczne krawędzie skóry i otrzewnej, aby bocznie naprężyć i zwiększyć ekspozycję.</li>
		<li>Delikatnie przesuń treść jelitową na prawą stronę brzucha, aby odsłonić lewą nerkę. Delikatnie umieść trakcję na nerce, aby wysunąć ją z brzucha.</li>
		<li>Umieść hemostat w poprzek wnęki lewej nerki. Użyj nożyczek do tęczówki, aby przeciąć moczowód i naczynia nerkowe.</li>
		<li>Umieścić lewą nerkę w 1% roztworze DPBS penicyliny/streptomycyny na lodzie.</li>
		<li>Przenieść probówkę zawierającą nerkę do sterylnego kaptura do hodowli tkanek. Przenieś nerkę z 15-mililitrowej stożkowej probówki na 60-milimetrową szalkę Petriego (<silna klasa="xfig">Ryc. 1). Spłucz dwukrotnie za pomocą 5 ml DPBS z wapniem i magnezem. Trzymaj nerkę zawieszoną w 5 ml DPBS w naczyniu o średnicy 60 mm.
		<ol>
			<li>Przygotuj dodatkową szalkę Petriego o średnicy 60 mm z 5 ml DPBS do użycia podczas protokołu mikrodysekcji.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Poddaj mysz eutanazji przez torakotomię i wykrwawienie po pobraniu nerki, zgodnie z zatwierdzonym protokołem IACUC dla zwierząt.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mysia mikrodysekcja nerki do izolacji segmentu nerkowego
<ol>
	<li>Kontynuuj stosowanie sterylnej techniki w tej części protokołu, w tym sterylnych rękawiczek, maski chirurgicznej i bouffantu, aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczenia.
	<ol>
		<li>Umieść sterylne zasłony na platformie mikroskopu stereoskopowego, a także w obszarach po lewej i prawej stronie mikroskopu, aby uzyskać sterylne pole dla instrumentów. Umieść plastikowe arkusze samoprzylepne na pokrętłach ostrości mikroskopu i spryskaj 70% etanolem. Włącz podwójny oświetlacz na gęsiej szyi, aby oświetlić scenę.</li>
		<li>Otwórz wysterylizowane narzędzia (cienkie kleszcze bez zębów, rękojeść skalpela, ostrze skalpela #15, dwa proste hemostatyki, dwie igły o wydrążonym otworze 301/2) na sterylnych serwetach. Umieść teraz ostrze #15 na uchwycie skalpela i przymocuj jeden hemostat do każdego adaptera/piasty igły, aby stworzyć narzędzia do preparowania igieł do późniejszego użytku, jak pokazano na <silna klasa = "xfig">Rysunek 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przesunąć 60-milimetrowe szalki Petriego, z których jedna zawiera nerkę w DPBS, a druga tylko DPBS, z kaptura do hodowli tkankowej w obszar mikroskopu.
	<ol>
		<li>Umieść szalkę Petriego o średnicy 60 mm pod obiektywem i zdejmij pokrywę, aby odsłonić nerkę. Pozostaw naczynie zawierające DPBS na boku na sterylnym polu do późniejszego użycia.</li>
		<li>Przesuń szalkę tak, aby widoczna była tylko przednia lub tylna powierzchnia nerki (tj. duża płaska powierzchnia nerki, przy czym druga powierzchnia dotyka dna naczynia). Powiększ do 3,2 - 4X dla tej części procedury. Używając ręki niedominującej, użyj cienkich kleszczy bez zębów, aby przekłuć i przycisnąć nerkę do naczynia w pobliżu dolnego i górnego bieguna nerki.</li>
		<li>Trzymaj rękę niedominującą na miejscu, aby przypiąć nerkę. Dominującą ręką użyj ostrza #15, aby usunąć półprzezroczystą włóknistą warstwę torebki z odsłoniętej powierzchni. Ogolić najbardziej powierzchowne 0,5 mm od odsłoniętej powierzchni nerki, aby usunąć pozostałą część kapsułki.</li>
		<li>Użyj ostrza #15, aby wyciąć odwróconą piramidę tkanki z odkapslowanego obszaru o wielkości około 2 mm3. Wyjmij 60-milimetrową szalkę zawierającą tylko DPBS i umieść piramidę tkanki w czystym naczyniu. Wyrzuć pozostałą część nerki.</li>
		<li>Zmniejsz powiększenie do 1,5 - 2,0X dla pozostałej części sekcji. Używając dwóch narzędzi z igłą hemostatu jako narzędzi do cięcia, pokrój fragment tkanki na coraz mniejsze kawałki, aż segmenty tkanki będą mniejsze lub równe średnicy końcówek igły. Tkanka nerkowa o wielkości 2mm3 po całkowitym wypreparowaniu wytworzy ponad 50 segmentów.</li>
		<li>Przenieść 60-milimetrową szalkę z segmentami nerkowymi do kaptura do hodowli tkankowej. Usunąć DPBS za pomocą pipety o pojemności 1000 μl. Dodaj 5 ml DMEM, uzupełniony 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% penicyliną/streptomycyną.</li>
		<li>Hodowlę przez 3 dni w temperaturze 37 °C w inkubatorze lub natychmiast wszczepić do konstruktów komórkowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Wytwarzanie konstruktów komórkowych segmentu nerki
<ol>
	<li>Hodowla normalnych ludzkich fibroblastów skóry (NHDF) i ludzkich komórek mikronaczyniowych tkanki tłuszczowej (HAMEC) przez kilka tygodni, aby uzyskać 7,2 x 105 fibroblastów i 1,8 x 105 komórek śródbłonka na pożądany konstrukt. W kapturze do hodowli tkankowej wysiewaj odpowiedni stosunek fibroblastów do komórek śródbłonka (4:1) do studzienek w kształcie pręcików w formach agarozowych, aby utworzyć wolne od rusztowań konstrukcje przednaczyniowe śródbłonka i fibroblastów (SPEC), jak wcześniej opisano przez Czajka i wsp19.</li>
	<li>Zaopatrz się w wysterylizowany hemostat, igłę 301/2 G i sterylną szpatułkę z płaskim końcem.
	<ol>
		<li>Usunąć większość pożywki z 60-milimetrowej płytki zawierającej segmenty nerkowe, uważając, aby nie zassać i nie usunąć segmentów nerkowych.</li>
