Name: Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 55 s
Description: Poznaj metodę pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach przepuszczalnych tułowi Drosophila przy użyciu wysokorozdzielczej respirometrii. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki i dostarcza wyników o wysokiej wartości fizjologicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

To badanie zostało sfinansowane z grantów National Sciences and Engineering Research Council (NSERC, grant na odkrycie) oraz Université de Moncton dla NP. LHB pragnie podziękować za wsparcie finansowe ze strony Kanadyjskiego Instytutu Badań nad Zdrowiem (CIHR), New Brunswick Innovation Foundation (NBIF) i Université de Moncton. Prace EHC są wspierane przez Alzheimer Society of Canada, Brain Canada, NSERC, Canadian Breast Cancer Foundation, New Brunswick Innovation Foundation, New Brunswick Health Research Foundation oraz Université de Moncton.

1. Przygotowanie odczynników
<ol>
	<li>Przygotuj następujące roztwory do wypreparowania i przepuszczalności tkanki.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór konserwujący: 2,77 mM CaK2EGTA, 7,23 mM K2EGTA, 5,77 mM Na2ATP, 6,56 mM MgCl2, 20 mM tauryna, 15 mM Na2fosfokreatyna, 20 mM imidazol, 0,5 mM ditiotreitol i 50 mM K-MES, pH 7,1 (można przechowywać w temperaturze -20 °C).</li>
		<li>Przygotuj roztwór saponin: 5 mg saponiny w 1 ml roztworu konserwującego (codziennie przygotuj świeży).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj następujące roztwory do pomiaru oddechu.
	<ol>
		<li>Przygotować medium oddechowe: 120 mM KCl, 5 mM KH2PO4, 3 mM HEPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2 i 0,2% BSA (w/v), pH 7,2.</li>
		<li>Przygotować podłoża, rozłączacz, inhibitory. Rozpuścić wszystkie substraty wH2Oi rozpuścić rozprzęgacz FCCP, jak również inhibitory w absolutnym etanolu (z wyjątkiem malonianu, który rozcieńcza się wH2O). Zneutralizować większość substratów, a także malonian (patrz Tabela Materiałów). Wszystkie stężenia podane w protokole są stężeniami końcowymi w komorach o pojemności 2 ml.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie i kalibracja respirometru o wysokiej rozdzielczości.
<ol>
	<li>Umyj komory, nasadki i korki respirometru trzykrotnie 70% etanolem i trzykrotnie wodą destylowaną.</li>
	<li>Kalibracja przy zerowym stężeniu tlenu: odmierzyć pipetę 2,3 ml pożywki oddechowej do komór i dodać 10 mg ditionitianu sodu. Chociaż maksymalna objętość komory wynosi 2 ml, dodaje się 2,3 ml, aby zapewnić, że żaden pęcherzyk powietrza nie pozostanie pod korkiem podczas zamykania komór. Zamknij komory korkami i mierz stężenie tlenu przez 10-20 min. Skalibruj elektrody przy zerowym stężeniu tlenu z wynikowym wskaźnikiem zużycia tlenu.</li>
	<li>Umyć komory wodą destylowaną, inkubować w etanolu absolutnym przez 10 minut, a następnie spłukać wodą destylowaną.</li>
	<li>Kalibracja przy nasyceniu powietrzem: odpipetować 2,3 ml medium oddechowego do komór, włożyć korki, zassać nadmiar medium na górze korków, a następnie podnieść korki z przekładką. Nadmiar pożywki oddechowej jest pipetowany do komór (łącznie objętość 2 ml), aby uniknąć obecności pęcherzyków powietrza po zamknięciu komór.</li>
	<li>Monitorować zużycie tlenu przez 45 minut do godziny, aż stężenie tlenu (niebieski ślad) ustabilizuje się około 250 nM w temperaturze 24 °C.</li>
</ol>
3. Sekcja much i przepuszczalność tkanek
<ol>
	<li>Upewnij się, że wszystkie kroki są wykonywane na lodzie.</li>
	<li>Znieczulić sześć samców much tego samego szczepu, w tym samym wieku i hodowanych na tej samej diecie na lodzie, aby ułatwić sekcję much (typ dziki w1118, 15-dniowy, karmiony pożywką z mąki kukurydzianej).</li>
	<li>Za pomocą skalpela i kleszczy z cienką końcówką rozetnij muchy (usuń głowy i brzuchy), aby zachować tylko klatkę piersiową zawierającą mięśnie lotu. Ten krok można wykonać gołym okiem. Z powstałymi klatkami piersiowymi należy obchodzić się za pomocą kleszczy z cienką końcówką.</li>
	<li>Przenieść trzy wypreparowane klatki piersiowe na szalkę Petriego o średnicy 25 mm zawierającą 2 ml lodowatego roztworu konserwującego za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką mechanicznie przepuszczalność klatki piersiowej poprzez włożenie końcówki kleszczy do klatki piersiowej i wielokrotnie rozerwać tkankę, aby uzyskać luźno połączoną sieć.</li>
