Name: De Novo Generowanie somatycznych komórek macierzystych metodą YAP/TAZ (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 5 s
Description: Poznaj metodę reprogramowania komórek zróżnicowanych w komórki macierzyste za pomocą czynnika transkrypcyjnego YAP. Technika ta umożliwia generowanie komórek progenitorowych z gruczołów mlekowych myszy, z zastosowaniem w medycynie regeneracyjnej i badaniach plastyczności komórkowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Dziękujemy F. Camargo za dar myszy tetO- YAPS127A; Myszy R26-rtTAM2 (stock #006965) zostały zakupione w The Jackson Laboratory. Dziękujemy Chiarze Frasson i Giuseppe Basso za pomoc w zabiegach FACS. Praca ta jest wspierana przez AIRC Special Program Molecular Clinical Oncology "5 per mille" oraz AIRC PI-Grant dla S.P, a także przez granty Epigenetics Flagship CNR-Miur dla S.P. Projekt ten otrzymał dofinansowanie Europejskiej Rady ds. Badań Naukowych (ERC) w ramach programu Unii Europejskiej w zakresie badań naukowych i innowacji Horyzont 2020 (umowa o grant DENOVOSTEM nr 670126).

<ol><li>Panciera, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+Expandable+Tissue-Specific+Stem%2FProgenitor+Cells+through+Transient+Expression+of+YAP%2FTAZ%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of Expandable Tissue-Specific Stem/Progenitor Cells through Transient Expression of YAP/TAZ.</a> Cell Stem Cell. 19 (6), 725-737 (2016).</li>
<li>Bar-Nur, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+conversion+induced+by+pluripotency+factors+involves+transient+passage+through+an+iPSC+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Lineage conversion induced by pluripotency factors involves transient passage through an iPSC stage.</a> Nat Biotechnol. 33 (7), 761-768 (2015).</li>
<li>Xu, J., Du, Y., Deng, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+lineage+reprogramming%3A+strategies%2C+mechanisms%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Direct lineage reprogramming: strategies, mechanisms, and applications.</a> Cell Stem Cell. 16 (2), 119-134 (2015).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).</li>
<li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cell+plasticity.+Plasticity+of+epithelial+stem+cells+in+tissue+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stem cell plasticity. Plasticity of epithelial stem cells in tissue regeneration.</a> Science. 344 (6189), 1242281(2014).</li>
<li>Bai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yes-associated+protein+regulates+the+hepatic+response+after+bile+duct+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Yes-associated protein regulates the hepatic response after bile duct ligation.</a> Hepatology. 56 (3), 1097-1107 (2012).</li>
<li>Cai, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hippo+signaling+pathway+restricts+the+oncogenic+potential+of+an+intestinal+regeneration+program%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Hippo signaling pathway restricts the oncogenic potential of an intestinal regeneration program.</a> Genes Dev. 24 (21), 2383-2388 (2010).</li>
<li>Elbediwy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrin+signalling+regulates+YAP+and+TAZ+to+control+skin+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Integrin signalling regulates YAP and TAZ to control skin homeostasis.</a> Development. 143 (10), 1674-1687 (2016).</li>
<li>Taniguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gp130-Src-YAP+module+links+inflammation+to+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A gp130-Src-YAP module links inflammation to epithelial regeneration.</a> Nature. 519 (7541), 57-62 (2015).</li>
<li>Zhang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+of+mutant+KRAS%2C+the+transcription+regulator+YAP+is+essential+for+neoplastic+progression+to+pancreatic+ductal+adenocarcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Downstream of mutant KRAS, the transcription regulator YAP is essential for neoplastic progression to pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Sci Signal. 7 (324), ra42(2014).</li>
<li>Zanconato, F., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+at+the+Roots+of+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ at the Roots of Cancer.</a> Cancer Cell. 29 (6), 783-803 (2016).</li>
<li>Azzolin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ+incorporation+in+the+beta-catenin+destruction+complex+orchestrates+the+Wnt+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ incorporation in the beta-catenin destruction complex orchestrates the Wnt response.</a> Cell. 158 (1), 157-170 (2014).</li>
<li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+unique+properties+of+mammary+epithelial+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Purification and unique properties of mammary epithelial stem cells.</a> Nature. 439 (7079), 993-997 (2006).</li>
<li>Means, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pancreatic+epithelial+plasticity+mediated+by+acinar+cell+transdifferentiation+and+generation+of+nestin-positive+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pancreatic epithelial plasticity mediated by acinar cell transdifferentiation and generation of nestin-positive intermediates.</a> Development. 132 (16), 3767-3776 (2005).</li>
<li>Shi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maintenance+of+acinar+cell+organization+is+critical+to+preventing+Kras-induced+acinar-ductal+metaplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Maintenance of acinar cell organization is critical to preventing Kras-induced acinar-ductal metaplasia.</a> Oncogene. 32 (15), 1950-1958 (2013).</li>
<li>Huch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlimited+in+vitro+expansion+of+adult+bi-potent+pancreas+progenitors+through+the+Lgr5%2FR-spondin+axis%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Unlimited in vitro expansion of adult bi-potent pancreas progenitors through the Lgr5/R-spondin axis.</a> EMBO J. 32, 2708-2721 (2013).</li>
<li>Fernandez Vallone, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trop2+marks+transient+gastric+fetal+epithelium+and+adult+regenerating+cells+after+epithelial+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Trop2 marks transient gastric fetal epithelium and adult regenerating cells after epithelial damage.</a> Development. 143 (9), 1452-1463 (2016).</li>
<li>Yanger, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+cellular+reprogramming+occurs+spontaneously+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Robust cellular reprogramming occurs spontaneously during liver regeneration.</a> Genes Dev. 27 (7), 719-724 (2013).</li>
<li>Yui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YAP%2FTAZ-Dependent+Reprogramming+of+Colonic+Epithelium+Links+ECM+Remodeling+to+Tissue+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">YAP/TAZ-Dependent Reprogramming of Colonic Epithelium Links ECM Remodeling to Tissue Regeneration.</a> Cell Stem Cell. , (2017).</li>
<li>Pan, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+patterns+of+multipotentiality+in+Ptf1a-expressing+cells+during+pancreas+organogenesis+and+injury-induced+facultative+restoration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration.</a> Development. 140 (4), 751-764 (2013).</li>
<li>Panciera, T., Azzolin, L., Cordenonsi, M., Piccolo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+YAP+and+TAZ+in+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of YAP and TAZ in physiology and disease.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (12), 758-770 (2017).</li>
<li>Lentiviral production and infection. , 
 <a target="_blank" href="http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf">http://www.bio.unipd.it/piccolo/protocols/YAP_reprogramming_protocols.pdf</a> (2016).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

