Name: Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Poznaj metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa. Prosta i niezawodna technika umożliwia generowanie powtarzalnych danych w badaniach nad zakażeniami.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie zostało częściowo sfinansowane z grantów NIH HL66299 dla TS, RB i SL, HL60024 dla TS, a HL136869 dla MF.

Wszystkie procedury na zwierzętach zostały sprawdzone i zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Południowej Alabamy i zostały przeprowadzone zgodnie ze wszystkimi przepisami federalnymi, stanowymi i lokalnymi. Pierwotne hodowle komórek mikronaczyniowego śródbłonka płuc szczurów (PMVEC) uzyskano z Cell Culture Core Facility w Centrum Biologii Płuc Uniwersytetu Południowej Alabamy. Komórki zostały przygotowane przy użyciu wcześniej opisanych procedur16.
1. Wytwarzanie cytotoksycznych supernatantów
Uwaga: Tutaj używamy dwóch różnych szczepów P. aeruginosa: PA103, który ma nienaruszony system wydzielania typu III zdolny do przenoszenia egzoenzymów ExoU i ExoT do komórek docelowych podczas infekcji, oraz ∆PcrV, który nie ma systemu wydzielania typu III i nie jest zdolny do przenoszenia egzoenzymów do komórek docelowych po inokulacji.
<ol>
	<li>Nanieś bakterie na płytki agarowe Vogel-Bonner (VB)17 i rozwijaj się przez noc w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Aby przygotować płytki, przygotuj następujący roztwór podstawowy (sole Vogela-Bonnera; 10x bulion): odmierz 2 gMgSO4, 20 g kwasu cytrynowego (wolnego kwasu), 100 gK2PO4 i 35 g NaH2PO4. Dodać ddH2O do 1 L i sterylizować w autoklawie przez 15 minut z powolnym wydechem.</li>
		<li>Umieścić 7,5 g agaru w 450 ml ddH2O i autoklaw jak powyżej.</li>
		<li>Po sterylizacji w autoklawie umieścić oba roztwory w łaźni wodnej o temperaturze 50 °C do ostygnięcia.</li>
		<li>Dodaj 50 ml 10x roztworu soli podstawowej VB do agaru.</li>
		<li>Dodać karbenicylinę do 400 μg/ml (dla stosowanych szczepów P. aeruginosa) i dobrze wymieszać, obracając kolbą.</li>
		<li>Umieścić 5 ml roztworu agaru VB w indywidualnych sterylnych szalkach hodowlanych, pozostawić agar do zestalenia się, a następnie przechowywać w temperaturze 4 °C do dnia wysiewu bakterii.</li>
		<li>W dniu wysiewu bakterii należy podgrzać płytkę do temperatury 37 °C, a następnie rozprowadzić bakterie na szalce za pomocą sterylnej pętli. Umieścić płytkę na noc w inkubatorze o temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdzić czystość PMVEC poprzez barwienie dodatnie lektyną Griffonia simplicifolia i barwienie ujemne fluorescencyjną lektyną Helix pomatia (marker komórek śródbłonka tętnic). Podwielokrotne komórki i zamrozić w ciekłym azocie.</li>
	<li>Do eksperymentów utrzymuj komórki w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i hoduj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C zawierającym 5% CO2 . Użyj komórek w przejściach od 5 do 15.
	<ol>
		<li>W celu wytworzenia cytotoksycznych supernatantów, umieść 2 x 106 komórek na pojedynczych szalkach o długości 150 cm i hoduj przez 3 - 4 dni, aż do osiągnięcia konfluencji. Użyj dwóch płytek na eksperyment (patrz poniżej).</li>
		<li>Do analizy cytotoksycznych supernatantów należy umieścić 1 x 105 komórek w pojedynczych dołkach 6-dołkowej płytki i rosnąć przez cztery dni, aż do osiągnięcia konfluencji.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wytworzyć supernatant, umyj jedną z dwóch 150 cm naczyń PMVEC z kroku 1.3.1 solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, poddaj ją trypsynizacji, a następnie policz komórki (używamy automatycznego licznika komórek i postępujemy zgodnie z protokołem producenta; patrz Tabela materiałów). Umyj drugie naczynie PMVEC zrównoważonym roztworem soli Hanka (HBSS), a następnie zainfekuj dowolnym szczepem P. aeruginosa przy wielokrotności infekcji (MOI) 20:1. Osiąga się to w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Dla P. aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 jtk/ml. Aby przygotować to rozcieńczenie, dodaj 1 ml HBSS do jednorazowej kuwety o pojemności 1 ml. Zeskrobać wystarczającą ilość bakterii z płytki, która została przygotowana w kroku 1.1, aż do osiągnięcia OD540 wynoszącego 0,25 podczas pomiaru za pomocą spektrofotometru. Następnym krokiem będzie obliczenie, ile bakterii będzie potrzebnych.</li>