		<li>Wyposaż lupy chirurgiczne w wizualizację implantacji segmentów.</li>
		<li>Delikatnie zeskrob koniec szpatułki wzdłuż dna naczynia o średnicy 60 mm, aby uzyskać 10 - 15 segmentów, rozłożonych równomiernie wzdłuż samego końca szpatułki. Umieść końcówkę szpatułki jak najbliżej krawędzi dołka, w którym wysiano SPEC.</li>
		<li>Z drugiej strony użyj narzędzia igłowego hemostat-301/2 G, aby przesunąć każdy pojedynczy segment od końcówki szpatułki do krawędzi studzienki. Delikatnie przesuń każdy segment w dół do studzienki za pomocą końcówki igły, aż lekko zanurzy się w wcześniej zasianej zawiesinie komórkowej.</li>
		<li>Hodowla segmentu nerkowego SPEC w stosunku 2:1:1 pożywki FGM-2/EGM-2/DMEM (całkowita objętość 2,5 ml). Zmieniaj pożywki hodowlane co 24 godziny przez 3 dni. Wyjąć konstrukty z form po 72 godzinach i utrwalić lub błyskawicznie zamrozić do obróbki.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Jha, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+kidney+disease%3A+global+dimension+and+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Chronic kidney disease: global dimension and perspectives.</a> Lancet. 382 (9888), London, England. 260-272 (2013).</li>
<li>2016 USRDS Annual Data Report: Epidemiology of Kidney Disease in the United States. U.S.R.D. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf">https://www.usrds.org/2016/download/v2_ESRD_16.pdf</a> (2016).</li>
<li>Hart, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OPTN%2FSRTR+2015+Annual+Data+Report%3A+Kidney%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+transplantation+%3A+official+journal+of+the+American+Society+of+Transplantation+and+the+American+Society+of+Transplant+Surgeons%22%5BJournal%5D)">OPTN/SRTR 2015 Annual Data Report: Kidney.</a> American journal of transplantation : official journal of the American Society of Transplantation and the American Society of Transplant Surgeons. 17, Suppl 1 21-116 (2017).</li>
<li>de Vries, E. F., Rabelink, T. J., van den Hout, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+the+Cost-Effectiveness+of+Delaying+End-Stage+Renal+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron%22%5BJournal%5D)">Modelling the Cost-Effectiveness of Delaying End-Stage Renal Disease.</a> Nephron. 133 (2), 89-97 (2016).</li>
<li>Lefebvre, P., Duh, M. S., Mody, S. H., Bookhart, B., Piech, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+economic+impact+of+epoetin+alfa+therapy+on+delaying+time+to+dialysis+in+elderly+patients+with+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Disease+management+%3A+DM%22%5BJournal%5D)">The economic impact of epoetin alfa therapy on delaying time to dialysis in elderly patients with chronic kidney disease.</a> Disease management : DM. 10 (1), 37-45 (2007).</li>
<li>Mennini, F. S., Russo, S., Marcellusi, A., Quintaliani, G., Fouque, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Economic+effects+of+treatment+of+chronic+kidney+disease+with+low-protein+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+renal+nutrition+%3A+the+official+journal+of+the+Council+on+Renal+Nutrition+of+the+National+Kidney+Foundation%22%5BJournal%5D)">Economic effects of treatment of chronic kidney disease with low-protein diet.</a> Journal of renal nutrition : the official journal of the Council on Renal Nutrition of the National Kidney Foundation. 24 (5), 313-321 (2014).</li>
<li>Moon, K. H., Ko, I. K., Yoo, J. J., Atala, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney+diseases+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Kidney diseases and tissue engineering.</a> Methods. 99, San Diego, Calif. 112-119 (2016).</li>
<li>Wobma, H., Vunjak-Novakovic, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine+2015%3A+A+Year+in+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering and Regenerative Medicine 2015: A Year in Review.</a> Tissue engineering. Part B, Reviews. 22 (2), 101-113 (2016).</li>
<li>Langer, R., Vacanti, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+pediatric+surgery%22%5BJournal%5D)">Advances in tissue engineering.</a> Journal of pediatric surgery. 51 (1), 8-12 (2016).</li>
<li>Jakab, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+by+self-assembly+and+bio-printing+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biofabrication%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering by self-assembly and bio-printing of living cells.</a> Biofabrication. 2 (2), 022001(2010).</li>
<li>Fisher, M. B., Mauck, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+regenerative+medicine%3A+recent+innovations+and+the+transition+to+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+B%2C+Reviews%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and regenerative medicine: recent innovations and the transition to translation.</a> Tissue engineering. Part B, Reviews. 19 (1), 1-13 (2013).</li>