	<li>W 24-dołkowej płytce napełnij dwie studzienki 12,5 μl roztworu saponin i 1 ml roztworu konserwującego, aby uzyskać końcowe stężenie 62,5 μg/ml saponiny. Napełnij dwie sąsiednie studzienki 1 ml medium oddechowego.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków z cienką końcówką przenieś trzy przepuszczalne klatki piersiowej do rozcieńczonego roztworu saponin i inkubuj z łagodnym mieszaniem na wytrząsarce orbitalnej, na lodzie, przez 20 minut.</li>
	<li>Po tej ostatniej inkubacji przenieść włókna do sąsiednich studzienek wypełnionych pożywką oddechową z łagodnym mieszaniem, na lodzie, przez 5 minut, aby spłukać saponinę.</li>
</ol>
4. Oznaczanie suchej masy
<ol>
	<li>Osusz przepuszczalne klatki piersiowej na chłonnej powierzchni i odwróć 3-4 razy za pomocą kleszczy z cienką końcówką, aby upewnić się, że cała wilgoć została usunięta.</li>
	<li>Zważ trzy klatki piersiowe razem na mikrowadze. Zwróć uwagę na uzyskaną masę, ponieważ zostanie ona wykorzystana do normalizacji wskaźników zużycia tlenu w mitochondriach.</li>
	<li>Natychmiast przenieść tkanki w kropli pożywki oddechowej na lód.</li>
</ol>
5. Określanie wskaźników zużycia tlenu
<ol>
	<li>Otworzyć komory respirometru (usunąć korki) i dodać 10 mM pirogronianu i 2 mM jabłczanu do każdej komory.</li>
	<li>Przepuszczalne tkanki należy wprowadzić bezpośrednio do komór wypełnionych medium oddechowym.</li>
	<li>Wymień korki za pomocą podkładki dystansowej.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 60 ml należy pobrać tlen bezpośrednio ze zbiornika tlenu i wstrzyknąć 2-5 ml tlenu przez kapilarnę korka każdej komory, aby upewnić się, że dyfuzja tlenu przez tkankę nie ograniczy zużycia tlenu.</li>
	<li>Włóż strzykawkę Hamiltona do kapilary każdego korka, aby upewnić się, że klatki piersiowe pozostały w komorze.</li>
	<li>Całkowicie zamknij komory, gdy stężenie tlenu wynosi około 400 nM, osiągając poziom tlenu powyżej nasycenia powietrzem (około 160% nasycenia powietrzem) wewnątrz komór.</li>
	<li>Zatrzymaj i uruchom ponownie mieszadła, aby sprawdzić, czy w komorach nie ma pęcherzyków powietrza.</li>
	<li>Wprowadź masę tkanki zważonej wcześniej, aby znormalizować częstość oddechów przez masę tkanki (mg), wyświetlając masowo specyficzne zużycie tlenu (pmol O2 zużyte s-1.mg-1 tkanki).</li>
	<li>Po ustabilizowaniu zużycia tlenu (czerwony ślad) dodać 5 mM ADP za pomocą strzykawki Hamiltona.</li>
	<li>Po każdym wstrzyknięciu należy przepłukać strzykawki wodą destylowaną, 70% etanolem i ponownie wodą destylowaną.</li>
	<li>Gdy zużycie tlenu ponownie się ustabilizuje, wstrzyknij 5 μl 4 mM cytochromu c.</li>
	<li>Przejdź do sekwencyjnych wstrzyknięć następujących substratów, aby ocenić zużycie tlenu w mitochondriach na różnych etapach ETS:
	<ol>
		<li>Dodać 5 μl 2 M proliny.</li>
		<li>Dodać 10 μl 1 M bursztynianu.</li>
		<li>Dodać 30 μl 1 M glicerol-3-fosforanu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wstrzykiwać rozprzęgacz FCCP w sposób miareczkowania w krokach co 0,5-1 μM (2 μl roztworu o stężeniu 1 mM) aż do osiągnięcia optymalnego stężenia, tj. stężenia pozwalającego osiągnąć najwyższe możliwe zużycie tlenu bez hamowania (UWAGA: patrz Tabela materiałów).</li>
	<li>Następujące inhibitory należy wstrzykiwać sekwencyjnie, aby całkowicie zahamować przepływ elektronów w ETS w celu pomiaru resztkowego zużycia tlenu (ROX), tj. reakcji nieoddechowych, takich jak między innymi reakcje oksygenazy:
	<ol>
		<li>Dodać 1 μl 1 mM rotenonu (UWAGA: patrz Tabela Materiałów).</li>
		<li>Dodać 5 μl 2 M malonianu (UWAGA: patrz Tabela Materiałów).</li>
		<li>Dodać 1 μl 5 mM antymycyny A (UWAGA: patrz Tabela Materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodaj kolejno 0,2 mM askorbinianu i 0,5 mM TMPD do komór, zaczynając od askorbinianu, aby zmierzyć zużycie tlenu przez kompleks IV.</li>
	<li>Dodać 20 mM azydku sodu, aby zahamować kompleks dożylny (UWAGA: patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Gdy sygnał się ustabilizuje, otwórz komory za pomocą przekładki, ponownie natlenić komory poprzez wstrzyknięcie 2 ml czystego tlenu i zamknij komory, gdy stężenie wynosi około 250-300 nmol.mL-1.</li>
	<li>Mierz sygnał przez 10-15 minut i obliczaj tło chemiczne, tj. zużycie tlenu w wyniku autooksydacji TMPD.</li>
</ol>
6. Czyszczenie respirometru
<ol>
	<li>Po pomiarach przepłukać komory raz wodą destylowaną i trzykrotnie przepłukać komory w 70% etanolu.</li>
	<li>Inkubować w absolutnym etanolu przez 10 minut w celu dezaktywacji inhibitorów.</li>
	<li>Spłukać trzykrotnie wodą destylowaną, napełnić komory 70% etanolem i wymienić korki i nakrętki do następnego użycia.</li>
</ol>