		<li>Po ustaleniu liczby PMVEC w szalce hodowlanej (krok 1.4 powyżej), należy określić odpowiednią liczbę bakterii, które należy dodać do drugiej, nietrypsynizowanej szalki hodowlanej zawierającej PMVEC. Na przykład, jeśli ustalono, że naczynie hodowlane PMVEC zawiera 1,3 x 107 komórek, należy przygotować 1,3 x 107 komórek x 20 bakterii/komórkę x 1 ml / 2 x 108 CFU = 1,3 ml bakterii.</li>
		<li>Rozcieńczyć 1,3 ml bakterii w HBSS do końcowej objętości 20 ml, tak aby cała powierzchnia naczynia o długości 150 cm mogła być pokryta płynem, a następnie dodać rozcieńczone bakterie do płytki PMVEC.</li>
		<li>Inkubować PMVEC zaszczepione bakteriami w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 przez 4 - 5 godzin, aż będzie można zobaczyć przerwy tworzące się w monowarstwie komórki, gdy płytka jest obserwowana pod mikroskopem (patrz rysunek 1 w celu uzyskania prawidłowego poziomu tworzenia luki).</li>
		<li>Zebrać supernatant, a następnie odwirować przez 10 minut przy 2 000 x g w wirówce stołowej w celu usunięcia resztek komórkowych. 
		Uwaga: Na tym etapie można użyć dowolnej wirówki stołowej zdolnej do wytworzenia siły g wystarczającej do osadzania niezlizanych komórek i dużych fragmentów komórek.</li>
		<li>Wlej supernatant do strzykawki z filtrem 0,2 μm przymocowanym do jej końca, a następnie przepuść supernatant przez filtr w celu usunięcia bakterii.</li>
		<li>Użyć podwielokrotności sterylnego supernatantu do zbadania cytotoksyczności (patrz 2.1) i zamrozić resztę supernatantu w temperaturze -80 °C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Analiza cytotoksycznych supernatantów
<ol>
	<li>Test cytotoksyczności
	<ol>
		<li>Hoduj PMVEC w 6-dołkowych naczyniach aż do konfluencji. Umyj studzienki raz HBSS, a następnie dodaj 1,5 ml supernatantu wysterylizowanego filtrem (zebranego z komórek zaszczepionych PA103 lub ∆PcrV) do poszczególnych studzienek. Dodaj sterylny HBSS do innego dołka jako kontrolę ujemną.</li>
		<li>Umieścić płytkę w inkubatorze CO2 na 21 - 24 godziny, a następnie obserwować pod kątem zabijania komórek/cytotoksyczności (patrz następny krok). Do dalszych eksperymentów należy używać supernatantów, które wykazują cytotoksyczność, i odrzucać te, które nie wykazują zabijania komórek.</li>
		<li>Kwantyfikacja zabijania komórek
		<ol>
			<li>Zmierz uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej (LDH) z martwych komórek przy użyciu dostępnych na rynku zestawów testowych LDH i procedur zalecanych przez producenta.</li>
			<li>Alternatywnie, określ ilościowo zabijanie komórek pod mikroskopem za pomocą oprogramowania ImageJ. W tym celu należy zarejestrować obrazy mikroskopowe i obszary szalki hodowlanej zawierające nienaruszone komórki, a następnie określić ilościowo regiony pozbawione komórek (wskazujące na śmierć komórki w monowarstwie) za pomocą niestandardowego makra ImageJ (National Institutes of Health) (patrz Dodatkowy plik kodowania). W razie potrzeby wykonaj kroki makr ręcznie w następujący sposób:
			<ol>
				<li>Wprowadź obrazy (w formacie RGB lub Tiff) do makro i dostosuj kontrast do 15% nasyconych pikseli. Zduplikuj obrazy o dostosowanym kontraście i wykonaj polecenie "odejmij tło", aby uzyskać obraz o wysokim kontraście zarówno komórki, jak i obszaru przerwy w polu widzenia.</li>