W tym miejscu przedstawiamy protokoły przeprogramowania ex vivo terminalnie zróżnicowanych komórek nabłonkowych różnych tkanek w odpowiadające im specyficzne tkankowo komórki progenitorowe (lub ySC) przez przejściową ekspresję YAP, jak opisano wcześniej1. Szczegółowo opisaliśmy dwie procedury: jedną umożliwiającą przeprogramowanie komórek oczyszczonych przez FACS za pomocą wektorów lentiwirusowych oraz drugą, która pozwala uniknąć infekcji wirusowej i wykorzystuje transgeniczną ekspresję YAP. Każdy protokół przedstawia skuteczną strategię izolacji i hodowli pierwotnych komórek zróżnicowanych oraz strategię wymuszania egzogennej ekspresji genu YAP w zróżnicowanych komórkach, generując de novo somatyczne, specyficzne dla tkanki ekspandowane komórki macierzyste (patrz schematy na rysunkach 1A i 2A).
Wykazaliśmy, że przedstawione tutaj strategie izolacji skutecznie izolują czystą populację zróżnicowanych komórek, o czym świadczy fakt, że nigdy nie wykryliśmy żadnego wyrostka z ujemnych próbek kontrolnych (ryc. 1C i 2C).
Wektory lentiwirusowe użyte w tym badaniu do przeprogramowania pierwotnych komórek LD sutka są indukowane doksycykliną, co daje możliwość ścisłej kontroli ekspresji transgenu; pozwala to na dowolne włączanie i wyłączanie egzogennej ekspresji YAP. Szczególną uwagę należy zwrócić na unikanie stosowania nadmiernego miana wirusa, ponieważ może to być szkodliwe pod względem skuteczności przeprogramowywania. W przypadku pierwotnych komórek groniastych przeszliśmy na podejście w pełni transgeniczne, aby uzyskać przeprogramowanie zależne od YAP przy minimalnych manipulacjach. Ta ostatnia strategia jest również szczególnie odpowiednia w przypadku pierwotnych ziarniaków trzustki, ponieważ izolowane klastry groniaste są prawie niepodatne na zakażenie lentiwirusowe i bardzo delikatne. Zastosowana strategia transgeniczna oferuje tę samą przewagę, co wektory lentiwirusowe zależne od doksycykliny, w ścisłej kontroli ekspresji genów. Co więcej, strategia transgeniczna zastosowana w przypadku pierwotnej acini trzustki ma dodatkową zaletę w postaci znacznie wyższej skuteczności przeprogramowania w porównaniu z indukowanym przez wirusa przeprogramowaniem komórek LD sutka. Poza różną wewnętrzną plastycznością związaną z komórkami pochodzącymi z różnych tkanek, wyższy wskaźnik przeprogramowania trzustki można uzyskać z wyższej wydajności ekspresji związanej z jednolitą i autonomiczną ekspresją YAP we wszystkich eksplantowanych komórkach. W szczególności wykazaliśmy, że egzogenny YAP nie jest już wymagany po wytworzeniu ySC (kolonii yMaSC i yDucts), bez wpływu na ich zdolność do samoodnawiania. Dzieje się tak, ponieważ ySC reaktywują endogenne YAP/TAZ i wykorzystują je do samoodnawiania, gdy egzogenny YAP jest wyłączony1.
Potwierdziliśmy pogląd, że ySC rzeczywiście wyłaniają się ze zróżnicowanych komórek, kontrolując komórkę, z której pochodzą nasze eksperymenty z przeprogramowaniem poprzez walidacje genetyczne śledzenia linii1.
Obszerna charakterystyka ySC pokazuje, że przeprogramowanie wywołane przez YAP generuje normalne somatyczne SC1 , ponieważ i) na poziomie transkryptomicznym ySC wykazują ogromne nakładanie się z natywnymi SC; (ii) ySC wykazują potencjał różnicowania i mogą wytwarzać potomstwo wieloliniowe, zawsze ograniczone do tożsamości tkanki ich pochodzenia; iii) ySC są nieprzekształcone i nierakotwórcze po przeszczepieniu in vivo.
W tym miejscu opisujemy również procedury utrzymywania i namnażania w hodowli zarówno yMaSCs, jak i yDucts jako organoidów osadzonych w 100% hydrożelach o macierzy błony podstawnej. Warunki te pozwalają na samoorganizację ySC w trójwymiarowe organoidy, które zapewniają długoterminowe utrzymanie właściwości łodyg w hodowli, umożliwiając dowolne rozszerzanie tych populacji łodyg w celu dalszych analiz i zastosowań. Z nieznanych przyczyn nie udało nam się uzyskać organoidów yMaSC poprzez umieszczenie zakażonych komórek LD bezpośrednio w warunkach hodowli organoidów 7 dni po leczeniu doksycykliną na plastikowej płytce do hodowli tkankowej; Innymi słowy, niezbędny jest pośredni etap wzrostu w warunkach kolonii sutkowej. W naszych rękach nawet rodzime MaSC wymagają warunków kolonii sutka przed pasażowaniem w kulturze organoidowej. Co więcej, najbardziej efektywny wzrost organoidów uzyskuje się, gdy unikamy dysocjacji pierwotnych kolonii na pojedyncze komórki, ale raczej przenosimy nienaruszone kolonie do warunków hodowli organoidów.
Warunki hodowli organoidów mają również tę zaletę, że dają możliwość kriokonserwacji ySC, pod warunkiem, że organoidy zostaną odzyskane z ich matryc, unikając dysocjacji komórek przed krioprezerwacją w kąpieli azotowej.
Przedstawiona procedura przeprogramowania YAP może przekształcić różne zróżnicowane typy komórek pochodzące z różnych dorosłych tkanek w odpowiadające im tkankowo specyficzne komórki macierzyste (przetestowaliśmy to na komórkach sutka, trzustki i neuronów)1. W odróżnieniu od iPSC lub innych prób przeprogramowania, YAP/indukowane SC mogą zachować pamięć o swojej tkance, z której pochodzą. Warto zauważyć, że dedyferencjacja komórek somatycznych w komórki obdarzone właściwościami podobnymi do macierzystych jest jedyną formą plastyczności i przeprogramowania losu komórki obserwowaną in vivo, na przykład po uszkodzeniu tkanek i w celu wspomagania gojenia się ran 5,17,18,19,20. Warto zauważyć, że YAP i TAZ są w dużej mierze zbędne dla normalnej homeostazy, ale kluczowe dla naprawy tkanek w wielu tkankach 11,21. Zgodnie z fizjologiczną funkcją opisanych tutaj etapów przeprogramowywania, ostatnio wykazano, że YAP / TAZ jest wymagany w regeneracji jelit w mysich modelach pacjentów z wrzodziejącym zapaleniem jelita grubego, powodując konwersję dorosłych komórek jelitowych w naprawczy nabłonek, który wykazuje cechy jelita płodu19. Przeprogramowanie YAP rozszerza zatem obecne strategie indukowanej plastyczności komórek, zapewniając środki do generowania somatycznych komórek macierzystych, stanu, który do tej pory był trudny do uchwycenia in vitro. Podejście to, jeśli zostanie rozszerzone również na komórki pochodzenia ludzkiego, może mieć szerokie znaczenie, począwszy od zastosowań w medycynie regeneracyjnej, a skończywszy na badaniu somatycznego stanu macierzystego i ekspansji somatycznych komórek macierzystych in vitro.

