Name: Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Poznaj metody doustnego dostarczania dwuniciowego RNA do owadów żywiących się sokiem roślinnym w celu wywołania interferencji RNA. Techniki te umożliwiają skuteczne wyciszanie genów in vivo i kontrolę szkodników.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Donaldowi Weberowi i Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) za dostarczenie BMSB i HB do eksperymentów i utrzymania kolonii; oraz Marii T. Gonzalez, Salvadorowi P. Lopezowi, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) i Jackie L. Metz (University of Florida, Fort Pierce, FL) za utrzymanie kolonii, przygotowanie próbek i analizy.

1. Hodowla BMSB
<ol>
	<li>Hoduj owady BMSB zgodnie ze standardową praktyką laboratoryjną i wcześniej opisaną63.</li>
	<li>Hoduj owady ACP (D. citri) na Citrus macrophylla w szklarni (22 °C) i naturalnym świetle. Stosować ACP dla dorosłych, około 5-7 dni po eklozji.</li>
</ol>
2. Wybór regionów genów i synteza in vitro dsRNA
<ol>
	<li>Wybierz geny specyficzne dla BMSB z wcześniej opublikowanych profili transkryptomu32.</li>
	<li>Upewnij się, że wybrane obszary zainteresowania wahają się od 200 do 500 par zasad.</li>
	<li>Przeprowadź reakcję łańcuchową polimerazy (PCR) w warunkach opisanych poniżej, aby wygenerować fragmenty związane z wybranym genem będącym przedmiotem zainteresowania z genomowego DNA. Patrz Tabela 1 dla oligonukleotydów specyficznych dla genu.
	<ol>
		<li>Reakcja PCR: W probówce PCR o pojemności 0,25 ml należy połączyć 5 μl buforu 10X PCR, 4 μl mieszaniny dNTP (po 2,5 mM każda), 2 μl matrycy DNA (50 ng / μL), po 2,5 μl starterów 1 i 2 (10 μM), 0,25 μl polimerazy DNA (5 U/μL), oraz woda wolna od DNaz/RNaz do 50 μL.</li>
		<li>Warunek PCR: Cyklicznie przeprowadzać reakcję PCR w celu amplifikacji obszaru zainteresowania w temperaturze 95 °C przez 3 minuty, a następnie 30 cykli w temperaturze 98 °C przez 10 s, 55 °C przez 30 s, 72°C przez 1 minutę. Inkubować reakcję w temperaturze 72 °C przez dodatkowe 10 minut. Oczyszczać reakcję PCR za pomocą zestawu do oczyszczania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Otrzymane fragmenty PCR należy dalej amplifikować za pomocą starterów specyficznych dla genu otoczonych sekwencją promotora polimerazy RNA T7 (5'-GAA, TTA, ATA, CGA, CTC, ACT, AGA, GGG, AGA-3'), jak wspomniano wcześniej62.</li>
	<li>Użyj genu LacZ jako kontroli negatywnej (pozorowanej) dla RNAi. 
	UWAGA: LacZ jest genem kodującym β-galaktozydazę amplifikowaną z genomowego DNA Escherichiacoli (użyte startery są wymienione w Tabeli 1).</li>
	<li>Wykonaj transkrypcję in vitro, aby uzyskać dsRNA, jak opisano wcześniej62.</li>
	<li>Rozpuść i ponownie zawieś powstałe dsRNA w 150 μl wody wolnej od DNazy/RNaz, zmierz stężenie i przechowuj w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
</ol>
3. Dostarczanie dsRNA za pomocą zielonej fasoli
<ol>
	<li>Wybierz wczesne nimfy BMSB w czwartym stadium rozwojowym wykluły się z tej samej masy jajowej i głodz je przez 24 godziny przed karmieniem dsRNA.</li>
	<li>Wybierz smukłą, certyfikowaną ekologiczną fasolkę szparagową (Phaseolus vulgaris L.) i myj 0,2% roztworem podchlorynu sodu przez 5 min. 
	UWAGA: Smukła fasolka szparagowa została wybrana tak, aby fasola mogła być łatwo umieszczona w probówkach do mikrowirówek o pojemności 2 ml.</li>
	<li>Umyć 3 razy za pomocą ddH2O i pozostawić do wyschnięcia na powietrzu.</li>
	<li>Przytnij fasolkę szparagową od końca kielicha do całkowitej długości 7,5 cm za pomocą czystej żyletki.</li>
	<li>Zanurz umytą i przyciętą fasolkę szparagową w pozbawionej nakrętki probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 300 μl roztworu kontrolnego (rozcieńczenie 1:10 zielonego barwnika spożywczego (składniki: woda, glikol propylenowy, Fd&C Yellow 5, Fd&C Blue 1 i Propyloparaben jako środek konserwujący)).</li>
	<li>Rozcieńczyć zsyntetyzowane in vitro dsRNA LacZ, JHAMT lub Vg, rozcieńczając 5 μg lub 20 μg w 300 μl wody wolnej od RNazy/DNazy, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 0,017 μg/μL lub 0,067 μg/μL.</li>
	<li>Zanurz umytą i przyciętą fasolkę szparagową w pozbawionej nakrętki probówce mikrowirówkowej o pojemności 2 ml zawierającej 300 μl roztworu dsRNA (od kroku 3.6).</li>