				<li>Odejmij ten obraz od oryginalnego obrazu i połącz wynikowy obraz z oryginalnym obrazem za pomocą funkcji "AND" kalkulatora obrazów. Przekonwertuj wynikowy obraz na czarną (przerwy) i białą (komórki) maskę z funkcją progu (minimum 0, maksimum 5) i użyj funkcji "erozji binarnej", aby usunąć szum z obrazu.</li>
				<li>Zmierz stosunek czarnych do białych pikseli w wynikowym obrazie za pomocą pomiaru "ułamka powierzchniowego". Wykreśl i wyraź obszary ułamkowe dla każdego punktu czasowego leczenia jako procent maksymalnej powierzchni przerwy.</li>
				<li>Oblicz średnie i porównaj przy użyciu jednoczynnikowej ANOVA z testem post hoc Tukeya, gdzie wartości p są mniejsze niż 0,05 uważane za istotne.</li>
			</ol>
			</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Użyj analizy immunoblot, aby ustalić obecność amyloidu, oligomerycznego tau i Aβ w supernatantach hodowli. Analizę immunoblot należy przeprowadzić przy użyciu standardowych procedur10,11,12, z wyjątkiem co najmniej 10-krotnego zagęszczenia supernatantów hodowlanych przed elektroforezą.
		<ol>
			<li>Aby zagęścić supernatant, należy umieścić 1 - 2 ml supernatantu w jednostce filtrującej wirówki, której membrana ma odciętą masę cząsteczkową 10 kDa. Następnie umieść jednostkę filtrującą w wirówce stołowej i odwiruj przy 2 000 x g, aż do osiągnięcia wymaganego stopnia stężenia (zwykle 45 - 60 min).</li>
			<li>Określić ilość białka w skoncentrowanym supernatant11 i załadować równe ilości próbek do poszczególnych dołków żelu.</li>
			<li>Uruchom żele, przenieś białka do nitrocelulozy, a następnie zbadaj blot przeciwciałem anty-amyloidowym A11, antyoligomerycznym przeciwciałem tau T22 lub przeciwciałem anty-Aβ MOAB2, a następnie odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi. Rozwiń bloty przy użyciu standardowych procedur chemiluminescencyjnych.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Aby wykonać test tioflawiny T, użyj fluorescencji tioflawiny T (ThT) do ilościowego określenia amyloidów w supernatantach. Do tych pomiarów należy używać supernatantów sterylizowanych filtrem.
		<ol>
			<li>Przygotować roztwór podstawowy (50x) tioflawiny T, zawieszając 8 mg tioflawiny T (ThT) w 10 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po wymieszaniu przefiltruj roztwór przez filtr 0,22 μm w celu usunięcia cząstek stałych.</li>
			<li>W przypadku pomiarów dodaj 20 μl materiału ThT do 1 ml PBS w kuwecie spektrofotometru o pojemności 1 ml. Umieścić rozcieńczoną próbkę w spektrofluorymetrze.</li>
			<li>Zmierzyć podstawową emisję fluorescencji za pomocą wzbudzenia 425 nm i skanować emisję fluorescencji w zakresie 450-575 nm w krokach co 2 nm.</li>
			<li>Wykonaj skan poklatkowy przy użyciu wzbudzenia 425 nm i emisji 482 nm, z danymi zbieranymi co 0,2 s przez 60 s.</li>
			<li>Początkowe 20 s skanu poklatkowego mierzy fluorescencję w ślepej kuwecie. Po 20 s przerwij skanowanie i dodaj 10 μl supernatantu wysterylizowanego przez filtr do kuwety. Wymieszaj kuwetę przez odwrócenie, a następnie umieść z powrotem w spektrofluorymetrze.</li>
			<li>Wznów skanowanie na podstawie czasu, uzyskując ostatnie 40 s danych.</li>
			<li>Po zakończeniu skanowania poklatkowego należy wykonać końcowe skanowanie widma emisji fluorescencji przy użyciu identycznych ustawień, jak opisano w ppkt 2.1.5.3.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pneumonia+really+the+old+man%27s+friend%3F+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li>
<li>Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+of+importance+for+the+long-term+prognosis+after+hospital+treated+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Thorax%22%5BJournal%5D)">Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia.</a> Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).</li>
