Dwuniciowe metody doustnego dostarczania RNA w celu wywołania interferencji RNA u łyka i owadów hemipteran żywiących się sokiem roślinnym

Ogólnym celem tych procedur jest zademonstrowanie naturalnej metody podawania doustnego. Dla specyficznych dla genów dsRNA, w celu wywołania interferencji RNA in vivo i szkodników owadzich. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące dostarczania biomolekuł do wnętrza owadów, wyjaśnienia wpływu biopestycydów molekularnych opartych na RNAi oraz kontrolowania owadów w środowisku.

Główną zaletą tej techniki jest to, że dostarczanie za pośrednictwem kwasów nukleinowych wyciszania genów może być stosowane do odżywiania się sokami roślinnymi, a także do żucia owadów. Chociaż przedstawione tutaj metody pokazują dostarczanie dwuniciowego RNA szkodnikom pluskwiaków, takim jak brązowy marmoryzowany pluskwa śmierdząca, pluskwa arlekinowa i azjatycki psyllid cytrusowy. Można je stosować do innych owadów.

Aby rozpocząć protokół, wybierz wczesną 4th Instar brązową marmoryzowaną pluskwiaka śmierdzącego lub nimfy BMSB, które wykluły się z masy jajowej, i głodz je przez 24 godziny przed karmieniem dsRNA. Następnie wybierz smukłą, certyfikowaną ekologiczną fasolkę szparagową i myj ją 0,2% roztworem podchlorynu sodu przez pięć minut. Następnie wykonaj trzy podwójnie destylowane płukanie H2O i pozostaw ziarna do wyschnięcia na powietrzu.

Po wyschnięciu przytnij fasolkę szparagową od końca kielicha do całkowitej długości 7,5 centymetra za pomocą czystej żyletki. Zanurz umytą i przyciętą fasolkę szparagową w pozbawionej nakrętki, dwumililitrowej mikroprobówce wirówkowej zawierającej 300 mikrolitrów roztworu kontrolnego. Rozcieńczyć zsyntetyzowane in vitro lac Z, JHAMT lub VGDSRNA, rozcieńczając 5 mikrogramów lub 20 mikrogramów i 300 mikrolitrów RNA, wody wolnej od DNA, aby uzyskać końcowe stężenia odpowiednio 0,017 mikrograma na mikrolitr lub 0,067 mikrograma na mikrolitr

Zanurz umytą i przyciętą fasolkę szparagową w pozbawionej nakrętki, dwumililitrowej probówce mikrowirówkowej, zawierającej 300 mikrolitrów roztworu dsRNA. Owiń i uszczelnij krawędzie probówek do mikrowirówek, otaczając zanurzone ziarna, aby zapobiec parowaniu roztworu dsRNA i zapobiec przedostawaniu się zwierząt do probówki mikrowirówki. Ustaw probówki pionowo w temperaturze pokojowej na trzy godziny, aby umożliwić załadowanie roztworu dsRNA przez zieloną fasolę poprzez działanie kapilarne.

Umieść probówki w czystych, polipropylenowych naczyniach hodowlanych i umieść 3 wygłodzone nimfy 4th Instar BMSB w naczyniach hodowlanych. Traktuj trzy owady na naczynie hodowlane. Każdy z nich zawiera trzy zielone ziarna z zielonym barwnikiem spożywczym lub roztworem dsRNA.

Utrzymuj owady w temperaturze 25 stopni Celsjusza i wilgotności względnej 72%, pod 16L, 8D fotoperiod w inkubatorze. Pozwól owadom żywić się zieloną fasolą zanurzoną i wchłoniętą w dsRNA przez pięć dni, a po trzech dniach uzupełnij je świeżą dietą zielonej fasolki traktowanej dsRNA. Wybierz rośliny lub sadzonki i nie podlewaj ich przez dwa do trzech dni przed użyciem, aby gleba wyschła do wilgoci, ale nie całkowicie wyschła.

Za pomocą ręcznie pompowanej butelki z rozpylaczem nałóż 200 mililitrów roztworu dsRNA na dolny baldachim. Próbkę nowego wzrostu z wcześniej ściętych drzew należy pobrać po 25 do 40 dniach, zbierając około 10 liści z końcówek czterech gałęzi. Wyodrębnij całkowity RNA i przeanalizuj go za pomocą RT-PCR i qPCR pod kątem obecności zastosowanego wyzwalacza dsRNA.