	<li>Owinąć i uszczelnić krawędzie probówek do mikrowirówek otaczających zanurzone ziarna, aby uniknąć parowania roztworu dsRNA i zapobiec przedostawaniu się zwierząt do probówki mikrowirówkowej.</li>
	<li>Umieść te probówki w pozycji pionowej w temperaturze pokojowej przez 3 godziny, aby umożliwić załadowanie roztworu dsRNA w całej zielonej fasoli poprzez działanie kapilarne.</li>
	<li>Umieść te probówki w czystych naczyniach hodowlanych (polipropylen). Umieść trzy wygłodzone nimfy BMSB w czwartym stadium rozwojowym w naczyniach hodowlanych.</li>
	<li>Potraktuj trzy zwierzęta na naczynie hodowlane, z których każde zawiera trzy zielone fasolki, zielonym barwnikiem spożywczym lub roztworem dsRNA. Utrzymuj owady w temperaturze 25 °C i wilgotności względnej 72%, w fotoperiodzie 16L:8D w inkubatorze.</li>
	<li>Pozwól owadom żywić się zieloną fasolką (zanurzoną i wchłoniętą z dsRNA) przez 5 dni, ale po 3 dniach uzupełnij świeżą dietą zieloną kulki do leczenia dsRNA.</li>
</ol>
4. Ilościowa analiza ekspresji genów w czasie rzeczywistym (qPCR) po wyciszeniu za pośrednictwem RNAi w BMSB
<ol>
	<li>Zmierz wpływ RNAi na poziomy ekspresji transkryptu za pomocą qPCR.</li>
	<li>Wyizoluj całkowite RNA od zwierząt traktowanych dsRNA i zsyntetyzuj cDNA62.</li>
	<li>Skonfiguruj reakcje qPCR przy użyciu systemu PCR w czasie rzeczywistym i starterów wymienionych w Tabeli 1. Stosować następujące warunki cykliczne qPCR: 95 °C przez 10 minut, a następnie 40 cykli po 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 minutę, wraz z etapem dysocjacji, w tym 95 °C przez 15 s, 60 °C przez 1 min, 95 °C przez 15 s i 60 °C przez 15 s.</li>
	<li>Określić wzorce qPCR: jako wzorzec odniesienia do oznaczania ilościowego należy użyć seryjnego rozcieńczenia cDNA przygotowanego z całkowitego RNA wyizolowanego od normalnego zwierzęcia.</li>
	<li>Użyj RNA BMSB 18s jako wewnętrznego wzorca, aby skorygować różnice w odzyskiwaniu RNA z tkanek32.</li>
</ol>
5. Opryskiwanie dolistne dużych doniczkowych drzew cytrusowych i sadzonek
Uwaga: Rośliny cytryny odmiany cytrusowej 'Carrizo' (Citrus sinensis XPoncirus trifoliata, Rutaceae) były hodowane w szklarni w naturalnym świetle i temperaturze, uprawiane w pojemnikach o pojemności 1,2 L. Rośliny były stale przycinane, aby pobudzić wzrost nowych pędów liściowych, zwanych "flush". ACP preferuje żerowanie i składanie jaj na nowym wzroście cytrusów64.
<ol>
	<li>Wybierz rośliny lub sadzonki i nie podlewaj ich przez 2-3 dni przed użyciem, aby gleba wyschła do wilgoci, ale nie całkowicie wyschła.</li>
	<li>Za pomocą butelki z rozpylaczem z pompką ręczną nałóż 200 ml roztworu dsRNA (0,5 mg/ml) na dolny baldachim (<klasa silna = "xfig">Rysunek 4A). 
	UWAGA: Przygotuj wyżej wymienione roztwory dsRNA w wodzie wolnej od DNaz/RNaz.</li>
	<li>Po rozpyleniu należy pozostawić zastosowany roztwór dsRNA do całkowitego wchłonięcia przez liście. 
	UWAGA: Drzewa cytrusowe wchłonęły zastosowane dsRNA, a następnie wyekstrahowano liście z nowego wzrostu lub z gałęzi, które zostały pokryte przed aplikacją; dsRNA był wykrywalny za pomocą qPCR i wykazywał ogólnoustrojowy ruch w liściach korony drzewa w 3-4 h44,45,46.</li>
	<li>Próbkę nowego wzrostu z wcześniej ściętych drzew należy pobrać po 25-40 dniach, zbierając około 10 liści z końcówek czterech gałęzi. Wyodrębnij całkowity RNA i przeanalizuj go za pomocą odwrotnej transkrypcji PCR (RT-PCR) i qPCR pod kątem obecności zastosowanego wyzwalacza dsRNA przy użyciu starterów wymienionych w Tabeli 1 i wcześniej opisanych metod46. 
	UWAGA: Pobieranie próbek, całkowita izolacja RNA, RT-PCR i qPCR zostały przeprowadzone zgodnie z wcześniejszym opisem46.</li>
	<li>Podobnie, rozpyl miejscowo 10 ml dsRNA na dolną część sadzonki lub liści małego drzewa doniczkowego. 
	UWAGA: Owady z rodzaju pluskwiaka (ACP i GWSS) miały dostęp do żerowania normalnie po 24 godzinach, po zabiegach na nowych przyrostach (liściach), które nie zostały bezpośrednio opryskiwane lub które wyrosły kilka tygodni później, lub na całych roślinach. W ten sposób powstały owady, które uzyskały pozytywny wynik testu na dsRNA po 3, 6 i 10 dniach po karmieniu.</li>
