Name: Pierwotna jednowarstwowa hodowla nabłonka żołądka pochodząca od myszy i człowieka do badania regeneracji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Poznaj metodę hodowli pierwotnego jednowarstwowego nabłonka żołądka pochodzącego od myszy i człowieka do badań regeneracji. Technika umożliwia analizę migracji komórek i gojenia ran w kontrolowanych warunkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 grant (YZ).

Aby uniknąć skażenia, wykonaj protokół w całości w sterylnym kapturze do hodowli tkanek. Ludzka tkanka dna płuc została pobrana od pacjentów poddawanych rękawowej resekcji żołądka zgodnie z zatwierdzonym protokołem IRB Uniwersytetu w Cincinnati (numer protokołu IRB: 2015 - 4869). 
Wszystkie badania na myszach zostały zatwierdzone przez University of Cincinnati Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC), który utrzymuje placówkę American Association of Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Ustanawianie antropogenicznych organoidów 3D dna żołądka
UWAGA: Ten protokół jest oparty na badaniach opublikowanych wcześniej w tym lab8.
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę organoidową 3D, która składa się w 50% z pożywki kondycjonowanej Wnt i w 20% z pożywki kondycjonowanej przez R-spondynę.
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę kondycjonowaną Wnt, hodować limfocyty L w pożywce wzrostowej Wnt (zmodyfikowana pożywka Eagle (DMEM) firmy Dulbecco, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 1% penicylina/streptomycyna) przez 7 dni, zebrać pożywkę i przefiltrować za pomocą filtra 0,22 μm.</li>
		<li>Przygotować pożywki kondycjonowane R-spondyną. Wyhoduj zmodyfikowaną linię komórkową wydzielającą R-spondynę HEK-293T w pożywce wzrostowej R-spondyny (zmodyfikowana pożywka Eagle Medium firmy Dulbecco, 10% płodowa surowica bydlęca (FBS), 1% penicylina / streptomycyna). Po przyłączeniu po 2 godzinach zmień pożywkę z tych komórek na pożywkę wzrostową OPTIMEM, 1% penicyliny/streptomycyny. Hoduj komórki przez 7 dni. Następnie zbierz pożywkę kondycjonowaną przez R-spondynę i przefiltruj ją za pomocą filtra 0,22 μm. 
		UWAGA: Ten protokół został opublikowany wcześniej, a bardziej szczegółowy protokół można znaleźć w 6,7,8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Rozmrozić zredukowaną przez czynnik wzrostu, wolną od czerwieni fenolowej matrycę błony podstawnej przez 16 godzin na lodzie w temperaturze 4 °C. Zebrać tkankę w lodowatym DBPS wolnym od Ca2+ / Mg2+ w dużym plastikowym pojemniku. Przechowywać na lodzie do rozpoczęcia etapu 1.4. 
	UWAGA: Tkanka pobierana jest od pacjentów poddawanych rękawowej resekcji żołądka.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy energicznie umyj tkankę w sterylnej zlewce zawierającej 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (DPBS) bez Ca2+/Mg2+. Myć przez około 30 sekund lub do momentu, gdy zanieczyszczenia i krew zostaną usunięte. Następnie za pomocą sterylnej gazy zetrzyj warstwę śluzową z nabłonka.</li>
	<li>Za pomocą dużych kleszczy mocno chwyć warstwę mięśniową tkanki i siłą zeskrob nabłonek za pomocą dużych zakrzywionych kleszczy hemostatycznych. Zbierz zeskrobane fragmenty nabłonka na sterylną, polistyrenową szalkę Petriego.</li>
	<li>Zmiel tkankę nabłonka na fragmenty o wymiarach około 2,0 x 2,0 mm2 za pomocą maszynki do golenia, aby zoptymalizować trawienie tkanek. Przemyć fragmenty tkanek DBPS bez Ca2+/Mg2+ uzupełnionego antybiotykami (DPBS bez Ca2+/Mg2+, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,25 mg/ml amfoterycyny B / 10 mg / ml gentamycyny, 50 mg / ml kanamycyny), aż do momentu, gdy płukanie będzie wolne od krwi. W razie potrzeby wykonaj wiele prań. Wyrzuć pranie, ostrożnie filtrując pranie przez sterylną gazę do zlewki na odpady.</li>
	<li>Zebrać umyte fragmenty do szklanej kolby okrągłodennej o pojemności 125 ml z mieszadłem o średnicy 25 mm i wstępnie podgrzaną pożywką inkubacyjną (pożywka podstawowa uzupełniona 2 mM L-glutaminy, 1% penicyliny/streptomycyny, 10 mM buforu HEPES, 1 mg/ml kolagenazy typu 1, albumina surowicy bydlęcej 2 mg/ml klasy hodowli komórkowej). Uszczelnić kolbę okrągłodenną gumowymi przegrodami.</li>
	<li>Włóż igłę rdzeniową o sile 20 G do przegrody i podłącz ją do butli z tlenem za pomocą gumowego węża. Aby odfiltrować wszelkie zanieczyszczenia, włóż bibułę do rurki, aby utworzyć filtr. Włącz odpływ tlenu na niskim poziomie. Włóż 10 - 15 igieł odpływowych do przegrody, aby uniknąć pęknięcia przegrody.</li>
	<li>Przymocuj zestaw do stojaka pierścieniowego za pomocą zacisków i umieść go w łaźni wodnej skalibrowanej do 37 °C z płytką mieszającą na 30 - 45 minut. Po 15 minutach inkubacji tkanki należy usunąć 50 μl pożywki inkubacyjnej i sprawdzić wzrokowo, czy nie ma zdysocjowanych gruczołów. Jeśli gruczoły nie są gęste lub nie oddzieliły się od tkanki, pozostaw na dodatkowe 5 - 10 minut.</li>
	<li>Bezpośrednio po inkubacji dodać 50 ml wstępnie podgrzanego DMEM/F12 do pożywki inkubacyjnej za pomocą sterylnej pipety serologicznej lub wlewając bezpośrednio do mieszaniny inkubacyjnej.</li>
	<li>Przefiltrować mieszaninę gruczołów przez sterylną gazę do czterech stożkowych probówek o pojemności 50 ml. Utrzymuj filtrat na lodzie przez 15 minut, aby wyekstrahowane gruczoły mogły osiąść na dnie stożkowej rurki. Należy uważać, aby nie naruszyć osiadłych gruczołów, usunąć i wyrzucić górne 40 ml supernatantu za pomocą pipety serologicznej. Pozostałe 10 ml zawiesić w 10 ml DPBS uzupełnionego antybiotykami.</li>