Tkankowe somatyczne komórki macierzyste (SC) są kluczowe dla odnowy i naprawy tkanek po urazie. Możliwość łatwej izolacji i nieograniczonej ekspansji ex vivo somatycznych SC stanowi kluczową kwestię dla potencjalnych terapii regeneracyjnych, a także dla zastosowań SC w badaniach podstawowych i modelowaniu chorób. Postęp w tym kierunku jest jednak ograniczony przez trudności w uchwyceniu stanu SC różnych narządów nabłonkowych in vitro. Rzeczywiście, w kilku dorosłych tkankach rezydentne SC mogą nie istnieć lub nie być łatwo dostępne, lub ich liczba i potencjał regeneracyjny mogą ulec erozji w wyniku starzenia się lub stanów chorobowych. W 2016 roku zaczęliśmy wypełniać tę lukę, informując, że ekspresja pojedynczego koaktywatora transkrypcji, YAP (białko związane z YES) lub jego blisko spokrewnionego białka TAZ (aktywator transkrypcji z motywem PDZ), w terminalnie zróżnicowanych komórkach skutecznie tworzy funkcjonalne, rozszerzalne, nienowotworowe, autologiczne populacje komórek, które są operacyjnie i molekularnie nie do odróżnienia od odpowiadających im specyficznych tkankowo SCs1. Impuls utrzymującej się aktywności YAP lub TAZ przez kilka dni wystarczy, aby wywołać pojawienie się samoodnawiających się somatycznych SC. Jest to stabilny stan, który nie jest już zależny od ciągłej ekspresji transgenu, ponieważ może być przenoszony przez pokolenia komórek bez dalszej ekspresji ektopowego YAP/TAZ1. Przedstawiony tutaj protokół szczegółowo opisuje procedurę stosowaną do generowania de novo nabłonkowych komórek macierzystych/progenitorowych gruczołu sutkowego i trzustki, zaczynając od zróżnicowanych komórek tych tkanek. Procedura ta wypełnia czarną skrzynkę na obecnej arenie przeprogramowywania/transdyferencjacji. Główne wysiłki w tym kierunku koncentrowały się do tej pory na przejściu komórek do stanu indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), a następnie na przekształceniu tych embrionalnych i pluripotencjalnych SC w bardziej zróżnicowane komórki. Jednak iPSC są rakotwórcze po wprowadzeniu do tkanek dorosłych, co rodzi potrzebę opracowania protokołów ich pełnego i skutecznego różnicowania2. Jednak ten krok różnicowania, nawet jeśli jest możliwy, odbywa się kosztem długoterminowej zdolności do ekspansji, samoorganizacji i potencjału ponownego zasiedlania narządów. Są to podstawowe cechy regeneracji narządów, które w rzeczywistości są typowe tylko dla endogennych SC specyficznych dla tkanek i obecnie opisywanych SC indukowanych przez YAP (ySCs). Podobnie, bezpośrednia transdyferencjacja jednego typu komórek w inny przy użyciu koktajli różnych czynników transkrypcyjnych również generuje zróżnicowane komórki, które nie mają niezbędnego potencjału proliferacyjnego i macierzystego3.
Opisana tutaj procedura również korzysta z niedawno wprowadzonej technologii organoidów, dzięki której endogenne SC mogą być rozszerzane i różnicowane ex vivo4. SC indukowane przez YAP mogą generować SC tworzące organoidy nawet w warunkach eksperymentalnych, biologicznych lub chorobowych, w których endogenne SC nie są obecne. Chcielibyśmy zauważyć, że w przeciwieństwie do innych procedur przeprogramowywania, rodzaj plastyczności komórek nadawany przez YAP może odpowiadać jedynej formie powrotu do stanu podobnego do SC, która występuje w żywych tkankach. Ponowne nabycie cech podobnych do SC wiąże się z naprawą tkanek lub aktywacją onkogenną5. Chociaż są zbędne dla homeostazy kilku dorosłych tkanek, YAP i/lub TAZ są absolutnie niezbędne do regeneracji, wzrostu guza i ekspansji somatycznych SC in vitro1,6,7,8,9,10,11,12

<table><tbody><tr><td>Sterylne strzykawki 10 ml</td><td>Rays</td><td>10LC</td><td></td></tr><tr><td>100 mm&nbsp; sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>15 mL sterylne probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>430052</td><td></td></tr><tr><td>24-dołkowe płytki o bardzo niskim mocowaniu Sitka</td><td>do komórek Costar</td><td>3473</td><td></td></tr><tr><td>40 mm</td><td>Corning</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowe płytki wielodołkowe</td><td>Corning</td><td>353078</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylne probówki stożkowe</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki wielodołkowe</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Zaawansowany suplement DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>B27 (50x)</td><td>Gibco</td><td>17504001</td><td></td></tr><tr><td>BPE</td><td>Gibco</td><td>13028014</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typu I</td><td>Sigma</td><td>17018029</td><td></td></tr><tr><td>deksametazon</td><td>Sigma</td><td>D4902&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco</td><td>1705-041</td><td></td></tr><tr><td>Skalpele jednorazowe</td><td>Swann-Morton</td><td>0503</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DnaseI</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>hyklalat doksycykliny</td><td>Sigma</td><td>D9891&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Etanol 100%</td><td>Sigma</td><td>51976</td><td></td></tr><tr><td>Rurki FACS (z nasadkami filtrującymi)</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>FITC anty-mysi CD326 (Ep-CAM)</td><td>BioLegend</td><td>118208</td><td></td></tr><tr><td>FUdeltaGW-rtTA&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#19780&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-EGFP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84041</td><td>stosowany jako kontrola ujemna</td></tr><tr><td>FUW-tetO-MCS</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84008</td><td>stosowany jako kontrola ujemna</td></tr><tr><td>FUW-tetO-wtYAP</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84009</td><td></td></tr><tr><td>FUW-tetO-YAPS94A</td><td>Addgene</td><td>&nbsp;#84010</td><td>stosowany jako kontrola negatywna (transkrypcyjnie martwy mutant YAP)</td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>30721</td><td></td></tr><tr><td>sól sodowa heparyny</td><td>Sigma</td><td>H3149&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór buforowy HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>ludzka R-Spondin1 (His Tag)</td><td>Sino Biological</td><td>11083-H08H-5</td><td></td></tr><tr><td>Hialuronidaza z jąder bydlęcych</td><td>Sigma</td><td>H3506&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ITS-X</td><td>Gibco</td><td>51500056</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało K-14</td><td>Life Technologies</td><td>Ab7800&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało K-8</td><td>Life Technologies</td><td>Ab14053&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>&nbsp; </td><td></td>25030081</tr><tr><td>Lin (koktajl przeciwciał allofikocyjaniny [APC] linii myszy)</td><td>BD Biosciences</td><td>51-9003632</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel&reg; Czynnik wzrostu Obniżona matryca błony podstawnej, Phenol Red-Free</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>N-acetylocysteina</td><td>Sigma</td><td>A9165</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T.Baker</td><td>0402</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A9434&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nikotynamid</td><td>Sigma</td><td>72340</td><td></td></tr><tr><td>bezkomórkowy klej 10 cm naczynia (sterylna polisirolowa szalka Petriego &oslash; 94)</td><td>ROLKA</td><td>18248</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x</td><td>Euroclone</td><td>ECM4004XL</td><td></td></tr><tr><td>PE Chomik Anty-Myszy CD61</td><td>BD Biosciences</td><td>553347</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Szczur Anty-Ludzki CD49f</td><td>BD Biosciences</td><td>551129</td><td></td></tr><tr><td>PE / Cy7 przeciwciało przeciw myszom / szczurom CD29</td><td>BioLegend</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>Pen / Strep (10 000 U / mL)</td> <td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen z ogona szczura I (powłoka)</td> <td>Sigma</td><td>122-20</td><td></td></tr><tr><td>Kolagen z ogona szczura I do hodowli 3D</td><td>Cultrex</td><td>3447-020-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki FGF10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany ludzki Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany mysi EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td></td></tr><tr><td>rekombinowany mysi FGF basic (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>450-33</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>31870025</td><td></td></tr><tr><td>SBTI (inhibitor trypsyny od Glycine max)</td><td>Sigma</td><td>T6522&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BAZA Tris&nbsp;</td><td>Roche</td><td>11814273001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA 0,05%</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Waymouth medium</td><td>Gibco</td><td>31220023</td><td></td></tr></tbody></table>

