Name: Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Poznaj metodę kwantyfikacji wzrostu wewnątrzkomórkowego Leishmania w makrofagach mysich. Ta szybka i niezawodna technika pozwala ocenić zjadliwość pasożytów oraz czynniki gospodarz-patogen w badaniach nad leiszmaniozą.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant National Institutes of Health RO1 AI067979 dla NWA. 
YK jest stypendystką Howard Hughes Medical Institute/University of Maryland College Park.

Wszystkie procedury eksperymentalne zostały przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych przez National Institutes of Health i zostały zatwierdzone przez IACUC Uniwersytetu Maryland. Wszystkie czynności opisane w sekcjach od 1 do 4 powinny być wykonywane w sposób aseptyczny w biologicznych komorach laminarnych. Należy stosować środki ochrony osobistej i zachować ostrożność podczas obchodzenia się z żywymi pasożytami Leishmania na wszystkich etapach eksperymentów.
1. Izolacja i różnicowanie makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego (BMM)8,30,31
<ol>
	<li>Dzień 0: Złożenie w ofierze 4 - 6-tygodniowej samicy myszy C57BL/6 lub BALB/c w komorze CO2 i potwierdzenie zgonu w wyniku zwichnięcia szyjki macicy. Zapewnij sterylizację nożyczek i kleszczy, trzymając je namoczone w 70% etanolu. Spryskaj rękawice 70% etanolem, aby umożliwić sterylną obsługę podczas całego procesu izolacji komórek szpiku kostnego.</li>
	<li>Przymocuj ofiarowaną mysz do deski preparucyjnej, przypinając jej przednie kończyny i zdezynfekuj, obficie spryskując 70% etanolem.</li>
	<li>Wykonaj małe nacięcie (około 1 cm) nożyczkami w pobliżu stawu biodrowego. Ostrożnie włóż nożyczki pod skórę, aby oddzielić mięsień leżący pod spodem i przeciąć skórę dookoła stawu biodrowego. 
	UWAGA: Deska preparcyjna może być obracana, aby umożliwić lepszy dostęp do stawu biodrowego.</li>
	<li>Ostrożnie odizoluj skórę od nogi, pociągając w kierunku kostki i usuń. Odetnij stopę w kostce, bardzo ostrożnie, aby przeciąć na lub poniżej stawu skokowego, aby pozostawić kość piszczelową w pełni nienaruszoną. 
	UWAGA: Kość strzałkowa na tym etapie jest luźno przymocowana i można ją łatwo oddzielić za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Ręcznie zlokalizuj staw biodrowy, manipulując kością udową, aby określić punkt obrotu. Ostrożnie użyj nożyczek, aby odciąć nogę powyżej stawu biodrowego, aby pozostawić nienaruszoną bliższą głowę kości udowej.</li>
	<li>Usuń jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej z nogi za pomocą nożyczek. Usuń pozostałą skórę z kostki i nadmiar materiału kostnego powyżej stawu biodrowego.</li>
	<li>Umieść oczyszczone kości nóg w sterylnym RPMI uzupełnionym penicyliną/streptomycyną (1% stężenie końcowe) na szalce Petriego na lodzie.</li>
	<li>Powtórz kroki od 1.4 do 1.6, aby odizolować kość piszczelową i kość udową od drugiej tylnej nogi.</li>
	<li>Usuń wszelkie pozostałe mięśnie i tkankę łączną z kości moczących się w RPMI za pomocą wysterylizowanych kleszczy i sterylnego ostrza #10.</li>
	<li>Umieść kości na pokrywie szalki Petriego. Ostrożnie przetnij kość piszczelową ostrzem bezpośrednio nad stawem skokowym, aby uzyskać dostęp do szpiku. Usuń kość piszczelową z reszty nogi, przecinając ją bezpośrednio pod stawem kolanowym.</li>
	<li>Pobrać 10 ml sterylnego RPMI uzupełnionego penicyliną/streptomycyną (1% stężenia końcowego) do strzykawki o pojemności 10 ml i przymocować igłę 25G.</li>
	<li>Trzymaj kość piszczelową mocno kleszczami, pionowo nad stożkową rurką o pojemności 50 ml na lodzie. Za pomocą strzykawki delikatnie wstrzyknąć około 5 ml RPMI w koniec kości, aby wypłukać szpik kostny z drugiego końca do stożkowej rurki. Przepłucz szpik kostny łącznie 10 ml RPMI, aż kość stanie się biała. 
	UWAGA: Po dokładnym spłukaniu kość powinna zmienić kolor na biały. Jeśli nie, kontynuuj płukanie, aby usunąć szpik. Dystalny koniec kości piszczelowej może wymagać przycięcia ostrza, jeśli jest zbyt wąski, aby wprowadzić igłę.</li>
	<li>Przeciąć kość udową bezpośrednio nad stawem kolanowym i bezpośrednio poniżej stawu biodrowego, aby odsłonić oba końce kości w celu uzyskania dostępu do szpiku. Przepłucz szpik kostny z kości udowej łącznie 10 ml RPMI w taki sam sposób jak kość piszczelowa.</li>
	<li>Powtórzyć kroki czyszczenia i płukania od 1,6 do 1,13 z pozostałymi kośćmi i zebrać przepłukane komórki szpiku kostnego w pojedynczej stożkowej probówce o pojemności 50 ml 
	UWAGA: Jeśli kość pęknie w dowolnym momencie podczas sekcji przed zaczerwienieniem kości, nie używaj szpiku z tej kości.</li>
