Name: Izolacja i hodowla pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z próbek serca dorosłego i płodu ludzkiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Poznaj metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z ludzkiego serca dorosłego i płodu. Technika ta umożliwia badanie zachowania komórek nasierdzia oraz procesu przejścia nabłonkowo-mesenchymalnego w kontekście rozwoju i chorób serca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Te badania są wspierane przez Holenderską Organizację Badań Naukowych (NWO) (VENI 016.146.079) oraz stypendium badawcze LUMC zarówno dla AMS, jak i LUMC Bontius Stichting (MJG).

Wszystkie eksperymenty na próbkach tkanek ludzkich zostały zatwierdzone przez komisję etyki Centrum Medycznego Uniwersytetu w Lejdzie i są zgodne z Deklaracją Helsińską. Wszystkie etapy są wykonywane za pomocą sterylnego sprzętu w komorze przepływowej do hodowli komórkowych.
1. Przygotowania
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę EPDC, mieszając zmodyfikowaną pożywkę Eagle's firmy Dulbecco (DMEM o niskiej zawartości glukozy) i pożywkę 199 (M199) w stosunku 1:1. Dodać 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicę bydlęcą (FBS, inaktywowaną termicznie przez 25 minut w temperaturze 56 °C) i uzupełnić 100 j./ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny. Podgrzej podłoże EPDC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Podgrzej trypsynę 0,25%/EDTA (1:1) w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Pokryj studzienki żelatyną. Dodać 0,1% żelatyny/PBS do każdego dołka i inkubować płytki przez co najmniej 15 minut w temperaturze 37 °C. Wytyczne dotyczące wymaganej płytki do hodowli komórkowej podsumowano w tabeli 1. Ostrożnie usuń cały płyn przed posiewaniem komórek.</li>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy o stężeniu 10 mM SB431542 (SB), rozcieńczony w DMSO (UWAGA). Przygotować 50 μl porcji w polipropylenowych probówkach wirówkowych ze stożkowym dnem, takich jak probówki Eppendorfa, i przechowywać je w temperaturze -20 °C. Należy pamiętać, że podwielokrotności SB można rozmrozić tylko raz.</li>
</ol>
2. Pobieranie i przechowywanie próbek serca dorosłego i płodowego
<ol>
	<li>Dorosłe małżowiny uszne należy przechowywać bezpośrednio po usunięciu podczas operacji w probówce o pojemności 50 ml z 15 ml DMEM o wysokiej zawartości glukozy zawierającej 10% FBS, 100 U/ml penicyliny i 100 mg/ml streptomycyny w temperaturze 4 °C. Próbki mają zwykle wielkość 3 - 5 cm i mogą być przechowywane do 48 godzin po sekcji.</li>
	<li>Serca płodów uzyskane z materiału poronnego należy przechowywać w pożywce EPDC w temperaturze 4 °C do 24 godzin po izolacji. W tym protokole należy użyć próbek w wieku ciążowym od 12 do 22 tygodni. Należy pamiętać, że całe serce może być użyte do izolacji nasierdzia.</li>
</ol>
3. Izolacja warstwy nasierdziowej
<ol>
	<li>W komorze z przepływem laminarnym przygotować 100-milimetrowe naczynie do hodowli komórkowych z PBS i umieścić oddzielną kroplę (~200 μL) PBS w pokrywce. Napełnij probówkę o pojemności 15 ml wstępnie podgrzanym podłożem EPDC o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Umieść tkankę w naczyniu do hodowli komórkowych wypełnionym PBS. Upewnij się, że tkanka jest często nawilżana podczas zabiegu.</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu stereoskopowego usuń jak najwięcej warstwy nasierdzia z próbki tkanki, odklejając ją za pomocą kleszczy. 