de novo generowanie somatycznych komórek macierzystych metodą yap/taz

De Novo Generation of Somatic Stem Cells by YAP/TAZ

Tutaj prezentujemy protokoły izolowania pierwotnych zróżnicowanych komórek i przekształcania ich w komórki macierzyste/progenitorowe (SC) tej samej linii poprzez przejściową ekspresję czynnika transkrypcyjnego YAP. Dzięki tej metodzie komórki zróżnicowane światłem (LD) mysiego gruczołu sutkowego są przekształcane w komórki, które wykazują właściwości molekularne i funkcjonalne SC sutka. YAP przekształca również w pełni zróżnicowane komórki zewnątrzwydzielnicze trzustki w progenitory przypominające przewody trzustkowe. Podobnie jak endogenne, naturalne SC, komórki macierzyste indukowane przez YAP ("ySC") mogą być ostatecznie namnażane jako hodowle organoidów w perspektywie długoterminowej in vitro, bez dalszej potrzeby ektopowego YAP/TAZ, ponieważ ySC są obdarzone dziedzicznym, samoodnawiającym się stanem podobnym do SC. 
Przedstawiona tutaj procedura przeprogramowania oferuje możliwość generowania i rozbudowy in vitro komórek progenitorowych z różnych źródeł tkankowych, zaczynając od komórek zróżnicowanych. Prosta ekspansja komórek somatycznych ex vivo ma implikacje dla medycyny regeneracyjnej, dla zrozumienia mechanizmów inicjacji nowotworu i, bardziej ogólnie, dla badań nad biologią komórkową i rozwojową.