	<li>Odwirować stożkową probówkę używaną do zbierania szpiku kostnego wypłukanego ze wszystkich czterech kości przez 10 minut w temperaturze 4 °C przy 300 x g.</li>
	<li>Umieścić 60 ml sterylnej pożywki BMM (RPMI o końcowym stężeniu 20% FBS, 1% penicyliny/streptomycyny, 1,2 mM Nas-pirogronianu, 25 μg/ml ludzkiego M-CSF) w 175 cm 2 kolbie do hodowli komórkowych z nasadką filtrującą.</li>
	<li>Po odwirowaniu odrzucić sklarowany osad i ponownie zawiesić osad komórkowy poprzez delikatne pipetowanie w górę i w dół, używając 5 ml pożywki BMM z kolby.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórek do kolby hodowlanej i dwukrotnie przepłukać stożkową probówkę pożywką BMM z kolby hodowlanej, aby zapewnić maksymalny odzysk komórek. Upewnij się, że zawiesina komórek jest dokładnie wymieszana z pożywką i rozprowadzić 30 ml z początkowej kolbydo hodowli komórkowych o długości 175 cm 2 do drugiej kolby do hodowli komórkowych o średnicy 175 cm z nasadką filtrującą.</li>
	<li>Inkubować obie kolby zawierające 30 ml zawiesiny komórek każda przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 w celu oddzielenia wszelkich zanieczyszczających fibroblastów, rezydujących makrofagów i innych przylegających komórek.</li>
	<li>DZIEŃ 1: Przenieść supernatant zawierający niezróżnicowane komórki szpiku kostnego z kolb na polistyrenowe płytki Petriego o wymiarach 100 mm x 15 mm niepoddanych działaniu TC w ilości około 10 ml na szalkę i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Wyrzucić kolby.</li>
	<li>DZIEŃ 3 lub 4: Dodać dodatkowe 5 ml pożywki BMM (wstępnie podgrzanej do 37 °C) do każdej płytki Petriego i kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Poszycie BMM na szkiełkach nakrywkowych na infekcję (DZIEŃ 7 lub 8)
<ol>
	<li>Przygotować 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych, umieszczając cztery (4) sterylne szkiełka nakrywkowe ze szkła o średnicy 12 mm (autoklawowane i przechowywane w zamkniętym szklanym pojemniku) na dnie każdej pustej studzienki. 
	UWAGA: Podnieś każde sterylne szkiełko nakrywkowe o średnicy 12 mm za pomocą końcówki zasysającej zamontowanej na przewodzie próżniowym. Umieść szkiełka nakrywkowe w studzienkach bez zachodzenia na siebie, zwalniając w żądanej pozycji, ściskając rurkę, aby przerwać próżnię.</li>
	<li>Odessać pożywkę (i wszelkie nieprzylegające komórki) z szalek Petriego pokrytych przylegającymi makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego i delikatnie przepłukać przylegające komórki 2x sterylnym roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanem Dulbecco bez chlorku wapnia i magnezu (PBS -/-) wstępnie podgrzanym do 37 °C.</li>
	<li>Dodawać kroplami, 5 ml sterylnego 1x PBS -/- o końcowym stężeniu 1 mM EDTA do każdej szalki Petriego i inkubować przez 5 minut w temperaturze 37 °C w celu odłączenia przylegających BMM. Sprawdzić, czy komórki są odłączone za pomocą mikroskopu.</li>
	<li>Zbierz wszystkie odłączone komórki zawieszone w 1x PBS -/- uzupełnione 1 mM EDTA w stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Opłucz każde naczynie 2x 5 ml PBS -/- i dodaj do puli zawiesiny komórkowej. 
	UWAGA: Zawiesinę komórkową można rozcieńczyć dodatkowym PBS -/- w celu ochrony makrofagów przed toksycznością EDTA podczas procesu pobierania.</li>
	<li>Wirować przy 300 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić makrofagi w pożywce o objętości 5 - 10 ml BMM przez pipetowanie. Umieść zawieszone komórki na lodzie, aby zapobiec przyczepianiu się do rurek i zbrylaniu.</li>
	<li>Policz żywe komórki, korzystając z wykluczenia błękitu trypanowego w hemocytometrze. 
	UWAGA: Aby policzyć komórki BMM zawieszone w pożywce o pojemności 5 ml, mieszanina rozcieńczania 25 μl zawiesiny komórek w 445 μl PBS -/- i 30 μl 0,4% roztworu błękitu trypanowego zazwyczaj umożliwia łatwe oznaczanie ilościowe w hemocytometrze (biorąc pod uwagę 20-krotny współczynnik rozcieńczenia dla końcowych obliczeń). Policz tylko komórki, które nie zostały wybarwione błękitem trypanowym (komórki żywotne). Objętość zawiesiny komórek może ulec zmianie, jeśli mieszanina ta jest zbyt stężona lub rozcieńczona. Ogólnie rzecz biorąc, wydajność BMM na preparat waha się od 2 x 107 do 5 x 107 komórek z jednej myszy.</li>
	<li>Przygotować zawiesinę komórek w pożywce BMM o pożądanym stężeniu galwanicznym (5 x 105/ml) i zdyspergować zawiesinę na 6 płytkach dołkowych w pożywce po 2 ml na studzienkę, tak aby każda studzienka otrzymała 1 x 106 makrofagów. 
	UWAGA: Jest to krytyczny krok, który zapewnia, że każda studzienka otrzymuje odpowiednią liczbę makrofagów, aby równomiernie pokryć szkiełka nakrywkowe. Sprawdź, czy szkiełka nakrywkowe w studzienkach nie zachodzą na siebie ani nie unoszą się w podłożu. Jeśli tak, delikatnie wyreguluj za pomocą sterylnej końcówki do pipety.</li>