	Uwaga: Nasierdzie można rozpoznać jako bardzo cienką, przezroczystą warstwę ściśle przylegającą do zewnętrznej części serca (<silna klasa="xfig">Ryc. 1A). Staraj się unikać zanieczyszczenia tkanką tłuszczową i naczyniami krwionośnymi nasierdzia, ponieważ utrudni to izolację.</li>
	<li>Zbierz kawałki tkanki nasierdzia w kropli PBS na pokrywie.</li>
	<li>Pokrój tkankę nasierdzia na małe kawałki (0,5 mm3) za pomocą skalpela (<silna klasa="xfig">Ryc. 1B) lub używając ostrych końcówek małych kleszczy. Zwróć uwagę, że kawałki powinny być w stanie przejść przez końcówkę pipety P1,000 (krok 3.6).</li>
	<li>Dodaj 1 ml trypsyny do tkanki nasierdzia i zbierz kawałki oraz trypsynę za pomocą końcówki do pipety P1,000. Przenieś tkankę do stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 1C).</li>
	<li>Inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 10 minut, wstrząsając z prędkością ~60 obr./min.</li>
	<li>Wyjmij rurkę z łaźni wodnej i wyczyść zewnętrzną część rurki 70% etanolem.</li>
	<li>Pozwól, aby tkanka opadła na dno probówki (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D) i ostrożnie przenieś supernatant zawierający komórki nasierdzia do 15-mililitrowej probówki zawierającej 5 ml pożywki EPDC, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Uzupełnij pozostałą tkankę w stożkowej probówce wirówkowej 1 ml trypsyny i wymieszaj, delikatnie pipetując w górę i w dół.</li>
	<li>Powtórz kroki od 3.7 do 3.10 dwa razy. Na ostatnim etapie, po łącznie 30 minutach inkubacji trypsyny, przenieś zarówno supernatant, jak i pozostałą tkankę nasierdzia do probówki zawierającej podłoże EPDC.</li>
	<li>Gdy wszystkie komórki zostaną zebrane w pożywce EPDC, delikatnie przepuść zawiesinę przez 10-mililitrową strzykawkę z igłą o rozmiarze 19 do nowej probówki o rozmiarze 15 ml, aby mechanicznie zdysocjować komórki (<silna klasa="xfig">Rysunek 1E). 
	Uwaga: Upewnij się, że zawiesina jest homogenizowana przez pipetowanie w górę i w dół przed przepuszczeniem roztworu przez igłę, aby zapobiec zatkaniu igły.</li>
	<li>Aby dalej dysocjować komórki, powtórz krok 3.12 z igłą o rozmiarze 21.</li>
	<li>Umieść sitko do komórek o wielkości 100 μm na probówce o pojemności 50 ml i przenieś pożywkę zawierającą komórki nasierdzia na sitko za pomocą pipety o pojemności 10 ml, aby usunąć wszystkie pozostałe grudki (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1F).</li>
	<li>Umyj sitko, aby zebrać resztki komórek, pipetując 5 ml pożywki EPDC na sitko.</li>
	<li>Odpipetować zawiesinę komórek z probówki o pojemności 50 ml do probówki o pojemności 15 ml. Ponieważ komórki opadają na dno probówki, przed pipetowaniem delikatnie wstrząsnąć roztworem. 
	Uwaga: Chociaż ten krok nie jest konieczny, mniejsza rurka pomaga w wizualizacji osadu po odwirowaniu.</li>
	<li>Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1G).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórek (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1H) w wymaganej objętości podłoża EPDC (Tabela 1). 
	Uwaga: W przypadku płodowych EPDC należy bezpośrednio użyć pożywki EPDC zawierającej 10 μM inhibitora kinazy ALK5 (EPDC+SB). Dorosłe komórki można posiać bez SB podczas pierwszego pasażu.</li>