<ol><li>Stephenson, R., Metcalfe, N. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+a+fly+through+its+history+and+current+use%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+the+Royal+College+of+Physicians+of+Edinburgh%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: a fly through its history and current use.</a> The journal of the Royal College of Physicians of Edinburgh. 43 (1), 70-75 (2013).</li>
<li>Morgan, T. H. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/jez.1400110404/abstract">An attempt to analyze the constitution of the chromosomes on the basis of sex-limited inheritance in Drosophila.</a> Journal of Experimental Zoology. 11 (4), 365-413 (1911).</li>
<li>Dobzhansky, T., Wright, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+Natural+Populations.+V.+Relations+between+Mutation+Rate+and+Accumulation+of+Lethals+in+Populations+of+Drosophila+Pseudoobscura%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genetics of Natural Populations. V. Relations between Mutation Rate and Accumulation of Lethals in Populations of Drosophila Pseudoobscura.</a> Genetics. 26 (1), 23-51 (1941).</li>
<li>Zipursky, S. L., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Neuronal+Cell+Fate%3A+Lessons+from+the+R7+Neuron+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Determination of Neuronal Cell Fate: Lessons from the R7 Neuron of Drosophila.</a> Annual Review of Neuroscience. 17 (1), 373-397 (1994).</li>
<li>Costa, R., Speretta, E., Crowther, D. C., Cardoso, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Testing+the+therapeutic+potential+of+doxycycline+in+a+Drosophila+melanogaster+model+of+Alzheimer+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Testing the therapeutic potential of doxycycline in a Drosophila melanogaster model of Alzheimer disease.</a> The Journal of biological chemistry. 286 (48), 41647-41655 (2011).</li>
<li>Blandini, F., Armentero, M. T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22251459">Animal models of Parkinson's disease.</a> FEBS Journal. 279 (7), 1156-1166 (2012).</li>
<li>Baker, K. D., Thummel, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetic+Larvae+and+Obese+Flies-Emerging+Studies+of+Metabolism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Diabetic Larvae and Obese Flies-Emerging Studies of Metabolism in Drosophila.</a> Cell Metabolism. 6 (4), 257-266 (2007).</li>
<li>Morris, S. N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+diet-induced+insulin+resistance+in+adult+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Basis+of+Disease%22%5BJournal%5D)">Development of diet-induced insulin resistance in adult Drosophila melanogaster.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Basis of Disease. 1822 (8), 1230-1237 (2012).</li>
<li>Abou-Sleiman, P. M., Muqit, M. M. K., Wood, N. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+insights+of+mitochondrial+dysfunction+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expanding insights of mitochondrial dysfunction in Parkinson's disease.</a> Nature Reviews Neuroscience. 7 (3), 207-219 (2006).</li>
<li>McGurk, L., Berson, A., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+an+in+vivo+model+for+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Drosophila as an in vivo model for human neurodegenerative disease.</a> Genetics. 201 (2), 377-402 (2015).</li>
<li>Lin, M. T., Beal, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+oxidative+stress+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases.</a> Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).</li>
<li>Carri, M. T., Valle, C., Bozzo, F., Cozzolino, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+mitochondrial+damage%3A+importance+in+non-SOD1+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and mitochondrial damage: importance in non-SOD1 ALS.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 1-6 (2015).</li>
<li>Balaban, R. S., Nemoto, S., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+oxidants%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, oxidants, and aging.</a> Cell. 120 (4), 483-495 (2005).</li>
<li>Szibor, M., Holtz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Research+in+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial ageing.</a> Basic Research in Cardiology. 98 (4), 210-218 (2003).</li>
<li>Palikaras, K., Lionaki, E., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+mitophagy+and+mitochondrial+biogenesis+during+ageing+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Coordination of mitophagy and mitochondrial biogenesis during ageing in C. elegans.</a> Nature. 521 (7553), 525-528 (2015).</li>
<li>López-Lluch, G., Irusta, P. M., Navas, P., de Cabo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+biogenesis+and+healthy+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial biogenesis and healthy aging.</a> Experimental Gerontology. 43 (9), 813-819 (2008).</li>
<li>Muoio, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inflexibility%3A+When+mitochondrial+indecision+leads+to+metabolic+gridlock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic inflexibility: When mitochondrial indecision leads to metabolic gridlock.</a> Cell. 159 (6), 1253-1262 (2014).</li>
<li>Efeyan, A., Comb, W. C., Sabatini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutrient-sensing+mechanisms+and+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nutrient-sensing mechanisms and pathways.</a> Nature. 517 (7534), 302-310 (2015).</li>
<li>Brown, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+respiration+and+ATP+synthesis+in+mammalian+mitochondria+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Control of respiration and ATP synthesis in mammalian mitochondria and cells.</a> The Biochemical journal. 284 (1), 1-13 (1992).</li>
<li>McDonald, A. E., Pichaud, N., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%26%2334%3BAlternative%26%2334%3B+fuels+contributing+to+mitochondrial+electron+transport%3A+Importance+of+non-classical+pathways+in+the+diversity+of+animal+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Comparative+Biochemistry+and+Physiology+Part+B%3A+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">&#34;Alternative&#34; fuels contributing to mitochondrial electron transport: Importance of non-classical pathways in the diversity of animal metabolism.</a> Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Biochemistry and Molecular Biology. , (2017).</li>
<li>Soares, J. B. R. C., Gaviraghi, A., Oliveira, M. F., Veuthey, J., Zamboni, N., Westermann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Physiology+in+the+Major+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti%3A+Substrate+Preferences+and+Sexual+Differences+Define+Respiratory+Capacity+and+Superoxide+Production%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Physiology in the Major Arbovirus Vector Aedes aegypti: Substrate Preferences and Sexual Differences Define Respiratory Capacity and Superoxide Production.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120600(2015).</li>
<li>Newell, C., Kane, C. L., Kane, D. A. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/phen.12127/abstract">Mitochondrial substrate specificity in beetle flight muscle: assessing respiratory oxygen flux in small samples from Dermestes maculatus and Tenebrio molitor.</a> Physiological Entomology. 41 (2), 96-102 (2016).</li>