</ol>
6. Stosowanie zraszania gleby/korzeni w dużych lub małych doniczkowych drzewach cytrusowych i sadzonkach
<ol>
	<li>Wybierz rośliny lub sadzonki i nie podlewaj ich przez 2-3 dni przed użyciem, aby gleba wyschła do wilgoci, ale nie całkowicie wyschła (tworzy to przestrzeń powietrzną do przechowywania płynnego roztworu, który ma być zastosowany).</li>
	<li>Dodać 1 l roztworu dsRNA (0,2 mg/ml) do gleby dużych roślin doniczkowych (około 2,5 m) i po 1 godzinie dodać 1 l wody (chaser).</li>
	<li>Zastosuj 100 ml roztworu dsRNA (1,33 mg/ml) na glebę drzew doniczkowych o wysokości 1 m w częściowo suchych glebach.</li>
	<li>W przypadku małych sadzonek nałóż 10 ml roztworu dsRNA (1 mg / ml) na glebę w szyszkach lub na gołe korzenie (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4B, C).</li>
	<li>Pozwól roślinom, które otrzymują roztwór dsRNA zastosowany jako zraszanie gleby, moczyć się przez 30 minut. Następnie zastosuj zwykłą wodę, aby wspomóc wchłanianie przez korzenie (20 ml dla roślin w żółtych pojemnikach lub 100 ml, jeśli większe doniczki mają > 1 galon). 
	UWAGA: Miejscowo stosowane dsRNA na liście powodowały wykrycie co najwyżej dystalnych końcówek gałęzi w ciągu 3-6 godzin po zabiegach, wykazując ogólnoustrojowy ruch przez drzewa. Nowe gałęzie wzrostu dały wynik pozytywny na obecność dsRNA po 60-90 dniach od zabiegów. Sadzonki są dostarczane owadom (ACP i GWSS) w teście biologicznym karmienia dsRNA44.</li>
</ol>
7. Zastosowanie Stem Tap (iniekcja pnia drzewa) w dużych doniczkowych drzewach cytrusowych i sadzonkach
<ol>
	<li>Wybierz sadzonki cytrusów, nowe lub około 3,5-letnie rośliny do wstrzykiwania dsRNA metodą stuknięcia w łodygę (iniekcja do pnia).</li>
	<li>Wywierć otwory w roślinach cytrusowych za pomocą wiertła i wiertła 10 mm, uważając, aby nie przekroczyć 2 cm, czyli około połowy średnicy łodygi.</li>
	<li>Owiń miedzianą końcówkę każdego wtryskiwacza 4-6 razy paskiem folii uszczelniającej o szerokości 0.6 cm (1/4 cala), aby zapobiec wyciekom w pobliżu końcówki.</li>
	<li>Napełnij wtryskiwacze pni drzew 6 ml (1,7 mg / ml) roztworu dsRNA rozcieńczonego w wodzie wolnej od DNaz / RNaz (oznaczonej tutaj jako kolorowy roztwór).</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór do pnia drzewa i pozostawić wtryskiwacz w pniu na 6-10 godzin, aby umożliwić wchłonięcie roztworu dsRNA. Pozwól owadom żerować na sadzonkach z traktowanych drzew po 3, 10 i 30 dniach od zabiegu. 
	UWAGA: dsRNA wstrzyknięty metodą iniekcji pnia utrzymywał się na drzewach przez okres 30-60 dni41,42,44. Walidację RNAi przeprowadzono metodą qPCR przy użyciu starterów wymienionych w tabeli 1.</li>
</ol>
8. Granulki gliny poddane działaniu dsRNA do dostarczania owadom przez glebę
<ol>
	<li>Wylej absorbent gliny do stożkowej probówki o pojemności 50 ml do oznaczenia 35 ml (około 30 g absorbentu gliny) na probówce.</li>
	<li>Wlać 20 ml roztworu dsRNA rozcieńczonego w wodzie wolnej od DNaz/RNaz (100 μg/ml) do probówki, aby zwilżyć cały absorbent. Zakryj stożkową rurkę, przechyl rurkę, aby ułatwić usunięcie powietrza, i zakryj rurkę.</li>
	<li>Ustaw probówkę pionowo i odstaw na 1-2 minuty, aby cząsteczki gliny wchłonęły roztwór.</li>
	<li>Dodaj wystarczającą ilość gliny nasączonej dsRNA do mieszanki gleby, aby wypełnić doniczkę o pojemności 1 galona.</li>
	<li>Wymieszaj i obróć glebę ręcznie, aby dokładnie wymieszać glinę nasączoną dsRNA z glebą.</li>
	<li>Użyj tej gleby do przesadzenia sadzonek wybranych do zabiegu dsRNA.</li>
	<li>Podlewaj glebę 200 ml zwykłej wody bez dsRNA. Po 30 minutach do 1 godziny należy skroplić 100 ml czystej wody. Po 24 godzinach ustaw roślinę na normalnym harmonogramie podlewania.</li>
	<li>Testuj 4-6 liści traktowanych roślin doniczkowych za pomocą absorbentów gliny i dsRNA każdego miesiąca po zabiegu na dsRNA, zbierając najbardziej wierzchołkowe liście nowego wzrostu roślin. 
	UWAGA: Rośliny lub sadzonki z tych roślin poddanych działaniu środka są karmione owadom w dowolnym momencie po 24 godzinach od zabiegu i są w stanie dostarczać owady RNAi przez okres do roku (dane niepublikowane).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