<li>Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+respiratory+tract+infections+and+risk+of+first-time+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction.</a> Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).</li>
<li>Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medium-term+survival+after+hospitalization+with+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia.</a> Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).</li>
<li>Yende, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammatory+markers+at+hospital+discharge+predict+subsequent+mortality+after+pneumonia+and+sepsis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Resp+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis.</a> Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).</li>
<li>Corrales-Medina, V. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+hospitalization+for+pneumonia+and+subsequent+risk+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Med+Assoc%22%5BJournal%5D)">Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease.</a> J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).</li>
<li>Frank, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+exoenzyme+S+regulon+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa.</a> Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).</li>
<li>Engel, J., Balachandran, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Pseudomonas+aeruginosa+type+III+effectors+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease.</a> Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).</li>
<li>Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y+is+a+promiscuous+cyclase+that+increases+endothelial+tau+phosphorylation+and+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability.</a> J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).</li>
<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343(2013).</li>
<li>Morrow, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exoenzymes+U+and+Y+induce+a+transmissible+endothelial+proteinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).</li>
<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+infection+liberates+transmissible%2C+cytotoxic+prion+amyloids%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids.</a> FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).</li>
<li>Stevens, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Pseudomonas+aeruginosa+exoenzyme+Y+impairs+endothelial+cell+proliferation+and+vascular+repair+following+lung+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Molec+Physiol%22%5BJournal%5D)">The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury.</a> Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).</li>
<li>Prusiner, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creutzfeldt-Jakob+disease+and+scrapie+prions%5BTitle%5D)+AND+%22Alzheimer+Dis+Assoc+Disord%22%5BJournal%5D)">Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions.</a> Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).</li>
<li>Hunter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scrapie%3A+Uncertainties%2C+biology%2C+and+molecular+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches.</a> Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).</li>
<li>King, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+characteristics+of+lung+macro-+and+microvascular+endothelial+cell+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Microvasc+Res%22%5BJournal%5D)">Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes.</a> Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).</li>
<li>Marmont, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligomeric+lipoprotein+PelC+guides+Pel+polysaccharide+export+across+the+outer+membrane+of+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).</li>
</ol>

