Name: Ocena alkalizacji lizosomalnej w jelicie żywego Caenorhabditis elegans (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-13T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Poznaj metodę oceny utraty kwasowości lizosomalnej w jelicie żywego Caenorhabditis elegans przy użyciu barwnika cDCFDA. Prosta technika do badań nad autofagią.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Centrum Genetyki Caenorhabditis za szczepy, Radzie Badań Nauk Przyrodniczych i Inżynierii (NSERC) oraz Kanadyjskiej Fundacji Innowacji (CFI) za finansowanie. Chcielibyśmy podziękować dr Lizhen Chen (Wydział Systemów Komórkowych i Anatomii, UT Health San Antonio) za umożliwienie nieograniczonego korzystania z jej urządzeń laboratoryjnych do wszystkich eksperymentów z C. elegans, a także dr Exing Wang (Zastępca Dyrektora, Zakład Obrazowania Optycznego, UT Health San Antonio) za pomoc w mikroskopii konfokalnej. Chcielibyśmy również podziękować dr Myronowi Ignatiusowi za wsparcie i zachętę do realizacji filmu.

1. Barwienie i obraz lizosomów jelitowych
<ol>
	<li>Płytki pożywki nasiennej nicieni (NGM) z OP50
	<ol>
		<li>Przygotuj płytki NGM zgodnie z zalecanym protokołem19 i pozostaw zamknięte płytki do wyschnięcia na 2 dni w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Zaszczepić bakterie OP50 w sterylnym bulionie Luria (LB) i hodować w inkubatorze z wytrząsaniem lub łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 36 godzin lub do momentu, gdy OD osiągnie zakres od 0,2 do 0,4. Unikaj stosowania kultur bakteryjnych o OD >1 lub OD <0,2.</li>
		<li>Gdy płytki NGM wyschną, umieść kroplę (~30 μl) inokulum OP50 na środku płytki, a następnie rozprowadź kroplę na plastrze o wymiarach mniej więcej 2 cm x 2 cm. 
		UWAGA: Wszelkie pozostałe inokulum OP50 można przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do miesiąca.</li>
		<li>Po wyschnięciu inokulum (około 10 lub 15 minut) odwrócić płytki OP50, a następnie inkubować płytki w temperaturze 37 °C przez 36 godzin.</li>
		<li>Po 36 godzinach wyjąć płytki z inkubatora i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu późniejszego użycia. 
		UWAGA: Talerze powinny być dobre do 1 miesiąca w temperaturze 4 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uzupełnienie cDCFDA do OP50
	<ol>
		<li>Aby uzupełnić cDCFDA na płytki OP50, należy przygotować zapas roboczy 10 mM cDCFDA w dimetylosulfotlenku (DMSO). Roztwór cDCFDA należy chronić przed światłem i przechowywać w temperaturze -20 °C do późniejszego użycia.</li>
		<li>Delikatnie umieść 100 μl 10 mM roztworu cDCFDA na powierzchni plastra OP50 o wymiarach 2 cm x 2 cm, tak aby cały plaster był równomiernie pokryty cDCFDA. 
		UWAGA: Bardzo ważne jest, aby cała łatka OP50 była pokryta cDCFDA. W razie potrzeby użyj do 150 μl cDCFDA na każdą płytkę. Konieczne jest również, aby roztwór cDCFDA nie wychodził poza granice łaty OP50, ponieważ wszelkie cDCFDA, które wypływają z plastra OP50, nie zostaną włączone do żywności i spowodują zmniejszenie intensywności barwienia.</li>
		<li>Umieść płytki OP50 w ciemnym pudełku na blacie stołu, aż cały roztwór cDCFDA zostanie wchłonięty przez plaster bakteryjny (zwykle około 25 do 30 minut).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Barwienie robaków za pomocą cDCFDA
	<ol>
		<li>Gdy cDCFDA całkowicie przeniknie do łaty OP50, umieścić nie więcej niż 20 robaków na płytce i inkubować płytki odwrócone w temperaturze 20 °C przez co najmniej 14 godzin 
		UWAGA: Zaleca się umieszczenie płytek cDCFDA w nieprzezroczystym pudełku, aby zminimalizować ekspozycję na światło.</li>
		<li>Aby kontrolować różnice w spożyciu między eksperymentami i normalizować sygnały cDCFDA, (zalecane) współbarwić 3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))metylideno]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimetyloamino)etylo]propanamidato)(difluoro)bor (2,5 μl świeżo przygotowanego roztworu 1 mM), kwasotropowym słabym barwnikiem aminowym, którego fluorescencja jest w dużej mierze niezmienna w stosunku do kwaśnego widma pH (patrz Tabela materiałów dla popularnych nazw odczynników). 
UWAGA: Nie plamić robaków krócej niż 14 godzin, ponieważ może to zapewnić niewystarczającą intensywność barwienia cDCFDA i dać fałszywą interpretację lizosomalnego pH.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie preparatów do mikroskopii
	<ol>
		<li>Umieść dwa równoległe paski taśmy do etykietowania w odległości około 3 cali od siebie na gładkiej, płaskiej powierzchni, takiej jak lustro (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
		<li>Pokryj powierzchnię lustra wodoodpornym sprayem i zetrzyj nadmiar płynu.</li>
		<li>Rozpuść 2% agarozy (rozpuszczonej w destylowanymH2O) w kuchence mikrofalowej aż do całkowitego upłynnienia, a następnie umieść kroplę 50 μl agarozy między dwoma paskami taśmy i szybko przykryj kroplę szkiełkiem mikroskopowym, tak aby szkiełko było prostopadłe do pasków taśmy. Po zestaleniu się agarozy, tworząc okrągłą podkładkę pod szkiełkiem, odwróć szkiełko i dodaj 10 do 15 μl 5 mM azydku sodu (NaN3) na podkładkę agarozową. 
		UWAGA: NaN3 jest inhibitorem cytochromu C, który stosowany w niskich stężeniach odwracalnie znieczula robaki, dzięki czemu nie poruszają się podczas obrazowania.</li>
		<li>Zbierz robaki z płytki OP50 uzupełnionej cDCFDA i przenieś je na czystą płytkę NGM bez OP50. Pozwól robakom poruszać się przez kilka sekund, aby umożliwić usunięcie większości OP50 z powierzchni robaków, a następnie przenieś robaki do podkładki agarozowej zawierającej 5 mM azydku sodu.</li>
		<li>Natychmiast przykryj podkładkę agarozową szkiełkiem nakrywkowym. Pamiętaj, aby delikatnie umieścić szkiełko nakrywkowe, nie wywierając zbyt dużego nacisku, ponieważ może to spowodować pękanie robaków. 
		UWAGA: Bakterie OP50 uzupełnione cDCFDA fluoryzują po uwidocznieniu pod mikroskopem, dlatego ważne jest, aby jak najlepiej oczyścić robaki przed umieszczeniem ich na podkładce agarozowej zawierającej azydek sodu. W przypadku przygotowania więcej niż 6 szczepów C. elegans (w tym N2, kontrola typu dzikiego), zaleca się przygotowanie próbek w partiach po 6 szczepów, tak aby robaki nie wyschły na podkładce agarozowej. W niektórych szczepach srom zaczyna pękać po dłuższym czasie z powodu nacisku szkiełka nakrywkowego, dlatego ważne jest, aby odpowiednio zaplanować.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mikroskopia konfokalna 