RNAi okazał się ważnym narzędziem do badania funkcji biologicznych i regulacji genów, z ogromnym potencjałem do wykorzystania w zwalczaniu szkodników owadzich 19,68,69,70,71. Ogromne znaczenie ma zarówno zaprojektowanie i wybór odpowiedniego genu (genów) do wyciszenia u danego gatunku owadów oraz metoda dostarczania odpowiadającego mu dsRNA (genów) owadow. Opt...

Owady Hemipteran stanowią jedne z najbardziej znaczących ekonomicznie szkodników rolnictwa, ze względu na ich zdolność do osiągania wysokiego wzrostu populacji i rozprzestrzeniania chorób w roślinach. BMSB, H. halys Stål, jest inwazyjnym szkodnikiem, który został przypadkowo wprowadzony na półkulę zachodnią w Allentown w Pensylwanii z Azji (Chiny, Tajwan, Korea i Japonia) z pierwszą obserwacją zgłoszoną w 1996 roku1. Od czasu wprowadzenia BMSB został wykryty w 43 stanach, z największymi populacjami na środkowym Atlantyku (DE, MD, PA, NJ, VA i WV), a także w Kanadzie i Europie, i stanowi potencjalne zagrożenie dla rolnictwa2. Jako polifagiczny szkodnik, BMSB może wyrządzić szkody około 300 zidentyfikowanym gospodarzom roślinnym, w tym uprawach o wysokiej wartości, takich jak jabłka, winogrona, rośliny ozdobne, rośliny nasienne, soja i kukurydza. Uszkodzenia są spowodowane przede wszystkim sposobem karmienia znanym jako szarpanie i uderzenie, w którym zwierzę przebija roślinę żywicielską swoim igłowatym stylem, aby uzyskać dostęp do składników odżywczych z tkanek naczyniowych2,3. BMSB jest również szkodnikiem wewnętrznym, ponieważ od jesieni do zimy może zamieszkać w pomieszczeniach mieszkalnych, takich jak szkoły i domy2. Chemikalia i alergeny lotne uwalniane przez BMSB zostały zgłoszone jako nielegalna reakcja alergiczna u pracowników upraw sadowniczych. BMSB może również przyczyniać się do choroby alergicznej prowadzącej do kontaktowego zapalenia skóry, zapalenia spojówek i nieżytu nosa u osób wrażliwych4,5. Inny owad z rodziny pluskwiaków, ACP, D. citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), jest poważnym szkodnikiem owoców cytrusowych i przenosi bakterie o ograniczonej liczbie łyka (Candidatus Liberibacter asiaticus) powodujące Huanglongbing (HLB), lepiej znane jako choroba zielenienia cytrusów6,7. HLB został po raz pierwszy zgłoszony z południowych Chin i rozprzestrzenił się na 40 różnych krajów Azji, Afryki, Oceanii, Ameryki Południowej i Północnej7. Zazielenianie cytrusów to ogólnoświatowy problem, który wiąże się z grożącymi stratami gospodarczymi i finansowymi z powodu utraty owoców cytrusowych; w związku z tym uważa się, że zarządzanie AKP ma ogromne znaczenie dla zapobiegania HLB i ich kontroli.
Środki skutecznego zwalczania tych szkodników zwykle wymagają stosowania chemicznych pestycydów, które są stosunkowo krótkotrwałe. Strategie kontroli insektycydów chemicznych często nie mają bezpiecznych strategii zarządzania środowiskiem lub mają zmniejszoną podatność ze względu na odporność na pestycydy w populacjach szkodników8,9. W związku z tym biologiczne zwalczanie szkodników za pomocą biopestycydów molekularnych jest potencjalną alternatywą, ale jego stosowanie na całym świecie pozostaje skromne, a różne gatunki parazytoidów (np. Trisolcus japonicus) mogą być również skuteczne jako naturalne środki kontroli biologicznej. RNAi to potencjalnie rozwijająca się technologia zwalczania inwazyjnych szkodników owadzich za pomocą biopestycydów molekularnych10. RNAi jest dobrze opisanym mechanizmem regulacji genów, który ułatwia skuteczne potranskrypcyjne wyciszanie genów endogennych, a także inwazyjnych dsRNA w sposób specyficzny dla sekwencji, co ostatecznie prowadzi do regulacji ekspresji genów na poziomie mRNA11,12. Krótko mówiąc, gdy egzogenne dsRNA jest internalizowane w komórce, jest przetwarzane na siRNA przez członka nadrodziny RNazy III nukleazy dwuzębnej, zwanej Dicer, która jest ewolucyjnie konserwowana u robaków, much, roślin, grzybów i ssaków13,14,15. Te 21-25 dupleksów nukleotydowych siRNA są następnie rozwijane i integrowane z kompleksem wyciszającym indukowanym RNA (RISC) jako przewodnikowe RNA. Ten kompleks RISC-RNA umożliwia parowanie zasad Watsona-Cricka z komplementarnym docelowym mRNA; to ostatecznie prowadzi do rozszczepienia przez białko Argonaute, wielodomenowe białko zawierające domenę podobną do RNazy H, która degraduje odpowiednie mRNA i zmniejsza translację białek, prowadząc w ten sposób do potranskrypcyjnego wyciszenia genów16,17,18.
RNAi do zwalczania szkodników wymaga wprowadzenia dsRNA in vivo, aby wyciszyć interesujący nas gen, aktywując w ten sposób szlak siRNA. Różne metody, które zostały wykorzystane do dostarczania dsRNA owadom i komórkom owadów w celu indukcji ogólnoustrojowego RNAi, obejmują karmienie10,19, soaking20,21, mikroiniekcja22, nośniki, takie jak liposomy23 i inne techniki24. Po raz pierwszy zademonstrowano RNAi u Caenorhabditis elegans w celu wyciszenia ekspresji genu unc-22 przez Fire and Mello25, a następnie obniżenie ekspresji kędzierzawych genów u Drosophila melanogaster26. Początkowe badania funkcjonalne wykorzystywały mikroiniekcję do dostarczania dsRNA owadom, takim jak Apis mellifera22,27, Acyrthosiphon pisum28, Blattella germanica29, H. halys30 oraz owady lepidoptera (sprawdzone przez Terenius et al.31). Mikroiniekcja jest korzystna dla dostarczenia dokładnej i precyzyjnej dawki do miejsca zainteresowania owada. Chociaż takie nakłucia septyczne mogą wywoływać ekspresję genów związanych z odpornością z powodu trauma32, co wyklucza jego praktyczność w rozwoju biopestycydów rolniczych.