Brak do zgłoszenia.

Przedstawiono proste metody in vitro , które pozwalają wykazać wytwarzanie cytotoksycznych amyloidów podczas zakażenia organizmem wywołującym zapalenie płuc. Metody te obejmują test cytotoksyczności hodowli komórkowej, immunoblotting, ocenę ilościową zabijania komórek przy użyciu nowatorskiej metody mikroskopowej oraz wiązanie ThT. Analizy czynników cytotoksycznych wykazały, że mają one charakter amyloidowy (ryc. 2 i ryc. 4) i wykazują ...

Pacjenci, którzy przeżyli zapalenie płuc, mają podwyższone wskaźniki śmiertelności w miesiącach następujących po wypisaniu ze szpitala1,2,3,4,5,6. W większości przypadków śmierć następuje z powodu pewnego rodzaju niewydolności narządów końcowych, w tym zdarzeń nerkowych, płucnych, sercowych lub wątrobowych, a także udaru mózgu5,6. Przyczyna podwyższonej śmiertelności w tej populacji pacjentów nigdy nie została ustalona.
Zapalenie płuc jest klasyfikowane jako nabyte przez społeczność lub szpitalne (szpitalne), a czynniki, które mogą powodować zapalenie płuc to bakterie, wirusy, grzyby i chemikalia. Jedną z głównych przyczyn szpitalnego zapalenia płuc jest bakteria Pseudomonas aeruginosa. P. aeruginosa jest organizmem Gram-ujemnym, który wykorzystuje system wydzielania typu III do przenoszenia różnych cząsteczek efektorowych, zwanych egzoenzymami, bezpośrednio do cytoplazmy komórek docelowych7,8. Podczas infekcji komórek śródbłonka płuc egzoenzymy atakują różne białka wewnątrzkomórkowe, w tym śródbłonkową formę białka związanego z mikrotubulami tau9,10,11,12, prowadząc do uszkodzenia bariery śródbłonkowej, co skutkuje poważnym obrzękiem płuc, pogorszeniem czynności płuc i często śmiercią.
Jak wspomniano wcześniej, pacjenci, którzy przeżyli początkowe zapalenie płuc, mają podwyższone wskaźniki śmiertelności w ciągu pierwszych 12 miesięcy po wypisaniu ze szpitala. Potencjalnym mechanizmem wyjaśniającym to zjawisko jest to, że podczas początkowej infekcji generowany jest pewien rodzaj długotrwałej toksyny, która prowadzi do złego długoterminowego wyniku. Dwie obserwacje potwierdzają tę możliwość. Po pierwsze, hodowane komórki śródbłonka płucnego, które są początkowo leczone P. aeruginosa, nie rozmnażają się przez okres do tygodnia po zabiciu bakterii przez antybiotyki13. Po drugie, długowieczne priony i czynniki o cechach prionowych zostały wykazane w różnych chorobach ludzi i zwierząt, w szczególności w chorobach związanych z układem nerwowym14,15.
Metody badania potencjalnej produkcji długożyciowych czynników cytotoksycznych podczas infekcji płuc nigdy nie zostały opisane. W tym miejscu przedstawiono szereg prostych testów in vitro, które można wykorzystać do zbadania produkcji i aktywności cytotoksyny po zakażeniu przy użyciu powszechnego czynnika wywołującego zapalenie płuc, P. aeruginosa. Testy te powinny być łatwo przystosowane do badania możliwej indukcji cytotoksyny po zakażeniu przy użyciu innych czynników wywołujących zapalenie płuc, a supernatanty, które są wytwarzane, powinny być również przydatne do badania wpływu cytotoksyn na całe narządy lub zwierzęta. Wreszcie, przedstawione tutaj testy, najprawdopodobniej będą mogły zostać przystosowane do testowania zwierzęcych i ludzkich płynów biologicznych pod kątem produkcji cytotoksyn podczas zapalenia płuc.

<table><tbody><tr><td>Królicze przeciwciało anty beta amyloid</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 Przeciwciało oligomerowe amyloidu</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 przeciwciało anty-tau oligomerowe</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Tioflawina T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe 0,22 mikrona</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Goat antirabbit IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Szczepy PA103 i &Delta; PcrV</td><td></td><td></td><td>Te szczepy P. aeruginosa uzyskano od Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>FITC Griffonia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia lectin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0,22 mikrona nitroceluloza</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyklon</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Karbenicylina Sól disodowa</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Koncentratory mikrocetrifugacji - 10 000 MW odcięcie</td><td>Milipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan potasu dwuzasadowy</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan magnezu siedmiowodny</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu dwuzasadowy siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Pacjenci, którzy przeżyli zapalenie płuc, mają podwyższone wskaźniki śmiertelności w miesiącach następujących po wypisaniu ze szpitala. Postawiono hipotezę, że zakażenie tkanki płucnej podczas zapalenia płuc powoduje wytwarzanie długożyciowych cytotoksyn, które mogą prowadzić do późniejszej niewydolności narządów końcowych. Opracowaliśmy testy in vitro, aby przetestować hipotezę, że cytotoksyny są wytwarzane podczas infekcji płuc. Jako systemy modelowe wykorzystuje się izolowane komórki śródbłonka płuc szczura i bakterię Pseudomonas aeruginosa, a wytwarzanie cytoksyn po zakażeniu komórek śródbłonka przez bakterie wykazano za pomocą hodowli komórkowej, a następnie bezpośredniej oceny ilościowej przy użyciu testów dehydrogenazy mleczanowej i nowatorskiej metody mikroskopowej wykorzystującej technologię ImageJ. Amyloidowy charakter tych cytotoksyn wykazano za pomocą testów wiązania tioflawiny T oraz przez immunoblotting i immunodepletion przy użyciu przeciwciała antyamyloidowego A11. Dalsze analizy z wykorzystaniem immunoblottingu wykazały, że oligomeryczne tau i Aβ są wytwarzane i uwalniane przez komórki śródbłonka po zakażeniu przez P. aeruginosa. Metody te powinny być łatwe do dostosowania do analiz próbek klinicznych pobranych od ludzi.

