Strategie sortowania komórek aktywowanych magnetycznie w celu izolacji i oczyszczenia mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z płynu maziowego z modelu królika

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w protokole sortowania w dziedzinie komórek macierzystych, zapewniając procedurę oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych bezpośrednio z płynu maziowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że ustaliliśmy prosty i ekonomiczny protokół izolacji i oczyszczania MAC z mazi stawowej królika. Generalnie w badaniach, ze względu na tę metodę, dokładamy wszelkich starań, ponieważ pluplowanie populacji komórek jest zależne od wytworzenia zawiesiny pojedynczej komórki.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że tylko metoda sortowania komórek aktywowana magnetycznie jest obecnie zatwierdzona przez FDA do zastosowań klinicznych. Rozpocznij tę procedurę od znieczulenia zwierzęcego zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby wykonać pobranie mazi stawowej z kolana królika, wybierz obszar o wymiarach około pięć na pięć centymetrów wokół kolana.

Ogol sierść królika z całego tego obszaru za pomocą bezpiecznej golarki elektrycznej. Na przemian trzykrotnie zdezynfekuj miejsce zabiegu roztworem jodu powidonu i 75% etanolem. Następnie nałóż sterylne zasłony po dokładnym wyschnięciu obszaru.

Za pomocą sterylnej strzykawki podskórnej wstrzyknąć od jednego do dwóch mililitrów izotonicznego roztworu soli fizjologicznej do jamy stawu kolanowego z bocznej przestrzeni stawowej. Przesuń kolano trzy do czterech razy, a następnie odessaj cały płyn maziowy w temperaturze pokojowej. Przefiltruj płyn maziowy przez sitko z nylonu o grubości 40 mikronów, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia w ciągu czterech godzin.

Aby wyhodować królicze SF-MSC, zbierz przefiltrowany płyn do 50-mililitrowych probówek wirówkowych i odwiruj z prędkością 1 500 obr./min przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Po odwirowaniu odrzucić supernatant i przemyć osad PBS. Po ponownym wymieszaniu osadu z kompletną pożywką hodowlaną, umieść pożywkę w 100-mililitrowych naczyniach.

Inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnej atmosferze zawierającej 5% dwutlenku węgla. Po 48 godzinach uzupełnij naczynia świeżą pożywką, aby usunąć wszelkie nieprzylegające komórki. Wymieniaj pożywkę dwa razy w tygodniu przez dwa tygodnie jako przejście zero.

Po 14 dniach od początkowego posiewu w szalkach hodowlanych powinno powstać wiele kolonii. Wybierz kolonie o średnicy większej niż dwa milimetry. Zaznacz miejsce, w którym znajdują się wybrane kolonie, śledząc ich obwód na dnie naczynia.

Wyrzuć kolonie o szerokości mniejszej niż dwa milimetry za pomocą skrobaków do komórek. Strawij wybrane kolonie za pomocą około pięciu mikrolitrów 0,25% trypsyny za pomocą cylindra do klonowania i przenieś kolonie do nowego naczynia w celu przejścia. Gdy komórki osiągną około 80% zbieżności, odessać pożywkę.

Następnie dodaj od jednego do dwóch mililitrów 0,25% trypsyny EDTA do każdego dania. Inkubuj naczynia przez dwie do trzech minut, aby umożliwić oderwanie komórek. Po odłączeniu komórek dodaj równą ilość pożywki hodowlanej, aby nieaktywna trypsyna.

Przepuść zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 40 mikronów i zbierz filtrat do 15-mililitrowej probówki. Następnie wiruj komórki w temperaturze 600 razy G przez dziesięć minut w temperaturze pokojowej. Ponownie zawieś osad komórki w buforze uruchomionym MACS.

Aby wykonać etykietowanie magnetyczne, określ liczbę komórek za pomocą hemocytometru. Odwirować zawiesinę komórkową w temperaturze 300 razy G przez dziesięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po całkowitym odessaniu supernatantu dodać 80 mikrolitrów buforu do reprodukcji na dziesięć milionów komórek.

Na dziesięć milionów komórek dodaj 20 mikrolitrów mikrogranulek sprzężonych z monoklonalnym przeciwciałem anty-króliczym CD90. Równomiernie wymieszaj kulki magnetyczne i komórki w probówkach. Następnie inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez 15 minut w ciemności.

Dodaj jeden mililitr buforu na dziesięć milionów komórek do probówki, a następnie odwiruj w temperaturze 300 razy G przez dziesięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby umyć komórki. Po odwirowaniu odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 500 mikrolitrach buforu na dziesięć milionów komórek.