	<li>Rozprowadzić mieszaninę równomiernie w probówkach do hodowli komórkowych o pojemności 5 ml. Wirować przez 5 minut przy 65 x g w temperaturze 4 °C i ostrożnie usunąć supernatant za pomocą pipety. Zawiesić osad dławika w rozmrożonej matrycy błony podstawnej za pomocą pipety lub końcówki pipety o szerokości 200 μl. Mieszać do uzyskania jednorodnej masy. 
	UWAGA: Bardzo ważne jest, aby wykonać ten krok na lodzie i uniknąć polimeryzacji matrycy membrany podstawnej podczas mieszania. Dodatkowo ważne jest, aby wizualnie sprawdzić gęstość dławnicy poprzez pobranie próbek na 50 μl. Optymalna gęstość to ~70% zbiegowiska.</li>
	<li>Następnie umieść gruczoły w 50 μl matrycy błony podstawnej za pomocą pipety z szeroką końcówką. Unikaj wytwarzania pęcherzyków podczas powlekania.</li>
	<li>Aby umożliwić polimeryzację matrycy błony podstawnej, inkubować przez 10-15 minut w temperaturze 37 °C. W przypadku posiewu na 12-dołkowej płytce hodowlanej dodać 1 ml pożywki hFGO (Advanced Dulbecco's modified Eagle medium/F12 podłoże uzupełnione 2mM L-glutaminą, 1% penicyliny/streptomycyny, 0,25 mg/ml amfoterycyny B /10 mg/ml gentamycyny, 50 mg/ml kanamycyny, 10 mM buforu HEPES, 1 mM n-akteylcystyny, 1 x N2, 1 x B27, 50% pożywki kondycjonowanej Wnt, 20% pożywki kondycjonowanej R-spondyną uzupełnionej 100 ng / ml inhibitorem morfogenetycznego białka kości, 1 nM gastryną, 50 ng / ml naskórkowym czynnikiem wzrostu, 200 ng / ml czynnikiem wzrostu fibroblastów 10, 10 mM nikotynamidu i 10 μM inhibitorem Y-27632 ROCK) na studzienkę. Jeśli nie używasz 12-dołkowej płytki hodowlanej, dodaj wystarczającą ilość pożywki, aby zanurzyć pęcherzyk macierzy błony podstawnej.</li>
	<li>Hodować komórki w temperaturze 37 °C w inkubatorze do hodowli komórkowych z wilgotnością 5% CO2 . Zmieniaj nośniki co 4-5 dni.</li>
</ol>
2. Ustanawianie 3D genowych organoidów dna żołądka pochodzących od myszy
UWAGA: Ten protokół został wcześniej opublikowany 6. Rozmrozić matrycę membrany podstawnej na lodzie i przygotować wszystkie odczynniki przed rozpoczęciem.
<ol>
	<li>Składaj ofiary na myszach przy użyciu metody zatwierdzonej przez instytucję badawczą, w której prowadzone są badania. Usuń żołądek myszy i przeprowadź sekcję zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami 6. Prać w 20 ml lodowato zimnego Ca2+/Mg2+ wolnego od DBPS. 
	UWAGA: Myszy C57BL/6 w wieku od 8 do 10 tygodni są używane do hodowli organoidów żołądka dna. Myszy zostały poddane eutanazji przez wdychanie dwutlenku węgla, a następnie ręczne zwichnięcie szyjki macicy przed usunięciem żołądka.</li>
	<li>Usuń warstwę mięśniową z brzucha i wszelkich widocznych naczyń krwionośnych, jak wcześniej opublikowano 6.</li>
	<li>Oddziel dno oka od antrum i przedżołądka za pomocą sterylnej żyletki. Przeciąć dno oka małymi nożyczkami chirurgicznymi na fragmenty o wymiarach około 2,0 x 2,0 mm. Za pomocą kleszczy zebrać fragmenty do stożkowej probówki o pojemności 15 ml zawierającej bufor do inkubacji EDTA (Ca2+/Mg2+-free DPBS, 5mM EDTA) i inkubować w temperaturze 4 °C przez 2 godziny z delikatnym mieszaniem.</li>
	<li>W sterylnym kapturze pozostaw stożkową probówkę i fragmenty na lodzie na około 5 minut. Za pomocą pipety usuń jak najwięcej buforu do inkubacji, pozostawiając fragmenty nietknięte. Dodać 5 ml buforu do wytrząsania (1 g D-sorbitolu, 1,47 g sacharozy w 100 ml Ca2+/Mg2+-free DPBS) i wstrząsać ręcznie z siłą przez 2 minuty. Pozwól dużym fragmentom osiąść i w pośpiechu, za pomocą pipety 1000p, usuń małe fragmenty, które jeszcze nie osiadły w górnej warstwie.</li>
	<li>Wirować usunięte fragmenty przez 5 minut w temperaturze 4 °C przy 65 x g.</li>
	<li>Unikając pęcherzyków powietrza, usunąć supernatant, ponownie zawiesić w matrycy błony podstawnej i mieszać do uzyskania jednorodnej konsystencji.</li>
	<li>Za pomocą pipety z szeroką końcówką pokryć matrycę błony podstawnej w ilości 50 μl na studzienkę, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Dodaj wystarczającą ilość pożywki wzrostowej mFGO (zmodyfikowana pożywka Eagle / pożywka F12 firmy Advanced Dulbecco uzupełniona 2 mM L-glutaminą, 1% penicyliną / streptomycyną, 10 mM buforem HEPES, 1 mM n-akteylcystyną, 1 x N2, 1 x B27, 50% pożywki kondycjonowanej Wnt, 20% pożywki kondycjonowanej R-spondyną uzupełnionej 100 ng / ml inhibitorem morfogenetyki białka kości, 10 nM gastryny, 50 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu, 10 ng / ml czynnika wzrostu fibroblastów 10 i inhibitora 10 μM Y-27632 ROCK), aby zanurzyć pęcherzyk.</li>
	<li>Hodowla komórek w inkubatorze do hodowli komórkowych w temperaturze 37 °C, 5% CO 2 Wilgotnyinkubator. Zmieniaj nośnik co 4-5 dni.</li>
</ol>
3. Powłoka kolagenowa do transferu 2D
UWAGA: Wykonuj wszystkie procedury w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej, chyba że określono inaczej. Rozpocznij powlekanie kolagenu 24 godziny przed przeniesieniem organoidów 3D do monowarstwy. Utrzymuj kolagen z ogona szczura na lodzie i chroń go przed światłem. Płytki pokryte kolagenem są dobre do 2 tygodni. Jeśli powlekane płytki nie zostaną natychmiast zużyte, owinąć je folią i przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy będą potrzebne.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć kolagen z ogona szczura do 50 μg/ml za pomocą 20 mM kwasu octowego.</li>
	<li>Wystarczająco pokryj powierzchnię studzienki rozcieńczonym kolagenem. W przypadku jednego dołka w standardowej płytce 12-dołkowej pokryj około 1 ml kolagenu. Pozostaw na noc w temperaturze pokojowej w sterylnym kapturze.</li>