	<li>Zawiesinę komórkową należy umieścić na płytkach hodowlanych pokrytych żelatyną (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1I). Wielkość studzienki zależy od wielkości próbki tkanki nasierdzia (tabela 1). Należy pamiętać, że niska konfluencja wywoła wystąpienie EMT.</li>
	<li>Umieścić komórki w inkubatorze na co najmniej 48 godzin w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aby umożliwić komórki przyczepieniu się do płytki hodowlanej.</li>
</ol>
4. Kultura EPDC
<ol>
	<li>Uzupełniaj pożywkę EPDC+SB co najmniej co 3 dni.</li>
	<li>Sprawdzaj komórki co najmniej co 3 dni za pomocą mikroskopu. Gdy komórki osiągną zbieg, tj. gdy płytka hodowlana jest całkowicie pokryta komórkami, należy przepuścić komórki w stosunku powierzchniowym 1:2. Należy pamiętać, że osiągnięcie konfluencji może zająć ~5 - 10 dni.
	<ol>
		<li>Zassać pożywkę za pomocą pipety lub systemu aspiracyjnego z, np. szklaną pipetą.</li>
		<li>Ostrożnie umyj komórki, dodając do nich PBS. Delikatnie zakręć płytką i zassaj PBS.</li>
		<li>Dodaj trypsynę do talerza. Delikatnie obrócić płytkę, aby pokryć wszystkie komórki trypsyną i inkubować płytkę przez 1 minutę w temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Użyj jak najmniejszej ilości trypsyny (wskazanie: 200 μL na dołek płytki 6-dołkowej)</li>
		<li>Postukaj w płytkę, aby mechanicznie odłączyć komórki od spodu płytki. Użyj mikroskopu, aby wizualnie sprawdzić, czy komórki się odłączyły. Jeśli nie, inkubuj płytkę do hodowli komórkowej przez dodatkową minutę.</li>
		<li>Dodać wymaganą objętość pożywki EPDC+SB do komórek, ponownie zawiesić przez pipetowanie w górę iw dół, a następnie przenieść zawiesinę komórek na nową płytkę hodowlaną pokrytą żelatyną. 
		UWAGA: Ogólnie rzecz biorąc, komórki mogą być utrzymywane w morfologii brukowej do przejścia 8.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Indukcja EMT w EPDC
<ol>
	<li>Aby indukować EMT, należy zdysocjować komórki trypsyną i przenieść komórki do nowych studzienek pokrytych żelatyną w stosunku powierzchniowym 1:2 w pożywce EPDC+SB, jak opisano w 4, i inkubować przez co najmniej 24 godziny w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Sprawdź, czy zbieg wynosi 50 - 70% i czy EPDC mają morfologię kostki brukowej. 
	UWAGA: Konfluencja wpływa na zdolność EPDC do poddania się EMT.</li>
	<li>Odessać pożywkę z komórek i dokładnie przemyć komórki PBS (patrz kroki 4.2.1 - 4.2.2).</li>
	<li>Stymulować komórki 1 ng/ml TGFβ3 w pożywce EPDC i umieszczać je w inkubatorze w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 5 dni. Należy pamiętać, że podczas stymulacji podłoże EPDC zawierające TGFβ3 nie musi być uzupełniane.</li>
	<li>Monitoruj komórki codziennie. Po 5 dniach komórki, które przeszły EMT, są rozpoznawane na podstawie morfologii w kształcie wrzeciona (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2A).</li>
	<li>Hodowla wrzecionowatych EPDC zgodnie z metodą opisaną w pkt 4 bez dodawania SB lub TGFβ do pożywki EPDC. Należy pamiętać, że ogólnie rzecz biorąc, wrzecionowate EPDC mogą być hodowane do pasażu 20.</li>
	<li>Zweryfikuj występowanie EMT za pomocą barwienia immunofluorescencyjnego przy użyciu przeciwciał przeciwko mezenchymalnym markerom αSMA lub wimentynie lub falloidynie w celu wykrycia tworzenia włókien stresowych F-aktyny (<silna klasa = "xfig" >Figura 2B) lub za pomocą qRT-PCR dla genów związanych z EMT (np. WT1, Periostin, Col1A1, αSMA, N-Kadheryna, MMP3, Ślimak, Ślimak) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C i Tabela 2).</li>
</ol>