<li>Stewart, D. E., Garcia, V. C., Rosendale, J. D., Klassen, D. K., Carrico, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosing+the+Decades-Long+Rise+in+the+Deceased+Donor+Kidney+Discard+Rate+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Diagnosing the Decades-Long Rise in the Deceased Donor Kidney Discard Rate in the United States.</a> Transplantation. 101 (3), 575-587 (2017).</li>
<li>Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+weekend+effect+alters+the+procurement+and+discard+rates+of+deceased+donor+kidneys+in+the+United+States%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+international%22%5BJournal%5D)">The weekend effect alters the procurement and discard rates of deceased donor kidneys in the United States.</a> Kidney international. 90 (1), 157-163 (2016).</li>
<li>Orlando, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discarded+human+kidneys+as+a+source+of+ECM+scaffold+for+kidney+regeneration+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies.</a> Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).</li>
<li>Katari, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+bioengineering+with+scaffolds+generated+from+human+kidneys%5BTitle%5D)+AND+%22Nephron.+Experimental+nephrology%22%5BJournal%5D)">Renal bioengineering with scaffolds generated from human kidneys.</a> Nephron. Experimental nephrology. 126 (2), 119(2014).</li>
<li>Kim, S. S., Park, H. J., Han, J., Choi, C. Y., Kim, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Renal+tissue+reconstitution+by+the+implantation+of+renal+segments+on+biodegradable+polymer+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+letters%22%5BJournal%5D)">Renal tissue reconstitution by the implantation of renal segments on biodegradable polymer scaffolds.</a> Biotechnology letters. 25 (18), 1505-1508 (2003).</li>
<li>Guimaraes-Souza, N. K., Yamaleyeva, L. M., AbouShwareb, T., Atala, A., Yoo, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+human+kidney+structures+for+renal+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nephrology%2C+dialysis%2C+transplantation+%3A+official+publication+of+the+European+Dialysis+and+Transplant+Association+-+European+Renal+Association%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of human kidney structures for renal cell therapy.</a> Nephrology, dialysis, transplantation : official publication of the European Dialysis and Transplant Association - European Renal Association. 27 (8), 3082-3090 (2012).</li>
<li>Kelley, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubular+cell-enriched+subpopulation+of+primary+renal+cells+improves+survival+and+augments+kidney+function+in+rodent+model+of+chronic+kidney+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+physiology.+Renal+physiology%22%5BJournal%5D)">Tubular cell-enriched subpopulation of primary renal cells improves survival and augments kidney function in rodent model of chronic kidney disease.</a> American journal of physiology. Renal physiology. 299 (5), 1026-1039 (2010).</li>
<li>Czajka, C. A., Drake, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+prevascular+tissues+from+endothelial+and+fibroblast+cells+under+scaffold-free%2C+nonadherent+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+engineering.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of prevascular tissues from endothelial and fibroblast cells under scaffold-free, nonadherent conditions.</a> Tissue engineering. Part A. 21 (1-2), 277-287 (2015).</li>
<li>Rhett, J. M., Wang, H., Bainbridge, H., Song, L., Yost, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin-Based+Therapeutics+and+Tissue+Engineering+Approaches+to+the+Amelioration+of+Chronic+Pancreatitis+and+Type+I+Diabetes%3A+Construction+and+Characterization+of+a+Novel+Prevascularized+Bioartificial+Pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+diabetes+research%22%5BJournal%5D)">Connexin-Based Therapeutics and Tissue Engineering Approaches to the Amelioration of Chronic Pancreatitis and Type I Diabetes: Construction and Characterization of a Novel Prevascularized Bioartificial Pancreas.</a> Journal of diabetes research. 2016, 7262680(2016).</li>
<li>Al-Awqati, Q., Oliver, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11849378">Stem cells in the kidney.</a> Kidney international. 61 (2), 387-395 (2002).</li>
<li>Aboushwareb, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+producing+cells+for+potential+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22World+journal+of+urology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin producing cells for potential cell therapy.</a> World journal of urology. 26 (4), 295-300 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Metody stosowane do inżynierii żywych konstruktów tkanki nerkowej różnią się znacznie zarówno pod względem rodzaju wykorzystywanych komórek, jak i biomateriałów, a w wielu przypadkach są przestarzałe lub słabo scharakteryzowane w literaturze7. Podczas gdy wiele osób stosuje metody oparte na komórkach macierzystych lub rekapituluje poszczególne elementy architektury nerek w izolacji, perspektywa sztucznego odtworzenia całego narządu z ponad 26 różnymi zróżnicowanymi typami komórek z zawiesin komórk...

