Name: Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Poznaj metodę resekcji glejaka wielopostaciowego u myszy z implantacją rusztowania z komórkami macierzystymi MSC. Technika ta pozwala badać skuteczność terapii komórkowej w neuroonkologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy doceniają wkład redakcyjny dr Kathryn Pietrosimone. Rusztowania PLA zostały wyprodukowane przez laboratorium dr Elizabeth Loboa na Uniwersytecie Stanowym Karoliny Północnej. Prace te były wspierane przez Uniwersytecki Fundusz Badań nad Rakiem UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center oraz UNC Translational and Clinical Sciences Institute (KL2TR001109, UL1TR001111).

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i Użytkowania (IACUC) Uniwersytetu Północnej Karoliny w Chapel Hill.
UWAGA: Ta procedura jest wykonywana na myszach z otwartą kraniotomią, jako zmodyfikowana wersja protokołu przez Mostany i Portera-Cailliau19, w którym tkanka kostna, która jest usuwana chirurgicznie, jest odrzucana, pozostawiając mózg dostępny do ustalenia i ewentualnej resekcji guzów GBM. Po kraniotomii guzy są ustalane za pomocą implantacji stereotaktycznej, jak opisano w Ozawa i James20. Wszczepiamy 1 x 105 komórek U87 mCh-Fl o następujących współrzędnych stereotaktycznych (w mm od bregmy): (2,5, 0, -0,5).
1. Hodowla komórkowa i przygotowanie rusztowania
UWAGA: Rusztowania powinny być przygotowane 48 godzin przed implantacją u myszy. Poniższe woluminy są dostarczane dla każdego rusztowania. Pomnóż ilości w razie potrzeby dla dodatkowych rusztowań.
<ol>
	<li>Pokrój rusztowania PLA na kawałki wielkości wnęki resekcyjnej (około 2 mm x 2 mm). Rusztowania można ciąć ręcznie za pomocą nożyczek lub dziurkacza w celu uzyskania powtarzalności.</li>
	<li>Sterylizować, zanurzając w 70% etanolu na 15 minut, a następnie zanurzając w PBS. Umieść rusztowanie w zmodyfikowanym pożywce Eagle's Medium (DMEM) firmy Dulbecco, zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) i 1% penicyliny-streptomycyny, przygotowując komórki do wysiewu.</li>
	<li>Podnieś wyhodowane MSCs za pomocą 0,05% trypsyny (3-5 ml dla kolby T75). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Upewnij się, że komórki się podniosły, a następnie dodaj 7-10 ml DMEM do kolby, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Przenieść zawartość kolby do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml. Policz komórki za pomocą hemocytometru. Granulki 5 x 105 MSC na każde rusztowanie przez odwirowanie przy 100 x g przez 5 min.</li>
	<li>Odessać supernatant i ponownie zawiesić MSC w 5 μl DMEM na 5 x 105 komórek.</li>
	<li>Przygotuj rusztowania do siewu, osuszając je.
	<ol>
		<li>Usuń rusztowanie z zanurzenia w DMEM za pomocą kleszczy i tymczasowo umieść je na pokrywie płytki 6-dołkowej. Podnieś rusztowanie z pokrywy, pozostawiając kroplę nadmiaru DMEM.</li>
		<li>Umieść rusztowanie z powrotem na pokrywie w nowym, suchym miejscu. Powtórz 3-5 razy, a następnie umieść częściowo wysuszone rusztowanie na nowej 6-dołkowej płytce do wysiewu. Powtórz te czynności dla każdego rusztowania. 
		UWAGA: Częściowo wysuszone rusztowanie zapewnia optymalne wyniki wysiewu komórek. Jeśli rusztowanie jest zbyt mokre, komórki zsuną się z rusztowania i przylgną do płyty studzienki poniżej. Jeśli rusztowanie jest zbyt suche, kropla nie rozprzestrzeni się po całym rusztowaniu, co spowoduje słabą początkową dystrybucję komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Za pomocą pipety delikatnie wymieszaj fiolkę z komórkami macierzystymi, aby ujednolicić zawiesinę, ponieważ niektóre komórki mogły osiąść na dnie.</li>
	<li>Powoli odpipetować 2,5 μl świeżo wymieszanej zawiesiny MSC bezpośrednio na rusztowaniu, tworząc małą kropelkę na górze rusztowania.</li>
	<li>Dodaj 300 μl DMEM do krawędzi każdej studzienki. Zapobiegnie to szybkiemu parowaniu kropelki komórki. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, pozwalając komórkom przyłączyć się do rusztowania.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy delikatnie odwróć rusztowania w płycie studziennej. Wysiew: 2,5 μl świeżo zmieszanej zawiesiny MSC (daje to w sumie 5 x 105 komórek wysianych na rusztowanie). Inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut, pozwalając komórkom przyłączyć się do rusztowania.</li>
	<li>Przykryj rusztowania w DMEM, dodając 2 ml do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Delikatnie podnieś rusztowania, aby media mogły pod nimi przepływać. Inkubować w tym stanie w temperaturze 37 °C przez 48 godzin przed zabiegiem implantacji.</li>