Opracowano prosty test in vitro w celu oznaczenia obecności cytotoksyn w nadsączach z komórek zainfekowanych bakterią P. aeruginosa. W zasadzie po 4 h od dodania bakterii pobiera się pożywkę hodowlaną z zainfekowanych komórek, bakterie usuwa się poprzez sterylizację nadsączu hodowlanego za pomocą filtra, a następnie sterylny nadsącz dodaje się do nowej populacji komórek. Komórki obserwuje się po 21–24 h od dodania nadsączu, a następnie kwantyfikuje obumieranie komórek.</...

Opisano proste metody demonstrowania produkcji cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa.

Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie opieki pulmonologicznej, takie jak dlaczego pacjenci, którzy przeżyli szpitalne zapalenie płuc, mają tak słabe długoterminowe wyniki? Zaletą tej metody jest to, że jest prosta i niezawodna, co oznacza, że każdy, kto przychodzi do laboratorium, może się jej nauczyć, a następnego dnia generuje przydatne i powtarzalne dane. Chociaż te metody analityczne mogą być stosowane w celu uzyskania wglądu w infekcję komórek hodowanych in vitro, można je również zastosować do modeli zwierzęcych i pacjentów.Aby wytworzyć cytotoksyczny supernatant, umyj 150-centymetrowe naczynie komórek śródbłonka HBSS i rozcieńcz kolonię P.aeruginosa do absorpcji 0,25 przy 540 nanometrach. Dalej rozcieńczyć komórki bakteryjne, aby umożliwić wielokrotność infekcji od 20 do jednego na 20 mililitrów HBSS i zasiać bakterie na płytce komórek śródbłonka. Następnie umieść zainfekowane komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 na cztery do pięciu godzin.Istotne jest, aby inkubacja bakterii i komórek śródbłonka zachodziła przez odpowiedni czas. Jeśli inkubacja jest zbyt krótka, amyloidy nie zostaną uwolnione do supernatantu. Jeśli inkubacja jest zbyt długa, komórki faktycznie ulegną lizie i uwolnią całą swoją zawartość do supernatantu.Wskaźnikiem, którego używamy dla odpowiedniego czasu inkubacji, jest powstawanie luk w monowarstwie śródbłonka. Gdy za pomocą mikroskopii świetlnej można zaobserwować przerwy w monowarstwie komórki, należy zebrać supernatant do odwirowania w celu usunięcia wszelkich zanieczyszczeń komórkowych. Zdekantować supernatant do strzykawki wyposażonej w filtr o wielkości 0,2 mikrona i przepuścić supernatant przez filtr w celu usunięcia wszelkich bakterii zanieczyszczających.Następnie odłóż 1,5 mililitra sterylnego supernatantu do badania cytotoksyczności i zamroź resztę próbki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Aby ocenić cytotoksyczność zebranego supernatantu, dodać 1,5 mililitra podwielokrotności wysterylizowanego filtrem supernatantu do pojedynczego dołka sześciodołkowej płytki zawierającej zlewającą się hodowlę komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc. Umieść płytkę w inkubatorze CO2 na 21 do 24 godzin.Następnie uzyskaj obrazy regionów kultur poddanych działaniu środka i kontrolnych. Zaimportuj obrazy do niestandardowego makra imagej i dostosuj kontrast do 15% nasyconych pikseli. Zduplikuj obrazy o dostosowanym kontraście i użyj opcji odejmij tło, aby uzyskać obrazy o wysokim kontraście zarówno nienaruszonych komórek, jak i obszaru