Inną metodą dostarczania dsRNA in vivo jest moczenie, które polega na spożyciu lub absorpcji dsRNA przez zawieszenie zwierząt lub komórek zazwyczaj w pożywce zewnątrzkomórkowej zawierającej dsRNA. Moczenie stosowano do skutecznego indukowania RNAi w komórkach hodowli tkankowej Drosophila S2 w celu zahamowania kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPKK) Downstream of-Raf1 (DSOR1) 20, a także u C. elegans w celu wyciszenia genu pos-133. Jednak dsRNA dostarczane za pomocą namaczania jest mniej skuteczne w indukowaniu RNAi w porównaniu do mikroiniekcji20. Wyciszanie za pośrednictwem RNAi u owada żującego zostało po raz pierwszy pokazane u zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej (WCR) (Diabrotica virgifera virgifera) poprzez wprowadzenie dsRNA do sztucznej diety agarowej10. Wcześniejsze doniesienia podsumowywały metody dostarczania dsRNA w infuzji w naturalnej diecie specyficznej dla stawonogów34. Ustalono ponadto, że te metody dostarczania są porównywalnie skuteczne ze sztucznymi środkami dostarczania; jak w przypadku muchy tse-tse (Glossina morsitans morsitans), gdzie zaobserwowano równy knockdown genu związanego z odpornością, gdy dsRNA było dostarczane albo przez mączkę z krwi, albo przez mikrowstrzyknięcie35. Podobnie, dostarczanie dsRNA przez kropelki u jasnobrązowej jabłoniowej (Epiphyas postvittana)36, larw diamentowej (Plutella xylostella)37, a także pszczół miodnych38,39 indukowały wydajne RNAi. Najbardziej efektywne eksperymenty RNAi u owadów hemipteran wykorzystywały wstrzyknięcie dsRNA40, ponieważ doustne dostarczanie dsRNA u owadów z pluskwiakami jest żmudne, ponieważ musi być dostarczane przez tkanki naczyniowe rośliny żywicielskiej. Skuteczne RNAi zaobserwowano również u ACP i skoczka wyborowego szklistego (GWSS), Homalodisca vitripennis: dsRNA było dostarczane przez cytrusy i winorośle, które wchłonęły dsRNA do tkanek naczyniowych poprzez zraszanie korzeni, opryskiwanie dolistne, iniekcje do pnia lub wchłanianie przez sadzonki41,42,43,44,45,46. Zaowocowało to również pierwszym patentem na dsRNA przeciwko ACP (2016, US 20170211082 A1). Dostarczanie siRNA i dsRNA za pomocą nośników, takich jak nanocząstki i liposomy, nadaje stabilność i szybko pojawia się wzrost skuteczności dostarczanego dsRNA23,47,48,49,50. Nowa klasa opartych na nanocząstkach nośników kwasów nukleinowych do in vitro i in vivo, która została podsumowana specjalnie do zastosowań terapeutycznych, może wnieść ogromny potencjał jako odpowiednie wektory dostarczania51. Nanocząstki jako nośnik dostarczania dsRNA mogą mieć wady, takie jak rozpuszczalność, hydrofobowość lub ograniczona bioakumulacja52, ale odpowiednie dostarczanie polimeru może zrekompensować te wady. Pojawiają się również prace rozwojowe i zastosowanie samodostarczających się nukleotydów zwanych "oligonukleotydami antysensownymi", które są jednoniciowymi dupleksami RNA/DNA46.
Witellogeneza u stawonogów jest kluczowym procesem kontrolującym reprodukcję i regulowanym przez hormon juweniliczny (JH) lub ekdyzon, które są kluczowymi induktorami syntezy Vg przez tkankę tłuszczową; Vg jest ostatecznie pobierane przez rozwijający się oocyt poprzez endocytozę, w której pośredniczy receptor Vg53. Vg to grupa polipeptydów syntetyzowanych pozajajnikowo, która jest niezbędna do rozwoju głównego białka żółtka jaja, witeliny54,55, a zatem jest ważna w reprodukcji i starzeniu się56. Vg zostało skutecznie wyciszone u nicieni57, a także u pszczół miodnych (Apis mellifera), gdzie zaobserwowano niedobór Vg za pośrednictwem RNAi u dorosłych i jaj22. Przetestowano posttranskrypcyjne wyciszanie genów Vg za pośrednictwem RNAi, ponieważ uważano, że jego wyczerpanie doprowadzi do obserwowalnego efektu fenotypowego, takiego jak zmniejszona płodność i płodność, aby potencjalnie pomóc w kontroli BMSB. Gen JHAMT, który koduje O-metylotransferazę kwasu S-adenozylo-L-metioniny (SAM) zależną od kwasu JH, katalizuje ostatni etap szlaku biosyntezy JH58. W tym szlaku pirofosforan farnezylu (FPP) jest sekwencyjnie przekształcany z farnezolu w kwas farnezoinowy, a następnie przekształcany przez JHAMT w farnezoinian metylu w JH. Szlak ten jest zachowany u owadów i stawonogów specjalnie do metamorfozy, procesu, który jest regulowany rozwojowo przez hormony59,60,61. U B. mori ekspresja genu JHAMT i aktywność biosyntetyczna JH w ciałkach białych sugerują, że supresja transkrypcji genu JHAMT ma kluczowe znaczenie dla zakończenia biosyntezy JH58. W związku z tym geny JHAMT i Vg zostały wybrane do celowego zubożenia za pomocą RNAi. RNAi testowano również na drzewach cytrusowych pod kątem kontroli ACP i GWSS. Drzewa cytrusowe potraktowano dsRNA poprzez zraszanie korzeni, stuknięcie w łodygę (iniekcje do pnia), a także opryskiwanie dolistne dsRNA przeciwko transkryptom kinazy argininowej (AK) specyficznej dla owadów42,44. Miejscowe stosowanie dsRNA wykryto na całym baldachimie drzew cytrusowych, co wskazuje na skuteczne dostarczanie przez tkanki naczyniowe roślin i spowodowało zwiększoną śmiertelność w ACP i GWSS41,42,45.
W obecnym badaniu zidentyfikowaliśmy naturalną metodę dostarczania diety do leczenia takiego jak dsRNA. Ta nowo opracowana technika została następnie wykorzystana do wyciszenia mRNA JHAMT i Vg przy użyciu specyficznych dla genów dsRNA w nimfach BMSB, jak wykazano wcześniej62. Zademonstrowane tutaj nowe protokoły dostarczania zastępują konwencjonalne systemy dostarczania RNA, które wykorzystują miejscowe spraye lub mikroiniekcje. Warzywa i owoce, kran z łodygą, nasiąkanie glebą i absorbenty gliniane mogą być wykorzystywane do dostarczania dsRNA, co ma kluczowe znaczenie dla dalszego rozwoju biopestycydów w zakresie zwalczania szkodników i patogenów.