<ol><li>Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+a+source+of+multipotent+adult+cardiac+progenitor+cells%3A+Their+origin%2C+role+and+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacological+research%22%5BJournal%5D)">The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate.</a> Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).</li>
<li>Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+human+embryonic+and+foetal+epicardium+during+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development.</a> Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).</li>
<li>Zhou, B., Ma, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+progenitors+contribute+to+the+cardiomyocyte+lineage+in+the+developing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart.</a> Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).</li>
<li>Smits, A., Riley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-Derived+Heart+Repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-Derived Heart Repair.</a> Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).</li>
<li>Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Induction+of+Fetal+Cardiomyocyte+Proliferation+via+a+Retinoic+Acid-Inducible+Trophic+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor.</a> Developmental Biology. 250 (1), 198-207 (2002).</li>
<li>Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium+is+required+for+the+full+rate+of+myocyte+proliferation+and+levels+of+expression+of+myocyte+mitogenic+factors+FGF2+and+its+receptor%2C+FGFR-1%2C+but+not+for+transmural+myocardial+patterning+in+the+embryonic+chick+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart.</a> Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).</li>
<li>Lavine, K. J., Yu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocardial+and+epicardial+derived+FGF+signals+regulate+myocardial+proliferation+and+differentiation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo.</a> Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).</li>
<li>Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+and+retinoic+acid%2C+secreted+from+the+epicardium%2C+are+required+for+cardiac+myocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation.</a> Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).</li>
<li>Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+analyses+of+the+function+of+the+proepicardium+using+a+new+microsurgical+procedure+to+induce+loss-of-proepicardial-function+in+chick+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos.</a> Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).</li>
<li>Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardium-derived+cells+enhance+proliferation%2C+cellular+maturation+and+alignment+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).</li>
<li>Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coronary+Artery+and+Orifice+Development+Is+Associated+With+Proper+Timing+of+Epicardial+Outgrowth+and+Correlated+Fas+Ligand+Associated+Apoptosis+Patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns.</a> Circulation Research. 96 (5), (2005).</li>
<li>Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epicardium+as+modulator+of+the+cardiac+autonomic+response+during+early+development%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).</li>
<li>van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+regeneration+from+activated+epicardium%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Cardiac regeneration from activated epicardium.</a> PloS one. 7 (9), e44692(2012).</li>
<li>Zhou, B., Honor, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+epicardium+modulates+myocardial+injury+by+secreting+paracrine+factors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+clinical+investigation%22%5BJournal%5D)">Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors.</a> The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).</li>
<li>Smart, N., Bollini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+cardiomyocytes+from+within+the+activated+adult+heart+after+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury.</a> Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).</li>
<li>Zangi, L., Lui, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modified+mRNA+directs+the+fate+of+heart+progenitor+cells+and+induces+vascular+regeneration+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction.</a> Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).</li>
<li>Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+and+adult+epicardial-derived+cells%3A+a+novel+model+to+study+their+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation.</a> Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).</li>
<li>Clunie-O'Connor, C., Smits, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Derivation+of+Primary+Human+Epicardium-Derived+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).</li>
<li>Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epicardial+Cells+of+Human+Adults+Can+Undergo+an+Epithelial-to-+Mesenchymal+Transition+and+Obtain+Characteristics+of+Smooth+Muscle+Cells+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro.</a> Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).</li>
<li>Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+epithelial-to-mesenchymal+transformation+in+human+adult+epicardial+cells+is+regulated+by+TGF%CE%B2-signaling+and+WT1%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+research+in+cardiology%22%5BJournal%5D)">In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1.</a> Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).</li>
<li>Chechi, K., Richard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermogenic+potential+and+physiological+relevance+of+human+epicardial+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity+Supplements%22%5BJournal%5D)">Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue.</a> International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Tutaj opisujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z ludzkich serc dorosłych i płodów. Obszerna charakterystyka tych komórek została wcześniej opublikowana17. Wykazaliśmy, że oba typy komórek mogą być utrzymywane jako nabłonkowe komórki przypominające bruk, gdy są hodowane z inhibitorem kinazy ALK5 SB431542. EMT jest integralną częścią aktywacji nasierdzia in vivo zarówno podczas rozwoju, jak i odpowiedzi po urazie. EMT można badać za pomoc...