Umieść kolumnę ze skrzydłami kolumny do przodu, w polu magnetycznym separatora magnetycznego. Przepłukać kolumnę separatora magnetycznego 500 mikrolitrami buforu na dziesięć milionów komórek. Przenieść zawiesinę jednokomórkową do kolumny.

Pozwól ujemnym komórkom przejść przez pole magnetyczne, aby odrzucić te nieoznakowane komórki. Przemyć kolumnę jeden do dwóch razy 500 mikrolitrami buforu na dziesięć milionów komórek i odrzucić przepływ. Przenieść kolumnę do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Dodaj jeden mililitr buforu na dziesięć milionów komórek do kolumny. Następnie natychmiast wepchnij tłok do kolumny, aby wypłukać magnetycznie oznaczone komórki. Powtórz powyższą procedurę z drugą kolumną separatora magnetycznego, aby zwiększyć czystość komórek CD90-dodatnich, które mogą wzbogacić eluowaną frakcję.

Po odwirowaniu zawiesiny komórek w temperaturze 300 razy G przez dziesięć minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad z pożywką hodowlaną. Zaszczepij komórki w 100-mililitrowych naczyniach po sortowaniu komórek aktywowanym magnetycznie. Inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza w wilgotnym inkubatorze komórkowym z 5% dwutlenkiem węgla.

Gdy osiągnie się 80 do 90% zbiegu kultury pierwotnej, po około siedmiu do dziesięciu dniach, trawić przylegające komórki za pomocą 0,25% trypsyny EDTA i pasować je w rozcieńczeniu jeden do dwóch, aby uzyskać pasaż drugi. Użyj tej samej metody, aby przekazać komórki do pasażu trzeciego, które można wykorzystać do testów in vitro. Pokazano tutaj morfologię jednowarstwowych hodowli królików SF-MSC przed i po MACS, pod odwróconym mikroskopem.

Przed sortowaniem przylegające populacje komórek mazi maziowej królika wykazują niejednorodność. Zawierają różne typy i rozmiary komórek, takie jak morfologia owalna, długa, krótka i gwiaździsta. Główną morfologią przejścia drugiego i szóstego jest morfologia wrzecionowata.

Po MACS z CD90 populacje komórek wykazują jednorodną morfologię. Wraz z subkulturą wzrasta liczba komórek. Analiza cytometrii przepływowej wykazała, że królicze komórki SF-MSC były dodatnie dla markerów MSC CD44 i CD105.

Ujemny dla markera komórek śródbłonka CD34 i markera komórek krwiotwórczych CD45. Wyniki pokazały, że przed MACS populacja królików SF-MSC składała się w około 40% z komórek MSC. Po MACS wzbogacona populacja zawierała więcej niż 99% komórek MSC.

Pokazano tutaj analizę cytometrii przepływowej markera CD90-dodatniego przed i po sortowaniu MAC. Barwienie czerwienią alizaryny wykazało, że zmineralizowane guzki tworzyły się pod wpływem indukcji osteogennej przez trzy tygodnie. Po trzech tygodniach indukcji adipogennej wykryto nagromadzenie wakuoli bogatych w lipidy za pomocą wewnątrzkomórkowego barwienia olejem czerwonym O.

Po tygodniach indukcji chondrogennej w drzewie, osad komórkowy poddano histologicznemu testowi z barwieniem błękitem toluidyny. Dodatni kwaśny proteoglikan charakteryzował komórki podobne do chondrocytów. Po trzech tygodniach indukcji wykryto względną ekspresję mRNA markera osteoblastu, markera adipogennego i markera chondrogennego.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch do czterech godzin. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć prostą izolację i oczyszczanie mezenchymalnych komórek macierzystych z płynu maziowego białego królika z Nowej Zelandii. Próbując tej procedury, należy pamiętać, aby wybrać te kolonie, które mają średnicę większą niż dwa mililitry.

Wyprodukuj również zawiesinę pojedynczej komórki przed sortowaniem immunomagnetycznym, ponieważ niechciane komórki przyczepione do oznakowanej komórki pozostaną na kulce magnetycznej. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak sortowanie komórek aktywowane fluorescencją, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące bezpieczeństwa i skuteczności oczyszczania mezenchymalnych komórek macierzystych. Po jej opracowaniu, technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się regeneracją chrząstki stawowej do zbadania idealnych komórek CD w naprawie chrząstki stawowej.

Nie zapominaj, że operacje zostały wykonane na łukowym stole chłodzącym, a środki ostrożności, takie jak rękawice, powinny być zawsze zachowane podczas wykonywania tej procedury. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię uszkodzeń chrząstki stawowej, ponieważ MASC pochodzące z mazi stawowej są obiecującymi kandydatami do regeneracji chrząstki stawowej.