Przewlekła choroba nerek (PChN) jest obecnie jednym z głównych wyzwań dla zdrowia publicznego na całym świecie1. Częstość występowania PChN w Stanach Zjednoczonych wynosi ponad 14% całej populacji, przy czym ponad 600 000 Amerykanów cierpi na najcięższą postać, schyłkową niewydolność nerek (ESRD)2. Obecnie dostępne opcje leczenia dla osób ze schyłkową niewydolnością nerek obejmują dializę i przeszczep nerki. Chociaż każdego roku około 25 000 pacjentów przechodzi przeszczep nerki, co roku dodawana jest znaczna liczba pacjentów, co prowadzi do dużej dysproporcji między tymi, którzy oczekują na narząd ratujący życie, a tymi, którzy otrzymują przeszczep3. Oprócz poważnego negatywnego wpływu na długowieczność i jakość życia, dializa wiąże się ze zdumiewającym obciążeniem finansowym. W 2014 roku Medicare wypłaciło odszkodowania na łączną kwotę ponad 30 miliardów dolarów dla pacjentów ze schyłkową niewydolnością nerek2. Ze względu na ograniczoną podaż narządów i brak widocznej tendencji spadkowej u pacjentów wymagających dializy, wysiłki badawcze mające na celu znalezienie alternatywnych rozwiązań dla dializ i transplantacji są nadal ważne. Nawet stosunkowo krótkie opóźnienie w potrzebie dializy znacznie zwiększa liczbę lat życia i produktywność pacjenta skorygowanych o jakość, jednocześnie odsuwając w czasie koszty związane z dializami4,5,6.
Rozwiązania dla funkcjonalnej utraty tkanki, takie jak ta w ESRD, są obecnie badane w laboratoriach inżynierii tkankowej i medycyny regeneracyjnej, z bardzo różnorodnymi podejściami, począwszy od produkcji organoidów opartych na rusztowaniach, a skończywszy na inżynierii całych narządów, wykorzystującej bezkomórkowe struktury narządowe do implantacji komórkowej7,8,9,10,11. Rekapitulacja złożonych struktur nerkowych z marginalnych lub odrzuconych nerek została zbadana tylko częściowo. W rzeczywistości prawie 20% nerek pobieranych do przeszczepu jest odrzucanych z różnych powodów12,13. Funkcjonalna tkanka nerkowa z tych domniemanych przeszczepów może być wykorzystana i włączona do jednego lub wielu konstruktów inżynierii tkankowej. Wcześniejsze badania wykazały możliwość pracy z tymi odrzuconymi narządami, wykorzystując nerki jako macierz zewnątrzkomórkową do celów inżynierii tkankowej14,15. Jednak niewielu wykorzystało pierwotną tkankę nerkową ze zdrowych nerek do celów inżynierii tkankowej16,17,18.
Jedna metoda wcześniej opisana przez Kima i wsp. polega na izolacji "segmentów" nerkowych ze zdrowych nerek szczurów, które następnie zostały umieszczone na rusztowaniach z kwasem poliglikolowym (PGA) w celu produkcji konstrukcji16. Jednak niewiele jest informacji na temat dokładnej metodologii preparacji, a segmenty uzyskano z połączenia drobnego mielenia i filtracji. Opisujemy modyfikację tego protokołu, która podobnie wytwarza dyskretne segmenty nerek z nienaruszoną architekturą nefronalną, ale zamiast tego opiera się na technikach mikrodysekcji. Nefrektomię wykonuje się na żywych dorosłych myszach, po czym nerki są przenoszone do mikroskopu preparacyjnego, gdzie usuwa się torebkę nerkową, a tkankę dalej preparuje. Igły 301/2 G o małej średnicy są używane jako narzędzia tnące, a także jako prowadnice wspomagające rozwarstwianie, ponieważ średnica igły jest równa docelowej średnicy segmentów nerkowych. Wyizolowane, w tym przypadku mysie, segmenty nerki zachowują żywotność w hodowli i łączą się z konstruktami komórkowymi śródbłonka i fibroblastów bez rusztowań19. Konstrukty te były wcześniej wykorzystywane do inżynierii innych narządów, w tym bio-sztucznej trzustki20.