	<li>Inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
3. Oczyszczanie z form zakaźnych L. amazonensis
UWAGA: Przygotuj Leishmania na infekcje - oczyść metacykliczne promastigoty ze stacjonarnych kultur promastigoty8,13, lub rozróżnij promastigoty w kulturze do formy amastigotycznej, używając standardowego protokołu różnicowania aksenicznego L. amazonensis6,8.
<ol>
	<li>Oczyszczanie metacyklicznych promastigotów Leishmania przy użyciu mediów o gradimencie gęstości (Materiały)33
	<ol>
		<li>Przygotować 40% roztwór podstawowy pożywek o gradiencie gęstości w sterylnej wodzie wolnej od endotoksyn.</li>
		<li>Rozcieńczyć roztwór gradientu gęstości w 10x pożywce M199 (bez surowicy), aby przygotować 10% stężenie w pożywce M199.</li>
		<li>Przefiltruj wszystkie roztwory przez filtr 0,22 μm. 
		UWAGA: Roztwory podstawowe można przechowywać w temperaturze 4 oC w ciemności nie dłużej niż 1 miesiąc.</li>
		<li>Dodaj 2 ml roztworu pożywki o gradientzie gęstości 40% na dno stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
		<li>Warstwę 2 ml roztworu pożywki gradientowej o gęstości 10% w M199 ostrożnie nałożyć na warstwę podłoża o gradiencie o gęstości 40%, używając pipety Pasteura, aby uniknąć mieszania się między dwiema warstwami.</li>
		<li>Zebrać 1 x 109 pasożytów z hodowli w fazie stacjonarnej przez odwirowanie przy 1 900 x g przez 10 minut.</li>
		<li>Zawieś komórki w 6 ml zmodyfikowanej pożywki niezbędnej (DMEM) firmy Dulbecco.</li>
		<li>Warstwę 2 ml zawiesiny komórek bezpośrednio na warstwę pożywki o gradiencie gęstości 10%, delikatnie, używając pipety Pasteura, aby uniknąć mieszania między warstwami.</li>
		<li>Odwirowywać gradient przez 10 minut przy 1 300 x g w temperaturze pokojowej. 
		UWAGA: Ze względu na różnice we właściwościach fizycznych między gatunkami Leishmania, warunki wirowania dla każdego z nich mogą wymagać nieznacznego dostosowania, aby zapewnić maksymalną wydajność.</li>
		<li>Zbierz pasożyty (wzbogacone w metacykliczną formę promastygoty) z pasma utworzonego na górnej granicy ośrodków gradientu gęstości 10% (interfejs między warstwami ośrodków gradientu gęstości 0% i 10%).</li>
		<li>Rozcieńczyć pasożyty jedną objętością DMEM i zebrać przez odwirowanie (1 900 x g przez 10 minut w temperaturze pokojowej).</li>
		<li>Ponownie zawiesić w pożywce DMEM o pojemności 500 μl i policzyć w hemocytometrze, aby określić ilościowo wydajność.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie L. amazonensis amastigotes w warunkach hodowli aksonicznej (niskie pH / podwyższona temperatura)6,8,13
	<ol>
		<li>Zmieszać 5 ml kultury promastigoty w fazie logarytmicznej (pH 7,4 w temperaturze 26 °C) z równą objętością pożywki amastigoty (pH 4,5), używając kolb o długości 25cm2 (łącznie 10 ml pożywki) i inkubować przez noc w temperaturze 26 °C.</li>
		<li>Przesunąć kolbę z 26 °C do 32 °C.</li>
		<li>Po 3 lub 4 dniach rozdzielić kulturę 1:5 w pożywce amastigote w temperaturze 32 °C.</li>
		<li>Sprawdź pasożyty w ciągu najbliższych 3 - 4 dni (maksymalnie 7 dni), aby zobaczyć, czy są gotowe do użycia w infekcjach. 
		UWAGA: Zdrowe akskoniczne amastigoty powinny mieć owalny kształt, bez widocznych wici. Częściowo zróżnicowane amastigoty mają duży owalny kształt z krótkimi wiciami. Kultura nie powinna mieć wielu grudek - wiele grudek wskazuje na nierosnące, umierające pasożyty. Kulturę amastigoty można podzielić w stosunku 1:5 i utrzymywać przez maksymalnie 3 tygodnie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Zakażenie L. amazonensis
<ol>
	<li>Rozcieńczyć zawiesiny pasożytów zgodnie z pożądanym MOI (zwykle 3-5 metacyklicznych promastigotów na makrofaga [MOI 1:3 lub 1:5] i 1 amastigota na makrofaga [MOI 1:1]). Dodać Leishmania w PBS -/- w objętości 50 - 100 μl do każdej studzienki zawierającej już 2 ml pożywki.</li>
	<li>Inkubować BMM przez 1 godzinę z amastigotami i 3 godziny z metacyklicznymi promastigotami w temperaturze 34 oC w celu zakażenia. 
	UWAGA: Optymalna temperatura infekcji może się różnić w zależności od gatunku.</li>
	<li>Po inkubacji dokładnie zmyć wolne pasożyty w każdym dołku 3x za pomocą 2 ml PBS -/- podgrzanego do 37 °C. 
	UWAGA: Delikatnie rozprowadź PBS, aby upewnić się, że szkiełka nakrywkowe nie unoszą się nad sobą. Delikatnie zakręć płytką, a następnie odessaj płyn. Użyj oddzielnej końcówki zasysającej, jeśli używasz wielu szczepów pasożytów, aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego.</li>