przerwy w polu widzenia.Odejmij ten obraz o wysokim kontraście od oryginalnego obrazu i użyj kalkulatora obrazów oraz funkcji, aby połączyć wynikowy obraz z oryginalnym obrazem. Użyj funkcji progu, aby przekonwertować połączony obraz na maskę z przerwami w kolorze czarnym i nienaruszonymi komórkami w kolorze białym. I użyj binarnej funkcji erody, aby usunąć wszelkie szumy z obrazu.Następnie użyj ułamka powierzchni, aby zmierzyć stosunek czarnych do białych pikseli w wynikowym obrazie. Wykreśl i wyraź obszary ułamkowe dla każdego punktu czasowego leczenia jako procent maksymalnego obszaru przerwy. Aby określić ilościowo zawartość amyloidów w supernatancie, dodaj 20 mikrolitrów świeżo przygotowanego i przefiltrowanego 50-krotnego roztworu podstawowego tioflawiny T do jednego mililitra PBS w jednomililitrowej kuwecie spektrofotometru i załaduj rozcieńczoną próbkę do spektrofluorometru.Zmierz bazową emisję fluorescencji za pomocą wzbudzenia 425 nanometrów. Skanowanie emisji fluorescencji od 450 do 575 nanometrów w krokach co dwa nanometry. Następnie ustaw instrument tak, aby wykonywał skanowanie poklatkowe przy użyciu wzbudzenia 425 nanometrów i emisji 482 nanometrów z akwizycją danych co 0,2 sekundy przez 60 sekund.Wstrzymaj skanowanie po 20 sekundach i 10 mikrolitrach wysterylizowanego supernatantu z filtrem do kuwety. Po wymieszaniu przez odwrócenie ponownie załaduj kuwetę do spektrofluorometru i wznów skanowanie oparte na czasie przez ostatnie 40 sekund. Po zakończeniu upływu czasu wykonaj końcowe skanowanie widma emisji fluorescencji, korzystając z oryginalnych ustawień skanowania.Dodatek P.aeruginosa do zlewających się warstw komórek śródbłonka mikronaczyniowego płuc indukuje tworzenie się luk między komórkami. Korzystając z imagej do oceny cytotoksyczności supernatantu, która wykazała w ciągu pierwszych 12 godzin leczenia, nadal zdrowe monowarstwy zlewających się komórek można zwizualizować jako wszystkie białe obszary w polu mikroskopowym. Jednak po 18 godzinach od dodania supernatantu pobranego z kultur zakażonych PA 103 można wykryć luki w monowarstwie, przy czym obszar szalki hodowlanej pozbawiony komórek zwiększa się w sposób liniowy do 36 godzin leczenia, w którym to momencie nie można zaobserwować prawie żadnych nienaruszonych komórek.Podobne wyniki można uzyskać, stosując uwalnianie dehydrogenazy mleczanowej jako markera cytotoksyczności. Z dehydrogenazą mleczanową wykrytą po raz pierwszy po 18 godzinach od dodania cytotoksycznego supernatantu i zwiększającą się w sposób liniowy, aż do maksymalnego zabicia komórek po 36 godzinach. Supernatanty można również ocenić za pomocą analizy immunoblot lub mierząc zmianę intensywności fluorescencji tioflawiny T spowodowaną zmianami potwierdzającymi wywołanymi wiązaniem amyloidu w celu określenia obecności cytotoksycznych amyloidów w supernatantach.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować cytotoksyczne supernatanty po zakażeniu komórek śródbłonka citomonsis aeruginosa. Ponadto powinieneś być dobrze zorientowany w rodzajach testów potrzebnych do scharakteryzowania i analizy cytotoksyn, które są obecne w tych supernatantach.