<table><tbody><tr><td>Bezokienne sterylne</td><td>jednorazówki szpitala Busse</td> bez okien <td>696</td><td></td></tr><tr>Sterylne <td>jednorazówki szpitala Busse</td> z<td>fenestracją</td><td>697</td><td></td></tr><tr><td>Kleszczyki do komarów Halsted 5 Zakrzywiony</td><td>Miltex</td><td>Mil-7-4</td> <td>"Hemostat" w rękopisie</td></tr><tr><td>Ekstra cienkie kleszcze Graefe, zakrzywione z zębami</td><td>Fine Science Tools</td><td>11155-10</td><td>Cienkie kleszcze z zębami</td></tr><tr><td>Ekstra cienkie kleszcze Graefe, ząbkowane (bez zębów)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td>Cienkie kleszcze bez zębów</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki - węglik wolframu</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Nożyczki do tęczówki</td></tr><tr><td>Betadine Peeling chirurgiczny z pompką, powidon-jod 7,5%</td><td>Purdue Products L.P.</td><td>67618-151-17</td><td></td></tr><tr><td>Sterylna bawełniana gazika (4 "x 4")</td><td>Fisher Healthcare</td><td>22-415-469</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowany fosforanem Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór penicyliny/streptomycyny, 100X</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td></td></tr><tr><td>Izofluran, USP</td><td>Producent: Piramal, Dystrybutor: McKesson</td><td>2254845</td><td></td></tr><tr><td>Nair Hair Remover</td><td>Nair</td><td>22600-23307</td><td>Krem do depilacji w tekście</td></tr><tr><td>200 Proof Ethanol</td><td>Decon Laboratories</td><td>2705</td><td>Rozcieńczony do 70% roztworu etanolu</td></tr><tr><td>BioLite 60mm Naczynie do hodowli tkankowych</td><td>Themo-Scientific</td><td>130181</td><td></td></tr><tr><td>Press'n Seal</td><td>Glad</td><td>12587-70441</td><td>Stosowany do stereoskopu</td></tr><tr><td>SZX16</td><td>Stereoskop Olympus</td><td>Oświetlacz światłowodowy SZX16</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Cole Parmer</td><td>41720-20</td><td></td></tr><tr><td>Samonośna rura dwulekowa, 23" L Gęsia szyja</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-41720-60</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela #3</td><td>Miltex</td><td>Mil-4-7</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne ostrze ze stali węglowej z żebrem, rozmiar ostrza 15</td><td>Bard-Parker</td><td>371115</td><td></td></tr><tr><td>31 1/2 Gauge</td><td>Igła ThermoFisher Naukowy</td><td>14-826F</td><td>Becton Dickinson 305106</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium</td><td>Corning</td><td>10-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Select 100% Surowica bydlęca</td><td>Atlas Biologicals</td><td>FS-0500-AD</td><td></td></tr><tr><td>Normalne ludzkie fibroblasty skórne</td><td>Lonza</td><td>CC-2511</td><td></td></tr><tr><td>Ludzkie komórki mikronaczyniowe śródbłonka tkanki tłuszczowej</td><td>Sciencell Research Laboratories</td><td>7200</td><td></td></tr><tr><td>Lupy chirurgiczne (2,5x)</td><td>Orascoptic</td><td>(N/A) na zamówienie</td><td></td></tr><tr><td>FGM-2 (Fibroblast Basal Medium z dodanymi pojedynczymi cytatami FGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3131, CC-4126</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 (śródbłonkowe podłoże podstawowe z dodanymi EGM-2 SingleQuots)</td><td>Lonza</td><td>CC-3156, CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do żywej/martwej żywotności/cytotoksyczności dla komórek ssaków</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-cytokeratyny-18</td><td>Abcam</td><td>ab668</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysie IgG, Alexa Fluor 633</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21052</td><td></td></tr><tr><td>Kozia anty-królicza IgG, Alexa Fluor 546</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11010</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw czynnikowi von Willebranda</td><td>Abcam</td><td>ab6994</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, izotiocyjanian fluoresceiny Koniugat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9771-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Hoescht 33342</td><td>BD Pharmingen</td><td>561908</td><td></td></tr><tr><td>Background Buster</td><td>Innovex Biosciences</td><td>NB306</td><td></td></tr></tbody></table>

mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Microdissection of Primary Renal Tissue Segments and Incorporation with Novel Scaffold-free Construct Technology

Przeszczep nerki jest obecnie głównym nurtem terapii schyłkowej niewydolności nerek. Jednak przy około 96 000 osób na liście oczekujących i tylko jedna czwarta tych pacjentów otrzymuje przeszczep, istnieje pilne zapotrzebowanie na alternatywy dla osób z niewydolnymi narządami. W celu zmniejszenia szkodliwych skutków dializ oraz ogólnych kosztów opieki zdrowotnej, jakie się z nimi wiąże, prowadzone są aktywne badania mające na celu poszukiwanie alternatywnych rozwiązań dla przeszczepiania narządów. Wszczepialne konstrukty komórkowe nerek oparte na inżynierii tkankowej są jednym z takich możliwych podejść do zastąpienia utraconej funkcjonalności nerek. Tutaj, opisana po raz pierwszy, jest mikrodysekcja mysich nerek w celu wyizolowania żywych segmentów korowo-rdzeniowych nerki. Segmenty te są zdolne do szybkiej integracji w pozbawionych rusztowań konstrukcjach śródbłonkowo-fibroblastowych, które mogą umożliwić szybkie połączenie z układem naczyniowym gospodarza po wszczepieniu. Nerki dorosłych myszy pobrano od żywych dawców, a następnie poddano mikrodysekcji stereoskopowej w celu uzyskania segmentów nerkowych o średnicy 200 - 300 μm. Wiele konstruktów nerkowych wyprodukowano przy użyciu pierwotnych segmentów nerki pobranych tylko z jednej nerki. Metoda ta demonstruje procedurę, która może uratować funkcjonalną tkankę nerkową z narządów, które w przeciwnym razie zostałyby wyrzucone.