	<li>Sprawdź rusztowania po 24 godzinach i dodaj/zmień pożywkę, jeśli zaobserwuje się nadmierne parowanie lub odbarwienie podłoża z powodu braku równowagi pH.</li>
</ol>
2. Resekcja pod kontrolą fluorescencji i implantacja rusztowania
UWAGA: Wysterylizuj wszystkie narzędzia przed rozpoczęciem operacji. Zastosuj profilaktyczną analgezję zgodnie z opisem w instytucjonalnym protokole IACUC.
<ol>
	<li>Umieść ramkę stereotaktyczną na stoliku fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego.</li>
	<li>Znieczulić mysz pod wpływem wdychanego izofluranu w komorze indukcyjnej. Po znieczuleniu zabezpiecz mysz w ramce stereotaktycznej za pomocą ciągłego dopływu znieczulenia wziewnego za pomocą adaptera stożka nosowego z izofluranem. Utrzymuj temperaturę ciała za pomocą poduszki grzewczej i/lub sondy. 
	UWAGA: 4-5% izofluranu nadaje się do indukcji, a 2-3% nadaje się do konserwacji, ale musi to być dostosowane i monitorowane dla każdej myszy.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy, aby zapobiec wysuszeniu rogówki. Wysterylizuj miejsce nacięcia skóry głowy serią trzech chusteczek nasączonych alkoholem i trzema chusteczkami betadynowymi.</li>
	<li>Wykonaj test odruchu szczypania palców u nóg na każdej kończynie i potwierdź negatywną odpowiedź, aby zapewnić prawidłowe znieczulenie. Zapewnić stałą częstość oddechów na poziomie około 55-65 oddechów/min.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy uszczypnij i delikatnie unieś skórę głowy. Wykonaj liniowe nacięcie rostralno-ogonowe w linii środkowej za pomocą nożyczek chirurgicznych. Przepłukać miejsce nacięcia PBS i usunąć tłuszcz podskórny za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką okrężnym ruchem szczotkowania. Ułóż skórę tak, aby wcześniej ustalone okno czaszki było w pełni widoczne.</li>
	<li>Delikatnie nakłuj oponę twardą tuż po wewnętrznej stronie do granic okna czaszki za pomocą igły 18-G. Powtarzaj, aż nacięcie w pełni obejmie wnętrze okna.</li>
	<li>Usuń oponę twardą, odrywając ją za pomocą cienkich kleszczy, odsłaniając leżący pod spodem miąższ i guz.</li>
	<li>Zlokalizuj guz U87 mCh-Fl, wyłączając światła w pomieszczeniu i włączając tryb fluorescencji stereomikroskopu. Przygotuj się do resekcji, wkładając końcówkę pipety o pojemności 1-200 μl do końca rurki pompy próżniowej.</li>
	<li>Włącz pompę próżniową. Wyciąć guz, delikatnie odsysając tkankę fluorescencyjną, aż nie pozostanie żaden sygnał. Wyłącz pompę próżniową i wyrzuć końcówkę pipety. Wyłącz fluorescencję i ponownie włącz światła w pomieszczeniu. 
	UWAGA: Aby zatamować krwawienie, przetrzymuj zimnym PBS i wywieraj stały nacisk za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką. W cięższych przypadkach jama resekcyjna może być również tymczasowo wypełniona środkiem hemostatycznym, o ile zostanie on usunięty po ustaniu krwawienia, a następnie ponownie irygowany PBS.</li>
	<li>Bezpośrednio przed implantacją należy powoli zanurzyć rusztowanie PLA z nasionami MSC w PBS, aby usunąć niechciane podłoże i powiązane komponenty. Wszczepić rusztowanie do jamy resekcyjnej. W razie potrzeby dodaj 1 μl fibrynogenu (67-106 mg/ml), a następnie 1 μl trombiny (400-625 U/ml), aby zabezpieczyć rusztowanie na miejscu.</li>
	<li>Po usunięciu opony twardej i wyrzuceniu płata kostnego z okienka czaszki, należy uszczelnić ranę, po prostu zamykając skórę i nakładając klej chirurgiczny. Wyjmij zwierzę ze znieczulenia wziewnego i pozostaw do odzyskania na rozgrzanej powierzchni.</li>
	<li>Po przejściu do ruchu przywróć mysz do klatki. Podawać leki przeciwbólowe zgodnie z harmonogramem zatwierdzonym przez IACUC. Powtórz procedurę dla każdej myszy.</li>
</ol>
3. Obrazowanie pooperacyjne
<ol>
	<li>Za pomocą strzykawki insulinowej 28-G wstrzyknij myszom D-lucyferynę (150 mg/kg dootrzewnowo).</li>
	<li>Odczekaj 10 min. Pozwoli to lucyferynie krążyć w całym ciele i reagować z komórkami rakowymi wyrażającymi lucyferazy w mózgu, aby uzyskać szczytową ekspresję.</li>
	<li>W znieczuleniu izofluranem (jak wspomniano wcześniej) zobrazuj myszy w systemie obrazowania bioluminescencyjnego (BLI) w celu wizualizacji guzów. W razie potrzeby zmieniaj czasy ekspozycji (od sekund do minut) w zależności od wielkości guza.</li>
	<li>W razie potrzeby powtórz procedurę obrazowania, aby określić kinetykę wzrostu guza. Kontynuuj monitorowanie zdrowia zwierząt. 
	UWAGA: Terapeutyczne MSCs będą konstytutywnie wyrażać TRAIL, zabijając komórki rakowe i hamując ogólny wzrost guza. Obrazowanie co 2-5 dni zapewnia wystarczającą do tego celu częstotliwość.</li>
	<li>Po osiągnięciu wcześniej określonych punktów końcowych określonych w protokole IACUC, należy złożyć ofiary myszy przez perfuzję przezsercową i pobrać tkanki do analizy.</li>
</ol>