	UWAGA: Niektóre mikroskopy mają wbudowaną funkcję, która automatycznie zwiększa intensywność fluorescencji, aby skompensować zmienne poziomy fluorescencji. Takie mikroskopy mogą nie działać dobrze w przypadku obrazowania robaków barwionych cDCFDA, ponieważ z natury zwiększają intensywność fluorescencji próbek.
	<ol>
		<li>Wykonaj obrazowanie na standardowym mikroskopie konfokalnym przy użyciu długości fal wzbudzenia/emisji ustawionych na 488/530 nm dla cDCFDA. Wykonaj zdjęcia pojedynczej płaszczyzny (nie stosy Z) lizosomów jelitowych i używaj tylko lizosomów, które są ostre (maksymalna intensywność sygnału) do ilościowego określania intensywności. 
		UWAGA: Być może ze względu na różnice w dostępności barwnika, lizosomy komórek jelitowych bezpośrednio za gardłem utrzymują intensywność barwienia cDCFDA niezależnie od genotypu lub wieku, dlatego należy zachować ostrożność, aby uniknąć obrazowania lizosomów w tych komórkach.</li>
		<li>Najpierw wyobraź sobie slajd zawierający 2-dniowe dzikie robaki typu N2. Robiąc to, dostosuj parametry obrazowania konfokalnego, takie jak moc lasera, otwór i apertura, aby upewnić się, że intensywność barwienia cDCFDA nie jest przesycona. 
		UWAGA: Po ustawieniu tych ustawień nie należy ich zmieniać przez cały czas trwania obrazowania w danym dniu.</li>
		<li>Przechwytuj obrazy pojedynczej płaszczyzny jelita o rozdzielczości 1024 x 1024 pikseli (od 3 do 4 obrazów na robaka) za pomocą obiektywu o powiększeniu 60x. 
		UWAGA: Widmo emisji cDCFDA u robaków da pojedynczy wyraźny pik przy 520 nm zbiegający się z raportowanym widmem fluorescencji20, zapewniając specyficzny odczyt sygnału, który różni się od autofluorescencji jelitowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
		<li>Eksportuj surowy obraz konfokalny (pliki .lsm) jako pliki .tiff dla każdego kanału.</li>
		<li>Następnie otwórz ImageJ i kliknij Plik| Otwórz, aby otworzyć plik obrazu, który ma zostać określony ilościowo. Po załadowaniu obrazu użyj narzędzia do zaznaczania owalnego kształtu w ImageJ, aby wybrać obszar zainteresowania (ROI).</li>
		<li>Następnie kliknij Analizuj | Zmierz w celu ilościowego określenia intensywności fluorescencji dla tego zwrotu z inwestycji. Wybierz 4–5 różnych lizosomów ostrych na obraz i oblicz średnią względną intensywność fluorescencji każdego obszaru zainteresowania (ROI).</li>
		<li>Dla każdego obrazu zmierz intensywność fluorescencji tła w obszarze jelita między lizosomami. Odejmij wartości intensywności fluorescencji tła od wartości intensywności fluorescencji lizosomalnej.</li>
		<li>W sumie zbierz około 30 do 50 indywidualnych znormalizowanych wartości intensywności cDCFDA (od 6 do 10 zwierząt) dla każdego testowanego szczepu. Użyj tych wartości, aby wykreślić wykres pudełkowy i wąsów za pomocą odpowiedniego oprogramowania statystycznego. 
		UWAGA: Barwienie może się znacznie różnić w zależności od takich czynników, jak temperatura, czas inkubacji i ogólny stan zdrowia/wiek zwierząt, tak że porównania intensywności fluorescencji są istotne tylko w procesie próbek w tym samym eksperymencie barwienia. Dlatego ważne jest, aby w każdym eksperymencie barwienia przeprowadzać kontrole. Obliczanie różnic statystycznych (testy t) przy użyciu odpowiedniego oprogramowania statystycznego.</li>
		<li>Wyobraź sobie kolejno wszystkie szczepy z tego samego eksperymentu (barwione tego samego dnia), uważając, aby nie zmienić żadnego z parametrów obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nystrom, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+aging+and+failure+to+segregate+damaged+proteins+in+Sir2+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants.</a> Genes Dev. 21 (19), 2410-2421 (2007).</li>
<li>Madeo, F., Eisenberg, T., Kroemer, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2758740/">Autophagy for the avoidance of neurodegeneration.</a> Genes Dev. 23 (19), 2253-2259 (2009).</li>
<li>Rubinsztein, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+intracellular+protein-degradation+pathways+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The roles of intracellular protein-degradation pathways in neurodegeneration.</a> Nature. 443 (7113), 780-786 (2006).</li>
<li>Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+activities+protect+against+age-onset+proteotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity.</a> Science. 313 (5793), 1604-1610 (2006).</li>
<li>Cuervo, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+aging%3A+the+importance+of+maintaining+%26%2334%3Bclean%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagy and aging: the importance of maintaining &#34;clean&#34; cells.</a> Autophagy. 1 (3), 131-140 (2005).</li>
<li>Harrington, A. J., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+as+a+model+system+for+identifying+effectors+of+alpha-synuclein+misfolding+and+dopaminergic+cell+death+associated+with+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans as a model system for identifying effectors of alpha-synuclein misfolding and dopaminergic cell death associated with Parkinson's disease.</a> Methods. 53 (3), 220-225 (2011).</li>
<li>Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+amyloid+formation%2C+and+neurodegeneration%3A+a+critical+role+for+molecular+chaperones%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, amyloid formation, and neurodegeneration: a critical role for molecular chaperones?</a> Neuron. 35 (1), 9-12 (2002).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10806201">Age-related decline in chaperone-mediated autophagy.</a> J Biol Chem. 275 (40), 31505-31513 (2000).</li>
<li>Tonoki, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+evidence+linking+age-dependent+attenuation+of+the+26S+proteasome+with+the+aging+process%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic evidence linking age-dependent attenuation of the 26S proteasome with the aging process.</a> Mol Cell Biol. 29 (4), 1095-1106 (2009).</li>
<li>Squier, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+and+protein+aggregation+during+biological+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress and protein aggregation during biological aging.</a> Exp Gerontol. 36 (9), 1539-1550 (2001).</li>
<li>Sarkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+molecules+enhance+autophagy+and+reduce+toxicity+in+Huntington%27s+disease+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Small molecules enhance autophagy and reduce toxicity in Huntington's disease models.</a> Nat Chem Biol. 3 (6), 331-338 (2007).</li>