Opisany protokół pozwala na uzyskanie około 50 segmentów nerkowych z każdego piramidalnego przekroju tkanki nerkowej o objętości 2 mm3. Przetworzone i zobrazowane segmenty nerkowe zawierają komponenty kanalikowe i kłębuszkowe w różnych proporcjach (patrz Rysunek 2). Nienaruszone segmenty poddano analizie w celu określenia żywotności różnych fragmentów co 24 h przez trzy dni. Zielona fluorescencja kalceiny-AM występuje przy aktywności esterazy wewną...

Inżynierskie konstrukty nerkowe dostarczają rozwiązania na niedobór narządów i szkodliwe skutki dializy. W tym miejscu opisujemy protokół mikropreparacji mysich nerek w celu izolacji segmentów korowo-rdzeniowych. Segmenty te są wszczepiane do konstruktów komórkowych wolnych od rusztowań, tworząc organoidy nerkowe.

Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Kidney transplantation is now a mainstream therapy for end-stage renal disease. However, with approximately 96,000 people on the waiting list and only ...

Ogólnym celem tej mikroskopowej procedury preparacji jest wyizolowanie dyskretnych segmentów żywej tkanki nerkowej z nienaruszoną architekturą nerek do zastosowań w inżynierii tkankowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie inżynierii tkankowej, takie jak: czy całe segmenty izolowanej tkanki narządu pierwotnego mogą być pobierane w sposób sterylny i utrzymywane przy życiu w hodowli? Główną zaletą tej techniki jest to, że segmenty zawierają nienaruszoną architekturę nerek, w przeciwieństwie do wykorzystania linii komórkowych do odtworzenia złożonego narządu z ponad 26 różnymi typami komórek.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię schyłkowej niewydolności nerek, ponieważ konstrukty te poprawią filtrację i mogą pomóc pacjentom uniknąć dializy. Podczas operacji należy nosić odpowiedni sprzęt chirurgiczny, w tym maskę i czepek, aby zminimalizować ryzyko zakażenia. Podobnie, dołóż wszelkich starań, aby zachować sterylność przez cały czas.Przygotowania rozpocznij od udrapowania stołu operacyjnego. Następnie otwórz paczkę z autoklawowanymi narzędziami na sterylnych obłożach. Muszą zawierać trzy małe hemostatyki, cienkie kleszcze z zębami, cienkie kle

microdissection-primary-renal-tissue-segments-incorporation-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten protokół opisuje decelularyzację nerek szczura Sprague Dawley poprzez wstępną perfuzję detergentów przez układ krwionośny, wytwarzając bezkomórkowe matryce zewnątrzkomórkowe nerek, które służą jako szablony do ponownego zasiedlenia ludzkimi komórkami nabłonka nerkowego. Recelularyzacja i zastosowanie testu perfuzji resazuryny do monitorowania wzrostu odbywa się w specjalnie zaprojektowanych bioreaktorach perfuzyjnych.

Repopulacja komórek nabłonkowych i przygotowanie rusztowań macierzy zewnątrzkomórkowej gryzoni do rozwoju tkanki nerkowej

Innowacyjna technika biofabrykacji została opracowana w celu inżynierii trójwymiarowych konstrukcji, które przypominają cechy architektoniczne, komponenty i właściwości mechaniczne tkanki in vivo. Technika ta wykorzystuje nowo opracowany materiał protektorowy, kauczuk BSA, który przenosi szczegółowe cechy przestrzenne, odtwarzając architekturę in vivo szerokiej gamy tkanek.

Trójwymiarowa technologia biomimetyczna: nowatorski biokauczuk tworzy zdefiniowane architektury w mikro i makroskali w hydrożelach kolagenowych

Głównym celem tego protokołu jest efektywne izolowanie żywotnych pierwotnych kultur kłębuszków nerkowych z minimalnymi zanieczyszczeniami do wykorzystania w różnych dalszych zastosowaniach. Wyizolowane kłębuszki nerkowe zachowują relacje strukturalne między typami komórek składowych i mogą być hodowane ex vivo przez krótki czas.