<ol><li>Adamson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+a+review+of+where+we+have+been+and+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+opinion+on+investigational+drugs%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: a review of where we have been and where we are going.</a> Expert opinion on investigational drugs. 18 (8), 1061-1083 (2009).</li>
<li>Asthagiri, A. R., Pouratian, N., Sherman, J., Ahmed, G., Shaffrey, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Brain+Tumor+Surgery%5BTitle%5D)+AND+%22Neurologic+Clinics%22%5BJournal%5D)">Advances in Brain Tumor Surgery.</a> Neurologic Clinics. 25 (4), 975-1003 (2007).</li>
<li>Affronti, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overall+survival+of+newly+diagnosed+glioblastoma+patients+receiving+carmustine+wafers+followed+by+radiation+and+concurrent+temozolomide+plus+rotational+multiagent+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Overall survival of newly diagnosed glioblastoma patients receiving carmustine wafers followed by radiation and concurrent temozolomide plus rotational multiagent chemotherapy.</a> Cancer. 115 (15), 3501-3511 (2009).</li>
<li>Erpolat, O., Akmansu, M., Goksel, F., Bora, H., Yaman, E., Büyükberber, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+newly+diagnosed+glioblastoma+patients+treated+by+radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide%3A+a+long-term+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Tumori%22%5BJournal%5D)">Outcome of newly diagnosed glioblastoma patients treated by radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide: a long-term analysis.</a> Tumori. 95 (2), 191-197 (2009).</li>
<li>Minniti, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma+in+elderly+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuro-Oncology%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma in elderly patients.</a> Journal of Neuro-Oncology. 88 (1), 97-103 (2008).</li>
<li>Stupp, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy+plus+concomitant+and+adjuvant+temozolomide+for+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma.</a> The New England Journal of Medicine. 352 (10), 987-996 (2005).</li>
<li>Delgado-López, P., Corrales-García, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+in+glioblastoma%3A+a+review+on+the+impact+of+treatment+modalities%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Survival in glioblastoma: a review on the impact of treatment modalities.</a> Clinical and Translational Oncology. 18 (11), 1062-1071 (2016).</li>
<li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+tracking+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticle-labeled+mesenchymal+stem+cell+tropism+to+malignant+gliomas+using+magnetic+resonance+imaging.+Laboratory+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurosurgery%22%5BJournal%5D)">In vivo tracking of superparamagnetic iron oxide nanoparticle-labeled mesenchymal stem cell tropism to malignant gliomas using magnetic resonance imaging. Laboratory investigation.</a> Journal of Neurosurgery. 108 (2), 320-329 (2008).</li>
<li>Nakamizo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+the+treatment+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the treatment of gliomas.</a> Cancer Research. 65 (8), 3307-3318 (2005).</li>
<li>Xu, F., Shi, J., Yu, B., Ni, W., Wu, X., Gu, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemokines+mediate+mesenchymal+stem+cell+migration+toward+gliomas+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reports%22%5BJournal%5D)">Chemokines mediate mesenchymal stem cell migration toward gliomas in vitro.</a> Oncology Reports. 23 (6), 1561-1567 (2010).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CXCR4-transfected+human+umbilical+cord+blood-derived+mesenchymal+stem+cells+exhibit+enhanced+migratory+capacity+toward+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Oncology%22%5BJournal%5D)">CXCR4-transfected human umbilical cord blood-derived mesenchymal stem cells exhibit enhanced migratory capacity toward gliomas.</a> International Journal of Oncology. 38 (1), 97-103 (2011).</li>
<li>Ho, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+Metalloproteinase+1+Is+Necessary+for+the+Migration+of+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+Toward+Human+Glioma%5BTitle%5D)+AND+%22STEM+CELLS%22%5BJournal%5D)">Matrix Metalloproteinase 1 Is Necessary for the Migration of Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells Toward Human Glioma.</a> STEM CELLS. 27 (6), 1366-1375 (2009).</li>
<li>Bexell, D., Svensson, A., Bengzon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell-based+therapy+for+malignant+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Treatment+Reviews%22%5BJournal%5D)">Stem cell-based therapy for malignant glioma.</a> Cancer Treatment Reviews. 39 (4), (2012).</li>
<li>Nouri, F., Wang, X., Hatefi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+theranostic+mesenchymal+stem+cells+for+the+evaluation+of+the+anticancer+efficacy+of+enzyme%2Fprodrug+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered theranostic mesenchymal stem cells for the evaluation of the anticancer efficacy of enzyme/prodrug systems.</a> Journal of Controlled Release. 200, 179-187 (2015).</li>
<li>Kauer, T., Figueiredo, J. -L., Hingtgen, S., Shah, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+therapeutic+stem+cells+implanted+in+the+tumor+resection+cavity+induce+cell+death+in+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated therapeutic stem cells implanted in the tumor resection cavity induce cell death in gliomas.</a> Nature Neuroscience. 15 (2), 197-204 (2011).</li>
<li>Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Hingtgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrin+matrices+enhance+the+transplant+and+efficacy+of+cytotoxic+stem+cell+therapy+for+post-surgical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Fibrin matrices enhance the transplant and efficacy of cytotoxic stem cell therapy for post-surgical cancer.</a> Biomaterials. 84, 42-53 (2016).</li>
<li>Bagó, J., Pegna, G., Okolie, O., Mohiti-Asli, M., Loboa, E., Hingtgen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+scaffolds+increase+the+efficacy+of+stem+cell-mediated+therapy+of+surgically+resected+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous scaffolds increase the efficacy of stem cell-mediated therapy of surgically resected glioblastoma.</a> Biomaterials. 90, 116-125 (2016).</li>
<li>Loebinger, M., Eddaoudi, A., Davies, D., Janes, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Stem+Cell+Delivery+of+TRAIL+Can+Eliminate+Metastatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Stem Cell Delivery of TRAIL Can Eliminate Metastatic Cancer.</a> Cancer Research. 69 (10), 4134-4142 (2009).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J. Vis. Exp. (12), e680(2008).</li>
<li>Ozawa, T., James, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Intracranial+Brain+Tumor+Xenografts+With+Subsequent+Analysis+of+Tumor+Growth+and+Response+to+Therapy+using+Bioluminescence+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Intracranial Brain Tumor Xenografts With Subsequent Analysis of Tumor Growth and Response to Therapy using Bioluminescence Imaging.</a> J. Vis. Exp. (41), e1986(2010).</li>
</ol>