<li>Glick, D., Barth, S., Macleod, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+cellular+and+molecular+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Autophagy: cellular and molecular mechanisms.</a> J Pathol. 221 (1), 3-12 (2010).</li>
<li>Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+function+and+dysfunction%3A+mechanism+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Lysosomal function and dysfunction: mechanism and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 17 (5), 766-774 (2012).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-aging+treatments+slow+propagation+of+synucleinopathy+by+restoring+lysosomal+function%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Anti-aging treatments slow propagation of synucleinopathy by restoring lysosomal function.</a> Autophagy. 12 (10), 1849-1863 (2016).</li>
<li>Vila, M., Bove, J., Dehay, B., Rodriguez-Muela, N., Boya, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysosomal+membrane+permeabilization+in+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Lysosomal membrane permeabilization in Parkinson disease.</a> Autophagy. 7 (1), 98-100 (2011).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+do+intracellular+proteolytic+systems+change+with+age%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">How do intracellular proteolytic systems change with age?</a> Front Biosci. 3, d25-d43 (1998).</li>
<li>Cuervo, A. M., Dice, J. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/10767573">When lysosomes get old.</a> Exp Gerontol. 35 (2), 119-131 (2000).</li>
<li>Gachet, Y., Codlin, S., Hyams, J. S., Mole, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((btn1%2C+the+Schizosaccharomyces+pombe+homologue+of+the+human+Batten+disease+gene+CLN3%2C+regulates+vacuole+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">btn1, the Schizosaccharomyces pombe homologue of the human Batten disease gene CLN3, regulates vacuole homeostasis.</a> J Cell Sci. 118 (Pt 23), 5525-5536 (2005).</li>
<li>Stiernagle, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK19649/?report=reader">Maintenance of C. elegans.</a> WormBook. , 1-11 (2006).</li>
<li>Preston, R. A., Murphy, R. F., Jones, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+vacuolar+pH+in+yeast+and+identification+of+acidification-defective+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Assay of vacuolar pH in yeast and identification of acidification-defective mutants.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (18), 7027-7031 (1989).</li>
<li>Pringle, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy+methods+for+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy methods for yeast.</a> Methods Cell Biol. 31, 357-435 (1989).</li>
<li>Baxi, K., Ghavidel, A., Waddell, B., Harkness, T. A., de Carvalho, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Lysosomal+Function+by+the+DAF-16+Forkhead+Transcription+Factor+Couples+Reproduction+to+Aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of Lysosomal Function by the DAF-16 Forkhead Transcription Factor Couples Reproduction to Aging in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 207 (1), 83-101 (2017).</li>
<li>Colacurcio, D. J., Nixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+lysosomal+acidification-The+emerging+role+of+v-ATPase+in+aging+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ageing+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Disorders of lysosomal acidification-The emerging role of v-ATPase in aging and neurodegenerative disease.</a> Ageing Res Rev. 32, 75-88 (2016).</li>
<li>Kang, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+screening+identifies+ATM+as+a+target+for+alleviating+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical screening identifies ATM as a target for alleviating senescence.</a> Nat Chem Biol. 13 (6), 616-623 (2017).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431 (7010), 805-810 (2004).</li>
<li>Brunk, U. T., Terman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial-lysosomal+axis+theory+of+aging%3A+accumulation+of+damaged+mitochondria+as+a+result+of+imperfect+autophagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial-lysosomal axis theory of aging: accumulation of damaged mitochondria as a result of imperfect autophagocytosis.</a> Eur J Biochem. 269 (8), 1996-2002 (2002).</li>
<li>Gerland, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autolysosomes+accumulate+during+in+vitro+CD8%2B+T-lymphocyte+aging+and+may+participate+in+induced+death+sensitization+of+senescent+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Autolysosomes accumulate during in vitro CD8+ T-lymphocyte aging and may participate in induced death sensitization of senescent cells.</a> Exp Gerontol. 39 (5), 789-800 (2004).</li>
<li>Poon, H. F., Vaishnav, R. A., Getchell, T. V., Getchell, M. L., Butterfield, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomics+analysis+of+differential+protein+expression+and+oxidative+modification+of+specific+proteins+in+the+brains+of+old+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Aging%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomics analysis of differential protein expression and oxidative modification of specific proteins in the brains of old mice.</a> Neurobiol Aging. 27 (7), 1010-1019 (2006).</li>
<li>Yin, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+basis+of+lipofuscin%2C+ceroid%2C+and+age+pigment-like+fluorophores%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Biochemical basis of lipofuscin, ceroid, and age pigment-like fluorophores.</a> Free Radic Biol Med. 21 (6), 871-888 (1996).</li>
<li>Nehrke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reduction+in+intestinal+cell+pHi+due+to+loss+of+the+Caenorhabditis+elegans+Na%2B%2FH%2B+exchanger+NHX-2+increases+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A reduction in intestinal cell pHi due to loss of the Caenorhabditis elegans Na+/H+ exchanger NHX-2 increases life span.</a> J Biol Chem. 278 (45), 44657-44666 (2003).</li>
<li>Chakraborty, K., Leung, K., Krishnan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+lumenal+chloride+in+the+lysosome+is+critical+for+lysosome+function%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">High lumenal chloride in the lysosome is critical for lysosome function.</a> Elife. 6, (2017).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konfliktu interesów.