Nasierdzie, jednokomórkowa warstwa nabłonkowa otaczająca serce, ma kluczowe znaczenie dla rozwoju i naprawy serca (recenzowane w Smits et al.1). Rozwojowo, nasierdzie powstaje z narządu przesierdziowego, małej struktury znajdującej się u podstawy rozwijającego się serca. Około dnia rozwojowego E9.5 u myszy i 4 tygodnie po zapłodnieniu u człowieka, komórki zaczynają migrować z tej struktury kalafiora i pokrywają rozwijający się mięsień sercowy2. Po utworzeniu pojedynczej warstwy komórek nabłonka część komórek nasierdzia ulega przejściu nabłonkowo-mezenchymalnym (EMT). Podczas EMT komórki tracą swoje cechy nabłonkowe, takie jak zrosty komórka-komórka, i uzyskują fenotyp mezenchymalny, który daje im zdolność do migracji do rozwijającego się mięśnia sercowego. Uformowane komórki pochodne nasierdzia (EPDC) mogą różnicować się w kilka typów komórek serca, w tym fibroblasty, komórki mięśni gładkich i potencjalnie kardiomiocyty i komórki śródbłonka3, chociaż różnicowanie dwóch ostatnich populacji komórek pozostaje przedmiotem debaty (przegląd w Smits et al.4). Ponadto, epicardium dostarcza instruktażowe sygnały parakrynne do mięśnia sercowego, aby regulować jego wzrost i unaczynienie5,6,7,8. Liczne badania wykazały, że upośledzone tworzenie nasierdzia prowadzi do wad rozwojowych mięśnia sercowego9,10, vasculature11, and conduction system12, podkreślając istotny wkład nasierdzia w tworzenie serca.
Chociaż w sercu dorosłego nasierdzia występuje jako warstwa uśpiona, ulega reaktywacji po niedokrwieniu13. Reaktywacja nasierdzia po urazie podsumowuje kilka procesów opisanych dla rozwoju serca, w tym proliferację i EMT14, choć mniej skutecznie. Co ciekawe, chociaż dokładny mechanizm nie jest w pełni zrozumiały, wkład nasierdzia w naprawę można poprawić poprzez leczenie np. tymozyną β415 lub zmodyfikowanym mRNA16, co skutkuje poprawą funkcji serca po zawale mięśnia sercowego. Nasierdzie jest zatem uważane za interesujące źródło komórek wspomagające endogenną naprawę uszkodzonego serca.
Mechanizmy rozwoju serca są często rekapitulowane podczas urazu, choć w mniej efektywny sposób. W poszukiwaniu aktywatorów nasierdzia niezwykle ważne jest, abyśmy mogli określić i porównać pełną pojemność nasierdzia płodu i dorosłego osobnika. Ponadto z terapeutycznego punktu widzenia ważne jest, abyśmy oprócz doświadczeń na zwierzętach poszerzali wiedzę dotyczącą odpowiedzi ludzkiego nasierdzia. W tym miejscu opisujemy metodę izolowania i hodowli komórek pochodzących z nasierdzia ludzkiego dorosłego i płodu (EPDC) w morfologii podobnej do komórek nabłonkowych oraz indukowania EMT. Dzięki temu modelowi staramy się zbadać i porównać zachowanie dorosłych i płodowych komórek nasierdziowych.
Główną zaletą tego protokołu jest użycie ludzkiego materiału nasierdziowego, który nie został dokładnie zbadany. Co ważne, opisany protokół izolacji i hodowli komórkowej zapewnia jedną, jednolitą metodę uzyskiwania EPDC zarówno płodu, jak i dorosłego bruku, umożliwiając bezpośrednie porównanie tych dwóch źródeł komórek. Dodatkowo, ponieważ nasierdzie jest izolowane na podstawie jego lokalizacji, zapewnia się, że komórki są faktycznie wyprowadzone nasierdziowo17.
Chociaż metody izolacji ludzkiego EPDC zostały już wcześniej ustalone, opierają się one głównie na protokołach przerastania, gdzie fragmenty tkanki sercowej lub nasierdziowej są umieszczane na szalce do hodowli komórek18,19. Podejście to selekcjonuje zatem specyficznie komórki, które częściowo tracą fenotyp nabłonka w celu migracji i które są bardziej podatne na spontaniczne EMT. W obecnym protokole nasierdzie jest najpierw przetwarzane na roztwór jednokomórkowy, który pozwala izolowanym EPDC utrzymać stan nabłonka. Metoda ta zapewnia zatem solidny model in vitro do badania EMT nasierdzia.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s zmodyfikowany Orzeł" s medium + GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>21885-025</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>31150-022</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25%</td><td>Invitrogen</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa penicyliny G</td><td>Roth</td><td>HP48</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan streptomycyny</td><td>Roth</td><td>HP66</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 1:250 z trzustki bydlęcej</td><td>Serva</td><td>37289</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Żelatyna ze skóry świni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane 6 dołków</td><td>Greiner bio-one</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane 12 dołków</td><td>Corning</td><td>3512</td><td></td></tr><tr><td>Płytki hodowlane 24 dołki</td><td>Greiner bio-one</td><td>662160</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102931</td><td></td></tr><tr><td>100-1000&mikro; L Filtrowane końcówki do pipet</td><td>Corning</td><td>4809</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Pibuła</td><td>Greiner bio-one</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Pibuła 5 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 100/20 mm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010056</td><td>Lub domowe i sterylizowane</td></tr><tr><td>probówki Eppendorf 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>0030120086</tr><tr><td>Probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Greiner bio-one</td><td>188271</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe</td><td>Greiner bio-one</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>10 ml</td> Igły do <td>305959</td><td></td><td>Becton Dickinson</td></tr><tr><td>19 Gauge</td><td>Becton Dickinson</td><td>301700</td><td></td></tr><tr><td>Igły o rozmiarze 21</td><td>Becton Dickinson</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>Sita siatkowe EASY, 100 i mikro; m</td><td>Greiner bio-one</td><td>542000</td><td></td></tr><tr><td>TGF&beta; 3&nbsp;</td><td>R& D systems</td><td>243-B3</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonalna antyaktyna, &alpha;-Smooth Muscle Sigma</td><td></td><td>A2547&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse Alexa Fluor 555</td><td>Invitrogen</td><td>A31570</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze </td></tr><tr><td>Pipet P1,000</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipet</td><td>Integra</td><td>155 015</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop światła odwróconego</td><td>Wirówka Olympus</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Kąpiel wodna</td><td>GFL</td><td>1083</td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja i hodowla pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z próbek serca dorosłego i płodu ludzkiego

