Zastosowanie przeciwciał anty-fosfo-girdyny do wizualizacji komórek kępek jelitowych w swobodnie pływających kriosekcjach jejunum myszy

Ogólnym celem tej procedury barwienia jest wizualizacja komórek kępek w kriosekcjach jelita czczego myszy. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie gastroenterologii, takie jak to, w jaki sposób zachodzi proliferacja komórek kępkowych w jelitach ssaków podczas infekcji pasożytniczej. Główną zaletą tej techniki jest to, że badacze z ograniczonym doświadczeniem histrologicznym mogą uzyskać wysokiej jakości obrazy komórek kępkowych.

Zacznij od odsłonięcia narządów miednicy świeżo utrwalonego w formalinie zwłok myszy. Odetnij koniec odbytnicy od odbytu i oddziel jelita od ciała, przecinając krezkę. Aby wyizolować jelito czcze, przetnij jelita cztery centymetry od strony odbytu antrum żołądka i wyrzuć odbytową połowę pozostałego jelita cienkiego.

Przytnij jelito czcze na pół, aby ułatwić procedurę spłukiwania. Załaduj 20 mililitrów 10% buforowanego neutralnego roztworu formaliny do 20-mililitrowej strzykawki i przymocuj prostą igłę o rozmiarze 18 z usuniętym skosem. Następnie wstrzyknij 10% buforowany neutralny roztwór formaliny z jednego końca przyciętego jelita czczego, aby wypłukać zawartość jelita i naprawić powierzchnię światła jelita.

Umyj światło jelita, wstrzykując PBS. Następnie przepłukać płynnym roztworem żelatyny, aby zastąpić PBS. Zamknij jeden koniec przyciętego jelita czczego przez podwiązanie szwów, używając nylonowego szwu 6-0.

Napełnij jelito czcze płynną żelatyną i zamknij przeciwległy koniec przez podwiązanie szwów. Następnie zawiąż cztery węzły szwów na całej długości jelita czczego. Namocz tkanki w 50 mililitrach 15% sacharozy w 10% buforowanym neutralnym roztworze formaliny przez noc, w temperaturze 4 stopni Celsjusza.

Następnego dnia przetnij jelito czcze w węzłach szwów, aby uzyskać trzy kawałki jelita czczego przypominające kiełbasę z podwiązanymi obydwoma końcami. Wyrównaj kawałki w krioformie, a następnie przykryj masą do zatapiania. Zamroź kriomold w izopentanie chłodzonym ciekłym azotem.

Aby przygotować skrawki jelita czczego, zacznij od ustawienia zarówno temperatury komory kriostatu, jak i temperatury obiektu na minus 22 stopnie Celsjusza. Umieść zamrożony blok tkanki w kriofordzie w komorze kriostatu na co najmniej 15 minut. Po 15 minutach przetnij blok na pół żyletką, aby odsłonić poprzeczny przekrój jelita czczego.

Zamontuj połowę bloku na adapterze do kriostatu. Pokrój wypełnione żelatyną jelito czcze na sekcje o grubości 30 mikronów. Użyj zamrożonych kleszczy, aby delikatnie przenieść skrawki do 35-milimetrowego naczynia hodowlanego zawierającego 3 mililitry PBS.

Po trzykrotnym umyciu skrawków przez pięć minut każda, z 3 mililitrami PBS-T, dodać 3 mililitry świeżo przygotowanego roztworu do pobierania antygenu do naczynia zawierającego swobodnie pływające sekcje. Następnie zamknij pokrywkę, uszczelnij szczelinę między naczyniem a pokrywką paskiem taśmy winylowej i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza w inkubatorze hybrydyzacyjnym przez trzy godziny, bez wstrząsania. Po barwieniu immunologicznym przenieś naczynie z wybarwionymi skrawkami w PBS do mikroskopu stereoskopowego.

Umieść 200 mikrolitrów PBS w kropli na środku szkiełka z białego szkła kodowanego przez MAS. Następnie za pomocą końcówki pipety P200 przenieś jeden fragment jelita czczego z naczynia do kropli. Po wyregulowaniu wyrównania sekcji zassać wszystkie pozostałe PBS otaczające sekcję.

Dodaj 20 mikrolitrów wodnego podłoża montażowego i umieść szkiełko nakrywkowe na wierzchu podłoża. Natychmiast uszczelnij krawędzie szkiełek nakrywkowych środkami montażowymi na bazie ksylenu i pozostaw do wyschnięcia na dwie do trzech godzin przed rozpoczęciem mikroskopii konfokalnej. Żelatynowe wypełnienie jelita czczego zachowuje okrągły kształt krążka i utrzymuje pionowe ułożenie kosmków.

W przypadku braku wypełnienia żelatynowego odcinki jelita czczego mają tendencję do załamywania się, co pozwala kosmkom odchylać się do tyłu. pY1798 w powtarzalny sposób wyznacza całe komórki kępki, w tym błonę, cytoplazmę somy w kształcie szpuli i silnie wybarwioną końcówkę luminalną, gdzie silna kondensacja sygnału odpowiada wystającej kępce komórki kępki. Falloidyna ma wysokie powinowactwo do aktyny nitkowatej, która jest obecna w mikrokosmkach tworzących granicę szczoteczki jelitowej.

Faloidyna powtarzalnie i wyraźnie zaznacza pogrubioną granicę pędzla, która odpowiada masie korzonków wystających z kępki. Konsekwentna kolokalizacja sygnałów pY1798 z wyraźnie pogrubioną, falloidynowo-dodatnią granicą szczoteczki pokazuje, że protokół ten z powodzeniem identyfikuje komórki kępkowe, niezależnie od tego, czy znajdują się one na kosmku, czy w krypcie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Połączenie żelatyny o niskiej emisji, swobodnie unoszących się kriosekcji i niskotemperaturowego pobierania antygenu może być stosowane do barwienia immunologicznego innych tkanek projektowych.