	<li>Przemyć dwukrotnie 1 ml DPBS bez Ca2+ / Mg2+ na studzienkę i pozostawić bez przykrycia na 2 godziny w temperaturze pokojowej w sterylnym kapturze.</li>
</ol>
4. Powłoka macierzy membrany podstawnej do transferu 2D
UWAGA: Wykonuj wszystkie procedury w sterylnym kapturze do hodowli tkankowej, chyba że określono inaczej. Rozpocznij powlekanie macierzy błony podstawnej 2 godziny przed przeniesieniem organoidów 3D do monowarstwy. Utrzymuj matrycę błony podstawnej na lodzie. Powlekane talerze są przeznaczone do natychmiastowego użycia i nie mogą być przechowywane przez dłuższy czas.
<ol>
	<li>Rozcieńczyć matrycę błony podstawnej w stożkowej probówce o pojemności 15 ml wodą klasy do hodowli komórkowych w stosunku 1:10. Rozcieńczyć na lodzie.</li>
	<li>Za pomocą pipety dodać 100 μl rozcieńczonej matrycy błony podstawnej do każdego dołka standardowej płytki 12-dołkowej. Za pomocą skrobaka do komórek równomiernie rozprowadź rozcieńczoną matrycę błony podstawnej w całej studzience, aby uzyskać równomierną powłokę.</li>
	<li>Inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.</li>
	<li>Usunąć resztki wody za pomocą pipety i suszyć w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę przed przeniesieniem organoidów 3D.</li>
</ol>
5. Transfer 3D m/hFGO do monowarstw komórek nabłonka żołądka 2D
<ol>
	<li>Po hodowli FGO 3D pochodzących od myszy lub człowieka przez 6-7 dni, rozpocznij transfer organoidów 3D do monowarstwy 2D. 
	UWAGA: Dla każdej wymaganej studzienki monowarstwy zaleca się użycie 300 nienaruszonych organoidów lub pojedynczych komórek pochodzących z 300 organoidów. W silnej kulturze oczekuje się, że uzyska około 150 organoidów/basenik w 12-dołkowej płytce hodowlanej.</li>
	<li>Upewnij się, że płytki są pokryte przed przeniesieniem. 
	UWAGA: Płytki pokryte matrycą membrany podstawnej mają półprzezroczystą warstwę żelu, jednak płytki pokryte kolagenem nie będą miały żadnych widocznych oznak powłoki.</li>
	<li>Usunąć pęcherzyk 3D z matrycą membrany podstawnej z płytki, bezpośrednio pipetując 1 ml sterylnego DBPS wolnego od Ca2+ / Mg2+ na środek pęcherzyka.</li>
	<li>Za pomocą pipety zebrać matrycę błony podstawnej i mieszaninę organoidów do probówek do hodowli komórkowych. Zebrać w proporcji 2 pęcherzyki matrycy błony podstawnej na probówkę. Wirować przez 5 minut w temperaturze 40 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Za pomocą systemu próżniowego usunąć supernatant i jak najwięcej matrycy błony podstawnej. Zawiesić ponownie w 4 ml Ca2+/Mg2+-free DBPS, usunąć supernatant i powtórzyć 2 - 3 razy. Aby zapoznać się z całym protokołem transferu organoidów, przejdź do kroku 5.10. Przejdź do kroku 5.7 dla protokołu zawieszenia pojedynczej komórki.</li>
	<li>Wstępnie podgrzej roztwór do oddzielania komórek do 37 °C i dodaj 1 ml do każdej probówki. Delikatnie wymieszać, odwracając probówki lub pipetując pipetą w górę i w dół. Inkubować przez 10 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodaj 2 ml DBPS wolnych od Ca2+/Mg2+ bezpośrednio do każdej probówki.</li>
	<li>Użyj igły 26 G i strzykaj mieszaninę 2-3 razy. Sprawdź wzrokowo, czy nie ma pojedynczych komórek. Strzykawkę jeszcze 1 - 2 razy, jeśli nadal występują organoidy lub skupiska komórek.</li>
	<li>Wirować przy 40 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić osad w pożywce 2D FGO (mysie podłoże wzrostu FGO 2D: Zaawansowane zmodyfikowane podłoże Eagle firmy Dulbecco/pożywka F12 uzupełnione 2mM L-glutaminą, 10 mM penicyliną/Streptomycyną, 10% płodową surowicą cielęcą, 10 mM buforem HEPES, 1 x N2, 1 x B27, uzupełnione 10 nM gastryną, Naskórkowy czynnik wzrostu 50 ng / mL, inhibitor 1 μM TGF-β i inhibitor 10 μM Y-27632 ROCK. Pożywka wzrostowa 2D dla człowieka FGO: Zaawansowana pożywka Eagle firmy Dulbecco/F12 uzupełniona 2 mM L-glutaminą, 1% penicyliną/streptomycyną, 10 mM buforem HEPES, 10% płodową surowicą cielęcą, 10 mM nikotynamidu, 1 x N2, 1 x B27, uzupełnioną 50 mg / ml kanamycyny, 50 ng / ml naskórkowego czynnika wzrostu i 10 μM inhibitora Y-27632 ROCK, 1 μM inhibitora TGF-β).</li>
	<li>Zawiesinę umieścić na płytkach powlekanych. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C. Wymieniać pożywkę co 4 dni lub częściej, jeśli podłoże zmieni kolor na żółty. Monowarstwa potrzebuje około 4 dni na uformowanie.</li>
</ol>
6. Test ran drapanych przy użyciu monowarstw komórek nabłonka żołądka 2D
<ol>
	<li>Za pomocą żyletki podrap monowarstwę, gdy kultura osiągnie 100% zbieżności.</li>
	<li>Utrwal monowarstwy za pomocą 3,7% formaldehydu przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przepuszczalność 0,5% niejonowego detergentu/PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Następnie blokuj monowarstwy z 2% surowicą osła przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i inkubuj z rozcieńczeniem 1:1000 pierwszorzędowego przeciwciała H+,K+-ATPazy przez noc w temperaturze 4 °C, przemyj 0,1% niejonowym detergentem/PBS i inkubuj w rozcieńczeniu 1:100 przeciwciała drugorzędowego przeciwko myszom 488 i 10 μg/ml barwienia jąder komórek Hoechsta w stosunku 1:100 przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Aby zidentyfikować powierzchniowe komórki śluzówki w jednowarstwowych hodowlach 2D żołądka pochodzących od człowieka, wybarwić komórki 20 μg / ml koniugatu Ulex europaeus (UEAI) FITC. Monowarstwy obrazu w mikroskopie konfokalnym.</li>
	<li>Rób zdjęcia rany co kilka godzin. Zadrapanie będzie ponownie nabłonkować w ciągu 24 - 48 godzin, w zależności od jakości monowarstwy i różnic między pacjentami.</li>
</ol>