<li>Teulier, L., Weber, J. M., Crevier, J., Darveau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proline+as+a+fuel+for+insect+flight%3A+enhancing+carbohydrate+oxidation+in+hymenopterans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+of+London+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Proline as a fuel for insect flight: enhancing carbohydrate oxidation in hymenopterans.</a> Proceedings of the Royal Society of London B: Biological Sciences. 283 (1834), 20160333(2016).</li>
<li>Ferguson, M., Mockett, R. J., Shen, Y., Orr, W. C., Sohal, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+decline+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22The+Biochemical+journal%22%5BJournal%5D)">Age-associated decline in mitochondrial respiration and electron transport in Drosophila melanogaster.</a> The Biochemical journal. 390 (2), 501-511 (2005).</li>
<li>Miwa, S., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+topology+of+superoxide+production+by+complex+III+and+glycerol+3-phosphate+dehydrogenase+in+Drosophila+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">The topology of superoxide production by complex III and glycerol 3-phosphate dehydrogenase in Drosophila mitochondria.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1709 (3), 214-219 (2005).</li>
<li>Katewa, S. D., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sympatric+Drosophila+simulans+flies+with+distinct+mtDNA+show+difference+in+mitochondrial+respiration+and+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sympatric Drosophila simulans flies with distinct mtDNA show difference in mitochondrial respiration and electron transport.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 37 (3), 213-222 (2007).</li>
<li>Brand, M. D., Nicholls, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3076726/">Assessing mitochondrial dysfunction in cells.</a> Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).</li>
<li>St-Pierre, J., Buckingham, J. A., Roebuck, S. J., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topology+of+superoxide+production+from+different+sites+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Topology of superoxide production from different sites in the mitochondrial electron transport chain.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 44784-44790 (2002).</li>
<li>Kuznetsov, A. V., Veksler, V., Gellerich, F. N., Saks, V., Margreiter, R., Kunz, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+in+situ+in+permeabilized+muscle+fibers%2C+tissues+and+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function in situ in permeabilized muscle fibers, tissues and cells.</a> Nature Protocols. 3 (6), 965-976 (2008).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle.+New+perspectives+of+mitochondrial+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle. New perspectives of mitochondrial physiology.</a> International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Picard, M., Taivassalo, T., Gouspillou, G., Hepple, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+isolation%2C+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: isolation, structure and function.</a> The Journal of Physiology. 589 (18), 4413-4421 (2011).</li>
<li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermal+sensitivity+of+mitochondrial+functions+in+permeabilized+muscle+fibers+from+two+populations+of+Drosophila+simulans+with+divergent+mitotypes%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Regulatory%2C+Integrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">Thermal sensitivity of mitochondrial functions in permeabilized muscle fibers from two populations of Drosophila simulans with divergent mitotypes.</a> American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 301 (1), R48-R59 (2011).</li>
<li>Pichaud, N., Ballard, J. W. O., Tanguay, R. M., Blier, P. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+mitochondrial+dna+haplotypes+exhibit+metabolic+differences%3A+insight+into+functional+properties+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Evolution%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring mitochondrial dna haplotypes exhibit metabolic differences: insight into functional properties of mitochondria.</a> Evolution. 66 (10), 3189-3197 (2012).</li>
<li>Pichaud, N., Messmer, M., Correa, C. C., Ballard, J. W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diet+influences+the+intake+target+and+mitochondrial+functions+of+Drosophila+melanogaster+males%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Diet influences the intake target and mitochondrial functions of Drosophila melanogaster males.</a> Mitochondrion. 13 (6), 817-822 (2013).</li>
<li>Wolff, J. N., Pichaud, N., Camus, M. F., Côté, G., Blier, P. U., Dowling, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+implications+of+mitochondrial+genetic+variation%3A+mitochondrial+genetic+effects+on+OXPHOS+respiration+and+mitochondrial+quantity+change+with+age+and+sex+in+fruit+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary implications of mitochondrial genetic variation: mitochondrial genetic effects on OXPHOS respiration and mitochondrial quantity change with age and sex in fruit flies.</a> Journal of Evolutionary Biology. 29 (4), 736-747 (2016).</li>
<li>Gnaiger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacity+of+oxidative+phosphorylation+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22The+International+Journal+of+Biochemistry+%26+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Capacity of oxidative phosphorylation in human skeletal muscle.</a> The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 41 (10), 1837-1845 (2009).</li>
<li>Phang, J. M., Donald, S. P., Pandhare, J., Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+metabolism+of+proline%2C+a+stress+substrate%2C+modulates+carcinogenic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">The metabolism of proline, a stress substrate, modulates carcinogenic pathways.</a> Amino Acids. 35 (4), 681-690 (2008).</li>
<li>Bender, T., Martinou, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+health+and+disease%3A+To+carry+or+not+to+carry%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Molecular+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial pyruvate carrier in health and disease: To carry or not to carry?</a> Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1863 (10), 2436-2442 (2016).</li>
<li>Divakaruni, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiazolidinediones+are+acute%2C+specific+inhibitors+of+the+mitochondrial+pyruvate+carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2013).</li>
<li>McCommis, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancestral+role+for+the+mitochondrial+pyruvate+carrier+in+glucose-stimulated+insulin+secretion%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">An ancestral role for the mitochondrial pyruvate carrier in glucose-stimulated insulin secretion.</a> Molecular Metabolism. 5 (8), 602-614 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W pracy opisano metodę przygotowania próbki przed pomiarami mitochondrialnego zużycia tlenu u Drosophila. Metoda ta została opracowana w celu przezwyciężenia różnych problemów związanych z protokołami wykorzystującymi izolacje mitochondrialne, zwłaszcza pod względem czasu trwania i wymaganej liczby osób. Zamiast pracować z izolacjami mitochondrialnymi, które zwykle wymagają dużej ilości tkanek pobranych od kilku osobników, eksperyment ten przeprowadza się na przepuszczalnych włóknach mięśniowych z klatki piersiowej kilku...

Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, była używana jako organizm modelowy do badań genetycznych przez ponad sto lat1. Badania nad tym organizmem nie tylko doprowadziły do zdobycia znaczącej podstawowej wiedzy na temat dziedziczenia sprzężonego z płcią2, mutation rate3, rozwoju układu nerwowego i determinacji losu komórki4, ale ostatnio stało się również cennym narzędziem do badania mechanizmów nieodłącznie związanych z kilkoma chorobami, takimi jak choroba Alzheimera i Parkinsona5, 6. Co więcej, jest to popularny model do badania procesu starzenia, ponieważ mogą być hodowane w dużej liczbie w krótkim czasie i mają krótką żywotność. Posiadają również struktury homologiczne do narządów ludzkich, takich jak serce, enocyty (komórki podobne do hepatocytów), ciała tłuszczowe (funkcjonujące podobnie jak wątroba i biała tkanka tłuszczowa), komórki produkujące insulinę (odpowiednik komórek β-trzustkowych), a także metabolity transportujące hemolimfę (analogicznie do krwi kręgowców)<klasa sup="xref">7. Co więcej, centralne szlaki pośredniego metabolizmu (w tym szlak sygnałowy podobny do insuliny/insulinopodobnego czynnika wzrostu i szlaki celu Rapamycyna-TOR) są również wysoce konserwatywne7. Z tych powodów Drosophila została ostatnio wykorzystana do opisania podstawowych mechanizmów kontrolujących metabolizm, szczególnie w stanach patologicznych nieodłącznie związanych z chorobami metabolicznymi człowieka, takimi jak cukrzyca8. Głównym składnikiem metabolizmu jest mitochondrium, które integruje wiele szlaków i pełni jedną z najważniejszych funkcji biologicznych w życiu, produkcję ATP, poprzez proces fosforylacji oksydacyjnej (OXPHOS). Biorąc pod uwagę ich centralną rolę w metabolizmie organizmu, nie jest zaskakujące, że dysfunkcje mitochondriów są zaangażowane w wiele chorób, takich jak choroba Parkinsona9 i choroby Alzheimera10, a także w stwardnieniu zanikowym bocznym11,12. Są one również podstawowymi determinantami procesu starzenia. Rzeczywiście, są głównymi producentami reaktywnych form tlenu (ROS) w komórce, które mogą być szkodliwe dla komórki w wysokim stężeniu poprzez uszkodzenia oksydacyjne11. Starzenie się wiąże się również z akumulacją uszkodzonego lub zmutowanego mitochondrialnego DNA13, dysfunkcjami mitofagii14,15, a także upośledzeniem biogenezy mitochondriów16. Mitochondria są również kluczowymi determinantami homeostazy komórki, ponieważ mogą wykorzystywać różne substraty do dostosowywania kilku funkcji komórkowych w zależności od obfitości lub niedoboru makroskładników odżywczych17,18.
Rzeczywiście, różne składniki odżywcze w diecie (węglowodany, lipidy i białka) są trawione, wchłaniane i transportowane w komórkach. Następnie są one przekształcane w cytozolu, a uzyskane substraty są transportowane do macierzy mitochondrialnej, gdzie wytwarzają redukujące odpowiedniki, takie jak NADH i FADH219. Te redukujące równoważniki są następnie utleniane przez różne kompleksy enzymatyczne systemu transportu elektronów (ETS). Kompleksy te są osadzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, takie jak kompleks I i kompleks II. Ponadto inne kompleksy enzymatyczne, takie jak mitochondrialna dehydrogenaza glicerol-3-fosforanowa i dehydrogenaza prolinowa, reprezentują alternatywne drogi wprowadzania elektronów do klasy ETS<sup="xref">20,21. Te "alternatywne" kompleksy są szczególnie ważne u owadów, ponieważ w zależności od gatunku mogą aktywnie uczestniczyć w zwiększaniu oddychania20,22,23,21. Elektrony z tych systemów zasilających ETS są przenoszone do ubichinonu, a następnie do kompleksu III, a następnie do kompleksu IV, aż do końcowego akceptora, tlenu cząsteczkowego. Ten transfer elektronów generuje siłę napędową protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną, napędzając fosforylację ADP do ATP w kompleksie V (ryc. 1). Biorąc pod uwagę centralną rolę mitochondriów w homeostazie komórki, badanie metabolizmu mitochondrialnego przy użyciu odpowiedniego modelu D. melanogaster stanowi potężne narzędzie do nakreślenia mechanizmów leżących u podstaw różnych stanów patofizjologicznych lub stresu komórkowego i środowiskowego. Co zaskakujące, tylko kilka badań faktycznie mierzyło oddychanie mitochondrialne u Drosophila24,25,26. Rzeczywiście, eksperymenty mające na celu ocenę zużycia tlenu w mitochondriach wymagają izolacji mitochondriów. Chociaż jest to korzystne dla pomiaru różnych funkcji mitochondriów (takich jak produkcja ROS lub stosunek P/O jako marker wydajności mitochondriów27,28), izolacje te zazwyczaj wymagają raczej dużych ilości tkanki od kilku osób24,29. Ten wymóg dla dużej ilości tkanek i osobników jest ważnym czynnikiem ograniczającym, zwłaszcza biorąc pod uwagę, że wszystkie osoby powinny być w tym samym wieku i najlepiej tej samej płci w eksperymentach, co sprawia, że pomiar oddychania w różnych punktach czasowych jest w najlepszym razie pracochłonny. Co więcej, podczas gdy izolacje mitochondrialne mogą dostarczyć znaczącego wglądu w podstawowe mechanizmy rządzące metabolizmem mitochondriów, metody stosowane do izolacji mitochondriów mają kilka wad, takich jak trudność w uzyskaniu powtarzalnych wyników, zakłócenie sieci mitochondrialnej oraz zmiana struktury i funkcji mitochondriów29,30,31.
Celem tego badania jest przedstawienie solidnego protokołu do pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach u Drosophila przy użyciu tylko minimalnej ilości tkanek od bardzo niewielu osób. Protokół ten polega na pomiarze zużycia tlenu w mitochondriach in situ przy użyciu przepuszczalnych włókien mięśniowych29 z klatki piersiowej Drosophila w połączeniu z respirometrią o wysokiej rozdzielczości32,33,34,35. Metoda ta ma również dodatkowe zalety w porównaniu z klasyczną metodą izolacji mitochondrialnej, ponieważ interakcje z innymi składnikami komórki, a także struktura i funkcja mitochondriów są lepiej zachowane we włóknach przepuszczalnych29,31,36, co sprawia, że podejście to jest bardziej istotne z fizjologicznego punktu widzenia. Dzięki temu protokołowi funkcje mitochondriów mogą być dokładnie oceniane za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości tylko w trzech piersiach Drosophila, z substratami umożliwiającymi określenie zużycia tlenu na kilku różnych etapach ETS. W związku z tym protokół ten może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące podstawowych mechanizmów kontrolujących metabolizm w kontekście wielu warunków środowiskowych lub patofizjologicznych, wykorzystując model Drosophila.
Aby zmierzyć zużycie tlenu na kilku różnych etapach ETS i ocenić, jak różne substraty przyczyniają się do oddychania, stosuje się różne substraty (Rysunek 1), rozprzęgacz i inhibitory30 po przepuszczalności tkanki. W szczególności wykonuje się sekwencyjne dodawanie różnych substratów w celu stymulowania wejścia elektronów przez różne kompleksy ETS. Następnie dodaje się rozprzęgacz, 4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu (FCCP) w optymalnym stężeniu w celu zmierzenia oddychania niesprzężonego, tj. oddychania niefosforylującego stymulowanego do maksymalnego zużycia tlenu. Następnie przeprowadza się sekwencyjne inhibicje kompleksów I, II i III w celu monitorowania resztkowego zużycia tlenu, które jest spowodowane reakcjami utleniania innymi niż ETS. Wreszcie, maksymalną zdolność oddychania kompleksu IV można ocenić przez wstrzyknięcie N,N,N',N,-tetrametylo-p-fenylenodiaminy (TMPD), sztucznego dostarczyciela elektronów i askorbinianu. Ważne jest, aby pamiętać, że eksperymenty są przeprowadzane w temperaturze 24 °C, ponieważ jest to temperatura, w której muchy są hodowane.