<table><tbody><tr><td>Owady BMSB (H. halys)&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) owady&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>organiczna fasolka szparagowa</td><td>Nie dotyczy Rośliny</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cytrusowe</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>roztwór podchlorynu sodu</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>zielony barwnik spożywczy&nbsp;</td><td>McCormick & Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Komory Thermo Forma&nbsp;</td><td>Naczynie Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magenta (Kultura)</td><td>Podkłady Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Applied Biosystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Butelka z rozpylaczem</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

dwuniciowe metody doustnego dostarczania rna w celu wywołania interferencji rna u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Owady żywiące się łykiem i sokami roślinnymi atakują integralność upraw i owoców, aby odzyskać składniki odżywcze, uszkadzając przy tym uprawy żywności. Owady pluskwiaka stanowią szereg istotnych ekonomicznie szkodników roślin, które powodują szkody w uprawach, żywiąc się sokiem łyka. Brązowy marmoryzowany pluskwa cuchnąca (BMSB), Halyomorpha halys (Heteroptera: Pentatomidae) i azjatycki psyllid cytrusowy (ACP), Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) to szkodniki owadów pluskwiakowych wprowadzone do Ameryki Północnej, gdzie są inwazyjnym szkodnikiem rolniczym upraw specjalistycznych, rzędowych i podstawowych o wysokiej wartości oraz owoców cytrusowych, a także uciążliwym szkodnikiem, gdy gromadzą się w pomieszczeniach. Odporność na insektycydy u wielu gatunków doprowadziła do opracowania alternatywnych metod strategii zwalczania szkodników. Interferencja RNA za pośrednictwem dwuniciowego RNA (dsRNAi) to mechanizm wyciszania genów w funkcjonalnych badaniach genomicznych, który ma potencjalne zastosowania jako narzędzie do zwalczania szkodników owadzich. Egzogennie zsyntetyzowane dsRNA lub małe interferujące RNA (siRNA) mogą wywołać wysoce skuteczne wyciszanie genów poprzez degradację endogennego RNA, który jest homologiczny do przedstawionego. Skuteczne i ekologiczne zastosowanie RNAi jako biopestycydów molekularnych do biokontroli owadów pluskwiaka wymaga dostarczania in vivo dsRNA poprzez karmienie. Tutaj pokazujemy metody dostarczania dsRNA owadom: ładowanie dsRNA do zielonej fasolki przez zanurzenie i wchłanianie specyficznego dla genu dsRNA z doustnym podawaniem przez spożycie. Przedstawiliśmy również nietransgeniczne podejścia do dostarczania roślin przy użyciu oprysków dolistnych, zraszania korzeni, iniekcji do pnia, a także granulek gliny, z których wszystkie mogą być niezbędne do trwałego uwalniania dsRNA. Potwierdzono, że skuteczne dostarczanie przez doustnie przyjmowane dsRNA jest skuteczną dawką wywołującą znaczny spadek ekspresji docelowych genów, takich jak kwas juwenilowy O-metylotransferaza (JHAMT) i witellogenina (Vg). Te innowacyjne metody reprezentują strategie dostarczania dsRNA do wykorzystania w ochronie upraw i przezwyciężenia wyzwań środowiskowych związanych z ochroną przed szkodnikami.

Przetestowano dostarczanie dsRNA za pośrednictwem warzyw poprzez karmienie nimf BMSB w 4tym stadium rozwojowym w celu opracowania molekularnych biopestycydów wykorzystujących RNAi przeciwko inwazyjnym szkodnikom owadzim. BMSB żywią się za pomocą igłowatych stylatów w mechanizmie znanym jako „rozrywanie i zalewanie” (lacerate and flush), co powoduje znaczne szkody w uprawach. Do sprawdzenia, czy składniki odżywcze lub dsRNA mogą być dostarczane in vivo do BMSB podczas ż...

