Name: Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Poznaj metodę szybkiej oceny generowania cytotoksycznych limfocytów T przy użyciu barwienia CFSE w komórkach OT-I. Technika ta pozwala w ciągu czterech dni ocenić skuteczność adiuwantów w rozwoju szczepionek przeciwko nowotworom i patogenom wewnątrzkomórkowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Jesteśmy wdzięczni naszym asystentom technicznym: U. Bröderowi i H. Shkarletowi, którzy pomagali nam podczas procedur eksperymentalnych. Prace te zostały częściowo sfinansowane z grantów unijnych (UniVax, umowa nr 601738, oraz TRANSVAC2, umowa nr . 730964) oraz stypendium Stowarzyszenia Helmholtza (HAI-IDR). Źródła finansowania nie miały wpływu na projekt badawczy, powstanie manuskryptu ani decyzję o przekazaniu go do publikacji.

Wszystkie myszy użyte w tym badaniu pochodziły z tła C57BL/6. Wszystkie zwierzęta były trzymane w warunkach wolnych od patogenów. Wszystkie doświadczenia zostały przeprowadzone zgodnie z normatywem niemieckiego prawa o ochronie zwierząt (TierSchG BGBl. I S 1105; 25.05.1998) i zostały zatwierdzone przez Komisję ds. Etyki Doświadczeń na Zwierzętach Dolnej Saksonii oraz Urząd Krajowy (Krajowy Urząd Ochrony Konsumentów i Bezpieczeństwa Żywności Dolnej Saksonii), pod numerem zezwolenia 33.4-42502-04-13/1281 i 162280.
1. Barwienie komórek OT-I T metodą CFSE i transfer adoptywny
UWAGA: Myszy OT-I są transgenicznie generowanymi zwierzętami, które wyrażają receptor limfocytów T (TCR) ze stałymi łańcuchami α i β, które razem rozpoznają immunodominujący peptyd OVA, SIINFEKL10,11. W rezultacie myszy te mają znacznie dużą liczbę limfocytów T CD8 + specyficznych dla SIINFEKL (97%)12 w porównaniu z myszami normalnymi lub zaszczepionymi przez OVA (≤ 1%)13.
<ol>
	<li>Izolacja identyfikowalnych limfocytów T CD8 + od myszy OT-I z ekspresją allelu Thy1a (Thy1.1) specyficznego dla limfocytów T:
	<ol>
		<li>Poddaj eutanazji myszy OT-I w wieku 6-9 tygodni przez inhalację CO2, a następnie zwichnięcie szyjki macicy14. Wypreparować śledzionę i główne węzły chłonne (tylko pary pachwinowe, pachowe i szyjne), przecinając skórę nożyczkami chirurgicznymi, odrywając skórę od ciała za pomocą szczypiec chirurgicznych i kleszczy, a następnie umieścić je na szalkach Petriego (60 x 15 mm), z których każda zawiera miseczkę z siatki porów o wielkości 100 μm do rozdrabniania tkanek i uwalniania komórek.</li>
		<li>Utrzymuj szalki Petriego (każda z jedną miseczką siatkową) w 3-5 ml kompletnego podłoża RPMI (RPMI 1640, 10% v/v FCS, 100 U/ml penicyliny, 50 μg/ml streptomycyny) trzymanej na lodzie.</li>
		<li>Rozgnieć narządy za pomocą tłoka strzykawki lub podobnego sterylnego narzędzia (wcześniejsze cięcie nie jest konieczne) i zebrać powstałą zawiesinę jednokomórkową do probówek wirówkowych o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant. Przemyć komórki w 10 ml zimnego PBS przez odwirowanie i zlizować erytrocyty ze śledziony poprzez ponowne zawieszenie osadu w 1 ml / śledzionę buforu chlorku amonu (bufor ACK, dostępny w handlu). Inkubować komórki przez 1,5 minuty na lodzie, a następnie przemyć komórki 10 ml zimnego PBS przez odwirowanie (jak poprzednio).</li>
		<li>Zawiesić osad w tej samej probówce w 1 ml PBS (pH 7,2) zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej w celu izolacji magnetycznej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wykonać izolację magnetyczną, przejdź do negatywnej selekcji limfocytów T CD8 + za pomocą zestawu do izolacji magnetycznej zgodnie z instrukcjami producenta lub opublikowanymi protokołami15.</li>
	<li>Aby wykonać barwienie CFSE, najpierw policz liczbę limfocytów T CD8 + uzyskanych od myszy OT-I za pomocą automatycznego licznika komórek (licznika cząstek). Zabarwić 1 - 5 x 107 komórek/ml w objętości 1-5 ml za pomocą 5 μM CFSE w PBS przez 7 minut w temperaturze 37 °C, chronić przed światłem w 15-ml probówce Falcon.</li>
	<li>Ugasić barwienie CFSE przez dodanie tej samej objętości (1:1) płodowej surowicy bydlęcej do komórek i inkubować je przez dodatkowe 7 minut w temperaturze 37 °C, chroniąc przed światłem. Umyj komórki dwukrotnie 10 ml PBS.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą automatycznego licznika komórek. Ustaw liczbę komórek na 3-5 x 107 komórek/ml PBS, aby wstrzyknąć 3-5 x 106 komórek/mysz w 100 μl dożylnie (dożylnie) przez żyłę ogonową.</li>
	<li>Aby wykonać iniekcje do żyły ogonowej, unieruchomić myszy w odpowiednich ogranicznikach. Ogrzej grzbiet i ogon myszy, które mają być wstrzyknięte, za pomocą lampy światła czerwonego, umieszczonej w odległości od 20 do 25 cm od myszy na 1-3 minuty, aby umożliwić rozszerzenie naczyń krwionośnych żył ogonowych. 
	UWAGA: Ułatwia to wykrywanie żył i podawanie zawiesiny komórkowej.</li>
	<li>Upewnij się (z ręką umieszczoną między myszami a lampą), że nie jest zbyt gorąco dla myszy i gdy żyły ogonowe są wyraźnie widoczne, przystąp do wstrzykiwania. Wstrzyknąć komórki do żyły ogonowej bocznej lub grzbietowej za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 25G16.</li>
</ol>
2. Immunizacja (Endo-free OVA +/- Adiuwant)
<ol>