<table><tbody><tr><td>Respirometr o wysokiej rozdzielczości Oxygraph O2K</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>10022-02</td><td>Zestaw respirometru Startup O2K &nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do miareczkowania O2K&nbsp;</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20820-03</td><td>Strzykawki Hamilton o różnych pojemnościach &nbsp;</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Datlab</td><td>Oroboros Instruments, Innsbruck, Austria</td><td>20700</td><td>Oprogramowanie do akwizycji i analizy danych &nbsp;</td></tr><tr><td>Kleszczyki antymagnetyczne z cienką końcówką</td><td>VWR</td><td>82027-400</td><td> &nbsp;</td></tr><tr><td>Secura225D-1S-DQE</td><td>Sartorius AG, Getynga, Niemcy</td><td></td><td>Waga półmikro (dystrybuowana przez kilka firm)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Drosophila melanogaster typ dziki w1118</td><td>Bloomington Drosophila stock Center, IN, USA</td><td></td><<td>br/> Warunki przechowywania: 24 &deg; C</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy-bis(2-aminoetyloeter)-N,N,N&prime;,N&prime;-tetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>EGTA Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1767</td><td>UWAGA: działa żrąco na metale, ostra toksyczność, Działanie na skórę, poważne uszkodzenie oczu, ostra toksyczność dla środowiska wodnego. Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4830</td><td> Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td> Warunki przechowywania: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9272</td><td> Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td></td><td>Taurine Sigma-Aldrich</td><td>T0625</td><td> Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td>Na2Phosphocreatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7936</td><td> Warunki przechowywania: -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5513</td><td> Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td> Warunki przechowywania: 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>MES hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250</td><td> Warunki przechowywania:</td></tr><tr><td>RT Saponina z kory quillaja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7900</td><td>Saponin Warunki przechowywania: RT Przygotowanie roztworu: 5 mg w 1 ml roztworu konserwującego. Codziennie przygotowuj świeże.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td> Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td> Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td> Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05470</td><td> Warunki przechowywania: 2-8 &deg; C</td></tr><tr><td>Na2S2O4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>157953</td><td>Ditionit sodu. UWAGA: substancje i mieszaniny samonagrzewające się, ostra toksyczność, ostra toksyna wodna przewlekła toksyczność dla środowiska wodnego. Warunki przechowywania: RT</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Pirogronian Warunki przechowywania: 2-8 &deg; C Przygotowanie roztworu: W wodzie MilliQ. Codziennie przygotowuj świeże.</td></tr><tr><td>Kwas L-(-)-jabłkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td>Malate Warunki przechowywania: RT Przygotowanie roztworu: W wodzie MilliQ. Zneutralizować za pomocą KOH i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Hydrat soli monopotasowej adenozyno5'-difosforanu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td>ADP Warunki przechowywania: -20 &deg; C Przygotowanie roztworu: W wodzie MilliQ. Zneutralizować za pomocą KOH i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Cytochrom c z serca konia</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7752</td><td>Cytochrom c Warunki przechowywania: -20 &deg; C Przygotowanie roztworu: W wodzie MilliQ. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>L-Proline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0380</td><td>Proline Warunki przechowywania: RT Przygotowanie roztworu: w wodzie MilliQ. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Bursztynian sodu dwuzasadowy sześciowodny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2378</td><td>Bursztynian Warunki przechowywania: RT Przygotowanie roztworu: W wodzie MilliQ. Zneutralizować HCl i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>sn-Glicerol 3-fosforan bis(cykloheksyloamoniowa) sól</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7886</td><td>Glicerol-3-fosforan Warunki przechowywania: -20 &deg; C Przygotowanie roztworu: W wodzie MilliQ. Zneutralizować HCl i przechowywać w temperaturze -80 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>4-(trifluorometoksy)fenylohydrazon cyjanku karbonylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td>FCCP. UWAGA: toksyczność ostra, działanie uczulające na skórę, przewlekła toksyczność dla środowiska wodnego. Warunki przechowywania: RT Przygotowanie roztworu: W absolutnym etanolu. Przechowywać w szklanych fiolkach w temperaturze -20 °C.</td></tr><tr><td>Rotenon</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td>UWAGA: ostra toksyczność, podrażnienie skóry, podrażnienie oczu, działanie toksyczne na narządy docelowe (układ oddechowy), ostra toksyczność dla środowiska wodnego, przewlekła toksyczność dla środowiska wodnego. Przygotowanie roztworu: W absolutnym etanolu. Przechowywać w ciemnych fiolkach w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Kwas malonowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1296</td><td>Malonate. UWAGA: ostra toksyczność, poważne uszkodzenie oczu. Warunki przechowywania: RT Przygotowanie roztworu: W wodzie MilliQ. Zneutralizować za pomocą KOH. Codziennie przygotowuj świeże.</td></tr><tr><td>Antymycyna A firmy Streptomyces sp.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td>Antymycyna A. UWAGA: ostra toksyczność, ostra toksyczność dla środowiska wodnego, przewlekła toksyczność dla środowiska wodnego. Warunki przechowywania: -20 &deg; C Przygotowanie roztworu: W absolutnym etanolu. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>N,N,N&prime;,N&prime;-Tetramethyl-p-fenylenodiamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7394</td><td>TMPD Warunki przechowywania: RT Przygotowanie roztworu: W wodzie MilliQ. Przechowywać w ciemnych fiolkach w&nbsp; -20 stopni Celsjusza</td></tr><tr><td>(+)-L-askorbinian sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td>Askorbinian Warunki przechowywania: RT Przygotowanie roztworu: w wodzie MilliQ. Przechowywać w ciemnych fiolkach w&nbsp; -20 stopni Celsjusza</td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td>Azydek sodu. UWAGA: toksyczność ostra (doustna i skórna), toksyczność swoista dla narządów docelowych (mózg), toksyczność dla organizmów wodnych, przewlekła toksyczność dla organizmów wodnych. Przygotowanie roztworu: W wodzie MilliQ. Przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza.</td></tr></tbody></table>

pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Measurement of Mitochondrial Oxygen Consumption in Permeabilized Fibers of Drosophila Using Minimal Amounts of Tissue

Muszka owocowa, Drosophila melanogaster, reprezentuje wyłaniający się model do badania metabolizmu. Rzeczywiście, Drosophila mają struktury homologiczne do narządów ludzkich, posiadają wysoce konserwatywne szlaki metaboliczne i mają stosunkowo krótką żywotność, która pozwala na badanie różnych podstawowych mechanizmów w krótkim czasie. Zaskakujące jest jednak to, że jeden z mechanizmów niezbędnych dla metabolizmu komórkowego, czyli oddychanie mitochondrialne, nie został dokładnie zbadany w tym modelu. Jest to prawdopodobne, ponieważ pomiar oddychania mitochondrialnego u Drosophila zwykle wymaga bardzo dużej liczby osobników, a uzyskane wyniki nie są wysoce powtarzalne. W tym miejscu opisano metodę pozwalającą na precyzyjny pomiar zużycia tlenu w mitochondriach przy użyciu minimalnych ilości tkanki z rodzaju Drosophila. W tej metodzie klatki piersiowej są preparowane i przepuszczalne zarówno mechanicznie za pomocą ostrych kleszczy, jak i chemicznie za pomocą saponin, co pozwala różnym związkom przenikać przez błonę komórkową i modulować oddychanie mitochondrialne. Po permeabilizacji przeprowadza się protokół w celu oceny zdolności różnych kompleksów systemu transportu elektronów (ETS) do utleniania różnych substratów, a także ich odpowiedzi na rozprzęgacz i kilka inhibitorów. Metoda ta ma wiele zalet w porównaniu z metodami wykorzystującymi izolacje mitochondrialne, ponieważ jest bardziej istotna fizjologicznie, ponieważ mitochondria nadal oddziałują z innymi składnikami komórkowymi, a morfologia mitochondriów jest zachowana. Co więcej, przygotowanie próbek jest szybsze, a uzyskane wyniki są wysoce powtarzalne. Łącząc zalety Drosophila jako modelu do badania metabolizmu z oceną oddychania mitochondrialnego, można uzyskać ważne nowe spostrzeżenia, zwłaszcza gdy muszki doświadczają różnych warunków środowiskowych lub patofizjologicznych.