Doktorzy Sheets, Bagó i Hingtgen mają udziały w firmie Falcon Therapeutics, która uzyskała licencję na aspekty technologii komórek macierzystych i rusztowań od UNC Chapel Hill.

Operacja może być zazwyczaj zakończona w ciągu 30 minut na mysz, biorąc pod uwagę, że następujące punkty są brane pod uwagę, aby zmaksymalizować precyzję i uniknąć czasochłonnych pułapek. Po pierwsze, upewnij się, że mysz jest prawidłowo umieszczona w instrumencie stereotaktycznym przed rozpoczęciem procedury. Niepożądane ruchy głowy ograniczą dokładność chirurgiczną kraniotomii, lokalizację implantacji guza i stopień resekcji guza. Przed resekcją należy całkowicie usunąć część opony twardej pokrywającą guz. Twarda, włók...

Glioblastoma (GBM) jest najczęstszym pierwotnym nowotworem mózgu u dorosłych, charakteryzującym się bardzo niską medianą przeżycia wynoszącą zaledwie 12-15 miesięcy1,2,3,4,5. Przeżywalność nie uległa znaczącej poprawie od 2005 roku, kiedy wprowadzono obecny standard kliniczny polegający na maksymalnej resekcji chirurgicznej, po której następowało naświetlanie oraz towarzysząca i uzupełniająca chemioterapia temozolomidem6,7. Choć leczenie to zapewnia pacjentom tymczasową ulgę w objawach, standardowa opieka niezmiennie prowadzi do nawrotu choroby, ponieważ inwazyjne ogniska nowotworowe unikają resekcji i są chronione przed terapiami systemowymi przez barierę krew-mózg (BBB). Pilnie potrzebne są strategie ukierunkowane na inwazyjne ogniska guza, które omijają BBB, aby móc skutecznie walczyć z tą agresywną i wyniszczającą chorobą.
Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) wykazują potencjał jako nośniki leków w terapii GBM ze względu na ich naturalny tropizm do guza8,9. MSC posiadają receptory i migrują w kierunku rozpuszczalnych czynników wydzielanych przez guzy, w tym między innymi czynnika pochodzenia komórek zrębu 1α (SDF-1α), metaloproteinazy macierzy-1 (MMP-1) oraz białka chemocytokinowego monocytów-1 (MCP-1)10,11,12,13. Modyfikacje genetyczne MSC w celu ekspresji i sekrecji leków cytotoksycznych pozwalają na ich wykorzystanie jako nośników leków kierowanych do guza. Zmodyfikowane MSC przemieszczają się w stronę inwazyjnych ognisk nowotworowych i dostarczają białka terapeutyczne. Podejście to wykazało wykonalność w różnych przedklinicznych modelach GBM9,14. Jednakże zdecydowana większość tych modeli nie uwzględnia resekcji chirurgicznej, mimo klinicznego znaczenia tego etapu. Nowsze badania z wykorzystaniem nowych modeli resekcji wykazały, że chirurgiczne usunięcie guza zmniejsza przeżywalność komórek macierzystych wstrzykiwanych bezpośrednio do jamy pooperacyjnej15. Utrata żywotności doprowadziła do zmniejszenia skuteczności, co prawdopodobnie wynika z redukcji dawki i czasu dostarczania leku do inwazyjnych ognisk nowotworowych.