<ol><li>Nagy, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Helicobacter+pylori+regulates+cellular+migration+and+apoptosis+by+activation+of+phosphatidylinositol+3-kinase+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Helicobacter pylori regulates cellular migration and apoptosis by activation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling.</a> J Infect Dis. 199 (5), 641-651 (2009).</li>
<li>Mnich, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Helicobacter+pylori+on+the+healing+process+of+the+gastric+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Impact of Helicobacter pylori on the healing process of the gastric barrier.</a> World J Gastroenterol. 22 (33), 7536-7558 (2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bm-TFF2%2C+a+toad+trefoil+factor%2C+promotes+cell+migration%2C+survival+and+wound+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Bm-TFF2, a toad trefoil factor, promotes cell migration, survival and wound healing.</a> Biochem Biophys Res Commun. 398 (3), 559-564 (2010).</li>
<li>Crabtree, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+cytokines+in+pathogenesis+of+Helicobacter+pylori-induced+mucosal+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of cytokines in pathogenesis of Helicobacter pylori-induced mucosal damage.</a> Dig Dis Sci. 43 (Supplement), 46S-53S (1998).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Zhang, M., Li, H., Ma, H., Qin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+microfluidic+strategy+for+cell+migration+assay+in+an+in+vitro+wound-healing+model%5BTitle%5D)+AND+%22Wound+Repair+Regen%22%5BJournal%5D)">A simple microfluidic strategy for cell migration assay in an in vitro wound-healing model.</a> Wound Repair Regen. 21 (6), 897-903 (2013).</li>
<li>Schlaermann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+human+gastric+primary+cell+culture+system+for+modelling+Helicobacter+pylori+infection+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">A novel human gastric primary cell culture system for modelling Helicobacter pylori infection in vitro.</a> Gut. 65 (2), 202-213 (2016).</li>
<li>Bertaux-Skeirik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+plays+a+functional+role+in+Helicobacter+pylori-induced+epithelial+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">CD44 plays a functional role in Helicobacter pylori-induced epithelial cell proliferation.</a> PLoS Pathog. 11 (2), e1004663(2015).</li>
<li>Tarnawski, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+mechanisms+of+gastrointestinal+ulcer+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular mechanisms of gastrointestinal ulcer healing.</a> Dig Dis Sci. 50 (Suppl 1), S24-S33 (2005).</li>
<li>Wright, N. A., Pike, C., Elia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+a+novel+epidermal+growth+factor-secreting+cell+lineage+by+mucosal+ulceration+in+human+gastrointestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Induction of a novel epidermal growth factor-secreting cell lineage by mucosal ulceration in human gastrointestinal stem cells.</a> Nature. 343, 82-85 (1990).</li>
<li>Wright, C. L., Riddell, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histology+of+the+stomach+and+duodenum+in+Crohn%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Histology of the stomach and duodenum in Crohn's disease.</a> Am J Surg Pathol. 22 (4), 383-390 (1998).</li>
<li>Engevik, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Development+of+Spasmolytic+Polypeptide%2FTFF2-Expressing+Metaplasia+%28SPEM%29+During+Gastric+Repair+Is+Absent+in+the+Aged+Stomach%5BTitle%5D)+AND+%22CMGH%22%5BJournal%5D)">The Development of Spasmolytic Polypeptide/TFF2-Expressing Metaplasia (SPEM) During Gastric Repair Is Absent in the Aged Stomach.</a> CMGH. , In Press (2016).</li>
<li>Bertaux-Skeirik, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD44+variant+isoform+9+emerges+in+response+to+injury+and+contributes+to+the+regeneration+of+the+gastric+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">CD44 variant isoform 9 emerges in response to injury and contributes to the regeneration of the gastric epithelium.</a> Journal of Pathology. 242 (4), 463-475 (2017).</li>
<li>Nam, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+chief+cells+are+cryptic+progenitors+for+metaplasia+in+the+stomach%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Mature chief cells are cryptic progenitors for metaplasia in the stomach.</a> Gastroenterology. 139 (6), 2028-2037 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecny protokół szczegółowo opisuje ustanowienie monowarstw nabłonka żołądka pochodzących od ludzi i myszy, które można wykorzystać do testów ran drapanych. Protokół opiera się na koncepcji izolacji rezydentnych komórek macierzystych z pierwotnych tkanek ludzkich (lub mysich) i jest zmodyfikowanym protokołem opublikowanym po raz pierwszy przez Schlaermanna i wsp.7. W szczególności zoptymalizowaliśmy tutaj protokół, aby ustalić zlewającą się i spolaryzowaną monowarstwę nabłonka żołądka, kt...