Skuteczna metoda przesiewania w celu odizolowania nienaruszonych kłębuszków nerkowych z nerki dorosłego szczura

Ta praca opisuje dwie metody badania rozwoju narządów, ulepszone ustawienie ksenotransplantacji na błonie kosmówkowo-omoczniowej (CAM) z ptasich embrionów, które pozwala na unaczynienie hodowanych narządów embrionalnych i organoidów oraz nowatorską metodę hodowli narządów w stałym kierunku z zmodyfikowanymi warunkami eksperymentalnymi, która pozwala na obrazowanie konfokalne w wysokiej rozdzielczości w trybie poklatkowym.

Optymalizacja organoidów nerkowych i hodowli organotypowych pod kątem unaczynienia, przedłużony rozwój i ulepszone obrazowanie mikroskopowe

Opisujemy protokół laserowej mikrodysekcji podsegmentów ludzkiej nerki, w tym kłębuszka nerkowego, kanalika proksymalnego, grubej kończyny wstępującej, przewodu zbiorczego i śródmiąższu. RNA jest następnie izolowane z uzyskanych przedziałów i przeprowadza się sekwencjonowanie RNA w celu określenia zmian w sygnaturze transkryptomicznej w każdym podsegmencie.

Zastosowanie mikrodysekcji laserowej do odkrycia regionalnej transkryptomiki w ludzkiej tkance nerkowej

Ten protokół wprowadza metodę tworzenia rusztowania przy użyciu pozbawionych komórek nerek szczurów. Protokół obejmuje procesy decelularyzacji i recelularyzacji w celu potwierdzenia biodostępności. Decelularyzacja odbywa się przy użyciu Triton X-100 i dodecylosiarczanu sodu.

Przygotowanie bezkomórkowych rusztowań nerkowych u szczurów

Implanty inżynierii tkankowej do chirurgii rekonstrukcyjnej rzadko wychodzą poza próby przedkliniczne ze względu na pracochłonne hodowle ex vivo, które zawierają skomplikowane i kosztowne elementy rusztowania. W tym miejscu przedstawiamy jednoetapową procedurę przeznaczoną do odprowadzania moczu za pomocą dostępnego rusztowania rurkowego na bazie kolagenu zawierającego autologiczne mikroprzeszczepy.

Model chirurgiczny jednoetapowych rurek urotelialnych inżynierii tkankowej u świnek miniaturowych

Tutaj prezentujemy protokoły, które szczegółowo opisują instrukcje dotyczące wdrażania hodowli komórkowych 3D przy użyciu matryc kolagenowych i kolagenowo-agarozowych w systemie mikrofizjologicznym. Protokoły te wspierają kogenerację kanalików proksymalnych nerek i sferoidów raka nerkowokomórkowego, symulując warunki in vivo i umożliwiając zaawansowane badania interakcji komórek raka nerki.

Kohodowla mikroprzepływowa zdrowych nerek i nabłonka guza w celu modelowania progresji raka nerki

W tym miejscu opisujemy protokoły uzyskiwania pierwotnych kultur ludzkich komórek nabłonka kanalików nerkowych (HRTEC) z kory nerkowej w celu opracowania monowarstwowych i trójwymiarowych kultur na macierzy zewnątrzkomórkowej (3D-HRTEC).

Rozwój hodowli pierwotnych komórek nabłonka ludzkich kanalików nerkowych w warunkach jednowarstwowych i trójwymiarowych

Przedstawiamy zoptymalizowany protokół przetwarzania całych ludzkich nerek w celu izolacji i hodowli pierwotnych komórek nabłonkowych kanałów proksymalnych nerek oraz zastosowanie tych komórek w trójwymiarowej, mikrofluidycznej, mikrofizjologicznej platformie do ponownego odtworzenia kanału proksymalnego nerk.

Izolacja pierwotnych komórek nabłonka nabłonka proksymalnego ludzkiego i ich zastosowanie w tworzeniu mikrofizjologicznego modelu kanału bliższego nerki

Poznaj metodę mikrodysekcji nerek myszy w celu izolacji segmentów kory i rdzenia z zachowaniem architektury nerkowej. Technika ta umożliwia tworzenie innowacyjnych konstruktów tkanek bez rusztowań dla zastosowań w inżynierii tkankowej nerek.

Mikrodysekcja pierwotnych segmentów tkanki nerkowej i włączenie do niej nowatorskiej technologii konstrukcji bez rusztowań

Przeglądaj więcej filmów