	<li>Ustalić 1 h lub 3 h punkty czasowe próbki, inkubując każdą studzienkę z 1,5 - 2 ml 2% PFA w PBS -/- przez 10 min. Przemyć 3x PBS -/-. Nie odsysać ostatniego mycia i przechowywać w lodówce płytki zawierające szkiełka nakrywkowe w PBS do czasu zabarwienia.</li>
	<li>Dodać 2 ml świeżej pożywki BMM do każdego dołka na płytkach w celu uzyskania dalszych punktów czasowych i inkubować w temperaturze 34 °C.</li>
	<li>Napraw pozostałe punkty czasowe zgodnie z potrzebami, jak opisano w kroku 4.3, i wstaw płytki do lodówki do czasu zabarwienia.</li>
</ol>
5. Barwienie DAPI i montaż szkiełek nakrywkowych
<ol>
	<li>Odessać PBS ze studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe i dodać 1,5 ml PBS -/- z 0,1% niejonowym detergentem. Inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie 3x przemyć 2 ml PBS -/-.</li>
	<li>Dodać 1 ml PBS -/- z 2 μg/ml DAPI (rozcieńczony z 5 mg/ml roztworu podstawowego w wodzie) do studzienek zawierających szkiełka nakrywkowe i inkubować przez kolejną 1 godzinę w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Czas inkubacji z DAPI ma kluczowe znaczenie dla prawidłowej wizualizacji wewnątrzkomórkowych pasożytów Leishmania. Jądra makrofagów barwią się szybko, ze względu na ich większy rozmiar i zawartość DNA, ale barwienie jąder pasożytów wewnątrzkomórkowych jest wolniejsze. Tak więc wydłużenie czasu inkubacji poza to, co jest wymagane do wizualizacji jąder BMM, jest konieczne, aby DAPI mogło przeniknąć przez błonę plazmatyczną pasożyta i błonę jądrową pasożyta. Przy prawidłowym barwieniu DAPI oprócz DNA jądrowego można również uwidocznić mitochondrialne DNA kinetoplastu w pobliżu kieszeni wiciowej pasożyta.</li>
	<li>Umyj każdą studzienkę zawierającą szkiełka nakrywkowe 3x 2 ml PBS -/-, a następnie podnieś i odwróć szkiełka nakrywkowe za pomocą kleszczyków, aby położyć komórkę do dołu i zamontować na szklanych szkiełkach mikroskopowych za pomocą dostępnego w handlu odczynnika montażowego zapobiegającego blaknięciu. 
	UWAGA: Szkiełka nakrywkowe są niezwykle delikatne i wymagają ostrożnego obchodzenia się. Unikaj wywierania na nie nacisku, zwłaszcza na ścianę boczną studni podczas podnoszenia. Dodanie kilku kropli PBS -/- zmniejsza napięcie powierzchniowe między szkiełkiem nakrywkowym a studnią i ułatwia proces podnoszenia. Można użyć cienkiej igły, aby pomóc w podważeniu szkiełek nakrywkowych z dna studni. Po umieszczeniu szkiełka nakrywkowego na szkiełku należy delikatnie docisnąć kleszkami, aby wypchnąć wszelkie pęcherzyki powietrza z nośnika montażowego. Jeśli szkiełko nakrywkowe zostało złamane lub prawdopodobnie przewróciło się podczas procesu podnoszenia, nie montuj go ponownie; Wystarczy użyć zapasowego czwartego szkiełka nakrywkowego.</li>
	<li>Szkiełka należy przechowywać w lodówce do momentu oznaczania ilościowego.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja infekcji
<ol>
	<li>Zbadaj szkiełka zabarwione DAPI pod mikroskopem fluorescencyjnym, skupiając się na makrofagach za pomocą soczewki obiektywowej 100X z olejkiem immersyjnym (wzbudzenie przy 358 nm; optymalna emisja przy 461 nm). 
	Upewnij się, że fokus jest skupiony na warstwie makrofagów między szkiełkiem podstawowym a szkiełkiem nakrywkowym.</li>
	<li>Określ ilościowo liczbę makrofagów (dużych jąder barwionych DAPI) i liczbę mniejszych jąder amastigotów skupionych wokół każdego jądra makrofaga (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 2A, DAPI) dla każdego pola widzenia, używając ręcznego licznika. 
	UWAGA: Jądra Amastigota mogą nie być widoczne w jednej płaszczyźnie ogniska ze względu na ich mały rozmiar. Policz te, które są widoczne, gdy skupiasz się na jądrach makrofagów, a następnie użyj precyzyjnej ostrości, aby sprawdzić, czy w płaszczyznach powyżej i poniżej jąder makrofagów nie ma jąder pasożytów.</li>
	<li>Przejdź do innego pola widzenia, aby powtórzyć kwantyfikację. Użyj oddzielnego klucza licznika, aby śledzić liczbę zliczonych pól. Poruszaj się po polach widzenia w równoległych rzędach na każdym szkiełku nakrywkowym, aby zapobiec nakładaniu się liczenia.</li>
	<li>Określ ilościowo co najmniej 200 makrofagów na szkiełko nakrywkowe. Określić ilościowo każdy punkt czasowy infekcji w trzech egzemplarzach (3 szkiełka nakrywkowe). Policz czwarte szkiełko nakrywkowe, jeśli jedno z poprzednich nie nadaje się do liczenia z powodu nakładania się szkiełek nakrywkowych, złego montażu, stłuczenia szkła itp. 
	UWAGA: Jeśli nie można policzyć 200 makrofagów na jednym szkiełku nakrywkowym, policz zapasowe czwarte.</li>
	<li>Oblicz wskaźniki infekcji jako amastigoty/makrofagi lub amastigoty/100 makrofagów i określ procent zakażonych makrofagów na podstawie surowych danych ilościowych.</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych,

