Szybka ocena in vivo zdolności wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T adiuwantu w celu opracowania szczepionki

Ogólnym celem tego eksperymentu jest określenie zdolności adiuwantów będących przedmiotem zainteresowania do generowania cytotoksycznych limfocytów T poprzez monitorowanie adoptywnie przenoszonej proliferacji limfocytów T OT1 CD8 barwionych CFSE w drenujących węzłach chłonnych i śledzionie uodpornionych zwierząt biorców. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie wakcynologii, takie jak siła działania adiuwantu w generowaniu odpowiedzi komórek cytotoksycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że można określić nie tylko pojemność CTL adiuwanta, ale także to, czy jest to działanie miejscowe czy ogólnoustrojowe i można to zrobić dopiero w ciągu czterech dni.

Procedurę zademonstruje technik w naszym laboratorium, Elena Reinhard. Aby wyizolować 1,1-dodatnie limfocyty T CD8 uda od myszy OT1, najpierw zbierz śledzionę i pachwinowe, pachowe i szyjne węzły chłonne zgodnie ze standardowymi protokołami, umieszczając wszystkie narządy w sitku o wielkości 100 mikrometrów na siatce o średnicy 60 milimetrów na 60-milimetrowej szalce Petriego zawierającej od trzech do pięciu mililitrów kompletnej pożywki na lodzie na mysz podczas ich zbierania. Nie należy pobierać próbek w dużych śledzionach lub węzłach chłonnych OT1, ponieważ limfocyty T z tych tkanek limfatycznych mogą być białaczkowe i będą się namnażać nawet bez stymulacji, zakłócając wyniki testu.

Po pobraniu wszystkich narządów od każdego zwierzęcia dawcy należy użyć tłoka strzykawki, aby przetrzeć próbki przez filtr siatkowy i przenieść powstałe pojedyncze zawiesiny do jednej stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów na mysz. Osadzać komórki przez wirowanie, a następnie płucz wirowanie w 10 mililitrach zimnego PBS. Lizować osad czerwonych krwinek w jednym mililitrze buforu chlorku amonu na probówkę na lodzie.

Po 90 sekundach umyj komórki w kolejnych 10 mililitrach PBS i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze PBS plus 5% FBS na probówkę. Następnie użyj ujemnego zestawu selektywnego, aby wyizolować limfocyty T CD8 dodatnie zgodnie ze standardowymi protokołami izolacji kulek magnetycznych i policz liczbę komórek T CD8 dodatnich posortowanych kulkami magnetycznymi. Następnie rozcieńczyć limfocyty T do jednego do pięciu na 10 do siódmych komórek na mililitr stężenia PBS w indywidualnych 15-mililitrowych stożkowych probówkach i zabarwić każdą próbkę komórki pięcioma mikromolowymi CFSE przez siedem minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza i chronić przed światłem.

Pod koniec inkubacji wygasić reakcję barwienia równą objętością FBS i umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza na dodatkowe siedem minut. Pod koniec drugiej inkubacji umyj komórki dwa razy w 10 mililitrach PBS na pranie i ponownie zawieś komórki w trzech do pięciu na 10 do siódmych komórek na mililitr objętości PBS. W celu adoptywnego przeniesienia limfocytów T OT1 oznaczonych CFSE, załaduj komórki do jednej mililitrowej strzykawki wyposażonej w igłę o rozmiarze 25 na eksperymentalną próbkę komórki i unieruchom pierwszą mysz biorcę w ograniczniku.

Następnie, gdy żyły ogonowe zostaną rozszerzone na naczynia krwionośne, dostarcz 100 mikrolitrów komórek przez boczną lub grzbietową żyłę ogonową. W celu uodpornienia adoptowanych zwierząt, należy ogolić sierść nad pośladkiem powierzchownym myszy z przeszczepionymi komórkami T OT1 i użyć igły o rozmiarze 25, aby podskórnie wstrzyknąć 50 mikrolitrów OVA wolnego od endotoksyn w ogolony obszar. Ważne jest, aby używać komórek jajowych wolnych od endotoksyn, ponieważ śladowe ilości endotoksyny w OVA mogą prowadzić do fałszywych wyników.