Aby zwiększyć żywotność komórek macierzystych i wydajność dostarczania leków, MSC można wysiać na rusztowania przed implantacją. W niniejszym protokole jako rusztowanie dla MSC zastosowano biokompatybilny i wchłanialny nanowłóknisty kwas polimlekowy (PLA) otrzymany metodą elektroprzędzenia. PLA zgina się i dopasowuje do kształtu jamy po resekcji podczas implantacji, co maksymalizuje zasięg terapeutyczny i minimalizuje dystans, jaki MSC muszą pokonać, aby dotrzeć do komórek nowotworowych. MSC pozostają na rusztowaniu podczas implantacji, a następnie migrują z niego w kierunku komórek nowotworowych po implantacji16,17. Następnie MSC oraz niesione przez nie leki cytotoksyczne gromadzą się w ogniskach nowotworowych. Dostarczenie leku cytotoksycznego do guza wymaga żywotności i przetrwania MSC, co jest wspomagane przez implantację na rusztowaniach.
W niniejszej procedurze wektory lentiwirusowe są wykorzystywane do indukowania stabilnej ekspresji markerów fluorescencyjnych (śledzenie in vitro) i bioluminescencyjnych (śledzenie in vivo) w liniach komórek nowotworowych oraz macierzystych. Ludzka linia GBM U87 jest infekowana mCherry oraz lucyferazą świetlikową (U87 mCh-Fl), a nieterapeutyczne MSC GFP i lucyferazą renilla (MSC GFP-Rluc). Wariant terapeutyczny MSC wykazuje ekspresję liganda indukującego apoptozę związanego z TNFα (MSC-TRAIL). TRAIL, będący białkiem wydzielanym konstytutywnie, wiąże się z pobliskimi receptorami śmierci na komórkach nowotworowych i inicjuje apoptozę zależną od kaspaz18.
W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przedklinicznej chirurgicznej resekcji GBM z prowadzeniem obrazowym oraz implantacji rusztowań zasiedlonych MSC. W skrócie, u myszy nago wykonuje się kraniotomię, po której po trzech dniach następuje stereotaktyczne wstrzyknięcie ortotopowe komórek U87 mCh-Fl w celu wytworzenia guza pierwotnego. Przeszczepiony guz rośnie przez okres około jednego tygodnia. Rusztowania PLA są zasiedlane MSC na 48 h przed operacją resekcji. Następnie guz jest resekowany pod kontrolą fluorescencyjną, a rusztowanie obciążone MSC jest implantowane do jamy po resekcji. Po operacji obciążenie guzem oraz przeżywalność myszy są monitorowane za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego (BLI). Harmonogram tych procedur przedstawiono poniżej (Rycina 1).
<img alt="Schemat osi czasu implantacji guza przedstawiający okno czaszkowe, zasiew rusztowania, resekcję i obrazowanie pooperacyjne." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57452/57452fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Harmonogram procedur. Myszy otrzymują początkowo okno czaszkowe (Dzień 0). Po trzydniowym okresie rekonwalescencji następuje implantacja guzów (Dzień 3), które rosną przez około tydzień. Rusztowania są zasiewane komórkami MSC (Dzień 8) na dwa dni przed procedurą resekcji guza i implantacji (Dzień 10). Następnie progresja guza i skuteczność terapeutyczna są oceniane za pomocą obrazowania pooperacyjnego (Dzień 10+). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57452/57452fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.</a>