Generowanie yMaSCs 
Przegląd strategii eksperymentalnej w celu przeprogramowania pierwotnych komórek LD gruczołu mlekowego poprzez przejściową ekspresję YAP przedstawiono na Rysunku 1A. Pierwotne nabłonkowe komórki LD gruczołu mlekowego są oczyszczane za pomocą fluorescencyjnego sortowania komórek (FACS)13. Rysunek 1B przedstawia typową procedurę sortowania w celu uzyskania trzech odrębnych subpopulacji: komórek podstawnych (EpCAMlowCD49fhighCD61-), komórek progenitorowych luminalnych (LP) (EpCAMhighCD49flowCD61+) oraz komórek LD (EpCAMhighCD49flowCD61-). Staranne bramkowanie trzech subpopulacji jest niezbędne do wyizolowania czystej preparacji komórek LD, które są w pełni zróżnicowane i całkowicie zatrzymane w cyklu wzrostu po wysianiu w warunkach tworzenia kolonii gruczołu mlekowego (patrz Rysunek 1C, lewy panel). Przeciwnie, po indukcji ekspresji egzogennego YAP, komórki LD zaczynają proliferować, tworząc łatwo rozpoznawalne, gęste kolonie nabłonkowe w zawiesinowych kulturach z 5% macierzy błony podstawnej (Rysunek 1C). Efektywność przeprogramowania, szacowana na około 3% w typowym eksperymencie, można ocenić, dzieląc liczbę kolonii przez liczbę pojedynczych komórek pierwotnie wysianych w zawiesinowych kulturach macierzy błony podstawnej (Rysunek 1D). Przeprogramowane komórki luminalne (yMaSCs) mogą być następnie pasażowane do warunków hodowli organoidów w 100% macierzy błony podstawnej (patrz schemat na Rysunku 1A), gdzie samoorganizują się w złożone struktury przypominające organoidy, które rozwijają się wokół wielu świateł i wykazują niezwykłą zdolność do samoodnawiania nawet w obecności doksycykliny (i.e. w przypadku braku transgenicznej ekspresji YAP) (Rysunek 1E). Histologicznie organoidy pochodzące z yMaSC wykazują warstwę podstawną (K14 dodatnią), przylegającą do zrekonstytuowanej ECM macierzy błony podstawnej, oraz warstwę luminalną (K8 dodatnią), przylegającą do jam przypominających światła wewnątrz organoidu (Rysunek 1F). Architektura ta jest nieodróżnialna od architektury organoidów tworzonych przez natywne MaSCs (Rysunek 1F).
Generowanie yDucts 
Przegląd strategii eksperymentalnej mającej na celu przeprogramowanie pierwotnych acynusów trzustki poprzez przejściową ekspresję YAP przedstawiono na Rysunku 2A. Całe klastry acynarne są izolowane z masy tkanki trzustki poprzez połączenie łagodnej dysocjacji i selekcji wielkością za pomocą filtracji. Typowe preparaty przedstawiono na Rysunku 2B. Po izolacji klastry komórek acynarnych powinny występować w formie zawiesiny egzokrynnych jednostek acynarnych o jednorodnej wielkości, bez zanieczyszczeń w postaci endokrynnych wysepek Langerhansa lub fragmentów drzewa przewodowego trzustki oraz z minimalną dysocjacją do pojedynczych komórek. Zanieczyszczenie wysepkami endokrynnymi lub fragmentami przewodów świadczy o niewystarczającej filtracji selektywnej (krok 2.1.10), co może wynikać z gwałtownego obchodzenia się z materiałem; niepożądana dysocjacja klastrów acynarnych do pojedynczych komórek może być spowodowana nadmierną obróbką kolagenazą lub niebuforowaną aktywnością enzymów proteolitycznych uwalnianych przez tkankę, co można ograniczyć poprzez dodatkową obróbkę SBTI.
Typowy eksperyment przeprogramowania acinarnego przedstawiono na Rysunku 2C; w ciągu 5-7 dni hodowli w hydrożelu na bazie kolagenu typu I w obecności doksycykliny, acini trzustkowe pochodzące od myszy R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A łatwo przekształcają się w klastry przypominające przewody (które nazwaliśmy yDucts), składające się z cienkiej jednowarstwy komórek nabłonkowych, które proliferują wokół rozszerzającej się centralnej jamie. Wydajność przeprogramowania, która w typowym eksperymencie wynosi około 70%, można łatwo zmierzyć, obliczając stosunek liczby klastrów przypominających przewody do całkowitej liczby wysianych acini (Rysunek 2D). Komórki kontrolne negatywne, czyli komórki R26-rtTAM2/+ lub komórki R26-rtTAM2/tetO-YAPS127A pozostawione bez doksycykliny, w tych warunkach hodowli niezmiennie pozostają w formie pomitotycznych klastrów acinarnych, zgodnie z wcześniejszymi doniesieniami1,14,15. Przeprogramowane yDucts mogą być następnie pasażowane na poziomie pojedynczych komórek do warunków hodowli organoidów na bazie Matrigelu16 (patrz schemat na Rysunku 2A), wykazując niezwykłą zdolność do samoodnawiania nawet w przypadku braku doksycykliny (i.e. przy braku transgenicznej ekspresji YAP) (Rysunek 2E).
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej i tworzenia organoidów macierzystych komórek gruczołu mlekowego; analiza wzrostu kolonii i różnicowania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Izolacja pierwotnych komórek LD gruczołu mlekowego i indukcja komórek macierzystych gruczołu mlekowego. (A) Schematyczna prezentacja procedury eksperymentalnej przyjętej w celu przeprogramowania pierwotnych komórek LD gruczołu mlekowego. (B) Reprezentatywne wykresy FACS ilustrujące typową procedurę sortowania w celu oczyszczenia komórek LD. i) zdysocjowane komórki są bramkowane zgodnie z rozproszeniem przednim (forward scatter) i bocznym (side scatter) w celu wyodrębnienia żywych komórek (P1; niebieski); ii) populacja P1 jest następnie dalej bramkowana zgodnie z profilem Lin: wybierana jest subpopulacja komórek Lineage-ujemnych (P2; szary), z wykluczeniem hematopoetycznych komórek Lineage-dodatnich; iii) populacja P2 jest następnie rozdzielana na subpopulacje EpCAMhigh (P3; żółty + zielony) oraz EpCAMlow (P6; czerwony); iv) P3 i P6 są następnie dalej bramkowane zgodnie z profilem CD61/CD49f na trzy subpopulacje: komórki podstawne EpCAMlowCD49fhighCD61- (P7; czerwony), komórki LP EpCAMhighCD49flowCD61+ (P8; żółty) oraz komórki LD EpCAMhighCD49flowCD61- (P9; zielony). (C) Zdjęcia ilustrujące zdolność komórek LD, zainfekowanych wskazanymi konstruktami, do tworzenia kolonii gruczołu mlekowego 15 dni po wysianiu w pożywce do kolonii gruczołu mlekowego. Tylko komórki wykazujące ekspresję YAP przekształcają się w komórki tworzące kolonie, podczas gdy komórki kontrolne negatywne (zainfekowane EGFP) pozostają pojedynczymi komórkami z zahamowanym wzrostem. Pasek skali = 50 μm. (D) Kwantyfikacja zdolności do tworzenia kolonii przez wskazane komórki, jak w (C). Dane przedstawiono jako średnia + s.d. i są one reprezentatywne dla pięciu niezależnych eksperymentów, z sześcioma powtórzeniami technicznymi w każdym. (E) Reprezentatywne zdjęcie przeprogramowanych przez YAP komórek przypominających komórki macierzyste gruczołu mlekowego (yMaSCs) po 12 dniach w warunkach hodowli organoidów w świeżym trójwymiarowym 100% hydrożelu z macierzy błony podstawnej w obecności doksycykliny. Pasek skali = 100 μm. (F) Reprezentatywne obrazy immunofluorescencyjne dla markera podstawnego K14 (zielony) i markera luminalnego K8 (czerwony) organoidów pochodzących ze wskazanych komórek, po 12 dniach w warunkach hodowli organoidów. Pasek skali = 10 μm. Rycina ta została powielona z pracy Panciera et al., 20161. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat tworzenia organoidów z zrazików trzustkowych wraz z obrazami mikroskopowymi i wykresem organoidów przewodowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57462/57462fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Izolacja pierwotnych komórek zrazikowych trzustki i indukcja progenitorów trzustkowych. (A) Schematyczna prezentacja procedury eksperymentalnej przyjętej w celu przeprogramowania pierwotnych komórek zrazikowych egzokrynnych trzustki. (B) Reprezentatywny obraz pierwotnych zrazików trzustkowych bezpośrednio po procedurze izolacji (krok 2.1.14). Preparat zrazikowy powinien mieć postać jednorodnej zawiesiny skupisk zrazikowych z minimalną obecnością pojedynczych komórek. Pasek skali = 400 μm. (C) Reprezentatywne obrazy pierwotnych zrazików trzustkowych pochodzących od myszy R26-rtTAM2 (panele górne) lub R26-rtTAM2; tetO-YAPS127A (panele dolne) i hodowanych w 3-D hydrożelu opartym na Kolagenie I przez 5 dni z doksycykliną (doxy) lub bez niej, zgodnie z oznaczeniem. Tylko pierwotne zraziki wykazujące ekspresję YAP przekształcają się w komórki rosnące jako organoidy przypominające cysty po dodaniu doksycykliny. Paski skali = 70 μm. (D) Ilościowa ocena zdolności zrazików trzustkowych do tworzenia organoidów przewodowych przy transgenicznej nadekspresji YAP, jak w (C). Dane przedstawiono jako średnia + s.d. i są one reprezentatywne dla pięciu niezależnych eksperymentów, przeprowadzonych z czterema powtórzeniami technicznymi. (E) Reprezentatywny obraz przeprogramowanych przez YAP komórek podobnych do przewodowych (yDucts) po trzech pasażach w świeżym trójwymiarowym 100% hydrożelu z macierzy błony podstawnej w obecności doksycykliny. Pasek skali = 130 μm. <a href="/files/ftp_upload/57462/57462fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Izolacja pierwotnych komórek gruczołu mlekowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+ roztwór chelatujący</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>0,02% m/v</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Roztwór do powlekania kolagenem typu I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kwas octowy 0,02 N, pH 3,23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagen z ogona szczura (powlekanie)</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór dispazy</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dyspaza</td>
			<td>5 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do dysocjacji</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zapasowy hialuronidazy</td>
			<td>400 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zapasowy kolagenazy I</td>
			<td>600 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór hemolityczny</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4roztwór Cl</td>
			<td>1 część</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrisBase 20,6 g/L</td>
			<td>9 części</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dostosować pH do wartości 7,2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS/PS</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>2x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zapasowy hialuronidazy</td>
			<td>Filtr 0.2 µm, przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hialuronidaza z jąder bydlęcych (proszek)</td>
			<td>2 000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bufor fosforanowy sodu 1M pH 7,3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4roztwór Cl</td>
			<td>Przechowywać w temp. pokojowej.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>H2O</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4Cl</td>
			<td>7,1 g/L</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dostosować pH do wartości 7,65</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór do sortowania</td>
			<td>Filtr 0.2 µm, przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES pH 7</td>
			<td>25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium płuczący nr 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicylina/streptomycyna</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium płuczący nr 2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do dwuwymiarowej hodowli komórek gruczołu mlekowego</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td>
			<td>2%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparyna</td>
			<td>4 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mysi bFGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mysi EGF</td>
			<td>10 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Indukcja i pasażowanie yMaSCs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pożywka do hodowli kolonii gruczołu mlekowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparyna</td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamina</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel (dodać bezpośrednio przed wysiewaniem)</td>
			<td>5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mysi bFGF</td>
			<td>20 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mysi EGF</td>
			<td>10 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pożywka do organoidów gruczołu piersiowego</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM:F12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heparyna </td>
			<td>4 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ludzki Noggin</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mysi bEGF</td>
			<td>20 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mysi EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondina 1</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Generowanie yMaSCs. Skład wszystkich różnych pożywek i roztworów wymaganych do izolacji pierwotnych komórek LD gruczołu mlekowego oraz indukcji yMaSCs (sekcja 1.)
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">Izolacja pierwotnych acinusów trzustki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Poziomka do hodowli komórek acynarnych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BPE</td>
			<td>50 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deksametazon</td>
			<td>1 µg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (płytki surowica wołowa) </td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ITS-X</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka Waymoutha</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Medium do przemywania acynarów</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>0.1%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicylina/streptomycyna</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka RPMI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pożywka do regeneracji acinarnej</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pożywka do hodowli komórek acynarnych</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS (płodowa surowica bydlęca)</td>
			<td>30%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">roztwór A kolagenazy I</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Medium do płukania acinarnego</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór zapasowy kolagenazy I</td>
			<td>360 U/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS/PS</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze 4 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (roztwór soli fosforanowo-buforowany)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór stokowy kolagenazy I</td>
			<td>Przechowywać w temperaturze -20 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kolagenaza, typ I (proszek)</td>
			<td>6 000 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Pasażowanie organoidów trzustkowych</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">roztwór kolagenazy I B</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS 1x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roztwór stokowy kolagenazy I</td>
			<td>240 U/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="2">Poziomka do hodowli organoidów trzustki</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Advanced DMEM/F12</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>gastryna</td>
			<td>10 nM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ludzki FGF10</td>
			<td>100 ng/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ludzki Noggin</td>
			<td>100 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mysi EGF</td>
			<td>50 ng/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>N-acetylocysteina</td>
			<td>1,25 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikotynamid</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>R-Spondyna 1</td>
			<td>1 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SBTI</td>
			<td>0,2 mg/ml</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2: Generowanie yDucts. Skład wszystkich różnych pożywek hodowlanych i roztworów wymaganych do izolacji pierwotnych komórek acynarnych oraz indukcji i pasażowania yDucts (sekcja 2.)