Wykorzystanie testów ran drapanych jest popularną metodą badania naprawy i regeneracji1,2,3,4,5,6. Proponowana metodologia może być wykorzystana do specyficznego badania regeneracji żołądka i kolonizacji Helicobacter pylori. W przeszłości linie komórkowe raka żołądka były wykorzystywane jako środek do badania infekcji Helicobacter pylori (H. pylori)1,2 i do niedawna preferowane były linie komórkowe raka żołądka, takie jak komórki AGS1,2,3,4. Jednym z ograniczeń hodowli komórek raka żołądka jest brak rekapitulacji różnorodności komórkowej nabłonka żołądka. Aby spróbować rozwiązać to ograniczenie, zademonstrowano tutaj ustanowienie i przeniesienie pierwotnych 3-wymiarowych organoidów dna żołądka (FGO) pochodzących od ludzi i myszy do monowarstwy nabłonka żołądka w celu oznaczania gojenia się ran w oparciu o zmodyfikowaną metodę opisaną po raz pierwszy przez Schlaermanna i wsp. 7 Pokazujemy, że monowarstwy nabłonka żołądka pochodzące z ściętych 3D FGO żołądka lub pojedyncze komórki pochodzące z FGO zachowują spolaryzowany skład komórkowy, który ściśle odzwierciedla nabłonek żołądka in vivo. Biorąc pod uwagę, że linie komórkowe raka żołądka nie wykazują składu komórkowego wyświetlanego przez tę technikę, obecny protokół ma przewagę nad alternatywnymi metodami oznaczania ran drapanych. Metodologia ta została zoptymalizowana, dzięki czemu monowarstwy mogą być tworzone z całych organoidów lub z zawiesiny pojedynczej komórki ze zdysocjowanych organoidów i powlekane przy użyciu macierzy błony podstawnej lub powłoki kolagenowej. Ogólnym celem tego protokołu jest ustanowienie jednowarstwowych kultur nabłonka żołądka pochodzących z organoidów do nowego testu gojenia ran.