Do starzenia się przyczyniają się różnorodne zdarzenia komórkowe i molekularne, na które wpływają cechy historii życia i czynniki genetyczne. Nasze ostatnie badanie22 sugeruje, że cykl rozrodczy odgrywa ważną rolę w kontrolowaniu sprawności somy poprzez regulację lizosomalnej dynamiki pH. Wykazaliśmy, że proteoliza za pośrednictwem lizosomów jest promowana, podczas gdy zwierzęta aktywnie rozmnażają się poprzez regulację w górę transkrypcji V-ATPazy, co z kolei zapewnia kwaśne lizosomy. Po zakończe...

Powszechnie przyjmuje się, że pojawienie się agregatów białkowych jest cechą charakterystyczną starzenia się komórek eukariotycznych1,2,3, a ich powstawanie uważa się za jeden z głównych czynników powodujących starzenie się komórek4,5,6,7. Istnieje coraz więcej dowodów na to, że wraz ze starzeniem się komórek katabolizm białek jest upośledzony, co prowadzi do wzrostu agregacji białek. Załamanie się proteolizy w starzejących się komórkach wiąże się z upośledzeniem autofagii8, a także degradacją białek za pośrednictwem proteasomów9. Wreszcie, w starych komórkach zwiększa się nieodwracalne utlenianie białek, co dodatkowo upośledza katabolizm białek10.
Autofagia początkowo uważana była za nieselektywny proces masowej degradacji uszkodzonych białek, ale ostatnie badania wykazały, że autofagia jest wysoce selektywna w stosunku do katabolizmu agregatów białkowych i dysfunkcyjnych organelli, które nie są podatne na degradację przez inne mechanizmy usuwania białek11. Podczas procesu autofagii uszkodzone i zagregowane białka są sekwestrowane do pęcherzyka o podwójnej błonie zwanego autofagosomem. Ten autofagosom następnie łączy się z kwaśnymi organellami zwanymi lizosomami, co prowadzi do degradacji autofagosomu cargo12. Lizosomy stanowią punkt końcowy szlaku autofagicznego i uczestniczą w różnych procesach komórkowych, takich jak naprawa błony, kontrola transkrypcji i wykrywanie składników odżywczych; podkreślając ich scentralizowaną rolę w homeostazie komórkowej (przegląd w odnośniku 13). Kilka badań wykazało związek między zależnym od wieku spadkiem funkcji lizosomów a różnymi zaburzeniami neurodegeneracyjnymi13. Konsekwentnie, przywrócenie funkcji lizosomalnej w starszych komórkach może opóźnić pojawienie się fenotypów związanych ze starzeniem się14,15. Badania nad składem środowiska śródświateł sugerują, że załamanie funkcji lizosomalnej w starszych komórkach nie jest spowodowane zmniejszeniem produkcji proteaz lizosomalnych16. Alternatywnie, zaproponowano, że utrata kwasowości wewnątrzlizosomalnej, krytyczna wymagalność jego aktywności enzymatycznej, może leżeć u podstaw spadku proteolizy, w której pośredniczy lizosom17. Aby móc zbadać tę hipotezę, konieczne jest opracowanie odczynników i protokołów do badania dynamicznych zmian pH lizosomów w żywych komórkach w powtarzalny i spójny sposób.
Jelito C. elegans jest główną tkanką metaboliczną robaków i jest krytycznym regulatorem homeostazy i długości życia układu. Opracowaliśmy testy do oceny zmian kwasowości światła lizosomów jelitowych robaków, aby określić, w jaki sposób proteoliza za pośrednictwem lizosomów przyczynia się do starzenia. Chociaż fluorofory wrażliwe na pH były wcześniej używane w C. elegans do oznaczania lizosomów jelitowych, nie podjęto jeszcze wysiłku w celu ustanowienia skutecznego protokołu, który mógłby wykryć niewielki wzrost pH lizosomów in vivo18. W tym miejscu przedstawiamy protokół, który można wykorzystać do wykrycia utraty kwasowości lizosomalnej w komórkach jelitowych C. elegans przy użyciu prostego i wygodnego protokołu żywienia, który zawiera fluorofor wrażliwy na pH (cDCFDA) do żywności OP50.