Dostępność somatycznych SC jest kluczowa dla medycyny regeneracyjnej, modelowania chorób i uzyskania wglądu we właściwości SC. W tym miejscu przedstawiamy eksperymentalne strategie przeprogramowania, in vitro, zróżnicowanych dorosłych komórek w odpowiadające im ekspandowalne tkankowo specyficzne komórki macierzyste / progenitorowe poprzez przejściową ekspresję pojedynczego koaktywatora transkrypcji YAP.

De Novo Generowanie somatycznych komórek macierzystych metodą YAP/TAZ

Here we present protocols to isolate primary differentiated cells and turn them into stem/progenitor cells (SCs) of the same lineage by transient ...

Ogólnym celem tej procedury jest przekształcenie pierwotnych komórek różniczkowanych w komórki progenitorowe tej samej linii poprzez przejściową ekspresję czynnika transkrypcyjnego YAP. Ta procedura przeprogramowania daje możliwość wytworzenia in vitro komórek progenitorowych lub komórek macierzystych różnych tkanek, zaczynając od ich zróżnicowanych odpowiedników, nawet jeśli endogenne komórki macierzyste są rzadkie lub trudne do zidentyfikowania. Wynikająca z tego możliwość ekspansji komórek somatycznych ex vivo ma implikacje dla medycyny regeneracyjnej, dla zrozumienia mechanizmów plastyczności komórek, która jest również istotna w przypadku nowotworów, oraz dla tkanki komórkowej i rozwoju badań biologicznych.Ta procedura wypełnia czarną skrzynkę na obecnej arenie przeprogramowywania, ponieważ naszym celem nie jest tworzenie wyspecjalizowanych komórek poprzez różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych, ale specyficzne tkankowo komórki macierzyste ze zróżnicowanych komórek. Po złożeniu w ofierze 10 samic myszy zgodnie z protokołem tekstowym, należy wypreparować gruczoły sutkowe, wykonując nacięcie w kształcie litery Y wzdłuż skóry brzucha. Następnie użyj kleszczy Dumonta, aby ostrożnie oddzielić gruczoły od otrzewnej, delikatnie pociągając.Umieść wypreparowane gruczoły w naczyniu z klejem bezkomórkowym z 10 mililitrami lodowatego HBSS + PS. Pod kapturem do hodowli tkankowej użyj 10 mililitrów świeżego HBSS + PS, aby raz umyć każdy gruczoł i umieścić je w pustym, niekomórkowym naczyniu klejącym. Następnie użyj dwóch sterylnych skalpeli, aby drobno zmielić gruczoły na jeden milimetrowy fragment.Prawidłowe rozdrobnienie gruczołów jest niezbędne do skutecznej izolacji komórek. Zbierz ze sobą 20 gruczołów i spróbuj wykonać ten krok w ciągu trzech do pięciu minut, aby uzyskać optymalną żywotność komórek. Używając pipety serologicznej o pojemności 25 mililitrów i 10 mililitrów pożywki dysocjującej, odzyskaj zmieloną tkankę z każdej płytki i przenieś zawiesinę do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, pipetując co najmniej pięć razy w celu rozdrobnienia grudek tkanki.Inkubować tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, ciągłe, energicznie wstrząsając. Następnie wiruj strawioną tkankę w temperaturze pokojowej 400 razy g przez pięć minut. Po odrzuceniu supernatantu użyj trzech mililitrów roztworu hemolitycznego do ponownego zawieszenia tkanki i inkubacji na lodzie przez trzy minuty.Następnie za pomocą 10 mililitrów pożywki myjącej numer jeden umyj komórki. Po odwirowaniu strawionej tkanki i odrzuceniu supernatantu, ponownie zawieś osad tkankowy w 10 mililitrach pożywki płuczącej numer dwa i umieść komórki w 10-centymetrowych szalkach do hodowli tkankowych. Następnie inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.Odzyskaj zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 mililitrów i obracaj probówkę pod ciśnieniem 400 razy g przez pięć minut. Następnie użyj 10 mililitrów roztworu chelatującego wapń, aby ponownie zawiesić osad. Po odwirowaniu i powtórzeniu mycia ponownie zawieś osad w pięciu mililitrach 0,25% trypsyny-EDTA.Po inkubacji próbki dodać pięć mililitrów roztworu dypazy uzupełnionego jednym mikrogramem na mililitr DNazy jeden na wierzch roztworu trypsyny. Aby zdezagregować grudki, użyj jednomililitrowej końcówki pipety, aby pipetować w górę i w dół co najmniej pięć razy i inkubuj próbkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut, wstrząsając co trzy minuty. Dodaj 10 mililitrów pożywki myjącej numer dwa i przefiltruj roztwór przez sitko o średnicy 40 mikrometrów do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów.Następnie odwirować zawiesinę komórek. Aby przeprowadzić oczyszczanie komórek za pomocą FACS, użyj 200 mikrolitrów pożywki myjącej numer jeden, aby ponownie zawiesić każdą granulkę. Następnie dodać 44,5 mikrolitra mieszanki przeciwciał, dokładnie pipetować i inkubować próbkę w ciemności na lodzie przez 30 minut.Rozcieńczyć zawiesinę komórek w 10 mililitrach pożywki płuczącej numer jeden i odwirować próbkę. Ponownie zawiesić osad komórkowy w dwóch mililitrach roztworu sortującego i przefiltrować przez rurkę FACS z sitkiem przed przystąpieniem do separacji populacji komórek FACS. Użyj roztworu myjącego numer jeden, aby przemyć komórki odzyskane z FACS.Po usunięciu supernatantu użyj pożywki hodowlanej 2D do ponownego zawieszenia osadu komórkowego i płytki 500 mikrolitrów na dołek na płytce poddanej działaniu kolagenu. Siedem dni po indukcji doksycykliny pierwotnych komórek LD zakażonych lentiwirusem, dodaj 150 mikrolitrów na studzienkę 05% trypsyny-EDTA do komórek i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Po umyciu i zliczeniu komórek użyj pożywki dla kolonii pamięci, uzupełnionej dwoma mikrogramami na mililitr doksycykliny, aby je ponownie zawiesić.Następnie wysiewaj 1 000 komórek na dołek w 24 dołkach o bardzo niskim nasadce do hodowli kolonii przypominających maskę YAP. Aby subkulturować maski, zbierz każdą próbkę i dodaj 10 do jednej objętości lodowatego HBSS, a następnie inkubuj próbki na lodzie przez godzinę w celu rozpuszczenia macierzy błony podstawnej. Po odwirowaniu kolonii użyj lodowatego HBSS, aby trzykrotnie umyć komórki.Następnie dodaj 05% trypsyny-EDTA do kolonii i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 10 minut. Przepuść kolonie przez końcówkę pipety P1000 10 razy, aby uzyskać zawiesinę pojedynczej komórki. Następnie policz i ponownie zasiew komórki w pożywce dla kolonii sutkowej bez doksycykliny w 24-dołkowych płytkach o bardzo niskim przyłączeniu o gęstości kolonogennej 1 000 komórek na dołek.Przed trzecim pasażem przenieś y maskuj kolonie w warunkach hodowli organoidów, odzyskując kolonie z pożywki dla kolonii sutkowej i użyj 100% matrycy błony podstawnej zredukowanej przez 100% czynnik wzrostu, aby je ponownie zawiesić. Po inkubacji, gdy matryca błony podstawnej zestaliła się, nałożyć na żele 500 mikrolitrów pożywki z organoidu sutkowego. Pasżować kultury, zbierając każdą próbkę organoidu i inkubując je w nadmiarze objętości HBSS na lodzie przez jedną godzinę.Następnie użyj lodowatego HBSS, aby trzykrotnie umyć organoidy. Trypsynizuj organoidy, jak pokazano wcześniej w tym filmie, i ponownie zasiej zawiesiny pojedynczych komórek w kropli 100% macierzy błony podstawnej zmniejszonej przez czynnik wzrostu, a następnie użyj 500 mikrolitrów pożywki z organoidów sutkowych do nałożenia żeli. Po umyciu strawionej tkanki trzustki myszy zgodnie z protokołem tekstowym, użyj sześciu mililitrów pożywki do odzyskiwania ziarniaków, aby ostrożnie zawiesić strawioną tkankę i podzielić ją między dwie studzienki sześciodołkowej płytki do hodowli tkankowej.Pod mikroskopem stereoskopowym dokładnie oceń jakość izolacji groniastej i usuń wszelkie duże grudki tkanki, które ostatecznie się pojawią. Aby wysiać pierwotną acinę trzustkową, po inkubacji klastrów przez dwie godziny w celu odzyskania komórek, należy zebrać zawiesinę komórek groniastych w stożkowej probówce i odwirować próbki w temperaturze 100 razy g i 18 stopni Celsjusza przez pięć minut. Po ponownym zaparowaniu acini w pożywce do hodowli ziarniaków rozcieńczyć zawiesinę równą objętością zneutralizowanego kolagenu z ogona szczura w jednym roztworze, utrzymując probówki na lodzie.Dokładnie i szybko wymieszaj i umieść zawiesinę komórkową w 16 dołkach na wierzchu poduszki kolagenowej. Dla optymalnego wysiewu acini trzustkowych ważne jest, aby przed posiewem trzymać wszystkie probówki w lodzie i postępować szybko, ale jednocześnie ostrożne pipetowanie, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza, jest niezbędne do stworzenia jednorodnej macierzy kolagenowej. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę, aby mógł powstać hydrożel.Następnie, aby indukować organoidy trzustkowe, nałóż hydrożele kolagenowe na 500 mikrolitrów pożywki do hodowli ziarniaków uzupełnionych doksycykliną. Aby przeprowadzić subhodowlę organoidów, wyrzuć pożywkę hodowlaną, ostrożnie wyekstrahuj hydrożele i przenieś je do stożkowych probówek zawierających cztery mililitry kolagenazy I, roztworu B, a następnie inkubuj probówki w temperaturze 37 stopni Celsjusza z energicznym wstrząsaniem przez 30 minut przed odwirowaniem komórek i usunięciem supernatantu. Po próbie pupsynizacji komórek i usunięciu supernatantu PBS, użyj lodowatej matrycy błony podstawnej, aby ponownie zawiesić osad komórkowy i zasiać zawiesinę w bardzo niskich płytkach mocujących.Pozwól, aby hydrożel macierzy błony podstawnej zestalił się, inkubując płytki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 40 minut, a następnie pokryj podłożem organoidowym trzustki. yDucts będą rosły jako torbiele podobne do organoidów w ciągu siedmiu do 10 dni. Staranne bramkowanie pierwotnych komórek nabłonka LD sutka w trzech pokazanych tutaj subpopulacjach jest niezbędne do wyizolowania czystego preparatu komórek LD, które są w pełni zróżnicowane i całkowicie zatrzymane w momencie wysiewu w warunkach tworzenia kolonii gruczołów sutkowych.I odwrotnie, po indukcji ekspresji egzogennego YAP, komórki LD zaczynają się namnażać, tworząc łatwo rozpoznawalne gęste kolonie nabłonkowe w 5% kulturach zawiesinowych macierzy błony podstawnej. W warunkach hodowli organoidów macierzy błony podstawnej przeprogramowane komórki luminalne samoorganizują się w złożone struktury podobne do organoidów, które rozwijają się wokół wielu lumenów i samoodnawiają się nawet przy braku doksycykliny. W ciągu pięciu do siedmiu dni hodowli w hydrożelu 3D na bazie kolagenu I w obecności doksycykliny, zróżnicowane acini trzustkowe łatwo przekształcają się w przewody przypominające klastry lub yDucty złożone z cienkiej monowarstwy komórek nabłonkowych, które namnażają się wokół rozszerzającej się jamy centralnej.Wydajność przeprogramowania można łatwo zmierzyć, oceniając liczbę klastrów przypominających kanały w stosunku do całkowitej liczby zasianych acini. Przeprogramowane yDucts mogą być następnie pasażowane na poziomie pojedynczej komórki do warunków hodowli organoidów opartych na matrigelu, wykazując niezwykłą zdolność do samoodnawiania się nawet przy braku endogennej ekspresji YAP. Mamy szczegółowo opisane dwie procedury.Jeden z nich pozwolił na przeprogramowanie oczyszczonych komórek FACS za pomocą wektorów lentiwirusowych, a drugi pozwolił uniknąć infekcji wirusowej i wykorzystał transgeniczną ekspresję YAP. Podczas próby przeprogramowania komórek sutka ważne jest, aby unikać stosowania nadmiernego miana wirusa, ponieważ może to być szkodliwe dla wydajności przeprogramowywania. W pełni transgeniczna strategia jest odpowiednia dla pierwotnych acini trzustkowych, ponieważ są one prawie niepodatne na infekcję lentiwirusową.Oferuje również tę samą zaletę, co wektory lentiwirusowe zależne od doksycykliny do kontroli typu ekspresji genów. Oprócz pokazanych tutaj przykładów, ten protokół przeprogramowania YAP okazał się skuteczny w przekształcaniu zróżnicowanych neuronów w same neurony proliferacyjne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić przeprogramowanie zależne od YAP, aby przekształcić zróżnicowane typy komórek z różnych dorosłych tkanek w odpowiadające im tkankowo specyficzne komórki macierzyste.Procedura ta rozszerza obecne strategie przeprogramowywania, zapewniając środki do generowania somatycznych komórek macierzystych, które mogą mieć znaczenie dla medycyny regeneracyjnej w badaniu somatycznej macierzystej i ekspansji somatycznych komórek macierzystych in vitro. Należy wziąć pod uwagę, że obchodzenie się z preparatem lentiwirusowym może być bardzo niebezpieczne i zgodnie z poziomem bezpieczeństwa podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować dwa środki.