	<li>Umieść myszy z przeszczepionymi komórkami OT-I (krok 1.7, <silna klasa="xfig">Rysunek 1) w komorze anestezjologicznej i podaj izofluran w tlenie za pomocą urządzenia do znieczulenia14.</li>
	<li>Kiedy mysz całkowicie śpi w znieczuleniu, wyjmij ją z komory i ogol futro myszy na obszarze nad pośladkiem powierzchownym (boczna dolna część pleców) za pomocą elektrycznej maszyny do przycinania włosów, aby wykonać czysty zastrzyk z dobrym widokiem obszaru aplikacji.</li>
	<li>Wstrzyknąć 50 μl szczepionki s.c. w ogolone miejsce za pomocą igły o rozmiarze 25.</li>
</ol>
3. Izolacja limfocytów i barwienie do analizy cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Izolacja limfocytów i splenocytów
	<ol>
		<li>Poddać eutanazji zaszczepione myszy przez wdychanie CO2 , a następnie zwichnięcie szyjki macicy.</li>
		<li>Wyodrębnić drenujące i odległe węzły chłonne oraz śledzionę i umieścić je na oddzielnych szalkach Petriego zawierających kubki o siatkowej siatce porów 100 μm do rozdrabniania tkanek i uwalniania komórek. Wykonaj kroki od 1.1.2 do 1.1.3.</li>
		<li>Zdekantować supernatant po odwirowaniu i ponownie zawiesić granulki komórek w tej samej objętości pozostałości PBS (ok. 100 μL).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie do analizy metodą cytometrii przepływowej
	<ol>
		<li>W probówce wirówkowej o pojemności 15 ml należy przygotować mieszankę wzorcową zawierającą przeciwciała barwiące w stężeniach przedstawionych w tabeli 1, uzyskując w ten sposób 2-krotnie skoncentrowaną mieszaninę barwiącą. Przygotować wystarczającą objętość mieszanki wzorcowej, aby uzyskać 100 μl na próbkę. Wymieszać komórki i mieszankę wzorcową w stosunku 1:1 i inkubować w temperaturze 4°C przez 30 min. 
		UWAGA: Ostateczna objętość barwienia na próbkę powinna wynosić 200 μl (100 μl osadu komórkowego + 100 μl głównej mieszanki przeciwciał).</li>
		<li>Przemyć komórki dwukrotnie przez odwirowanie zgodnie z opisem w ppkt 1.1.3, dwukrotnie dodając 10 ml PBS.</li>
		<li>Ponownie zawiesić wybarwione komórki w 0,5-1 ml PBS w celu pobrania i przenieść zawiesinę do probówek cytometru przepływowego. Próbki należy zawsze przechowywać na lodzie i chronić przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa
<ol>
	<li>Próbki komórek należy zawsze wstępnie filtrować za pomocą filtrów 70-100 μm.</li>
	<li>Przygotować pojedyncze kontrole kompensacji barwienia dla fluoroforów wyszczególnionych w Tabeli 1 (kulki lub komórki). 
	UWAGA: Kompensację należy przeprowadzić w cytometrze lub oprogramowaniu do analizy17,18,19 i zastosować do wszystkich próbek.</li>
	<li>Postępuj zgodnie ze strategią bramkowania przedstawioną w Rysunek 2. Krótko mówiąc, populacje bramek w obszarze rozproszenia z przodu w porównaniu z obszarem rozproszenia z przodu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A) i ponownie obszar rozproszenia bocznego w porównaniu z obszarem rozproszenia bocznego (SSA, <silna klasa="xfig">Rysunek 2B) w celu wykluczenia dubletów.</li>
	<li>Bramka populacji z klasy <silnej = "xfig">Rysunek 2B, wykreślając BV 650 (autofluorescencja) vs. FITC (CFSE) w celu odróżnienia prawdziwych komórek barwionych CFSE od komórek o wysokiej zawartości autofluorescencji. Włączyć kulki lub komórki barwione przeciwciałem sprzężonym z BV 650 do kontroli kompensacyjnych. Ten wykres (klasa <silna="xfig">Rysunek 2C) BV 650 vs. FITC służy do bramkowania komórek barwionych OT-I CFSE.</li>
	<li>Bramka populacji z <silna klasa="xfig">Rysunek 2C dla Pe-Cy7 (Thy1.1 -CD90.1-) vs. APC (CD8) w celu rozróżnienia komórek pochodzących od myszy dawcy i biorcy. 
	UWAGA: Komórki pochodzące od myszy dawcy OT-I to Thy1.1+ (CD90.1), podczas gdy komórki pochodzące od myszy WT (C57BL / 6, biorca) to Thy1.2+ (CD90.2) (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D). Niektóre laboratoria mają myszy OT-I w tle Thy1.2 i WT (C57BL / 6) w Thy1.1. W takim przypadku należy użyć przeciwciała przeciwko Thy1.2 do bramkowania komórek OT-I.</li>
	<li>Ponownie bramkuj komórki CD8 + z populacji Thy1.1 +, wykreślając je na bramce składającej się z BV 450 (CD4) kontra APC (CD8) (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Wyświetl populację bramkowaną w <silna klasa="xfig">Rysunek 2E, używając histogramu komórek CD8+ pokazujących CFSE (FITC, 530/15 kanał -niebieski laser-), bramki proliferowanej populacji, uwzględniając intensywności od 102 do poziomu, w którym znajdują się niepodzielone populacje kontrolne (intensywności ~105, w zależności od skuteczności barwienia CFSE i ustawienia napięcia na cytometrze przepływowym) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2F).</li>
	<li>Wykonać dodatkową bramkę (nie pokazaną na rysunku 2) wykreślającą znacznik FITC w stosunku do L/D (kanał 450/20, laser UV) w celu oceny martwych komórek równolegle z oceną proliferacji.</li>
	<li>Zbierz co najmniej 5000 zdarzeń dla kontroli kompensacji i 10 000 zdarzeń (bramka E, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2) z próbek w cytometrze przepływowym. Uruchom cytometr przy niskim lub średnim przepływie (nie przekraczaj natężenia przepływu 20 000 zdarzeń/s).</li>
</ol>

