Wykorzystanie oocytów myszy do oceny funkcji ludzkich genów podczas mejozy I

Ogólnym celem tej serii testów jest zbadanie funkcji ludzkich genów podczas mejozy I przy użyciu oocytów myszy. Metody te mogą pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie reprodukcji człowieka, takie jak to, czy istnieje genetyczna predyspozycja do aneuploidii matki. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona oocyty myszy jako model mejozy ssaków, co jest przydatne, biorąc pod uwagę niedostępność ludzkich komórek jajowych do badań funkcji genów.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zsekwencjonowaliśmy egzomy kobiet, które przeszły zabiegi zapłodnienia in vitro i których częstość aneuploidii zarodkowej nie mogła być wyjaśniona wiekiem matki. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy analizy obrazu są trudne do nauczenia, a zdefiniowanie ścisłych parametrów analizy jest kluczem do rygoru i odtwarzalności. Korzystając ze zwalidowanej strategii klonowania, należy wprowadzić pełnowymiarową sekwencję kodującą genu będącego przedmiotem zainteresowania do regionu wielokrotnego klonowania wektora transkrypcyjnego in vitro.

Mutagenizować DNA, jeśli generuje polimorfizmy pojedynczego nukleotydu lub insercje i delecje, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie przekształć zmutagenizowane DNA w bakteryjnego gospodarza. Użyj zestawu do wyizolowania i oczyszczenia plazmidu, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.

Następnie linearyzuj produkty końcowe za pomocą trawienia pojedynczym enzymem restrykcyjnym oczyszczonego DNA. Oczyść strawiony produkt za pomocą zwalidowanego protokołu oczyszczania DNA lub zestawu. I eluować w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNaz / DNaz.

In vitro należy dokonać transkrypcji DNA przy użyciu polimerazy T7 zgodnie z protokołem producenta. Na koniec oczyść i wymyj RNA w 30 mikrolitrach wody wolnej od RNaz / DNaz za pomocą zestawu do oczyszczania kwasów nukleinowych na bazie kolumny spinowej na matrycy krzemionkowej zgodnie z protokołem producenta. Podziel oocyty na równe grupy do mikroiniekcji.

Mikrowstrzyknij jednej grupie eksperymentalne mRNA, a drugiej grupie kontrolne NPB typu dzikiego lub mRNA GFP. Za pomocą ręcznego lub ustnego aparatu do pipetowania, w którym szklany otwór pipety jest nieco większy niż średnica oocytu, przenieś oocyty do 100-mikrolitrowej kropli pożywki hodowlanej wolnej od milrinonu na szalce Petriego pokrytej olejem mineralnym o jakości zarodkowej. Następnie inkubuj oocyty przez siedem godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% CO2, aby umożliwić wystarczające dojrzewanie do metafazy Mejozy I. Po inkubacji użyj tego samego aparatu pipetowego, aby przenieść oocyty do naczynia do hodowli narządów w basenie centralnym, zawierającego 700 mikrolitrów wstępnie schłodzonej pożywki zbiorczej MEM w studzience środkowej i 500 mikrolitrów wody w pierścieniu zewnętrznym

Umieść naczynie na lodzie na siedem minut. Napraw oocyty, przenosząc je do studzienki z przezroczystej szklanej płytki punktowej zawierającej 400 mikrolitrów 2% paraformaldehydu w 1x PBS. Inkubować przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Po barwieniu immunologicznym, zgodnie z opisem w protokole tekstowym, zobrazuj oocyty za pomocą obiektywu o powiększeniu od 40 do 63x pod mikroskopem konfokalnym. Uchwyć małe kroki w płaszczyźnie Z zoptymalizowane dla celu roboczego i zobrazuj cały obszar wrzeciona metafazy. Aby określić stan przyłączenia mikrotubuli kinetochorowej, najpierw otwórz obraz, przeciągając plik na pasek narzędzi ImageJ.

W otwartej serii Z przejdź do menu rozwijanego obrazu, a następnie na karcie podrzędnej Kolor kliknij opcję Scal kanały, aby wyświetlić wszystkie kanały. Bardzo ważne jest, aby analityk był zaznajomiony z tym, jakiego rodzaju przyłączenia do kinetochorów są możliwe w oocytach myszy. Jakość obrazu w dużym stopniu wpłynie na Twoją zdolność do prawidłowej analizy tych danych.

Za pomocą przełącznika u dołu obrazu przejdź przez każdy plasterek Z i określ przyczepienie mikrotubuli kinetochorowej. Używając tego samego aparatu do pipet, przenieś oocyty do 100-mikrolitrowej kropli pożywki hodowlanej bez milrinonu pod olejem. Inkubować oocyty przez siedem godzin, aby umożliwić wystarczające dojrzewanie do metafazy Mejozy I, jak poprzednio.

Następnie przenieś oocyty do naczynia do hodowli narządów w studzience centralnej, zawierającej 700 mikrolitrów pożywki hodowlanej zawierającej monoastrol w studzience środkowej i 400 mikrolitrów wody w otaczającym pierścieniu. Inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny. Wypłucz monastrol, przenosząc oocyty przez trzy krople po 100 mikrolitrów pożywki hodowlanej CZB.