de-novo-generation-of-somatic-stem-cells-by-yaptaz

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę generowania indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukowalnego lentiwirusa wykazującego ekspresję Oct4, Sox2, c-Myc oraz Klf4.

Generowanie komórek iPS z MEF poprzez wymuszoną ekspresję Sox-2, Oct-4, c-Myc i Klf4

Opisano metodę generowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) poprzez transdukcję retrowirusową prowadzącą do ektopowej ekspresji czynników OCT4, SOX2, KLF4 i MYC. Omówiono również praktyczny sposób identyfikacji kolonii ludzkich iPSC na podstawie ekspresji GFP.

Reprogramowanie ludzkich komórek somatycznych w indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) przy użyciu wektora retrowirusowego z GFP

W niniejszym materiale przedstawiamy prosty i skuteczny protokół generowania ludzkich iPSC z 3-4 ml krwi obwodowej przy użyciu pojedynczego lentiwirusowego wektora reprogramującego. Reprogramowanie łatwo dostępnych komórek krwi daje nadzieję na przyspieszenie wykorzystania technologii iPSC poprzez udostępnienie jej szerszemu gronu badaczy.

Generowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z krwi obwodowej przy użyciu wektora lentiwirusowego STEMCCA

To badanie pokazuje przeprogramowanie komórek somatycznych w kierunku pluripotencji in vivo bez generowania potworniaków. Zastosowaliśmy hydrodynamiczne wstrzyknięcie do żyły ogonowej plazmidowego DNA kodującego czynniki Yamanka, aby indukować przeprogramowanie in vivo dorosłych hepatocytów na komórki o zwiększonej pluripotencji.

In vivo (in vivo) Przeprogramowanie dorosłych komórek somatycznych na pluripotencję przez nadekspresję czynników Yamanaka

Indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSC) stanowią źródło tkanek specyficznych dla pacjenta do zastosowań klinicznych i badań podstawowych. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół przeprogramowania ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMNC) uzyskanych z zamrożonych kożuchów w wolne od wirusa iPSC przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych z zamrożonych płaszczy kożuchowych przy użyciu nieintegrujących plazmidów episomalnych

Ten protokół opisuje szczegółową metodę efektywnego generowania bezintegracyjnych iPSC z ludzkich dorosłych komórek krwi obwodowej. Za pomocą czterech wektorów episomalnych opartych na oriP/EBNA do ekspresji czynników przeprogramowujących, KLF4, MYC, BCL-XL lub OCT4 i SOX2, z 1 ml krwi obwodowej można uzyskać tysiące kolonii iPSC.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych bez integracji z ludzkich komórek jednojądrzastych krwi obwodowej przy użyciu wektorów episomalnych

Pierwotne komórki rozrodcze (PGC) są powszechnymi prekursorami zarówno plemników, jak i jaj. Ludzkie embrionalne PGC są określane z pluripotencjalnych komórek epiblastów poprzez interakcje cytokin. Tutaj opisujemy 13-dniowy protokół indukcji komórek ludzkich transkryptomalnie przypominających PGC na powierzchni ciał zarodkowych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją.

Wytwarzanie ludzkich pierwotnych komórek rozrodczych podobnych do komórek rozrodczych na powierzchni ciał embrionalnych z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych pluripotencją

Ten protokół został stworzony jako sposób na produkcję organoidów mózgowych w uproszczony, tani sposób, bez egzogennych czynników wzrostu lub macierzy błony podstawnej, przy jednoczesnym zachowaniu różnorodności typów komórek mózgowych i wielu cech organizacji komórkowej.

Statyczna, samosterowna metoda generowania organoidów mózgowych z ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Prezentujemy tutaj metodę, która łączy użycie chemicznego usuwania epigenetycznego z sygnałami związanymi z mechanosensoryką, aby efektywnie generować komórki pluripotencjalne ssaków, bez potrzeby transfekcji genów lub wektorów retrowirusowych. Strategia ta jest zatem obiecująca dla medycyny translacyjnej i stanowi znaczący postęp w technologii organoidów komórek macierzystych.

Dwuetapowa strategia, która łączy modyfikację epigenetyczną i wskazówki biomechaniczne w celu wygenerowania komórek pluripotencjalnych ssaków

Ten artykuł opisuje procedurę wytwarzania iTenocytów poprzez generowanie mezenchymalnych komórek zrębowych pochodzących z iPSC z połączoną nadekspresją twardówki przy użyciu wektora lentiwirusowego i jednoosiowego rozciągania za pomocą bioreaktora 2D.

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych iTenocytów pochodzących z komórek macierzystych poprzez połączoną nadekspresję twardówki i jednoosiowe napięcie 2D

Poznaj metodę reprogramowania komórek zróżnicowanych w komórki macierzyste za pomocą czynnika transkrypcyjnego YAP. Technika ta umożliwia generowanie komórek progenitorowych z gruczołów mlekowych myszy, z zastosowaniem w medycynie regeneracyjnej i badaniach plastyczności komórkowej.

De Novo Generowanie somatycznych komórek macierzystych metodą YAP/TAZ

Przeglądaj więcej filmów