Czterdzieści osiem godzin po szczepieniu należy pobrać pachwinowe węzły chłonne i śledziony od każdego biorcy zgodnie ze standardowymi protokołami i wygenerować indywidualne zawiesiny jednokomórkowe dla każdej próbki węzła chłonnego i śledziony, jak właśnie pokazano. Zebrać komórki przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach PBS na próbkę. Aby zabarwić próbki do analizy cytometrycznej przepływowej, inkubować komórki ze 100 mikrolitrami koktajlu głównej przeciwciał pierwszorzędowych sprzężonych z fluoroforem przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Pod koniec inkubacji umyć komórki dwa razy w 10 mililitrach PBS i ponownie zawiesić próbki w 0,5 do jednego mililitra PBS na probówkę. Przefiltruj komórki przez sitka o średnicy od 70 do 100 mikrometrów do pięciu rurek do analizy cytometrii przepływu milimetrowego i uzyskaj pojedyncze kontrole kompensacji barwienia, a także próbki w cytometrze przepływowym. Aby przebramkować próbki, otwórz wykres wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do obszaru rozproszenia do przodu oraz wykres i bramę obszaru rozproszenia bocznego w porównaniu z obszarem rozproszenia bocznego, aby wykluczyć dublety.

Wygeneruj wykres FITC w porównaniu z autofluorescencją w celu odróżnienia populacji prawdziwych komórek barwionych CSFE od komórek o wysokiej zawartości autofluorescencji. Bramkować te wybarwione komórkami OT1 CSFE jako populacje, które rozciągają się głównie na osi FITC. Aby odróżnić komórki pochodzące od zwierząt dawcy i biorcy, należy zaszczepić udo 1,1 plus CD90 0,1 plus CD8 plus limfocyty T i ponownie bramkę populacji CD8 plus, aby wykluczyć limfocyty T CD4 i T.

Następnie wyświetl tę proliferowaną populację limfocytów T CD8 na histogramie zgodnie z ich ekspresją CSFE i bramkuje proliferowane populacje od intensywności 10 do drugiej aż do intensywności niepodzielonej populacji kontrolnej. Uzyskaj co najmniej 5 000 zdarzeń dla kontroli kompensacji i 10 000 zdarzeń dla każdej próbki przy niskiej lub średniej szybkości analizy przepływu. W tym eksperymencie dwie grupy myszy zostały zaszczepione jednym z dwóch różnych adiuwantów.

Myszy, którym wstrzyknięto OVA plus drugi adiuwant, wykazywały wyższą zdolność wytwarzania cytotoksycznych limfocytów T lokalnie w drenujących węzłach chłonnych w porównaniu z myszami, którym wstrzyknięto pierwszy adiuwant plus OVA, sama OVA lub szczepionka kontrolna PBS. Natomiast u myszy, którym wstrzyknięto drugi adiuwant plus OVA, nie wygenerowały odpowiedzi cytotoksycznych limfocytów T w przedziale ogólnoustrojowym, podczas gdy limfocyty T CD8-dodatnie wyizolowane ze śledziony adiuwanta pierwszego plus OVA myszy wykazywały wyższy poziom proliferacji niż śledziony CD8-dodatnie limfocyty T wyizolowane z samego OVA, kontroli PBS i adiuwantu dwóch plus OVA szczepionych zwierząt. Po opanowaniu technika ta pozwoli Ci określić pojemność CTL cząsteczki adiuwantowej przy użyciu antygenu OVA w ciągu zaledwie czterech dni pracy.

Po wykonaniu tej techniki będziesz mógł dalej stosować wszystkie inne techniki do wyizolowanych limfocytów T, a następnie do fenotypu profilu cytokin lub profilu metabolicznego odpowiedzi CTL twojego adiuwanta.