<table><tbody><tr><td>OP50 (E. coli)</td>Centrum <td></td><td>Genetyki Caenorhabditis</td><td>Zamów online pod adresem https://cgc.umn.edu/strain/OP50</td></tr><tr><td>Diacetan 5(6)-karboksyloksy-2',7'-dichlorofluoresceiny&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>C369</td><td>Powszechnie znany jako cDCFDA</td></tr><tr><td>9-dietyloamino-5H-benzo(a)fenoksazyno-5-on i (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))metylidena]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimetyloamino)etylo]propanamidato)(difluoro)bor</td><td>ThermoFisher</td><td>L7528</td><td>Powszechnie znany jako mikroskop konfokalny Lysotracker Red</td></tr><tr><td>(np. Zeiss LSM 510)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Pobierz za darmo z https://imagej.nih.gov/ij/download.html</td></tr><tr><td>LB Rosół w proszku</td><td>ThermoFisher</td><td>22700041</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Sigma</td><td>A5306-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Fisher Scientific</td><td>S71604</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol w proszku</td><td>Sigma</td><td>C3045&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma 449709</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>K3PO4</td><td>Sigma</td><td>P5629</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe</td><td>ThermoFisher</td><td>3406</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A6013</td><td></td></tr><tr><td>Lustro inkubatora</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>lub inna gładka płaska powierzchnia</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ocena alkalizacji lizosomalnej w jelicie żywego caenorhabditis elegans

Assessing Lysosomal Alkalinization in the Intestine of Live Caenorhabditis elegans