Podobnie, rozpyl miejscowo 10 mililitrów dsRNA na dolną część sadzonki lub liści drzew doniczkowych. Wybierz rośliny lub sadzonki i nie podlewaj ich przez dwa do trzech dni przed użyciem, aby gleba wyschła, aby zwilżyć, ale nie całkowicie wyschnąć. Następnie dodaj jeden litr roztworu dsRNA do gleby roślin doniczkowych o dużych doniczkach.

Po godzinie dodaj jeden litr wody. Nałóż 100 mililitrów roztworu dsRNA na glebę drzew doniczkowych o wysokości jednego metra w częściowo suchych glebach. Pozwól roślinom otrzymać roztwór dsRNA w postaci namoczenia glebowego, aby moczyły się przez 30 minut.

Następnie zastosuj zwykły zabieg wodny, aby wspomóc wchłanianie przez korzenie. Wybierz sadzonki cytrusów, nowe lub około 3,5-letnie rośliny do wstrzyknięcia dsRNA za pomocą kranu z łodygą, znanego również jako metoda iniekcji pnia. Owiń miedzianą końcówkę każdego wtryskiwacza cztery do sześciu razy paskiem folii sufitowej o szerokości 0.6 centymetra, aby zapobiec wyciekom w pobliżu końcówki.

Następnie napełnij wstrzykiwacze pni drzew sześcioma mililitrami roztworu dsRNA rozcieńczonego DNA, wodą wolną od RNA. Wywierć otwory w roślinach cytrusowych za pomocą wiertła o pojemności 10 mililitrów i uważaj, aby nie przekroczyć dwóch centymetrów, czyli około połowy średnicy łodygi. Następnie wstrzyknij roztwór do pnia drzewa i pozostaw wtryskiwacz w pniu na sześć do 10 godzin, aby umożliwić wchłonięcie roztworu dsRNA.

Pozwól owadom żywić się sadzonkami z traktowanych drzew po 3, 10 i 30 dniach po zabiegu. Wlej 30 gramów absorbentu gliny do 50-mililitrowej stożkowej rurki do znaku 35 mililitrów. Wlej 20 mililitrów roztworu dsRNA rozcieńczonego w DNA, wody wolnej od RNA do probówki, aby zwilżyć cały absorbent.

Zakryj stożkową rurkę, przechyl rurkę, aby usunąć powietrze, umieść rurkę pionowo i odstaw na jedną do dwóch minut, aż cząsteczki gliny wchłoną roztwór. Dodaj wystarczającą ilość gliny nasączonej dsRNA do mieszanki gleby, aby wypełnić doniczkę o pojemności jednego galona. Wymieszaj i obróć glebę ręcznie, aby dokładnie wymieszać glinę nasączoną dsRNA z glebą.

Użyj gleby do ponownego przesadzenia sadzonek wybranych do zabiegu dsRNA. Podlewaj glebę 200 mililitrami zwykłej wody, bez dsRNA, po 30 minutach do godziny. Następnie dodaj 100 mililitrów zwykłej wody.

Po 24 godzinach ustaw roślinę w normalnym harmonogramie podlewania. Każdego miesiąca testuj od czterech do sześciu liści traktowanych roślin doniczkowych z absorbentami gliny i dsRNA, po leczeniu dsRNA, zbierając najbardziej wierzchołkowe liście nowego wzrostu rośliny. QPCR segmentów zielonej fasoli zanurzonych w zsyntetyzowanym in vitro dsRNA, specyficznym dla brązowego marmoryzowanego pluskwiaka śmierdzącego lub mRNA BMSB, wskazał na pomyślną indukcję RNAi, ponieważ ekspresja celów JHAMT i Vg została znacznie zmniejszona in vivo.

Ta metoda dostarczania jest również skuteczna w przypadku innego szkodnika pluskwiaka błotnego, pluskwiaka arlekinowego. Jak wskazują ich zielone odchody. Po obejrzeniu tych wizualnych demonstracji powinieneś dobrze zrozumieć, jak dostarczać dwuniciowemu RNA owadom poprzez doustne spożycie w celu indukowania owadów RNAi in vivo.

Postępy w technologii nucelotydów RNAi nadal poszerzają możliwości naukowców w zakresie modulowania RNA, ekspresji genów i poziomów białek w szerokim zakresie organizmów żywych. Dotyczy to zarówno roślin, jak i owadów oraz najtrudniejszych mikroorganizmów. Tak więc, podczas gdy koszt produkcji dwuniciowego RNA nadal spada, a metody dostarczania i stabilność nadal się poprawiają, przyszłość technologii RNAi będzie nadal wykorzystywana do rozwiązywania pojawiających się, złożonych problemów.