Dane ilościowe uzyskane za pomocą opisanego powyżej testu infekcji BMM pozwalają badaczom uzyskać wskaźniki infekcji i wiarygodne określenie zmian właściwości wirulencji w stosunkowo krótszym okresie czasu (maksymalnie 2 tygodnie, w porównaniu z 2 miesiącami wymaganymi w przypadku eksperymentów in vivo ). Metoda ta opiera się na barwniku specyficznym dla DNA DAPI, który specyficznie barwi makrofagi i jądra pasożytów oraz umożliwia szybką identyfikację i kwantyfikację zakażonych komórek. Dla porównania, inne plam...

Leishmaniasis odnosi się do szerokiego spektrum chorób ludzkich wywoływanych przez gatunki pasożytów pierwotniaków z rodzaju Leishmania. Około 12 milionów ludzi na całym świecie jest obecnie zarażonych Leishmanią, a ponad 350 milionów jest zagrożonych. Patologia choroby zależy od gatunku Leishmania i czynników gospodarza, a objawy wahają się od nieszkodliwych, samoleczących się zmian skórnych po śmiertelne formy trzewne. Nieleczona leiszmanioza trzewna jest śmiertelna, plasując się tylko po malarii jako najbardziej śmiertelna choroba człowieka spowodowana zakażeniem pasożytem pierwotniaka1. Pomimo szerokich różnic w patologii i objawach choroby, wszystkie gatunki Leishmania mają digeniczny cykl życiowy naprzemiennie w stadiach promastygoty i amastigoty odpowiednio u gospodarzy owadów i kręgowców. Wewnątrz kręgowców Leishmania atakuje makrofagi gospodarza do inwazji i indukuje tworzenie parazytoforycznych wakuoli (PV), kwaśnych przedziałów o właściwościach fagolizosomów, w których replikują się wysoce zjadliwe formy amastigotów. Amastigoty utrzymują się w tkankach gospodarza podczas przewlekłych infekcji i mogą być przekazywane niezakażonym muchom piaskowym, kończąc cykl transmisji. Dlatego też, w kontekście rozwoju chorób u ludzi, amastigoty są najważniejszą formą cyklu życiowego Leishmania2. Zbadanie, w jaki sposób amastigoty replikują się wewnątrz fotowoltaików makrofagów<, ma kluczowe znaczenie dla zrozumienia zjadliwości Leishmania class=sup class="xref">3,4,5,6,7 oraz dla opracowania nowych skutecznych terapii.
Opisujemy tutaj metodę regularnie używaną przez nasze laboratorium do badania infekcji Leishmania i replikacji w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM), która polega na ilościowej ocenie liczby wewnątrzkomórkowych Leishmania w czasie. Proces ten obejmuje pobieranie monocytów ze szpiku kostnego myszy i różnicowanie do makrofagów w hodowli, zakażenie in vitro formami infekcyjnymi (metacykliczne promastigoty lub amastigoty) Leishmania oraz oznaczanie ilościowe liczby pasożytów wewnątrzkomórkowych w odstępie co 24 godziny przez okres 72 - 96 godzin po zakażeniu. Test ten został wykorzystany w naszym laboratorium do określenia wpływu kilku czynników środowiskowych i genów pasożytów, w tym identyfikacji krytycznej roli żelaza w promowaniu zjadliwości L. amazonensis, która została następnie potwierdzona w badaniach rozwoju uszkodzeń opuszków stóp u myszy6,8,9,10,11,12,13,14,15. Ponieważ wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania tworzą swoją niszę replikacyjną wewnątrz makrofagów gospodarza, test ten może być powszechnie stosowany do oznaczania wirulencji u wszystkich gatunków Leishmania.
Przeprowadzanie infekcji BMM pozwala na analizę interakcji gospodarz-pasożyt na poziomie pojedynczej komórki, a tym samym na dokładniejsze zrozumienie, w jaki sposób pasożyty Leishmania oddziałują z preferowanym mikrośrodowiskiem gospodarza, PV makrofagów. Testy infekcji makrofagami są z powodzeniem stosowane przez wiele grup16,17,18,19,20,21,22 w celu zbadania funkcji zarówno makrofagów gospodarza, jak i Leishmanii specyficzne geny i ich potencjalny udział w złożonej wzajemnej zależności, która charakteryzuje infekcję wewnątrzkomórkową. Infekcje BMM pozwalają na ilościowe określenie wzrostu pasożyta jako odczyt wpływu czynników gospodarza, które wpływają na przeżycie wewnątrzkomórkowe, takich jak mikrobójcza produkcja tlenku azotu, wytwarzanie reaktywnych form tlenu i inne niekorzystne warunki występujące wewnątrz lizosomopodobnych PVs23. Testy infekcji makrofagami zostały również wykorzystane do identyfikacji potencjalnych potencjalnych leków przeciwleiszmanialnych do opracowania terapeutycznego13,24.
Natura in vitro zakażeń BMM zapewnia kilka zalet w porównaniu z innymi metodami oceny zjadliwości Leishmania. Jednak kilka wcześniejszych badań badających mechanizmy przetrwania pasożyta wewnątrzkomórkowego w czasie nie określiło ilościowo infekcji jako wskaźnika20,21,24. Co więcej, wiele badań skupiających się na śledzeniu zakażeń in vivo w czasie robiło to poprzez pomiar wielkości zmiany skórnej i innych objawów fizjologicznych, które są tylko pośrednio związane z replikacją pasożyta25,26,27. Zakażenie in vivo jest rygorystycznym podejściem do oceny zjadliwości pasożytów, ale pomiary wielkości zmian na podstawie samego obrzęku opuszki stopy są często niewystarczające, ponieważ odzwierciedlają odpowiedź zapalną w zakażonych tkankach, a nie bezwzględną liczbę pasożytów. Z tego powodu po testach rozwoju zmian w opuszkach stóp musi nastąpić kwantyfikacja obciążenia pasożytami w zakażonych tkankach, procedura, która wymaga długotrwałych testów rozcieńczenia28. Ponadto badania in vivo często polegają na poświęceniu wielu zwierząt w różnych momentach w czasie w celu ekstrakcji interesujących ich tkanek6,8,9,10,11,13. W przeciwieństwie do tego, dużą liczbę BMM można uzyskać od tylko jednego zwierzęcia, a komórki te mogą być posiane w warunkach, które pozwalają na ocenę infekcji w różnych momentach w czasie. Ponadto, w porównaniu z badaniami in vivo, wykonywanie zakażeń BMM in vitro pozwala na większą kontrolę nad warunkami eksperymentalnymi. Ilościowe określenie makrofagów, które mają zostać zakażone, wraz z samymi pasożytami pozwala na precyzyjną kontrolę mnogości infekcji (MOI) i warunków hodowli. Precyzyjna kontrola nad tymi czynnikami może mieć kluczowe znaczenie dla identyfikacji cech dyskretnych szlaków komórkowych i zrozumienia ich wpływu na przebieg infekcji.
Biorąc pod uwagę te zalety, jest nieco zaskakujące, że bardzo niewiele grup badających zjadliwość Leishmania do tej pory w pełni wykorzystało ilościową ocenę wewnątrzkomórkowej replikacji makrofagów. W tym artykule omawiamy typowe pułapki, które mogą utrudniać szersze wykorzystanie tego testu, i przedstawiamy protokół krok po kroku, aby ułatwić jego prawidłowe wdrożenie. Biorąc pod uwagę jego precyzję i wszechstronność, opisywany tutaj test infekcji BMM może być wykorzystany nie tylko do zbadania interakcji gospodarz-patogen wpływających na zjadliwość Leishmania, ale także do badania innych mikroorganizmów, które replikują się wewnątrz makrofagów29. Co ważne, test ten może być również opracowany jako szybka i ekonomiczna przedkliniczna metoda przesiewowa do opracowywania leków przeciwleiszmanialnych.