Nicień Caenorhabditis elegans (C. elegans) jest systemem modelowym, który jest powszechnie używany do badania długowieczności i ścieżek rozwojowych. Takie badania są ułatwione dzięki przezroczystości zwierzęcia, zdolności do wykonywania testów genetycznych do przodu i do tyłu, względnej łatwości generowania białek znakowanych fluorescencyjnie oraz zastosowaniu barwników fluorescencyjnych, które mogą być mikrowstrzykiwane do wczesnego zarodka lub włączane do jego pożywienia (szczep E. coli OP50) do znakowania organelli komórkowych (np. 9-dietyloamino-5H-benzo(a)fenoksazyno-5-on i (3-{2-[(1H,1'H-2,2'-bipyrrol-5-yl-kappaN(1))metylideno]-2H-pyrrol-5-yl-kappaN}-N-[2-(dimetyloamino)etylo]propanamidato)(difluoro)bor). W tym miejscu przedstawiamy zastosowanie fluorescencyjnego barwnika wrażliwego na pH, który barwi lizosomy jelitowe, zapewniając wizualny odczyt dynamicznych, fizjologicznych zmian kwasowości lizosomalnej u żywych robaków. Protokół ten nie mierzy lizosomalnego pH, ale ma na celu ustanowienie wiarygodnej metody oceny fizjologicznych istotnych zmian kwasowości lizosomalnej. cDCFDA jest związkiem przenikającym komórkę, który jest przekształcany w fluorescencyjny fluorofor 5-(i-6)-karboksyl-2',7'-dichlorofluoresceinę (cDCF) po hydrolizie przez esterazy wewnątrzkomórkowe. Protonacja wewnątrz lizosomów zatrzymuje cDCF w tych organellach, gdzie się gromadzi. Ze względu na niskie pKa wynoszące 4,8, barwnik ten był używany jako czujnik pH u drożdży. Tutaj opisujemy zastosowanie cDCFDA jako suplementu diety do oceny kwasowości lizosomów jelitowych w C. elegans. Technika ta pozwala na wykrywanie lizosomów alkalizujących u żywych zwierząt i ma szeroki zakres zastosowań eksperymentalnych, w tym badania nad starzeniem się, autofagią i biogenezą lizosomalną.

cDCFDA barwi lizosomy w sposób zależny od pH, a jego niskie pKa i łatwe przenikanie do lizosomów sprawiają, że jest on idealnym czujnikiem pH21. Intensywność barwienia cDCFDA jest odwrotnie proporcjonalna do pH lizosomów (t.j. intensywność barwienia wzrasta wraz ze spadkiem pH)18,2. Sygnały cDCFDA są konsekwentnie słabe w lizosomach zwierząt traktowanych 20 mM chlorochiną, inhibitorem zakwaszania l...

Przewodnik krok po kroku do badania utraty kwasowości lizosomalnej w jelicie C. elegans przy użyciu wrażliwego na pH barwnika witalnego 5(6)-karboksyloksy-2',7'-dichlorofluoresceiny dioctanu (cDCFDA)