<ol><li>Krishna, S., Anderson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-Cell+Epitope+Discovery+for+Therapeutic+Cancer+Vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">T-Cell Epitope Discovery for Therapeutic Cancer Vaccines.</a> Methods Mol Biol. 1403, 779-796 (2016).</li>
<li>Pinchuk, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+CD8%2B+T+cell+heptaepitope+minigene+vaccine+induces+protective+immunity+against+Chlamydia+pneumoniae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">A CD8+ T cell heptaepitope minigene vaccine induces protective immunity against Chlamydia pneumoniae.</a> Journal of immunology. 174, 5729-5739 (2005).</li>
<li>Zhang, J., Silvestri, N., Whitton, J. L., Hassett, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonates+mount+robust+and+protective+adult-like+CD8%28%2B%29-T-cell+responses+to+DNA+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+virology%22%5BJournal%5D)">Neonates mount robust and protective adult-like CD8(+)-T-cell responses to DNA vaccines.</a> Journal of virology. 76, 11911-11919 (2002).</li>
<li>Marchant, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+CD8%28%2B%29+T+lymphocyte+response+to+viral+infection+during+fetal+life%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mature CD8(+) T lymphocyte response to viral infection during fetal life.</a> J Clin Invest. 111, 1747-1755 (2003).</li>
<li>Simmons, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mucosal+delivery+of+a+respiratory+syncytial+virus+CTL+peptide+with+enterotoxin-based+adjuvants+elicits+protective%2C+immunopathogenic%2C+and+immunoregulatory+antiviral+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Mucosal delivery of a respiratory syncytial virus CTL peptide with enterotoxin-based adjuvants elicits protective, immunopathogenic, and immunoregulatory antiviral CD8+ T cell responses.</a> Journal of immunology. 166, 1106-1113 (2001).</li>
<li>Fulginiti, V. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Virus+Immunizationa+Field+Trial+Of+Two+Inactivated+Respiratory+Virus+Vaccines%3B+An+Aqueous+Trivalent+Paratnfluenza+Virus+Vaccine+And+An+Alum-Precipitated+Respiratory+Syncytial+Virus+Vaccine1%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+epidemiology%22%5BJournal%5D)">Respiratory Virus Immunizationa Field Trial Of Two Inactivated Respiratory Virus Vaccines; An Aqueous Trivalent Paratnfluenza Virus Vaccine And An Alum-Precipitated Respiratory Syncytial Virus Vaccine1.</a> American journal of epidemiology. 89, 435-448 (1969).</li>
<li>Olson, M. R., Varga, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+T+cells+inhibit+respiratory+syncytial+virus+%28RSV%29+vaccine-enhanced+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">CD8 T cells inhibit respiratory syncytial virus (RSV) vaccine-enhanced disease.</a> Journal of immunology. 179, 5415-5424 (2007).</li>
<li>Lirussi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+IFN+and+not+TNF%2C+is+Essential+for+Cyclic+Di-nucleotide-elicited+CTL+by+a+Cytosolic+Cross-presentation+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22EBioMedicine%22%5BJournal%5D)">Type I IFN and not TNF, is Essential for Cyclic Di-nucleotide-elicited CTL by a Cytosolic Cross-presentation Pathway.</a> EBioMedicine. 22, 100-111 (2017).</li>
<li>Ebensen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-%283%27%2C5%27%29-cyclic+dimeric+adenosine+monophosphate%3A+strong+Th1%2FTh2%2FTh17+promoting+mucosal+adjuvant%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Bis-(3',5')-cyclic dimeric adenosine monophosphate: strong Th1/Th2/Th17 promoting mucosal adjuvant.</a> Vaccine. 29, 5210-5220 (2011).</li>
<li>Hogquist, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+antagonist+peptides+induce+positive+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">T cell receptor antagonist peptides induce positive selection.</a> Cell. 76, 17-27 (1994).</li>
<li>Clarke, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+ovalbumin-specific+TCR+transgenic+line+OT-I%3A+MHC+elements+for+positive+and+negative+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection.</a> Immunology and cell biology. 78, 110-117 (2000).</li>
<li>Topham, D. J., Castrucci, M. R., Wingo, F. S., Belz, G. T., Doherty, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+antigen+in+the+localization+of+naive%2C+acutely+activated%2C+and+memory+CD8%28%2B%29+T+cells+to+the+lung+during+influenza+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">The role of antigen in the localization of naive, acutely activated, and memory CD8(+) T cells to the lung during influenza pneumonia.</a> Journal of immunology. 167, 6983-6990 (2001).</li>
<li>Le Bon, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-priming+of+CD8%2B+T+cells+stimulated+by+virus-induced+type+I+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+immunology%22%5BJournal%5D)">Cross-priming of CD8+ T cells stimulated by virus-induced type I interferon.</a> Nature immunology. 4, 1009-1015 (2003).</li>
<li>Otto, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOtto%2C+K+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 555-569 (2004).</li>
<li>Lim, J. F., Berger, H., Su, I. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Activation+of+Murine+Lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and Activation of Murine Lymphocytes.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. , (2016).</li>
<li>Shimizu, S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShimizu%2C+S+%22The+Laboratory+Mouse%22">The Laboratory Mouse</a>. Bullock, G. , Academic Press. 527-542 (2004).</li>
<li>Breton, G., Lee, J., Liu, K., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+human+dendritic+cell+progenitors+by+multiparametric+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+protocols%22%5BJournal%5D)">Defining human dendritic cell progenitors by multiparametric flow cytometry.</a> Nature protocols. 10, 1407-1422 (2015).</li>
<li>Kaminski, D. A., Wei, C., Rosenberg, A. F., Lee, F. E. -H., Sanz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparameter+Flow+Cytometry+and+Bioanalytics+for+B+Cell+Profiling+in+Systemic+Lupus+Erythematosus%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Multiparameter Flow Cytometry and Bioanalytics for B Cell Profiling in Systemic Lupus Erythematosus.</a> Methods in molecular biology. 900, Clifton, N.J. 109-134 (2012).</li>
<li>Bayer, J., Grunwald, D., Lambert, C., Mayol, J. F., Maynadie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thematic+workshop+on+fluorescence+compensation+settings+in+multicolor+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+cytometry%22%5BJournal%5D)">Thematic workshop on fluorescence compensation settings in multicolor flow cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical cytometry. 72, 8-13 (2007).</li>
<li>Newrzela, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+receptor+diversity+prevents+T-cell+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">T-cell receptor diversity prevents T-cell lymphoma development.</a> Leukemia. 26, 2499-2507 (2012).</li>
<li>Iwasaki, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allergen+endotoxins+induce+T-cell-dependent+and+non-IgE-mediated+nasal+hypersensitivity+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Allergen endotoxins induce T-cell-dependent and non-IgE-mediated nasal hypersensitivity in mice.</a> J Allergy Clin Immunol. 139, 258-268 (2017).</li>
<li>Tsuchiya, K., Siddiqui, S., Risse, P. A., Hirota, N., Martin, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+presence+of+LPS+in+OVA+inhalations+affects+airway+inflammation+and+AHR+but+not+remodeling+in+a+rodent+model+of+asthma.+American+journal+of+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Lung+cellular+and+molecular+physiology%22%5BJournal%5D)">The presence of LPS in OVA inhalations affects airway inflammation and AHR but not remodeling in a rodent model of asthma. American journal of physiology.</a> Lung cellular and molecular physiology. , L54-L63 (2012).</li>
<li>Burgdorf, S., Scholz, C., Kautz, A., Tampe, R., Kurts, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+mechanistic+separation+of+cross-presentation+and+endogenous+antigen+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spatial and mechanistic separation of cross-presentation and endogenous antigen presentation.</a> Nature. 9, 558-566 (2008).</li>
<li>Last'ovicka, J., Budinsky, V., Spisek, R., Bartunkova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+lymphocyte+proliferation%3A+CFSE+kills+dividing+cells+and+modulates+expression+of+activation+markers%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+immunology%22%5BJournal%5D)">Assessment of lymphocyte proliferation: CFSE kills dividing cells and modulates expression of activation markers.</a> Cellular immunology. , 79-85 (2009).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+characterization+of+CD8%28%2B%29+antigen-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+after+enrichment+based+on+cytokine+secretion%3A+comparison+with+the+MHC-tetramer+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Functional characterization of CD8(+) antigen-specific cytotoxic T lymphocytes after enrichment based on cytokine secretion: comparison with the MHC-tetramer technology.</a> Scand J Immunol. 52, 544-549 (2000).</li>
<li>Wang, W., Golding, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytotoxic+T+lymphocyte+response+against+a+protein+antigen+does+not+decrease+the+antibody+response+to+that+antigen+although+antigen-pulsed+B+cells+can+be+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+letters%22%5BJournal%5D)">The cytotoxic T lymphocyte response against a protein antigen does not decrease the antibody response to that antigen although antigen-pulsed B cells can be targets.</a> Immunology letters. 100, 195-201 (2005).</li>
<li>O'Sullivan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory+CD8%28%2B%29+T+cells+use+cell-intrinsic+lipolysis+to+support+the+metabolic+programming+necessary+for+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Memory CD8(+) T cells use cell-intrinsic lipolysis to support the metabolic programming necessary for development.</a> Immunity. 41, 75-88 (2014).</li>
<li>Xu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+interferon+protects+antiviral+CD8%2B+T+cells+from+NK+cell+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Type I interferon protects antiviral CD8+ T cells from NK cell cytotoxicity.</a> Immunity. 40, 949-960 (2014).</li>
<li>Volk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+three+humanized+mouse+models+for+adoptive+T+cell+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+gene+medicine%22%5BJournal%5D)">Comparison of three humanized mouse models for adoptive T cell transfer.</a> The journal of gene medicine. 14, 540-548 (2012).</li>
<li>Safinia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+Mice+as+Preclinical+Models+in+Transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Humanized Mice as Preclinical Models in Transplantation.</a> Methods Mol Biol. 1371, 177-196 (2016).</li>
<li>Grover, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humanized+NOG+mice+as+a+model+for+tuberculosis+vaccine-induced+immunity%3A+a+comparative+analysis+with+the+mouse+and+guinea+pig+models+of+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Humanized NOG mice as a model for tuberculosis vaccine-induced immunity: a comparative analysis with the mouse and guinea pig models of tuberculosis.</a> Immunology. 152, 150-162 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Nowoczesne szczepionki są idealnie skomponowane z oczyszczonego antygenu i adiuwantów, z możliwym dodatkiem systemu dostarczania, takiego jak liposomy, cząsteczki wirusopodobne, nanocząstki lub żywe wektory. Kluczowym aspektem przy projektowaniu szczepionki jest wybór odpowiedniego adiuwanta w zależności od potrzeb klinicznych. Część zakresu może obejmować faworyzowanie humoralnej i komórkowej odpowiedzi immunologicznej (lub obu), wybór lokalnej i ogólnoustrojowej odpowiedzi immunologicznej (lub obu) oraz rodzaj pamięci,...