<table><tbody><tr><td>Zaawansowane zmodyfikowane podłoże Eagle/F12 firmy Dulbecco (podłoże podstawowe)</td><td>Life Technologies</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (L-glutamina)</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Thermo Scientific SV30010</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amfoterycyna B/Gentamycyna</td><td>Thermo Scientific</td><td>R01510</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Thermo Fisher</td><td>RO1510</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Buffer</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>n-Acetylocystyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor BMP (Noggin)</td><td>Pepro Tech</td><td>250-38</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin</td><td>Tocris</td><td>3006</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Pepro Tech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Pepro Tech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N0636</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 Inhibitor ROCK</td><td>Sigma</td><td>Aldrich Y0503</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; Inhibitor</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+/Mg2+ bez DPBS</td><td>Fisher</td><td>21-031CV</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco</td><td></td> <td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca dla płodu</td><td>FBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>OPTIMEM</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,22 i mikro; M filtr</td><td>Fisher</td><td>099-720-004</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg; C Kąpiel</td><td></td><td></td><td></td>wodna</tr><tr><td>Kolagenaza Typ 1</td><td>Worthington&nbsp;</td><td></td><td></td>LS004214</tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes (bibułka)</td><td>Fischer Scientific</td><td>06-666C</td><td></td></tr><tr><td>125 ml kolba</td><td></td><td></td><td></td>okrągłodenna</tr><tr><td>1 cal (25 mm) mieszadło</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gumowa septa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylna gaza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stojak na płytkę</td><td></td><td></td><td></td>mieszającą</tr><tr><td>Stojak</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>na pierścień Zaciski</td><td></td><td></td><td></td></tr> do stojaka na pierścienie <tr><td>Sterylna szalka</td><td></td><td></td><td></td>Petriego</tr><tr><td>18 G igły o długości 1,5 cala</td><td>Thermo Fisher</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>20 G Igły rdzeniowe o długości 3,5 Thermo</td><td>Fisher</td><td>405182</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa płytka poddana działaniu hodowli komórkowych</td><td>Midwest Scientific</td><td>92012</td><td></td></tr><tr><td>Obniżony czynnik wzrostu, bez czerwieni fenolu MatrigelTM (matryca membrany podstawnej)</td> <td>Fisher</td><td>CB-40230C</td><td></td></tr><tr><td>Sterylne żyletki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td><td></td>z szeroką końcówką</tr><tr><td>Zakrzywione kleszcze</td><td></td><td></td><td></td>hemostatyczne</tr><tr><td>200 i mikro; L szerokie końcówki do pipet</td><td>Thermo Fisher</td><td>02-707-134</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówki do hodowli komórkowych</td><td>Fisher</td><td>14-956-3C</td><td></td></tr><tr><td>Zbiornik tlenu z gumowym wężem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 g D-sorbitol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Fisher</td><td>SS-500</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>preparacyjny Taca</td> <td>preparcyjna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rocking Table</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rat Tail Collagen Type 1</td><td>Life Technologies</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Lodowaty kwas octowy klasy hodowli komórkowej</td><td>Fisher</td><td>A38-212</td><td></td></tr><tr><td>Woda klasy hodowli komórkowej</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>2-dołkowa zjeżdżalnia komorowa</td><td>Thermo Fisher</td><td>155380</td><td></td></tr><tr><td>12-dołkowa Transwell (wkładki z membraną poliestrową)</td><td>Skrobak do komórek Corning</td><td>3460</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>353086</td><td></td></tr><tr><td>Accutase (roztwór do odrywania komórek)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 263/8 Thermo</td><td>Fisher</td><td>309625</td><td></td></tr><tr><td>Żyletka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>L Cells</td><td>Limfocyty L, linia komórkowa wytwarzająca Wnt3a, zostały otrzymane w prezencie od dr Hansa Cleversa (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Holandia). &nbsp;</td><td>Zmodyfikowana</td><td></td></tr><tr>linia komórkowa wydzielająca<td>R-spondynę HEK-293T</td><td>Zmodyfikowana linia komórkowa wydzielająca R-spondynę HEK-293T została uzyskana od dr Jeffa Whitsetta (Sekcja Neonatologii, Biologii Okołoporodowej i Pulmonologicznej, Centrum Medyczne Szpitala Dziecięcego w Cincinnati oraz The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA&nbsp;). &nbsp; &nbsp;</td><td>Nr DOTYCZY</td><td></td></tr><tr><td>HK-ATPazy Przeciwciało pierwszorzędowe</td><td>Invitrogen</td><td>SC-374094</td><td></td></tr><tr><td>E-Cadherinn</td><td>SantaCruz</td><td>sc-59778</td><td></td></tr><tr><td>UEA1</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9006</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>Alexafluor 488 przeciwciało drugorzędowe (przeciwciało drugorzędowe przeciwko myszi Donkey 488)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R37114</td><td></td></tr></tbody></table>