Ocena alkalizacji lizosomalnej w jelicie żywego Caenorhabditis elegans

The nematode Caenorhabditis elegans (C. elegans) is a model system that is widely used to study longevity and developmental pathways. Such studies are ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena względnej utraty kwasowości lizosomalnej w lizosomach jelitowych C.elegans. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie autofagii, pośrednio dostarczając informacji na temat funkcji lizosomalnej i degradacji białek. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest prosta, niedroga, wygodna i powtarzalna.Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy obserwowaliśmy technikę barwienia stosowaną do oceny alkalizacji wakuolicznej u drożdży. Wizualna demonstracja tej metody jest ważna, ponieważ pewne kroki, takie jak dodawanie cDCFDA do żywności OP50 i kontrola obrazowania dwudniowych robaków typu dzikiego, mają kluczowe znaczenie. Po przygotowaniu płytek NGM pozostaw je do wyschnięcia w temperaturze pokojowej przez dwa dni z zamkniętą pokrywą.Następnie zaszczepij bakterie OP50 w sterylnym bulionie Luria. Po zaszczepieniu pozostawić inokulant w inkubatorze, aż OD znajdzie się między 0,2 a 0,4. Następnie umieść kroplę inokulantu OP50 na środku suchej płytki NGM.Następnie użyj rozsiewacza, aby rozprowadzić inokulant w plastrze o wymiarach około dwa na dwa centymetry. Po około 15 minutach odwróć płytkę OP50 po wyschnięciu inokulantu. Następnie inkubuj płytkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 36 godzin.Po zakończeniu inkubacji przenieść płytkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza do momentu użycia. Następnie przygotuj zapas roboczy 10 milimolowych cDCFDA w buforze M9. Roztwór cDCFDA należy przechowywać z dala od światła w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza.Następnie odpipetować 100 mikrolitrów 10-milimolowego cDCFDA, aby równomiernie pokryć cały plaster OP50 na płytce. Pozostaw płytki cDCFDA w ciemnym pudełku na blacie stołu na około 30 minut. Po tym, jak cDCFDA całkowicie przeniknie do łaty OP50, przenieś 20 robaków na płytkę, a następnie pozostaw płytkę w stanie odwróconym na około 14 godzin w temperaturze 20 stopni Celsjusza.Następnie weź dwa paski taśm do etykietowania i umieść je w odległości 1,5 cala od siebie na gładkiej, płaskiej powierzchni lustra. Następnie pokryj powierzchnię lustra wodoodpornym sprayem i usuń nadmiar płynu. Następnie rozpuść 2% agarozy w wodzie destylowanej w kuchence mikrofalowej.Po upłynnieniu agarozy umieść kroplę agarozy między dwoma paskami taśm i przykryj kroplę szkiełkiem mikroskopowym. Po tym, jak agaroza zastygnie w kształcie okrągłej podkładki pod szkiełkiem, odwróć szkiełko. Następnie dodaj 10 do 15 mikrolitrów pięciomilimolowego azydku sodu na podkładkę agarozową.Teraz przenieś robaki z płytki uzupełnionej cDCFDA na czystą płytkę NGM bez OP50. Pozwól robakom poruszać się przez kilka sekund, aby OP50 został usunięty z ich powierzchni. Następnie przenieś robaka na podkładkę agarozową zawierającą pięć milimolowych azydków sodu.Szybko przykryj podkładkę agarozową szkiełkiem nakrywkowym. Następnie użyj obiektywu o 60-krotnym powiększeniu i uchwyć obrazy w jednej płaszczyźnie jelita z dwudniowych dzikich i zmutowanych robaków. Następnie otwórz ImageJ i kliknij plik.Następnie kliknij przycisk Otwórz, aby otworzyć plik, który ma zostać określony ilościowo. Po załadowaniu obrazu użyj owalnego narzędzia do zaznaczania, aby wybrać interesujący Cię obszar. Następnie kliknij przycisk Analizuj, a na końcu przycisk Zmierz, aby określić ilościowo intensywność fluorescencji obszaru zainteresowania.Aby zbadać lizosomalną aktywność funkcjonalną, intensywność barwienia cDCFDA określa się ilościowo za pomocą obrazowania konfokalnego. Na tym zdjęciu występuje silna intensywność sygnału fluorescencji cDCFDA w lizosomach jelitowych C.Elegans typu dzikiego dnia drugiego. Wskazuje to na funkcjonalnie kompetentny kwaśny lizosom.Wręcz przeciwnie, intensywność fluorescencji jest znacznie stłumiona w lizosomach jelitowych dzikich robaków dnia ósmego. To w porównaniu z lizosomami jelitowymi robaków drugiego dnia. Wynik wskazał na obecność funkcjonalnie niekompetentnego lizosomu alkalicznego u robaków w wieku ośmiu dni.Co ciekawe, intensywność fluorescencji cDCFDA jest również znacznie zmniejszona zarówno u robaków RNAi w wieku dwóch, jak i ośmiu dni w porównaniu z robakiem typu dzikiego. W tym przypadku gen vha, kodujący wakuolarne podjednostki ATPazy w wyściółce lizosomalnej, został powalony przez robaki w wieku drugiego i ósmego dnia. Po opanowaniu, cały schemat barwienia i mikroskopii można wykonać w mniej niż 18 godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o inkubacji robaków w suplemencie cDCFDA w pokarmie OP50 przez co najmniej 14 godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić utratę kwasowości lizosomalnej w lizosomach jelitowych żywych C.elegans.

assessing-lysosomal-alkalinization-intestine-live-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Źródło: Le, T. A. N., i in., Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Jelit of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Ten film demonstruje test oparty na fluorescencji mającycy na celu ilościową przepuszczalność jelit u osób C. elegans, które były narażone na Pseudomonas aeruginosa. W porównaniu z kontrolami karmionymi Escherichia coli, robaki poddane patogenom wykazują zwiększoną przeciekliwość fluoroforu do jamy ciała, co wskazuje na uszkodzenie bariery nabłonkowej.

Ocena przepuszczalności jelit u C. elegans po ekspozycji na bakterie

Ten film opisuje test kolorymetryczny do pomiaru mleczanu w lizatach komórkowych przy użyciu enzymu dehydrogenazy mleczanowej. Enzym ten przekształca mleczan w pirogronian, wraz z konwersją NAD do NADH, który reaguje z barwnikami tetrazolowymi i daje kolorowy produkt, który można zmierzyć spektrofotometrycznie w celu ilościowego określenia mleczanu.

Test kolorymetryczny do oznaczania ilościowego mleczanu w próbkach badanych

Opisujemy metody badania aspektów amylopatii u robaka C. elegans. Pokazujemy, jak konstruować robaki wyrażające ludzkie Aβ42 w neuronach i jak testować ich funkcję w testach behawioralnych. Dalej pokazujemy, jak uzyskać pierwotne hodowle neuronów, które można wykorzystać do badań farmakologicznych.