Szczepionki indukujące cytotoksyczne limfocyty T (CTL) są kluczowymi interwencjami terapeutycznymi, które zostały opracowane do walki z pewnymi typami raka1. CTL są również ważne dla szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym2. Co więcej, CTL są jednym z niewielu immunologicznych mechanizmów obronnych funkcjonalnie aktywnych w populacjach ryzyka, takich jak noworodki3,4, które również polegają na CTL w zwalczaniu infekcji we wczesnym okresie życia5. W związku z tym szczepionki przeciwko syncytialnemu wirusowi oddechowemu (RSV), które zostały opracowane z adiuwantem, który nie wywołuje odpowiedzi CTL (ałun), spowodowały całkowite niepowodzenie szczepionki, co doprowadziło do poważnych powikłań po zakażeniach u niemowląt6. Te negatywne skutki szczepienia mogą być odwrócone przez odpowiedź limfocytów T CD8+7. Wcześniej wykazaliśmy, że główne cytokiny (interferony typu I) wywoływane przez niektórych agonistów stymulatora genów interferonu (STING) są niezbędne dla odpowiedzi CTL generowanych przez te adiuwanty8, częściowo poprzez pomiar proliferacji komórek OT-I T po szczepieniu i wykorzystanie tych wyników jako miary zdolności indukowania CTL obserwowanych w rozszerzonych schematach szczepień9. Pomiar proliferacji limfocytów T OT-I CD8 + u myszy biorcy C57BL / 6 typu dzikiego (WT) za pomocą rozcieńczenia barwnika estrem karboksyfluoresceiny sukcynimidylowej (CFSE) jest solidnym oszacowaniem zdolności adiuwanta szczepionki do generowania mieszanego primingu SIINFEKL (immunodominującego peptydu albuminy jaja kurzego, OVA). Odmiany tej techniki są szeroko stosowane do oceny proliferacji limfocytów T OT-I CD8 + i OT-II CD4 +. Na przykład stosowano go przy braku wybranych cytokin (myszy KO) lub do pomiaru skuteczności szczepionki po wycofaniu antygenu u zwierząt z gatunku WT. Opracowaliśmy krótki protokół (4-dniowy eksperyment), w którym po biernym transferze limfocytów T OT-I CD8 + barwionych CPSE CPS, podaje się podskórną (s.c.) immunizację składającą się z jednej dawki 50 μg OVA wolnej od endotoksyn uzupełnionej adiuwantami testowymi (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Monitorowanie wyników 48 godzin po szczepieniu dostarcza wiarygodnego dowodu na zdolność adiuwanta do generowania odpowiedzi CTL. Dzięki tej strategii można ocenić siłę miejscowej odpowiedzi immunologicznej w drenującym węźle chłonnym po szczepieniu, a także zakres odpowiedzi poprzez pomiar aktywności CTL w śledzionie (lub odległych węzłach chłonnych).