Ten artykuł demonstruje nowe techniki opracowane do doustnego dostarczania dwuniciowego RNA (dsRNA) przez tkanki naczyniowe roślin w celu interferencji RNA (RNAi) u owadów żywiących się sokiem łyka.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Ogólnym celem tych procedur jest zademonstrowanie naturalnej metody podawania doustnego. Dla specyficznych dla genów dsRNA, w celu wywołania interferencji RNA in vivo i szkodników owadzich. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące dostarczania biomolekuł do wnętrza owadów, wyjaśnienia wpływu biopestycydów molekularnych opartych na RNAi oraz kontrolowania owadów w środowisku.Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarczanie za pośrednictwem kwasów nukleinowych wyciszania genów może być stosowane do odżywiania się sokami roślinnymi, a także do żucia owadów. Chociaż przedstawione tutaj metody pokazują dostarczanie dwuniciowego RNA szkodnikom pluskwiaków, takim jak brązowy marmoryzowany pluskwa śmierdząca, pluskwa arlekinowa i azjatycki psyllid cytrusowy. Można je stosować do innych owadów.Aby rozpocząć protokół, wybierz wczesną 4th Instar brązową marmoryzowaną pluskwiaka śmierdzącego lub nimfy BMSB, które wykluły się z masy jajowej, i głodz je przez 24 godziny przed karmieniem dsRNA. Następnie wybierz smukłą, certyfikowaną ekologiczną fasolkę szparagową i myj ją 0,2% roztworem podchlorynu sodu przez pięć minut. Następnie wykonaj trzy podwójnie destylowane płukanie H2O i pozostaw ziarna do wyschnięcia na powietrzu.Po wyschnięciu przytnij fasolkę szparagową od końca kielicha do całkowitej długości 7,5 centymetra za pomocą czystej żyletki. Zanurz umytą i przyciętą fasolkę szparagową w pozbawionej nakrętki, dwumililitrowej mikroprobówce wirówkowej zawierającej 300 mikrolitrów roztworu kontrolnego. Rozcieńczyć zsyntetyzowane in vitro lac Z, JHAMT lub VGDSRNA, rozcieńczając 5 mikrogramów lub 20 mikrogramów i 300 mikrolitrów RNA, wody wolnej od DNA, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 0,017 mikrograma na mikrolitr lub 0,067 mikrograma na mikrolitr.Zanurz umytą i przyciętą fasolkę szparagową w pozbawionej nakrętki, dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej, zawierającej 300 mikrolitrów roztworu dsRNA. Owiń i uszczelnij krawędzie probówek do mikrowirówek, otaczając zanurzone ziarna, aby zapobiec parowaniu roztworu dsRNA i zapobiec przedostawaniu się zwierząt do probówki mikrowirówki. Ustaw probówki pionowo w temperaturze pokojowej na trzy godziny, aby umożliwić załadowanie roztworu dsRNA przez zieloną fasolę poprzez działanie kapilarne.Umieść probówki w czystych, polipropylenowych naczyniach hodowlanych i umieść 3 wygłodzone nimfy 4th Instar BMSB w naczyniach hodowlanych. Traktuj trzy owady na naczynie hodowlane. Każdy z nich zawiera trzy zielone ziarna z zielonym barwnikiem spożywczym lub roztworem dsRNA.Utrzymuj owady w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 72%, pod 16L, 8D fotoperiod w inkubatorze. Pozwól owadom żywić się zieloną fasolą zanurzoną i wchłoniętą w dsRNA przez pięć dni, a po trzech dniach uzupełnij je świeżą dietą zielonej fasolki traktowanej dsRNA. Wybierz rośliny lub sadzonki i nie podlewaj ich przez dwa do trzech dni przed użyciem, aby gleba wyschła do wilgoci, ale nie całkowicie wyschła.Za pomocą ręcznie pompowanej butelki z rozpylaczem nałóż 200 mililitrów roztworu dsRNA na dolny baldachim. Próbkę nowego wzrostu z wcześniej ściętych drzew należy pobrać po 25 do 40 dniach, zbierając około 10 liści z końcówek czterech gałęzi. Wyodrębnij całkowity RNA i przeanalizuj go za pomocą RT-PCR i qPCR pod kątem obecności zastosowanego wyzwalacza dsRNA.Podobnie, rozpyl miejscowo 10 mililitrów dsRNA na dolną część sadzonki lub liści drzew doniczkowych. Wybierz rośliny lub sadzonki i nie podlewaj ich przez dwa do trzech dni przed użyciem, aby gleba wyschła, aby zwilżyć, ale nie całkowicie wyschnąć. Następnie dodaj jeden litr roztworu dsRNA do gleby roślin doniczkowych o dużych doniczkach.Po godzinie dodaj jeden litr wody. Nałóż 100 mililitrów roztworu dsRNA na glebę drzew doniczkowych o wysokości jednego metra w częściowo suchych glebach. Pozwól roślinom otrzymać roztwór dsRNA w postaci namoczenia glebowego, aby moczyły się przez 30 minut.Następnie zastosuj zwykły zabieg wodny, aby wspomóc wchłanianie przez korzenie. Wybierz sadzonki cytrusów, nowe lub około 3,5-letnie rośliny do wstrzyknięcia dsRNA za pomocą kranu z łodygą, znanego również jako metoda iniekcji pnia. Owiń miedzianą końcówkę każdego wtryskiwacza cztery do sześciu razy paskiem folii sufitowej o szerokości 0.6 centymetra, aby zapobiec wyciekom w pobliżu końcówki.Następnie napełnij wstrzykiwacze pni drzew sześcioma mililitrami roztworu dsRNA rozcieńczonego DNA, wodą wolną od RNA. Wywierć otwory w roślinach cytrusowych za pomocą wiertła o pojemności 10 mililitrów i uważaj, aby nie przekroczyć dwóch centymetrów, czyli około połowy średnicy łodygi. Następnie wstrzyknij roztwór do pnia drzewa i pozostaw wtryskiwacz w pniu na sześć do 10 godzin, aby umożliwić wchłonięcie roztworu dsRNA.Pozwól owadom żywić się sadzonkami z traktowanych drzew po 3, 10 i 30 dniach po zabiegu. Wlej 30 gramów absorbentu gliny do 50-mililitrowej stożkowej rurki do znaku 35 mililitrów. Wlej 20 mililitrów roztworu dsRNA rozcieńczonego w DNA, wody wolnej od RNA do probówki, aby zwilżyć cały absorbent.Zakryj stożkową rurkę, przechyl rurkę, aby usunąć powietrze, umieść rurkę pionowo i odstaw na jedną do dwóch minut, aż cząsteczki gliny wchłoną roztwór. Dodaj wystarczającą ilość gliny nasączonej dsRNA do mieszanki gleby, aby wypełnić doniczkę o pojemności jednego galona. Wymieszaj i obróć glebę ręcznie, aby dokładnie wymieszać glinę nasączoną dsRNA z glebą.Użyj gleby do ponownego przesadzenia sadzonek wybranych do zabiegu dsRNA. Podlewaj glebę 200 mililitrami zwykłej wody, bez dsRNA, po 30 minutach do godziny. Następnie dodaj 100 mililitrów zwykłej wody.Po 24 godzinach ustaw roślinę w normalnym harmonogramie podlewania. Każdego miesiąca testuj od czterech do sześciu liści traktowanych roślin doniczkowych z absorbentami gliny i dsRNA, po leczeniu dsRNA, zbierając najbardziej wierzchołkowe liście nowego wzrostu rośliny. QPCR segmentów zielonej fasoli zanurzonych w zsyntetyzowanym in vitro dsRNA, specyficznym dla brązowego marmoryzowanego pluskwiaka śmierdzącego lub mRNA BMSB, wskazał na pomyślną indukcję RNAi, ponieważ ekspresja celów JHAMT i Vg została znacznie zmniejszona in vivo.Ta metoda dostarczania jest również skuteczna w przypadku innego szkodnika pluskwiaka błotnego, pluskwiaka arlekinowego. Jak wskazują ich zielone odchody. Po obejrzeniu tych wizualnych demonstracji powinieneś dobrze zrozumieć, jak dostarczać dwuniciowemu RNA owadom poprzez doustne spożycie w celu indukowania owadów RNAi in vivo.Postępy w technologii nucelotydów RNAi nadal poszerzają możliwości naukowców w zakresie modulowania RNA, ekspresji genów i poziomów białek w szerokim zakresie organizmów żywych. Dotyczy to zarówno roślin, jak i owadów oraz najtrudniejszych mikroorganizmów. Tak więc, podczas gdy koszt produkcji dwuniciowego RNA nadal spada, a metody dostarczania i stabilność nadal się poprawiają, przyszłość technologii RNAi będzie nadal wykorzystywana do rozwiązywania pojawiających się, złożonych problemów.