System modelowy Caenorhabditis elegans do badania amylopatii

Aby zbadać związek między homeostazą białek, stresem i starzeniem się, monitorowaliśmy zmiany w fałdowaniu białek, śledząc dysfunkcję białek, lokalizację białek w komórce i stabilność białek na poziomie organizmu, komórkowym i białkowym, używając genetycznie wykonalnego metazoanu Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego.

Wykorzystanie Caenorhabditis elegans jako systemu modelowego do badania homeostazy białek w organizmie wielokomórkowym

Przezroczyste jelito C. elegans może służyć jako "komora tkankowa in vivo" do badania biogenezy błony wierzchołkowej i światła na poziomie pojedynczej komórki i subkomórkowej podczas tubulingenezy wielokomórkowej. Protokół ten opisuje, w jaki sposób połączyć standardowe znakowanie, genetykę utraty funkcji/RNAi i podejścia mikroskopowe w celu przeanalizowania tych procesów na poziomie molekularnym.

Jelito C. elegans jako model morfogenezy światła międzykomórkowego i biogenezy błony spolaryzowanej in vivo na poziomie pojedynczej komórki: znakowanie przez barwienie przeciwciałami, analiza utraty funkcji RNAi i obrazowanie

Kanał wydalniczy C. elegans jest unikalnym modelem jednokomórkowym do wizualnej analizy in vivo biogenezy błony spolaryzowanej de novo. Protokół ten opisuje połączenie standardowych podejść genetycznych/RNAi i obrazowania, które można dostosować do identyfikacji i charakterystyki cząsteczek kierujących jednokomórkową tubulingenezą oraz biogenezą błony wierzchołkowej i światła.

Kanał wydalniczy C. elegans jako model wewnątrzkomórkowej morfogenezy światła i biogenezy spolaryzowanej błony in vivo w pojedynczej komórce: znakowanie za pomocą fuzji GFP, badania przesiewowego interakcji RNAi i obrazowania

Opisujemy zmodyfikowaną ekstrakcję na małą skalę i testy kolorymetryczne mleczanu i pirogronianu u nicieni C. elegans. W przypadku korzystania z komercyjnych zestawów testowych ważny jest techniczny rozwój ich czułości i dokładności. Wytrącanie białek podczas ekstrakcji jest najbardziej krytycznym etapem ilościowego oznaczania metabolitów wewnątrzkomórkowych.

Małoskalowe testy kolorymetryczne wewnątrzkomórkowego mleczanu i pirogronianu u nicienia Caenorhabditis elegans

Ten protokół opisuje, jak mierzyć przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans. Metoda ta jest pomocna w podstawowych badaniach biologicznych nad zdrowiem jelit związanych z interakcją między bakteriami jelitowymi a ich gospodarzem oraz w badaniach przesiewowych w celu identyfikacji czynników probiotycznych i chemicznych w leczeniu zespołu nieszczelnego jelita i chorób zapalnych jelit.

Pomiar wpływu bakterii i substancji chemicznych na przepuszczalność jelit Caenorhabditis elegans

Spadek proteostazy jest cechą charakterystyczną starzenia się, ułatwiając wystąpienie chorób neurodegeneracyjnych. Przedstawiamy protokół do ilościowego pomiaru proteostazy w dwóch różnych tkankach Caenorhabditis elegans poprzez heterologiczną ekspresję powtórzeń poliglutaminy połączonych z fluorescencyjnym reporterem. Model ten umożliwia szybką analizę genetyczną proteostazy in vivo.

Kwantyfikacja swoistego dla tkanki spadku proteostazy u Caenorhabditis elegans

Mikroskopia stymulowanego rozpraszania Ramana (SRS) umożliwia selektywne, bezznacznikowe obrazowanie określonych cząsteczek chemicznych i została skutecznie wykorzystana do obrazowania cząsteczek lipidów in vivo. W tym miejscu przedstawiamy krótkie wprowadzenie do zasady działania mikroskopii SRS i opisujemy metody jej wykorzystania w obrazowaniu magazynowania lipidów w Caenorhabditis elegans.

Bezznacznikowe obrazowanie dynamiki magazynowania lipidów u Caenorhabditis elegans przy użyciu mikroskopii wymuszonego rozpraszania Ramana

Nauczanie nauk biologicznych może być bardziej stymulujące dla studentów dzięki zastosowaniu eksperymentów. Ten manuskrypt przedstawia dwa różne, ale uzupełniające się protokoły, które można wykorzystać w klasie, aby zachęcić uczniów do formułowania i testowania hipotez związanych z dietami wysokokalorycznymi, głodówką i starzeniem się.

Stosowanie tanich barwników do wizualizacji akumulacji glikogenu i integralności jelit u Caenorhabditis elegans

Poznaj metodę oceny utraty kwasowości lizosomalnej w jelicie żywego Caenorhabditis elegans przy użyciu barwnika cDCFDA. Prosta technika do badań nad autofagią.

Ocena alkalizacji lizosomalnej w jelicie żywego Caenorhabditis elegans

Przeglądaj więcej filmów