methods-for-detecting-cytotoxic-amyloids-following-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Źródło: Balczon, R., et al. Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia protokół ilościowego oznaczania amyloidów w supernatantach z hodowli komórek śródbłonka płuc zakażonych zjadliwymi bakteriami, przy użyciu tioflawiny T, barwnika fluorescencyjnego, który wiąże się ze strukturami beta-arkuszy amyloidu. Wzrost fluorescencji w porównaniu z wartością wyjściową wskazuje na obecność...

Kwantyfikacja amyloidów wywołanych infekcjami bakteryjnymi za pomocą fluorescencji tioflawiny T

Źródło: Balczon, R., et al. Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Ten film przedstawia procedurę wytwarzania cytotoksycznego supernatantu z komórek śródbłonka płuc po zakażeniu Pseudomonas aeruginosa. Opisuje, w jaki sposób bakteryjne białka efektorowe zaburzają strukturę komórek gospodarza i indukują uwalnianie cytotoksycznych oligomerów amyloidowych do supernatantu.

Otrzymywanie cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu bakteryjnym komórek śródbłonka płuc szczura

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Opisujemy metodę śledzenia pęknięcia błony wewnętrznej wywołanego przez wewnątrzkomórkowe bakterie Shigella flexneri i Mycobacterium tuberculosis po inwazji komórek gospodarza. Nasz test wykorzystuje CCF4, cytoplazmatyczną sondę FRET gospodarza w żywych lub utrwalonych komórkach. Ten reporter jest degradowany przez aktywność enzymatyczną obecną na powierzchni bakterii.

Pomiary pojedynczych komórek pęknięcia wakuolarnego spowodowanego przez patogeny wewnątrzkomórkowe

Opracowaliśmy model uszkodzenia płuc myszy poprzez wstrzyknięcie do tchawicy bakterii Pseudomonas aeruginosa. Model ten naśladuje uszkodzenie płuc podczas zapalenia płuc i ma znaczenie kliniczne.

Pseudomonas aeruginosa Model indukowanego uszkodzenia płuc

Tutaj opisujemy przygotowanie i użycie sondy opartej na aktywności (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oksoazetydyno-3-ylo]karbaminianu), która pozwala na wykrycie i ilościowe określenie aktywnej formy prozapalnego enzymu amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego (NAAA), zarówno in vitro, jak i ex vivo.

Przygotowanie i zastosowanie in vivo sondy aktywności dla amidazy kwasu N-acyloetanoloaminowego

Tutaj opisujemy warunki wzrostu do hodowli małego wariantu kolonii Pseudomonas aeruginosa. Opisujemy również dwie oddzielne metody wykrywania i oznaczania ilościowego alginianu egzopolisacharydów wytwarzanego przez P. aeruginosa przy użyciu tradycyjnego testu karbazolu kwasu uronowego i testu ELISA opartego na przeciwciałie monoklonalnym specyficznym dla alginianu (mAb).

Hodowla wariantu Pseudomonas aeruginosa w małej kolonii i ocena ilościowa jego alginianu

Opisujemy protokół dla trójwymiarowego modelu kohodowli zakażonych dróg oddechowych, wykorzystującego komórki CFBE41o, makrofagi THP-1 i Pseudomonas aeruginosa, ustalony na granicy powietrze-ciecz. Model ten zapewnia nową platformę do jednoczesnego testowania skuteczności antybiotyków, funkcji bariery nabłonkowej i markerów stanu zapalnego.

P. aeruginosa (P. aeruginosa) Zakażona kohodowla 3D komórek nabłonka oskrzeli i makrofagów na granicy faz powietrze-ciecz w celu przedklinicznej oceny środków przeciwinfekcyjnych

Oporność na antybiotyki wśród szczepów Escherichia coli adhezywno-inwazyjnych stanowi wyzwanie dla oceny inwazji bakteryjnej przy użyciu tradycyjnego testu ochrony gentamycyną. Opisano ulepszoną metodę oceny ilościowej inwazji bakteryjnej poprzez liczenie jednostek tworzących kolonie i oceny jakościowej poprzez wizualizację zakażonych komórek za pomocą konfokalnej mikroskopii immunofluorescencyjnej.

Test ochrony amikacyny do ilościowego i wizualnego określenia Escherichia coli inwazji komórkowej

Niniejsza praca opisuje różne metody hodowli biofilmu Pseudomonas aeruginosa na hodowlach ludzkich komórkach nabłonkowych dróg oddechowych. Protokoły te można dostosować do badania różnych aspektów tworzenia biofilmu, w tym wizualizacji biofilmu, barwienia biofilmu, pomiaru jednostek tworzących kolonie (CFU) w biofilmie oraz badania cytotoksyczności biofilmu.

Modele kokultury biofilmów Pseudomonas aeruginosa hodowanych na żywych komórkach dróg oddechowych człowieka

Poznaj metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa. Prosta i niezawodna technika umożliwia generowanie powtarzalnych danych w badaniach nad zakażeniami.

Metody wykrywania cytotoksycznych amyloidów po zakażeniu komórek śródbłonka płuc przez Pseudomonas aeruginosa

Przeglądaj więcej filmów