double-stranded-rna-oral-delivery-methods-to-induce-rna-interference

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

W tym protokole opisujemy dwie strategie, które jednocześnie tłumią dwa geny (podwójny knockdown genu) u pszczół miodnych. Następnie przedstawiamy, jak wykorzystać test odpowiedzi na rozszerzenie trąby (PER) do zbadania wpływu knockdownu podwójnego genu na percepcję smakową pszczoły miodnej.

Pomiar podwójnego knockdownu genu i percepcji smakowej za pośrednictwem RNAi u pszczół miodnych (Apis mellifera)

Tutaj opisujemy procedurę hamowania funkcji genów u komarów wektorów chorób za pomocą chitozanu/interferujących nanocząsteczek RNA, które są połykane przez larwy.

Wyciszanie genów za pośrednictwem chitozanu/interferujących nanocząstek RNA w larwach komarów wektorów chorób

Interferencja RNA (RNAi) jest niezwykle cennym narzędziem do odkrywania funkcji genów. Jednak zdolność do celowania w geny za pomocą RNAi w stadiach przeddorosłych jest ograniczona w przypadku głównego wektora malarii u ludzi Anopheles gambiae. Opisujemy protokół RNAi w celu zmniejszenia funkcji genu poprzez bezpośrednią iniekcję podczas rozwoju poczwarki.

Dostarczanie RNAi do poczwarek Anopheles gambiae

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli chrząszcza pośredniego zarodka, Dermestes maculatus (D. maculatus) w laboratorium. Udostępniamy również protokoły dla embrionalnego i rodzicielskiego RNAi oraz metody analizy fenotypów embrionalnych w celu zbadania funkcji genów u tego gatunku.

Hodowla i knockdown genów za pośrednictwem dwuniciowego RNA u chrząszcza skórnego, Dermestes maculatus

Ten manuskrypt demonstruje wyczerpanie ekspresji genów w jelicie środkowym karalucha niemieckiego poprzez doustne spożycie dwuniciowego RNA zamkniętego w liposomach.

Praktyczne zastosowanie interferencji RNA: doustne dostarczanie dwuniciowego RNA w nośnikach liposomów dla karaluchów

Interferencja RNA jest szeroko stosowaną, potężną techniką manipulowania ekspresją genów na określonych etapach rozwoju. Tutaj opisujemy niezbędne kroki do wdrożenia tej techniki u wodnego chrząszcza nurkującego Thermonectus marmoratus, od nabycia sekwencji genów po knockdown genów wpływających na strukturę lub zachowanie.

Interferencja RNA u chrząszczy wodnych jako potężne narzędzie do manipulowania ekspresją genów w określonych punktach rozwojowych

Obecny protokół opisuje metodę zbierania wystarczającej ilości śliny od owadów wysysających za pomocą sztucznego podłoża. Jest to wygodna metoda zbierania śliny owadów i badania funkcji śliny pod kątem zachowań żywieniowych owadów i przenoszenia wirusa przenoszonego przez wektory.

Dwuwarstwowa metoda kanapkowa z membraną do zbierania śliny Laodelphax striatellus

Doustne podawanie dsRNA wytwarzanego przez bakterie, metoda dostarczania interferencji RNA (RNAi), która jest rutynowo stosowana u Caenorhabditis elegans, została tutaj z powodzeniem zastosowana u dorosłych komarów. Nasza metoda pozwala na rzetelne badania genetyki odwrotnej i badania wektorów blokujących transmisję bez użycia iniekcji.

Skuteczne doustne podawanie RNA interferencji (RNAi) dorosłym komarom z rodzaju Anopheles gambiae

Tutaj przedstawiamy szczegółową metodę moczenia interferencji RNA u Bursaphelenchus xylophilus , aby ułatwić badanie funkcji genów.

Zastosowanie interferencji RNA w nicieni sosnowym, Bursaphelenchus xylophilus

Manipulacja interferencją RNA (RNAi) stanowi ogromne wyzwanie dla wielu gatunków parazytoidów o niewielkich rozmiarach, takich jak osy Trichogramma. W badaniu tym opracowano skuteczną metodę RNAi u Trichogramma denrolimi. Obecna metodologia zapewnia solidny model do badania regulacji genów u os Trichogramma.

Interferencja RNA w parazytoidzie jaja, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Prezentowany tutaj jest protokół dostarczania nanocząsteczek chitozan/dsRNA larwom jedwabników Bombyx mori w celu wywołania wyciszenia genów poprzez spożycie.

Interferencja RNA larw w jedwabniku Bombyx mori poprzez dostarczanie nanocząstek chitozanu/dsRNA

Poznaj metody doustnego dostarczania dwuniciowego RNA do owadów żywiących się sokiem roślinnym w celu wywołania interferencji RNA. Techniki te umożliwiają skuteczne wyciszanie genów in vivo i kontrolę szkodników.

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym (Wideo) | JoVE Journal

Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Przeglądaj więcej filmów