The Isolation and Culture of Primary Epicardial Cells Derived from Human Adult and Fetal Heart Specimens

Nasierdzie, warstwa komórek nabłonkowych pokrywająca mięsień sercowy, odgrywa istotną rolę podczas rozwoju serca, jak również w odpowiedzi naprawczej serca po urazie niedokrwiennym. Po aktywacji komórki nasierdzia przechodzą proces znany jako przejście nabłonkowe do mezenchymalnego (EMT), aby dostarczyć komórki do regenerującego się mięśnia sercowego. Ponadto nasierdzie przyczynia się do wydzielania niezbędnych czynników parakrynnych. Aby w pełni docenić potencjał regeneracyjny nasierdzia, potrzebny jest model komórki ludzkiej. W tym miejscu przedstawiamy nowy model hodowli komórkowej w celu uzyskania pierwotnych komórek pochodnych nasierdzia (EPDC) z tkanki serca ludzkiego dorosłego i płodu. Aby wyizolować EPDC, nasierdzie jest wycinane z zewnątrz próbki serca i przetwarzane na zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie EPDC są siane i hodowane w pożywce EPDC zawierającej inhibitor kinazy 5 ALK SB431542 w celu utrzymania ich fenotypu nabłonkowego. EMT jest indukowany przez stymulację TGFβ. Metoda ta po raz pierwszy umożliwia badanie procesu EMT w ludzkim nasierdziu w kontrolowanych warunkach i ułatwia uzyskanie lepszego wglądu w sekretom EPDC, które mogą wspomagać regenerację serca. Co więcej, to jednolite podejście pozwala na bezpośrednie porównanie zachowań nasierdziowych u dorosłych i płodów.