<table><tbody><tr><td>Tylko dla myszy instrument stereotaktyczny</td><td>Stoelting</td><td>51730</td><td>Utrzymuje stabilną pozycję głowy podczas operacji</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy fluorescencyjny</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>Umożliwia obrazowanie guza w czasie rzeczywistym podczas resekcji</td></tr><tr><td>Zmotoryzowany zintegrowany system wtryskiwacza stereotaktycznego (ISI)</td><td>Stoelting</td><td>53315</td><td>Umożliwia precyzyjną objętość i szybkość wstrzykiwania komórek nowotworowych</td></tr><tr><td>Klej tkankowy Vetbond</td><td>3M</td><td>1469</td><td>Klej sugiczny do zamykania ran skóry</td></tr><tr><td>Sztuczne łzy</td><td>Akorn</td><td>664268</td><td>Zapobiega wysuszaniu oczu podczas operacji</td></tr><tr><td>Alkohol Webcol przygotowuje</td><td>Covidien</td><td>6818</td><td>Sterylizuj miejsce nacięcia</td></tr><tr><td>Peeling chirurgiczny Betadine</td><td>Purdue Fredick Company</td><td>6761815117</td><td>Sterylizuj miejsce nacięcia</td></tr><tr><td>Aplikatory z bawełnianą końcówką</td><td>Fisherbrand</td><td>23-400-115</td><td>Narzędzie chirurgiczne</td></tr><tr><td>System aspiracyjny E-vac</td><td>Argos</td><td>EV310</td><td>Pompa próżniowa używana do resekcji guza</td></tr><tr><td>Fibrynogen i trombina ekstrahowane z otrzymanego TISSEEL</td><td>Baxter</td><td></td><td>Aby tymczasowo zabezpieczyć rusztowanie w jamie resekcyjnej</td></tr><tr><td>IVIS Kinetyczny system obrazowania optycznego in vivo</td><td>Suwmiarka Nauki przyrodnicze</td><td></td><td>Obrazowanie bioluminescencyjne</td></tr><tr><td>Sól potasowa D-Lucyferyna</td><td>PerkinElmer</td><td>122799</td><td>Środek do obrazowania in vivo</td></tr></tbody></table>

resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi

Image-Guided Resection of Glioblastoma and Intracranial Implantation of Therapeutic Stem Cell-seeded Scaffolds

Glejak wielopostaciowy (GBM), najczęstszy i najbardziej agresywny pierwotny rak mózgu, prowadzi do 12-15 miesięcy. Krótka oczekiwana długość życia wynika częściowo z niezdolności obecnego leczenia, składającego się z chirurgicznej resekcji, a następnie radioterapii i chemioterapii, w celu wyeliminowania inwazyjnych ognisk nowotworowych. Leczenie tych ognisk może być ulepszone dzięki rakobójczym ludzkim mezenchymalnym komórkom macierzystym (MSC). MSCs wykazują silny tropizm nowotworowy i mogą być modyfikowane do ekspresji białek terapeutycznych, które zabijają komórki nowotworowe. Postępy w modelach przedklinicznych wskazują, że resekcja chirurgiczna powoduje przedwczesną utratę MSC i zmniejsza skuteczność terapeutyczną. Skuteczność zabiegu MSC można poprawić, wysiewając MSCs na biodegradowalnym rusztowaniu z poli(kwasu mlekowego) (PLA). Dostarczenie MSC do jamy resekcji chirurgicznej na rusztowaniu PLA przywraca retencję komórek, trwałość i zabijanie guza. Aby zbadać wpływ implantacji PLA zasianego przez MSC na GBM, potrzebny jest dokładny model przedkliniczny. W tym miejscu przedstawiamy przedkliniczny protokół chirurgiczny do sterowanej obrazem resekcji guza GBM u myszy z niedoborem odporności, a następnie implantacji rusztowania z nasionami MSC. MSCs są modyfikowane przy użyciu konstruktów lentiwirusowych w celu konstytutywnej ekspresji i wydzielania terapeutycznego liganda indukującego apoptozę związanego z TNFα (TRAIL), a także białka zielonej fluorescencji (GFP), aby umożliwić śledzenie fluorescencyjne. Podobnie, komórki nowotworowe U87 są zaprojektowane do ekspresji lucyferazy mCherry i świetlika, zapewniając podwójne śledzenie fluorescencyjne / luminescencyjne. Chociaż protokół ten jest obecnie stosowany do badania dostarczania leków za pośrednictwem komórek macierzystych, może zostać zmodyfikowany w celu zbadania wpływu resekcji chirurgicznej na inne interwencje GBM.