<table><tbody><tr><td>Analizator komórek BD LSR Fortessa</td><td>Cytometr przepływowy</td><td>BD</td> specjalnego <td>zamówienia</td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>CFSE</td><td>C34554</td><td>Barwnik proliferacyjny</td></tr><tr><td>Mysz MojoSort Zestaw do izolacji komórek T CD8 Biolegend</td><td></td><td>480007</td><td>Izolacja magnetyczna Koraliki i przeciwciała do negatywnej selekcji nietkniętych limfocytów T CD8.</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Zestaw do barwienia niebieskich martwych komórek, do wzbudzania UV</td><td>Sondy molekularne</td><td>L23105</td><td>Marker martwych komórek</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Przeciwciało monoklonalne (HIS51), PE-cyjanina7</td><td>eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>Przeciwciało</td></tr><tr><td>APC przeciwko myszom Przeciwciało CD8a</td><td>Przeciwciało BioLegend</td><td>100712</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Przeciwciało przeciw myszy Szczur</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>CD4 BD 740007Redlica Z2 Analizator liczby i wielkości cząstek</td><td>Beckman Coulter</td><td>9914591DA</td><td>Licznik komórek. Z2 Automatyczny licznik cząstek/komórek</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td> <td>Hyglos (Niemcy)</td> <td>321000</td><td>Testowany bez endotoksyn albuminy jaja kurzego.</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe 100&micro; m nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Sitko do komórek (100 &mikro; m miseczki z siatki porów).</td></tr><tr><td>Fiolki na próbki</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Fiolki na próbki do myszy z automatycznym licznikiem Z2</td></tr><tr><td>C57BL/6 (CD90.2)</td><td>Harlan (Rossdorf, Niemcy)</td><td></td><td>Firma to teraz Envigo</td></tr><tr><td>OT-I (tło C57BL/6, CD90.1)</td><td>Harlan (Rossdorf, Niemcy)</td><td></td><td>Chów wsobny w naszym zakładzie dla zwierząt. Firma, z której zakupiono dominek, to obecnie Envigo</td></tr><tr><td>Probówki FACS</td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon Probówki polistyrenowe z okrągłym dnem</td></tr><tr><td>Falcon 15 ml probówki</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Stożkowe probówki wirówkowe Falcon 15</td></tr><tr><td>ml PBS (500 ml)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (sól fizjologiczna buforowana fosforanami), pH 7,2</td></tr><tr><td>Czerwona lampa (lampa grzewcza)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (Niemcy)</td><td>405096</td><td>Lampa grzewcza (100 watów)</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane)</td><td>Abbott Laboratories (USA)</td><td>5260.04-05.</td><td>Izofluran znieczulający (kolba 250 ml).</td></tr><tr><td> stołowa maszyna anestezjologiczna / mobilna maszyna anestezjologiczna z absorberem CO2 </td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>Izofluran aparat do znieczulenia.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco (dystrybuowane przez ThermoFischer)</td><td>11-875-093</td><td>Pożywka bazowa z glutaminą (500 ml)</td></tr><tr><td>Roztwór antybiotyku Pen-Strept (Gibco)</td><td>Gibco (dystrybuowane przez ThermoFischer)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco Penicylina-Streptomycyna (10 000 U/ml)</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bobine (Gibco)</td><td>Gibco (dystrybuowana przez ThermoFischer)</td><td>10082147</td><td>Płodowa surowica bydlęca, certyfikowana, inaktywowana termicznie, pochodzenie z USA</td></tr><tr><td>Bufor lizujący ACK (100 ml)</td><td>Gibco (dystrybuowany przez ThermoFischer)</td><td>A1049201</td><td>Bufor do lizy krwi pełnej z chlorkiem amonu (ACK), odpowiedni również do lizy erytrocytów w zawiesinach śledziony</td></tr><tr><td>Plastikowe szalki Petriego</td><td>Nunc (dystrybuowane przez ThermoFischer)</td><td>150340</td><td>60 x 15mm Plastikowa szalka Petriego, nieobrobiony</td></tr><tr><td>filtr grudek komórkowych</td><td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>KomórkaTrics&reg; 50 &mu; m, sterylne</td></tr></tbody></table>

szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów t adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Ocena nowoczesnych szczepionek podjednostkowych pokazuje, że wytwarzanie przeciwciał neutralizujących jest ważne, ale niewystarczające do wyboru adiuwantów. Dlatego pilnie potrzebne są adiuwanty o zdolnościach immunostymulujących zarówno humoralnych, jak i komórkowych, które są w stanie promować odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T (CTL). W związku z tym wierne monitorowanie kandydatów na adiuwanty, które indukują mieszanie, a następnie zwiększają wytwarzanie CTL, stanowi kluczowy krok w opracowywaniu szczepionek. W niniejszym artykule przedstawiamy zastosowanie metody wykorzystującej limfocyty T specyficzne dla SIINFEKL (OT-I) do monitorowania prezentacji krzyżowej modelowej antyalbuminy jaja kurzego (OVA) in vivo w obecności różnych kandydatów na adiuwanty. Ta metoda stanowi szybki test w celu wybrania adiuwantów o najlepszych zdolnościach do mieszania. Proliferacja limfocytów T CD8 + jest najcenniejszym wskaźnikiem torowania krzyżowego i jest również uważana za korelat prezentacji krzyżowej indukowanej adiuwantem. Ta cecha może być oceniana w różnych narządach odpornościowych, takich jak węzły chłonne i śledziona. Można również monitorować zakres wytwarzania CTL, co daje wgląd w charakter odpowiedzi miejscowej (głównie drenaż węzłów chłonnych) lub ogólnoustrojowej (odległe węzły chłonne i/lub śledziona). Technika ta pozwala ponadto na wielokrotne modyfikacje w celu testowania leków, które mogą hamować określone szlaki prezentacji krzyżowej, a także oferuje możliwość stosowania w różnych szczepach myszy konwencjonalnych i modyfikowanych genetycznie. Podsumowując, aplikacja, którą tutaj prezentujemy, będzie przydatna dla laboratoriów szczepionkowych w przemyśle lub środowisku akademickim, które opracowują lub modyfikują adiuwanty chemiczne do badań i rozwoju szczepionek.