W niniejszej pracy przedstawiamy prosty protokół izolacji EPDCs z tkanki serca dorosłego człowieka oraz płodu (Ryc. 1). Protokół ten wykorzystuje łatwo dostępną lokalizację epikardium na zewnętrznej powierzchni serca (Ryc. 1A). Barwienie uszka serca po sekcji wykazuje, że epikardium WT1+ zostaje usunięte, podczas gdy leżąca pod nim podepikardialna macierz zewnątrzkomórkowa i tkanka mięśnia sercowego pozostają nienaruszone (<stron...

Nasierdzie odgrywa kluczową rolę w rozwoju i naprawie serca, dostarczając komórek i czynników wzrostu do ściany mięśnia sercowego. W tym miejscu opisujemy metodę hodowli ludzkich pierwotnych komórek nasierdziowych, która umożliwia badanie i porównanie ich cech rozwojowych i dorosłych.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z próbek serca dorosłego i płodu ludzkiego

The epicardium, an epithelial cell layer covering the myocardium, has an essential role during cardiac development, as well as in the repair response of ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie i hodowla ludzkich komórek pochodzących z nasierdzia w celu zbadania zachowania komórek nasierdzia. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań kardiologicznych, takie jak to, w jaki sposób nasierdzie jest aktywowane podczas rozwoju i choroby serca. Główną zaletą tej techniki jest to, że można ją zastosować do próbek ludzkich tkanek serca, co może pomóc w przeniesieniu wyników do warunków klinicznych.Nasz protokół opisuje badanie przejścia nabłonkowego do mezenchymalnego komórek pochodzących z nasierdzia. Jednak może być również stosowany do badania proliferacji lub wydzielania czynników. Na początek napełnij 100-milimetrowe naczynie do hodowli komórkowych PBS w komorze o przepływie laminarnym.Umieść około 200 mikrolitrów PBS w pokrywce, a następnie dodaj 5 mililitrów wstępnie podgrzanego podłoża EPDC do 15-mililitrowej probówki. Umieść tkankę serca, wyizolowaną z serca dorosłego człowieka, w naczyniu. Pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczy, aby ostrożnie usunąć warstwę nasierdziową.Następnie zbierz kawałki tkanki nasierdzia w pokrywie i za pomocą skalpela pokrój je na 0,5 milimetra sześciennego. Dodaj

the-isolation-culture-primary-epicardial-cells-derived-from-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym protokole zidentyfikowaliśmy nową populację komórek melanocytopodobnych (znanych również jako melanocyty serca) w sercach myszy i ludzi, które przyczyniają się do wyzwalania arytmii przedsionkowej u...

Izolowanie pierwotnych komórek melanocytopodobnych z serca myszy

Pierwotna hodowla komórkowa jest użyteczną techniką do analizy określonych populacji komórek, szczególnie z transgenicznych zarodków myszy w określonych stadiach rozwoju. W tym przypadku komory embrionalne są preparowane i dysocjowane, a kulki sprzężone z przeciwciałami rozpoznają i oddzielają komórki śródbłonka do dalszej analizy.

Izolacja embrionalnych komórek śródbłonka komór

Obecna wiedza na temat komórkowych podstaw chorób serca opiera się głównie na badaniach na modelach zwierzęcych. W tym miejscu opisujemy i walidujemy nowatorską metodę uzyskiwania pojedynczych żywotnych kardiomiocytów z małych próbek chirurgicznych ludzkiego mięśnia sercowego komorowego. Ludzkie miocyty komorowe mogą być wykorzystywane do badań elektrofizjologicznych i testów leków.