Komórki nowotworowe U87 zostały zmodyfikowane w celu ekspresji mCherry oraz lucyferazy świetlika (U87 mCh-Fl) przed wstrzyknięciem, aby umożliwić resekcję pod kontrolą obrazowania oraz śledzenie bioluminescencyjne (Rysunek 2A-C). Komórki macierzyste zostały w podobny sposób zmodyfikowane za pomocą diagnostycznej GFP-Rluc (MSC-GFP) lub terapeutycznej GFP-TRAIL (MSC-TRAIL), a następnie wysiane na rusztowania z PLA w celu potwierdzenia ich przyc...

Terapeutyczne mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecujące jako metoda leczenia inwazyjnego glejaka. Optymalna transplantacja polega na dostarczeniu MSCs do jamy resekcji guza na rusztowaniach. W tym miejscu przedstawiono techniki przedkliniczne do badania leczenia glejaka wielopostaciowego MSC, w tym: resekcja guza pod kontrolą obrazu; wszczepianie rusztowań z nasionami MSC; i śledzenie terapii pooperacyjnej.

Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi

Glioblastoma (GBM), the most common and aggressive primary brain cancer, carries a life expectancy of 12-15 months. The short life expectancy is due in ...

Ogólnym celem tej procedury jest chirurgiczne wycięcie raka mózgu u myszy i wszczepienie rusztowania wysianego terapeutycznymi komórkami macierzystymi naprowadzającymi się na nowotwór do jamy resekcji pooperacyjnej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie terapii komórkowej i neuroonkologii, takie jak to, jak resekcja chirurgiczna wpływa na implantację komórek do jamy operacyjnej, jak skuteczne są nowe środki terapeutyczne w przypadku pooperacyjnego raka mózgu oraz jak systemy dostarczania oparte na rusztowaniach wpływają na wyniki terapeutyczne. Główną zaletą tej techniki jest to, że interwencje w kierunku raka mózgu można badać na myszach w sposób, który ściśle naśladuje kliniczny standard opieki u ludzi.Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat terapii komórkami macierzystymi dostarczanymi na rusztowaniu, może być również stosowana do innych interwencji, takich jak nanocząsteczki, małe cząsteczki, wirusy onkolityczne lub inne nowo pojawiające się terapie. Przygotuj rusztowania na 48 godzin przed implantacją u myszy, najpierw przecinając rusztowania PLA na kawałki wielkości jamy reekcyjnej o wielkości około dwóch na dwa milimetry. Wysteryliz

image-guided-resection-glioblastoma-intracranial-implantation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Dośródczaszkowa implantacja komórek GL261 u myszy C57BL/6 powoduje powstanie złośliwych glejaków, które odzwierciedlają wiele cech charakterystycznych dla ludzkiego wielopostaciowego glejakaa. Wykorzystaliśmy komórki GL261 stabilnie wykazujące ekspresję lucyferazy, co pozwoliło nam zastosować obrazowanie in vivo do śledzenia progresji guza. Przedstawiono procedurę chirurgiczną oraz trójwymiarowe obrazowanie in vivo.

Implantacja wewnątrzczaszkowa z następującym obrazowaniem bioluminescencyjnym 3D in vivo glejaków mysich

Opisujemy zintegrowaną metodę precyzyjnej implantacji stereotaktycznej ludzkich komórek wielopostaciowego glejaka do mózgów myszy nago oraz następującego po niej seryjnego obrazowania in vivo w celu monitorowania wzrostu i odpowiedzi na leczenie powstałych ksenograftów.