Aby przetestować terapie z wykorzystaniem innej kombinacji adiuwantów (ADJ1 i ADJ2), oceniliśmy zdolność do generowania CTL poprzez pomiar proliferacji adoptywnie przeniesionych komórek T CD8+ OT-I za pomocą cytometrii przepływowej (Rysunek 2). W tym celu uprzednio zabarwiliśmy komórki wyizolowane z drenujących węzłów chłonnych i śledziony (Tabela 1). Pomiar proliferacji komórek T CD8+ w węzłach chłonnych i śledzionie po...

Prezentujemy tutaj aplikację do standardowej techniki immunologicznej (proliferacja OT-I barwiona CFSE) przeznaczonej do szybkiego monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T (CTL) za pośrednictwem adiuwantów in vivo. To szybkie oszacowanie zdolności CTL jest przydatne do opracowywania szczepionek profilaktycznych przeciwko patogenom wewnątrzkomórkowym, a także terapeutycznych szczepionek przeciwnowotworowych.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie zdolności adiuwantów będących przedmiotem zainteresowania do generowania cytotoksycznych limfocytów T poprzez monitorowanie adoptywnie przenoszonej proliferacji limfocytów T OT1 CD8 barwionych CFSE w drenujących węzłach chłonnych i śledzionie uodpornionych zwierząt biorców. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wakcynologii, takie jak siła działania adiuwantu w generowaniu odpowiedzi komórek cytotoksycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można określić nie tylko pojemność CTL adiuwanta, ale także to, czy jest to działanie miejscowe czy ogólnoustrojowe i można to zrobić dopiero w ciągu czterech dni.Procedurę zademonstruje technik w naszym laboratorium, Elena Reinhard. Aby wyizolować 1,1-dodatnie limfocyty T CD8 uda od myszy OT1, najpierw zbierz śledzionę i pachwinowe, pachowe i szyjne węzły chłonne zgodnie ze standardowymi protokołami, umieszczając wszystkie narządy w sitku o wielkości 100 mikrometrów na siatce o średnicy 60 milimetrów na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej od trzech do pięciu mililitrów kompletnej pożywki na lodzie na mysz podczas ich zbierania. Nie należy pobierać próbek

rapid-vivo-assessment-adjuvant-s-cytotoxic-t-lymphocytes-generation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Szybki, prosty i kosztowo efektywny protokół generowania pochodzących od dawcy wielowirusowych specyficznych limfocytów T cytotoksycznych (rCTL) do infuzji dla biorców allogenicznych przeszczepów komórek macierzystych krwi tworzącej (HSCT) będących w grupie ryzyka zakażeń CMV, Adv lub EBV. Ten proces wytwarzania jest zgodny z zasadami GMP i powinien zapewnić szersze wdrożenie immunoterapii limfocytami T poza wyspecjalizowanymi ośrodkami.