Izolacja i charakterystyka funkcjonalna ludzkich kardiomiocytów komorowych ze świeżych próbek chirurgicznych

Tutaj opisujemy metody izolowania pierwotnych komórek nasierdziowych myszy za pomocą testu hodowli outgrowth i oceny funkcjonalnej migracji komórek pochodzących z nasierdzia (EPDC) za pomocą systemu hodowli serca ex vivo. Protokoły te są odpowiednie do identyfikacji genetycznych i chemicznych modulatorów przejścia nabłonka nasierdzia do mezenchymalnego (EMT) i ruchliwości.

Test hodowli wzrostu nasierdzia i ocena ex vivo migracji komórek pochodzących z nasierdzia

Nasierdzie jest niezbędnym źródłem multipotencjalnych komórek progenitorowych układu sercowo-naczyniowego i czynników parakrynnych, które są niezbędne do rozwoju i regeneracji układu sercowo-naczyniowego. Opisujemy tutaj metodę hodowli embrionalnych komórek nasierdziowych myszy.

In vitro Hodowla komórek nasierdzia z zarodka serca myszy

Ludzka tkanka serca zawiera multipotencjalne okołonaczyniowe populacje komórek prekursorowych, które mogą być odpowiednie do regeneracji mięśnia sercowego. Opisana technika pozwala na jednoczesną izolację i oczyszczenie dwóch multipotencjalnych populacji komórek zrębu związanych z natywnymi naczyniami krwionośnymi, tj. perycytów CD146+CD34- i komórek przybyszowych CD34+CD146-, z ludzkiego mięśnia sercowego.

Izolacja okołonaczyniowych multipotencjalnych populacji komórek prekursorowych z ludzkiej tkanki serca

Kilka protokołów zostało opracowanych i opisanych do izolacji różnych typów komórek serca z serca szczura. W tym miejscu opisano zoptymalizowany protokół, który pozwala na izolację wysokiej jakości głównych typów komórek serca (kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów) z jednego preparatu, zmniejszając koszty eksperymentu.

Jednoczesna izolacja wysokiej jakości kardiomiocytów, komórek śródbłonka i fibroblastów z serca dorosłego szczura

Celem tej pracy jest opracowanie metody powtarzalnego izolowania kardiomiocytów od serca dorosłego człowieka oraz mierzenia zawartości DNA i zarodkowania.

Izolacja kardiomiocytów ze stałych serc do analizy immunocytochemicznej i ploidalnej

Przedstawiamy protokół izolacji komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z serc szczurów poprzez sekwencyjne trawienie tkanek w buforze trawiennym, pobieranie komórek z powtarzających się cykli wirowania i oczyszczanie komórek za pomocą mikrogranulek anty-szczurzych CD31.

Izolacja komórek śródbłonka wsierdzia i naczyń wieńcowych z wolnej ściany komory serca szczura

Prezentowany jest protokół izolacji ludzkich i zwierzęcych kardiomiocytów komorowych z wyciętych wibratomem plastrów mięśnia sercowego. Wysoką wydajność komórek tolerujących wapń (do 200 komórek/mg) można uzyskać z niewielkich ilości tkanek (&lt;50 mg). Protokół ma zastosowanie do mięśnia sercowego narażonego na zimne niedokrwienie przez okres do 36 godzin.

Izolacja ludzkich kardiomiocytów komorowych z plastrów mięśnia sercowego wycinanych wibratomem

Opisano metodę jednoczesnej izolacji miocytów i nie-miocytów zarówno z przedsionków, jak i komór serca pojedynczej dorosłej myszy. Protokół ten zapewnia stałą wydajność wysoce żywotnych miocytów serca i niemiocytów oraz szczegółowo opisuje optymalne warunki hodowli specyficzne dla komórek do fenotypowania i analizy in vitro.

Jednoczesna izolacja i hodowla miocytów przedsionkowych, miocytów komorowych i niemiocytów z serca dorosłej myszy

Poznaj metodę izolacji i hodowli pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z ludzkiego serca dorosłego i płodu. Technika ta umożliwia badanie zachowania komórek nasierdzia oraz procesu przejścia nabłonkowo-mesenchymalnego w kontekście rozwoju i chorób serca.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek nasierdzia pochodzących z próbek serca dorosłego i płodu ludzkiego

Przeglądaj więcej filmów