Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie opieki pulmonologicznej, takie jak dlaczego pacjenci, którzy przeżyli szpitalne zapalenie płuc, mają tak słabe długoterminowe wyniki? Zaletą tej metody jest to, że jest prosta i niezawodna, co oznacza, że każdy, kto przychodzi do laboratorium, może się jej nauczyć, a następnego dnia generuje przydatne i powtarzalne dane. Chociaż te metody analityczne mogą być stosowane w celu uzyskania wglądu w infekcję komórek hodowanych in vitro, można je również zastosować do modeli zwierzęcych i pacjentów.

Aby wytworzyć cytotoksyczny supernatant, umyj 150-centymetrowe naczynie komórek śródbłonka HBSS i rozcieńcz kolonię P.aeruginosa do absorpcji 0,25 przy 540 nanometrach. Dalej rozcieńczyć komórki bakteryjne, aby umożliwić wielokrotność infekcji od 20 do jednego na 20 mililitrów HBSS i zasiać bakterie na płytce komórek śródbłonka. Następnie umieść zainfekowane komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na cztery do pięciu godzin.

Istotne jest, aby inkubacja bakterii i komórek śródbłonka zachodziła przez odpowiedni czas. Jeśli inkubacja jest zbyt krótka, amyloidy nie zostaną uwolnione do supernatantu. Jeśli inkubacja jest zbyt długa, komórki faktycznie ulegną lizie i uwolnią całą swoją zawartość do supernatantu.

Wskaźnikiem, którego używamy dla odpowiedniego czasu inkubacji, jest powstawanie luk w monowarstwie śródbłonka. Gdy za pomocą mikroskopii świetlnej można zaobserwować przerwy w monowarstwie komórki, należy zebrać supernatant do odwirowania w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń komórkowych. Zdekantować supernatant do strzykawki wyposażonej w filtr o wielkości 0,2 mikrona i przepuścić supernatant przez filtr w celu usunięcia wszelkich bakterii zanieczyszczających.

Następnie odłóż 1,5 mililitra sterylnego supernatantu do badania cytotoksyczności i zamroź resztę próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby ocenić cytotoksyczność zebranego supernatantu, dodać 1,5 mililitra podwielokrotności wysterylizowanego filtrem supernatantu do pojedynczego dołka sześciodołkowej płytki zawierającej zlewającą się hodowlę komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc. Umieść płytkę w inkubatorze CO2 na 21 do 24 godzin.

Następnie uzyskaj obrazy regionów kultur poddanych działaniu środka i kontrolnych. Zaimportuj obrazy do niestandardowego makra imagej i dostosuj kontrast do 15% nasyconych pikseli. Zduplikuj obrazy o dostosowanym kontraście i użyj opcji odejmij tło, aby uzyskać obrazy o wysokim kontraście zarówno nienaruszonych komórek, jak i obszaru przerwy w polu widzenia.

Odejmij ten obraz o wysokim kontraście od oryginalnego obrazu i użyj kalkulatora obrazów oraz funkcji, aby połączyć wynikowy obraz z oryginalnym obrazem. Użyj funkcji progu, aby przekonwertować połączony obraz na maskę z przerwami w kolorze czarnym i nienaruszonymi komórkami w kolorze białym. I użyj binarnej funkcji erody, aby usunąć wszelkie szumy z obrazu.

Następnie użyj ułamka powierzchni, aby zmierzyć stosunek czarnych do białych pikseli w wynikowym obrazie. Wykreśl i wyraź obszary ułamkowe dla każdego punktu czasowego leczenia jako procent maksymalnego obszaru przerwy. Aby określić ilościowo zawartość amyloidów w supernatancie, dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego i przefiltrowanego 50-krotnego roztworu podstawowego tioflawiny T do jednego mililitra PBS w jednomililitrowej kuwecie spektrofotometru i załaduj rozcieńczoną próbkę do spektrofluorometru.

Zmierz bazową emisję fluorescencji za pomocą wzbudzenia 425 nanometrów. Skanowanie emisji fluorescencji od 450 do 575 nanometrów w krokach co dwa nanometry. Następnie ustaw instrument tak, aby wykonywał skanowanie poklatkowe przy użyciu wzbudzenia 425 nanometrów i emisji 482 nanometrów z akwizycją danych co 0,2 sekundy przez 60 sekund.

Wstrzymaj skanowanie po 20 sekundach i 10 mikrolitrach wysterylizowanego supernatantu z filtrem do kuwety. Po wymieszaniu przez odwrócenie ponownie załaduj kuwetę do spektrofluorometru i wznów skanowanie oparte na czasie przez ostatnie 40 sekund. Po zakończeniu upływu czasu wykonaj końcowe skanowanie widma emisji fluorescencji, korzystając z oryginalnych ustawień skanowania.

Dodatek P.aeruginosa do zlewających się warstw komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc indukuje tworzenie się luk między komórkami. Korzystając z imagej do oceny cytotoksyczności supernatantu, która wykazała w ciągu pierwszych 12 godzin leczenia, nadal zdrowe monowarstwy zlewających się komórek można zwizualizować jako wszystkie białe obszary w polu mikroskopowym. Jednak po 18 godzinach od dodania supernatantu pobranego z kultur zakażonych PA 103 można wykryć luki w monowarstwie, przy czym obszar szalki hodowlanej pozbawiony komórek zwiększa się w sposób liniowy do 36 godzin leczenia, w którym to momencie nie można zaobserwować prawie żadnych nienaruszonych komórek.

Podobne wyniki można uzyskać, stosując uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej jako markera cytotoksyczności. Z dehydrogenazą mleczanową wykrytą po raz pierwszy po 18 godzinach od dodania cytotoksycznego supernatantu i zwiększającą się w sposób liniowy, aż do maksymalnego zabicia komórek po 36 godzinach. Supernatanty można również ocenić za pomocą analizy immunoblot lub mierząc zmianę intensywności fluorescencji tioflawiny T spowodowaną zmianami potwierdzającymi wywołanymi wiązaniem amyloidu w celu określenia obecności cytotoksycznych amyloidów w supernatantach.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować cytotoksyczne supernatanty po zakażeniu komórek śródbłonka citomonsis aeruginosa. Ponadto powinieneś być dobrze zorientowany w rodzajach testów potrzebnych do scharakteryzowania i analizy cytotoksyn, które są obecne w tych supernatantach.