Generowanie wielowirusowych swoistych limfocytów T w celu zapobiegania i leczenia infekcji wirusowych po allogenicznym przeszczepieniu hematopoetycznych komórek macierzystych

Film demonstruje immunologiczną metodę monitorowania in vivo indukowanej adiuwantem produkcji cytotoksycznych limfocytów T lub CTL. Myszowi wstępnie wstrzykuje się genetycznie zmodyfikowane, proliferacyjne, barwione barwnikiem limfocyty T CD8 + dawcy. Podskórne wstrzyknięcie albuminy jaja kurzego z adiuwantami generuje cytotoksyczne limfocyty T CD8 +, które są identyfikowane po zbiorze za pomocą barwienia immunologicznego i cytometrii przepływowej.

Immunologiczna technika monitorowania wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T za pośrednictwem adiuwantów

Możliwość szczegółowego monitorowania odpowiedzi limfocytów T in vivo jest ważna dla rozwoju naszego zrozumienia odpowiedzi immunologicznej. W tym miejscu opisujemy zastosowanie docelowych macierzy fluorescencyjnych (FTA) w teście in vivo limfocytów T, który ocenia &gt;250 parametrów jednocześnie za pomocą cytometrii przepływowej.

Zastosowanie fluorescencyjnych macierzy docelowych do oceny odpowiedzi limfocytów T in vivo

Opisujemy obrazowanie całego zwierzęcia i techniki oparte na cytometrii przepływowej do monitorowania ekspansji limfocytów T CD8+ specyficznych dla antygenu w odpowiedzi na immunizację nanocząstkami w mysim modelu szczepienia.

Obrazowanie całych zwierząt i techniki cytometrii przepływowej do analizy odpowiedzi limfocytów T CD8 + specyficznych dla antygenu po szczepieniu nanocząstkami

Celem tego protokołu jest umożliwienie wykrywania in vivo specyficznego dla antygenu zabijania komórki docelowej w modelu mysim.

In vivo (in vivo) Test do wykrywania swoistej dla antygenu funkcji cytolitycznej limfocytów T przy użyciu modelu szczepienia

Tutaj prezentujemy demonstrację modelu przywołania pęcherza ssącego na skórę. Model ten umożliwia prosty dostęp do badania in vivo adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych u ludzi, na przykład w kontekście opracowywania szczepionek.

Protokół blistra ssącego do badania reakcji przywołania ludzkich limfocytów T in vivo

Eksperymentalne procedury późniejszej ekstrakcji tkanek limfatycznych w celu przetestowania aktywacji limfoidalnych komórek dendrytycznych są opisane po leczeniu immunostymulującym nanomateriałem.

Ocena czynnika immunostymulującego: ekstrakcja tkanki limfatycznej i aktywacja komórek dendrytycznych zależna od drogi iniekcji

Opisujemy tutaj test zabijania in vivo oparty na cytometrii przepływowej, który umożliwia badanie dominacji immunologicznej w odpowiedziach cytotoksycznych limfocytów T (CTL) na modelowy antygen nowotworowy. Podajemy przykłady, w jaki sposób ten elegancki test może być wykorzystany do badań mechanistycznych i do testowania skuteczności leków.

Dostosowywanie testów cytotoksyczności in vivo do badania immunodominacji w odpowiedziach limfocytów T CD8 + specyficznych dla nowotworu

Protokół przedstawia szczegółowe metody oceny, czy adiuwant nanoemulsji ofiopogoniny D wspomaga skuteczne komórkowe odpowiedzi immunologiczne.

In vitro Ocena aktywności komórkowej adiuwantu szczepionki nanoemulsyjnej ofiopogoniny D

Tutaj prezentujemy szczegółowe metody przygotowania i oceny nosowej samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsji in vitro i in vivo.

Przygotowanie, charakterystyka, toksyczność i skuteczność oceny samoorganizującej się szczepionki przeciwnowotworowej z nanoemulsją do nosa in vitro i in vivo

Metodologia opisuje wytwarzanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych (MoDC) i ich zastosowanie do oceny in vitro kandydatów na antygeny podczas opracowywania potencjalnych szczepionek weterynaryjnych u bydła.

Oznaczanie immunogenności szczepionki przy użyciu komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów bydlęcych

Poznaj metodę szybkiej oceny generowania cytotoksycznych limfocytów T przy użyciu barwienia CFSE w komórkach OT-I. Technika ta pozwala w ciągu czterech dni ocenić skuteczność adiuwantów w rozwoju szczepionek przeciwko nowotworom i patogenom wewnątrzkomórkowym.

Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Przeglądaj więcej filmów