pierwotna jednowarstwowa hodowla nabłonka żołądka pochodząca od myszy i człowieka do badania regeneracji

Mouse- and Human-derived Primary Gastric Epithelial Monolayer Culture for the Study of Regeneration

Badania in vitro nad gojeniem ran żołądkowych zazwyczaj obejmują użycie linii komórkowych raka żołądka w teście na ranie drapanej proliferacji i migracji komórek. Jednym z krytycznych ograniczeń takich testów jest jednak ich jednorodny asortyment typów komórkowych. Naprawa to złożony proces, który wymaga interakcji kilku typów komórek. Dlatego badanie kultury pozbawionej podtypów komórkowych jest problemem, który musi zostać przezwyciężony, jeśli mamy zrozumieć proces naprawy. Model organoidów żołądka może złagodzić ten problem, ponieważ niejednorodny zbiór typów komórek ściśle odzwierciedla nabłonek żołądka lub inne natywne tkanki in vivo. Zademonstrowano tutaj nowatorski test in vitro na ranę drapaną uzyskany z trójwymiarowych organoidów ludzkich lub mysich, które można następnie przenieść do monowarstwy nabłonka żołądka jako nienaruszone organoidy lub jako zawiesinę pojedynczych komórek zdysocjowanych organoidów. Celem protokołu jest ustanowienie monowarstw nabłonka żołądka pochodzących z organoidów, które można wykorzystać w nowatorskim systemie oznaczania ran drapanych do badania regeneracji żołądka.

Organoidy wyprowadzono z trzonu ciała żołądka ludzkiego lub z tkanek dna żołądka mysiego (Rysunek 1A). Po trawieniu tkanki żołądka ludzkiej lub mysiej odpowiednio kolagenazą lub EDTA, gruczoły osadzono w macierzy błony podstawnej i hodowano przez 6 - 7 dni (Rysunek 1A). Rysunek 1B przedstawia tworzenie ludzkich organoidów żołądkowych (huFGOs), które następnie przeniesiono na warstwę monowarstwy nabło...

Tutaj opisujemy protokół tworzenia i hodowli trójwymiarowych (3D) organoidów żołądkowych pochodzących od ludzi i myszy oraz metodę transferu organoidów 3D do jednowarstwowej 2-wymiarowej. Opisano również zastosowanie monowarstwy nabłonka żołądka jako nowatorskiego testu na ranę drapaną do badań nad regeneracją.

Pierwotna jednowarstwowa hodowla nabłonka żołądka pochodząca od myszy i człowieka do badania regeneracji

In vitro studies of gastric wound repair typically involves the use of gastric cancer cell lines in a scratch-wound assay of cellular proliferation and ...

Ogólnym celem tego systemu hodowli jest wygenerowanie pierwotnej monowarstwy żołądka pochodzącej od myszy lub człowieka do badania regeneracji w teście gojenia się ran. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w polu żołądkowym, takie jak mechanizm regeneracji komórek nabłonka żołądka w odpowiedzi na uraz. Główną zaletą tej techniki jest po pierwsze, badanie migracji i regeneracji komórek w teście gojenia się ran, wygenerowanym z pierwotnych komórek żołądka pochodzących od myszy lub ludzi, a po drugie, generacja organoidów żołądkowych pochodzenia ludzkiego do eksperymentów na dużą skalę.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w regenerację nabłonka żołądka, może być również stosowana do innych systemów, takich jak zakażenie Helicobacter pylori i kohodowle nabłonkowych komórek odpornościowych. Procedurę zademonstruje Emma Teal, doktorantka z mojego laboratorium. Na początek zbierz przygotowaną tkankę do dużego plastikowego pojemnika wypełnionego DPBS bez wapnia i magnezu.Pozostaw plastikowy pojemnik na lodzie do czasu użycia. Następnie za pomocą kleszczy energicznie umyj tkankę w sterylnej zlewce zawierającej 100 mililitrów DPBS bez wapnia i magnezu przez około 30 sekund.

mouse-human-derived-primary-gastric-epithelial-monolayer-culture-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Ten film opisuje metodę izolowania komórek nabłonka żołądka od ludzkiej tkanki dna żołądka. Wyizolowane komórki nabłonkowe można wykorzystać jako model in vitro do badania ich roli regulacyjnej w fizjologii i patofizjologii żołądka.