Następnie przenieś oocyty do nowego naczynia do hodowli narządów w studzience centralnej, zawierającego 700 mikrolitrów pożywki hodowlanej oraz inhibitora proteasomu w pierścieniu środkowym. Dodaj 400 mikrolitrów wody do zewnętrznego pierścienia i inkubuj przez trzy godziny. Następnie utrwal oocyty, przenosząc je do studzienki z przezroczystej szklanej płytki punktowej zawierającej 400 mikrolitrów 2% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut w temperaturze pokojowej.

Zobrazuj oocyty za pomocą obiektywu o powiększeniu od 40 do 63x pod mikroskopem konfokalnym, rejestrując mniej niż jeden mikron kroków w płaszczyźnie Z i upewniając się, że obrazujesz cały obszar wrzeciona metafazy. Aby określić stan wyrównania chromosomów, otwórz pliki obrazów za pomocą oprogramowania do obrazowania. Następnie przeciągnij obraz do panelu sterowania ImageJ.

W otwartej serii Z użyj narzędzia punktowego, aby zaznaczyć punkty na końcu każdego bieguna wrzeciona w odpowiednim przekroju Z, umieszczając narzędzie nad biegunem wrzeciona na obrazie i klikając obraz. Dodaj te punkty do Menedżera ROI, naciskając jednocześnie przycisk poleceń i przycisk T na klawiaturze. Określ konkretne współrzędne dla każdej z ustawionych pozycji, podświetlając konkretny punkt w Menedżerze ROI i klikając przycisk Zmierz.

Spowoduje to wyświetlenie tabeli wyników zawierającej współrzędne X i Y dla każdego punktu, które są odpowiednio punktami X1, Y1 i X1, Y2. Następnie określ rzeczywistą współrzędną Z. Odbywa się to poprzez pomnożenie numeru wycinka określonego wycinka Z w stosie Z, w którym biegun wrzeciona został zidentyfikowany na podstawie grubości stosu.

Będą to odpowiednio punkty Z1 i Z2. Określ długość wrzeciona za pomocą równania twierdzenia Pitagorasa z wcześniej zdefiniowanymi współrzędnymi X, Y i Z. Następnie określ strefę środkową wrzeciona.

Oblicza się to jako 1/2 długości wrzeciona. Kliknij ikonę linii na pasku narzędzi ImageJ i narysuj linię biegnącą od jednego bieguna wrzeciona do strefy środkowej wrzeciona. Długość zostanie wyświetlona na pasku narzędzi ImageJ.

Zdefiniowanie ścisłych parametrów dopasowania chromosomów pozwala na solidną analizę ilościową, co jest ważne dla odtwarzalności danych. Określ stan wyrównania chromosomów, oceniając odległość chromosomu od strefy środkowej wrzeciona za pomocą narzędzia do pomiaru linii. Kliknij ikonę linii na pasku narzędzi ImageJ i narysuj linię od strefy środkowej wrzeciona do chromosomu.

Długość zostanie wyświetlona na pasku narzędzi ImageJ. Chromosomy większe niż cztery mikrony od strefy środkowej wrzeciona są uważane za niewyrównane. Po poddaniu oocytów barwieniu immunologicznemu i obrazowaniu można ocenić prawidłowe przyłączanie kinetochoru mikrotubul

W normalnym przyczepie każda siostrzana para kinetochorów biwalentnych jest przyłączona do mikrotubul wrzeciona z przeciwnych biegunów. Można zaobserwować do trzech różnych rodzajów nieprawidłowych przystawek. Jednym z przykładów jest sytuacja, w której nie ma mikrotubul stykających się z kinetochorem.

Alternatywnie, mikrotubule mogą wiązać się nieprawidłowo, tworząc przyczepy synteliczne lub meroteliczne. Przyczepy synteliczne tworzą się z obiema parami siostrzanych kinetochorów przyłączonymi do mikrotubul emanujących z jednego bieguna. Przyczepy meroteliczne występują, gdy siostrzane kinetochory w parze są przyczepione do przeciwległych biegunów.

Po tym, jak oocyty odzyskają sprawność po indukowanej niewspółosiowości, zdolność chromosomów do ponownego wyrównania ocenia się za pomocą obrazowania. W tym przykładzie jeden dwuwartościowy chromosom jest uważany za niewspółosiowy, ponieważ znajduje się w odległości większej niż cztery mikrony od strefy środkowej wrzeciona. Przy wyborze testu, który jest odpowiedni do oceny funkcji wariantu genu, ważne jest, aby pamiętać, że badane warianty genów ludzkich ulegają nadekspresji i że endogenne homologi myszy mogą wymagać wyczerpania w tym samym czasie.

Po tej procedurze można zastosować inne metody, takie jak CRISPR-Cas9 do tworzenia humanizowanych szczepów myszy, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak zrozumienie, w jaki sposób wariant genu wpływa na jakość jaj i zarodków oraz czy wpływa na zdrowie reprodukcyjne danej osoby. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się genetyką rozrodu do zbadania innych czynników powodujących aneuploidię matczyną u ludzi. Identyfikacja genów może dostarczyć potężnej diagnostyki i stanowić podstawę do badań nad korygowaniem aneuploidii.

Dziękuję za oglądanie. Powodzenia w eksperymentach.