<table><tbody><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli komórkowej</td><td>Cellstar</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Acros Organics</td><td>AC147440250</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z barierą aerozolową (100-1000 &mu; L)</td> <td>Fisherbrand</td><td>02-707-404</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z barierą aerozolową (20-200 &mu; L)</td> <td>Fisherbrand</td><td>02-707-430</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet z barierą aerozolową (2-20 &mu; L)</td> <td>Fisherbrand</td><td>02-707-432</td><td></td></tr><tr><td>Ostrze chirurgiczne ze stali węglowej Bard-Parker Rib-Back #10</td><td>Aspen Surgical</td><td>371110</td><td></td></tr><tr><td>BD Luer-Lok Końcówka 10 ml Strzykawka</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Igła BD Precisionglide, 25G&nbsp;</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>305124</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 35 mm x 10 mm</td><td>Cellstar</td><td>627 160</td><td></td></tr><tr><td>Kolba do hodowli komórkowych</td><td>Cellstar</td><td>660175</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe: koła 12 mm</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>D-Biotyna</td><td>J.T. Baker</td><td>C272-00</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy 200 proof</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 100 mm x 15 mm polistyren bez TC szalka Petriego</td><td>Corning</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Seradigm</td><td>1500-500</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll400</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8016</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>E200</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-mysia IgG Texas czerwony</td><td>Invitrogen</td><td>T-862</td><td></td></tr><tr><td>Koza anty-królik IgG AlexaFluor488</td><td>Invitrogen</td><td>A-11034</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Tokyo Chemical Industry Co. LTD</td><td>H0008</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Rozcieńczalnik Isoton II</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td>8546719</tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gemini</td><td>400-106</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (10X)</td><td>Gibco</td><td>11825-015</td><td></td></tr><tr><td>Na pirogronian (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Alfa Aesar</td><td>43368</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina/Streptomycyna</td><td>Gemini</td><td>400-109</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (-/-)</td><td>ThermoFisher</td><td>14200166</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylinowe stożkowe probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Cellstar</td><td>188 271</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylinowe stożkowe probówki wirówkowe 50 ml</td><td>Cellstar</td><td>227 261</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Odczynnik zapobiegający blaknięciu</td><td>ThermoFisher</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw myszom Lampa-1 dla szczurów</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>1D4B</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinowany ludzki M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td></td></tr><tr><td>Reichert Bright-Line&nbsp; Hemocytometr&nbsp;</td><td>Hausser Scientific</td><td>1492</td><td></td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640 (1X)</td><td>Gibco</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 Surfaktant</td><td>Millipore Sigma</td><td>TX1568-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Delikatne nożyczki, 4 1/2</td><td>"VWR</td><td>82027-582</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze preparacyjne, cienka końcówka</td><td>VWR</td><td>82027-386</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>VWR</td><td>16004-368</td><td></td></tr><tr><td>Z1 Licznik cząstek redlic dwuprogowych</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605699</td><td></td></tr></tbody></table>

kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów leishmania

Quantification of Intracellular Growth Inside Macrophages is a Fast and Reliable Method for Assessing the Virulence of Leishmania Parasites

Cykl życia Leishmania, czynnika wywołującego leiszmaniozę, przebiega naprzemiennie między stadiami promastygoty i amastigoty odpowiednio u gospodarzy owadów i kręgowców. Podczas gdy objawy chorobotwórcze leiszmaniozy mogą się znacznie różnić, od łagodnych zmian skórnych po wysoce śmiertelne formy choroby trzewnej w zależności od gatunku zakaźnego, wszystkie gatunki Leishmania przebywają w makrofagach gospodarza na etapie ich cyklu życiowego u kręgowców. Zakaźność Leishmania jest zatem bezpośrednio związana z jej zdolnością do inwazji, przetrwania i replikacji w wakuolach parazytoforycznych (PV) wewnątrz makrofagów. W związku z tym ocena zdolności pasożyta do replikacji wewnątrzkomórkowej służy jako niezawodna metoda określania zjadliwości. Badanie rozwoju leiszmaniozy przy użyciu modeli zwierzęcych jest czasochłonne, żmudne i często trudne, szczególnie w przypadku patogennie ważnych form trzewnych. Opisujemy tutaj metodologię śledzenia wewnątrzkomórkowego rozwoju Leishmania w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Liczbę pasożytów wewnątrzkomórkowych określa się w odstępach 24 godzin przez 72 - 96 godzin po zakażeniu. Metoda ta pozwala na wiarygodne określenie wpływu różnych czynników genetycznych na zjadliwość Leishmania. Jako przykład pokazujemy, w jaki sposób delecja pojedynczego allelu genu mitochondrialnego transportera żelaza Leishmania (LMIT1) upośledza zdolność zmutowanego szczepu Leishmania amazonensis LMIT1 / ΔLmit1 do wzrostu wewnątrz BMM, odzwierciedlając drastyczne zmniejszenie zjadliwości w porównaniu z typem dzikim. Test ten pozwala również na precyzyjną kontrolę warunków eksperymentalnych, którymi można indywidualnie manipulować w celu analizy wpływu różnych czynników (składników odżywczych, reaktywnych form tlenu itp.) na interakcję gospodarz-patogen. W związku z tym odpowiednie wykonanie i kwantyfikacja badań nad zakażeniem BMM stanowi nieinwazyjną, szybką, ekonomiczną, bezpieczną i niezawodną alternatywę dla konwencjonalnych badań na modelach zwierzęcych.