Izolacja gruczołów dna żołądka: metoda izolowania gruczołów dna żołądka od ludzkiej tkanki żołądka

Ten film pokazuje hodowlę komórek glejowych Müllera (MG) wyizolowanych z siatkówki myszy. Siatkówki są dysocjowane w zawiesinę jednokomórkową za pomocą enzymów trawiennych. Komórki są następnie hodowane w pożywce z czynnikiem wzrostu, który sprzyja proliferacji komórek MG i śmiertelności komórek neuronalnych. Martwe komórki neuronalne są usuwane podczas pasażowania, a komórki MG są hodowane w celu dalszej analizy.

Ustanowienie hodowli komórek glejowych Müllera uzyskanej z siatkówki myszy

Kultury pochodzące z komórek macierzystych kryją w sobie ogromny potencjał do modelowania chorób zakaźnych. W tym miejscu opisano hodowlę mysich i ludzkich organoidów żołądkowych pochodzących z dorosłych komórek macierzystych. Organoidy są mikrowstrzykiwane z patogenem żołądkowym Helicobacter pylori.

Organoidy jako model chorób zakaźnych: hodowla organoidów żołądka ludzkiego i mysiego oraz mikroiniekcja Helicobacter pylori

Ten protokół opisuje izolację i hodowlę mieszanych mysich komórek jelita cienkiego. Te pierwotne hodowle jelitowe umożliwiają badanie szlaków sygnałowych leżących u podstaw wydzielania peptydów jelitowych przy użyciu wielu technik.

Mieszane pierwotne hodowle mysiego jelita cienkiego przeznaczone do badania wydzielania hormonów jelitowych i obrazowania żywych komórek enteroendokrynnych

Tutaj opisujemy metodę hodowli trójwymiarowej do analizy morfologii komórek pierwotnego raka piersi, a także do badania ich bezpośrednich/pośrednich interakcji z monocytami i wyników, takich jak degradacja kolagenu, rekrutacja komórek odpornościowych, inwazja komórek i promowanie stanu zapalnego związanego z rakiem.

Analiza komunikacji między monocytami a pierwotnymi komórkami raka piersi w trójwymiarowym systemie opartym na ekstrakcie z macierzy zewnątrzkomórkowej (ECME)

Opisujemy instrukcje krok po kroku, aby: 1) efektywnie konstruować organoidy jelitowe za pomocą nanocząsteczek magnetycznych do transdukcji soczewicowacej lub retrowirusowej, oraz 2) generować zamrożone skrawki z zmodyfikowanych organoidów. Podejście to zapewnia potężne narzędzie do efektywnej zmiany ekspresji genów w organoidach w celu zbadania dalszych efektów.

Inżynieria genetyczna pierwotnych organoidów jelitowych myszy z wykorzystaniem wektorów wirusowych transdukcji nanocząstek magnetycznych do zamrożonego cięcia

W tym protokole opisujemy, jak generować monowarstwy mysiego pierwotnego nabłonka jelita grubego bezpośrednio z krypt jelitowych. Zapewniamy eksperymentalne podejścia do generowania zlewających się monowarstw na filtrach przepuszczalnych, monowarstw konfluentnych do gojenia ran drapanych i badań biochemicznych oraz rzadkich i zlewających się monowarstw do analizy immunofluorescencyjnej.

Generowanie monowarstw nabłonka pierwotnego jelita grubego myszy z krypt jelitowych

Pierwotne kultury glejowe Müllera uzyskane z siatkówki myszy stanowią bardzo solidne i niezawodne narzędzie do badania konwersji gleju w komórki progenitorowe siatkówki po leczeniu mikroRNA. Pojedyncze cząsteczki lub ich kombinacje mogą być badane przed ich późniejszym zastosowaniem w metodach in vivo.

Pierwotne hodowle komórkowe w celu zbadania potencjału regeneracyjnego mysiego gleju Müllera po leczeniu mikroRNA

Organoidy pochodzące od pacjentów żołądkowych znajdują coraz większe zastosowanie w badaniach, jednak brakuje formalnych protokołów do generowania ludzkich organoidów żołądkowych z jednokomórkowych trawień o standaryzowanej gęstości wysiewu. W protokole przedstawiono szczegółową metodę wiarygodnego tworzenia organoidów żołądka z tkanki biopsyjnej uzyskanej podczas endoskopii górnego odcinka kręgosłupa.

Ustalenie i charakterystyka organoidów żołądkowych pochodzących od pacjenta z biopsji łagodnego ciała żołądka i nabłonka antralnego

Komórki M w wyspecjalizowanym nabłonku związanym z mieszykami, pokrywającym kępki Peyera, odgrywają istotną rolę w nadzorze immunologicznym błony śluzowej w tkance limfatycznej związanej z jelitami. W niniejszej pracy opisaliśmy metodę oceny transcytozy bakteryjnej przez komórki M in vivo. Metoda ta pozwala na zrozumienie funkcji komórek M w układzie odpornościowym.

Zastosowanie testu pętli jelitowej z podwiązaną plamką Peyer’a u myszy do oceny wychwytu bakterii przez komórki M

Poznaj metodę hodowli pierwotnego jednowarstwowego nabłonka żołądka pochodzącego od myszy i człowieka do badań regeneracji. Technika umożliwia analizę migracji komórek i gojenia ran w kontrolowanych warunkach.

Pierwotna jednowarstwowa hodowla nabłonka żołądka pochodząca od myszy i człowieka do badania regeneracji

Przeglądaj więcej filmów