Stereotaktyczna implantacja wewnątrzczaszkowa i obrazowanie bioluminescencyjne in vivo ksenoprzeszczepów guzów w mysim modelu glioblastoma multiforme

Łącząc zastosowanie polerowanego i wzmocnionego cienkiego okna czaszkowego (PoRTS) z wstrzykiwaniem komórek glejaka wielopostaciowego (GBM), możemy w sposób podłużny obserwować inicjację i wzrost glejaka z wstrzykniętych komórek GBM w mózgu żywej myszy.

Obrazowanie inicjacji glejaka in vivo poprzez wypolerowane i wzmocnione cienkie okno czaszkowe

Ten film opisuje technikę wysiewu mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) na biodegradowalnym rusztowaniu z poli(kwasu mlekowego) (PLA). Przygotowane rusztowania mogą być wszczepione do chirurgicznej jamy resekcyjnej mózgu, skąd mogą migrować w kierunku ognisk nowotworowych. Co więcej, komórki te mogą być zmodyfikowane tak, aby wyrażały białka terapeutyczne w celu stymulowania apoptozy w komórkach nowotworowych.

Przygotowanie rusztowania nasiennego MSC: technika przygotowania rusztowania wysianego mezenchymalnymi komórkami macierzystymi do chirurgicznej implantacji do modelu mysiego

Ten film przedstawia procedurę chirurgiczną resekcji guza pod kontrolą obrazu i implantacji bio-rusztowania obsianego genetycznie modyfikowanymi mezenchymalnymi komórkami macierzystymi lub MSC eksprymującymi ligand indukujący apoptozę związaną z czynnikiem martwicy nowotworu lub TRAIL. Te terapeutyczne MSCs mają potencjał w leczeniu nowotworów mózgu.

Resekcja guza sterowana fluorescencją i implantacja rusztowania wysiewanego przez MSC w modelu mysim: procedura chirurgiczna mająca na celu dostarczenie terapeutycznych mezenchymalnych komórek macierzystych do jamy resekcji guza mózgu w modelu mysim

Ustaliliśmy korowy model glejaka ortotopowego u myszy do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej, który podsumowuje ograniczenia biofizyczne, które normalnie występują podczas wzrostu guza. Przewlekłe szklane okienko zastępujące czaszkę nad guzem umożliwia śledzenie postępu guza w czasie za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

Ortotopowy mysi model glejaka wielopostaciowego utrzymujący fizyczne ograniczenia miąższu mózgu i nadający się do przyżyciowej mikroskopii dwufotonowej

Komórki macierzyste są obiecującymi nośnikami terapeutycznymi w leczeniu guzów mózgu ze względu na ich wewnętrzny tropizm nowotworowy. Nieinwazyjne donosowe podawanie komórek macierzystych omija barierę krew-mózg i wykazuje duży potencjał w zakresie translacji klinicznej. W artykule podsumowano podstawowe zasady podawania donosowych komórek macierzystych w mysim modelu glejaka.

Donosowe podawanie terapeutycznych komórek macierzystych do glejaka w modelu mysim

Ta praca opisuje rozwój elastycznych elektrod międzypalcowych do implementacji w modelach 3D guzów mózgu, a mianowicie w hodowli in vitro, modelu in ovo i modelu mysim in vivo. Proponowana metoda może być wykorzystana do oceny wpływu pulsacyjnych pól elektrycznych na nowotwory na różnych poziomach złożoności.

Elastyczne organiczne urządzenia elektroniczne do terapii pulsacyjnym polem elektrycznym glejaka

Prezentujemy nowatorskie podejście do dwufotonowej mikroskopii dostarczania przez nowotwór znakowanych fluorescencyjnie nanocząstek tlenku żelaza do glejaka w modelu mysim.

Dwufotonowa mikroskopia przyżyteczna glejaka w modelu mysim

In vivo komunikacja międzykomórkowa leżąca u podstaw wielu chorób ośrodkowego układu nerwowego, takich jak glejak (GBM), jest notorycznie trudna do zmierzenia i scharakteryzowania. Opisujemy tutaj procedury mikroperfuzji otwartego przepływu mózgu (cOFM), które można zastosować do pobierania próbek składników płynu międzymiąższowego w podłużnym modelu zwierzęcym GBM.

Wykorzystanie mikroperfuzji otwartego przepływu mózgu do podłużnego pobierania płynu śródmiąższowego w zwierzęcym modelu glejaka

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj metodę resekcji glejaka wielopostaciowego u myszy z implantacją rusztowania z komórkami macierzystymi MSC. Technika ta pozwala badać skuteczność terapii komórkowej w neuroonkologii.

Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi (Wideo) | JoVE Journal

Resekcja glejaka wielopostaciowego pod kontrolą obrazu i wewnątrzczaszkowa implantacja terapeutycznych rusztowań wysiewanych komórkami macierzystymi

Przeglądaj więcej filmów