Reprezentatywny zapis zużycia tlenu przez mitochondria, uzyskany zgodnie z opisanym powyżej protokołem, przedstawiono w Rycina 2Pirowian i jabłczan wstrzykiwane do komór wraz z permeabilizowanymi włóknami mięśniowymi odnoszą się do respiracji CI-LEAK, t. j., gdy kompleks I łańcucha transportu elektronów (ETS) jest stymulowany przez NADH wytwarzany w procesie utleniania pirogronianu i jabłczanu w cyklu kwasów trójkarboksylowych (CI). Podczas tego temp...

W tym artykule opisana jest metoda pomiaru zużycia tlenu za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości w permeabilizowanych piersiach Drosophila. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki w porównaniu z klasyczną techniką izolacji mitochondriów, a uzyskane wyniki są bardziej istotne fizjologicznie.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

The fruit fly, Drosophila melanogaster, represents an emerging model for the study of metabolism. Indeed, drosophila have structures homologous to human ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena oddychania mitochondrialnego u muszki owocnej Drosophila Melanogaster za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości. Osiąga się to poprzez najpierw wypreparowanie Drosophila, aby zebrać klatkę piersiową. Klatka piersiowa zawierająca mięśnie lotu jest następnie ostrożnie przepuszczana mechanicznie za pomocą ostrych kleszczy i inkubowana z saponiną w celu dalszej przepuszczalności. Klatka piersiowa jest następnie przenoszona do komór respirometru, a zużycie tlenu w mitochondriach jest mierzone za pomocą kombinacji różnych substratów, rozprzęgaczy i inhibitorów. Cześć, jestem Chlo

measurement-mitochondrial-oxygen-consumption-permeabilized-fibers

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Wysokiej rozdzielczości respirometria służy do określania zużycia tlenu w mitochondriach. Jest to prosta technika określania częstości oddechów mitochondrialnych kompleksów łańcucha oddechowego (I-IV), maksymalnej pojemności mitochondrialnego systemu transportu elektronów i integralności mitochondrialnej błony zewnętrznej.

Respirometria o wysokiej rozdzielczości do oceny funkcji mitochondriów w przepuszczalnych i nienaruszonych komórkach

Analiza zależności między strukturą a funkcją mitochondriów jest niezbędna do dokładnego zrozumienia mechanizmów regulacyjnych funkcjonalności mitochondriów. W artykule opisano i zademonstrowano specyficzne metody badania struktury i funkcji mitochondriów w żywych i utrwalonych jajnikach Drosophila.

Badanie struktury i funkcji mitochondriów w jajnikach Drosophila

Przedstawiamy protokół pomiaru zużycia tlenu i pozakomórkowego zakwaszenia w mózgach larw i dorosłych Drosophila melanogaster. Analizator metaboliczny jest używany z dostosowanym i zoptymalizowanym protokołem. Ograniczenia mikrotkanek są kluczowym elementem tego protokołu i zostały zaprojektowane i stworzone specjalnie do ich wykorzystania w tej analizie.

Analiza metaboliczna larwalnych i dorosłych mózgów Drosophila melanogaster

Oddychanie mitochondrialne jest kluczowe dla przetrwania organizmu; dlatego wskaźnik zużycia tlenu jest doskonałym wskaźnikiem zdrowia mitochondriów. W tym protokole opisujemy zastosowanie dostępnego na rynku respirometru do pomiaru podstawowych i maksymalnych wskaźników zużycia tlenu u żywych, nienaruszonych i swobodnie ruchliwych Caenorhabditis elegans.

Pomiar wskaźników zużycia tlenu w nienaruszonym Caenorhabditis elegans

Wysokorozdzielcza respirometria sprzężona z czujnikami fluorescencyjnymi określa zużycie tlenu w mitochondriach i generowanie reaktywnych form tlenu (ROS). Niniejszy protokół opisuje technikę oceny częstości oddechów mitochondriów i produkcji ROS w przepuszczalnym nerwie kulszowym.

Ocena funkcji mitochondriów w nerwie kulszowym za pomocą respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Kulometryczna respirometria jest idealna do pomiaru tempa metabolizmu małych organizmów. Po dostosowaniu do Drosophila melanogaster w niniejszym badaniu, zmierzone spożycieO2 mieściło się w zakresie zgłoszonym dla dzikiego typu D. melanogaster w poprzednich badaniach. Konsumpcja O2 na muchę przez mutanty CASK, które są mniejsze i mniej aktywne, była znacznie niższa niż w przypadku typu dzikiego.

Pomiar zużyciaO2 u Drosophila melanogaster za pomocą mikrorespirometrii kulometrycznej

Tutaj prezentujemy protokół respirometrii o wysokiej rozdzielczości do analizy bioenergetyki u zmutowanych muszek owocowych PINK1B9-null. W metodzie wykorzystuje się protokół SUIT (Substrate-Uncouplingr-Inhibitor-Titration).

Analiza funkcji mitochondriów u Drosophila melanogaster PINK1B9-Null mutant przy użyciu respirometrii o wysokiej rozdzielczości

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Poznaj metodę pomiaru zużycia tlenu w mitochondriach przepuszczalnych tułowi Drosophila przy użyciu wysokorozdzielczej respirometrii. Technika ta wymaga minimalnej ilości tkanki i dostarcza wyników o wysokiej wartości fizjologicznej.

Pomiar mitochondrialnego zużycia tlenu w przepuszczalnych włóknach Drosophila przy użyciu minimalnych ilości tkanki

Przeglądaj więcej filmów