Leishmania występuje w dwóch formach zakaźnych – promastygotach metacyklicznych, które różnicują się z promastygot procyklicznych w fazie stacjonarnej hodowli, oraz amastygotach, które stanowią stadia wewnątrzkomórkowe (Rycina 1). U niektórych gatunków Leishmania, takich jak L. amazonensis, amastygoty można również różnicować w hodowli aksenicznej poprzez przeniesienie komórek promastygot do środowiska o niższym pH (4.5) i podwyższo...

Wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania rezydują i rozmnażają się wewnątrz makrofagów swoich kręgowców gospodarzy. W tym miejscu przedstawiamy protokół infekowania mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w hodowli Leishmania, a następnie precyzyjne określenie ilościowe kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta jest przydatna do badania poszczególnych czynników wpływających na interakcję gospodarz-patogen i zjadliwość Leishmania.

Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania

The lifecycle of Leishmania, the causative agent of leishmaniasis, alternates between promastigote and amastigote stages inside the insect and vertebrate ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena zjadliwości różnych szczepów Leishmania poprzez zakażenie makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy in vitro, a następnie ilościowe określenie kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego pasożyta. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące czynników pochodzących zarówno z makrofagów gospodarza, jak i patogenu, które decydują o zjadliwości zakaźnych pasożytów Leishmania. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybka, ekonomiczna i niezawodna metoda, która wymaga znacznie mniejszej liczby zwierząt w porównaniu z badaniami in vivo.Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii leiszmaniozy, ponieważ można ją wykorzystać do oceny zakaźności zmutowanych szczepów Leishmania lub skuteczności związków terapeutycznych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego i kwantyfikacji pasożytów wewnątrzkomórkowych są trudne do nauczenia się na podstawie samych pisemnych protokołów. Zacznij od przymocowania cztero- do sześciotygodniowej samicy myszy do deski sekcyjnej i zdezynfekowania zwierzęcia 70% etanolem.Użyj nożyczek, aby wykona

quantification-intracellular-growth-inside-macrophages-is-fast

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

System obrazowania in vivo jest wykorzystywany do generowania pomiarów ilościowych zakażenia myszy pierwotniakiem z grupy Trypanosomatidów, Leishmania. Jest to nieinwazyjna i nieletalna metoda wykrywania pasożytów wykazujących ekspresję lucyferazy w wielu tkankach w przebiegu przewlekłej infekcji Leishmania spp.

Obrazowanie in vivo transgenicznych pasożytów Leishmania u żywego gospodarza

Opracowano zoptymalizowany test ratowania i transformacji pasożytów z komórek THP1 zainfekowanych in vitro za pomocą Leishmania donovani w celu przesiewania leków przeciwleiszmaniowych. Test ten obejmuje różnicowanie komórek THP1, infekcję promastigotami, traktowanie badanymi lekami, kontrolowaną lizę zainfekowanych makrofagów, ratowanie amastigot, ich transformację w promastigoty oraz monitorowanie wzrostu i proliferacji promastigot za pomocą testu fluorometrycznego.

Test ratowania i transformacji pasożytów do przesiewania leków przeciwleiszmaniowych przeciwko wewnątrzkomórkowym amastigotom Leishmania donovani w ludzkiej linii komórkowej ostrej białaczki monocytycznej THP1

Ten film demonstruje technikę kwantyfikacji in vitro w celu określenia zakażenia Listeria monocytogenes makrofagami za pomocą testu jednostki tworzącej kolonię. Kolonie bakteryjne na płytce agarowej reprezentują wewnątrzkomórkową populację bakterii, która wymyka się mechanizmowi obronnemu gospodarza i przeżywa w makrofagach.

Kwantyfikacja infekcji bakteryjnej w komórkach gospodarza za pomocą testu jednostkowego tworzącego kolonię

Ten film bada zjadliwość Leishmanii poprzez traktowanie makrofagów metacyklicznymi promastigotami, co prowadzi do powstania wewnątrzkomórkowych amastigotów. Potwierdzenie zjadliwości Leishmania uzyskuje się poprzez barwienie barwnikiem fluorescencyjnym kwasem nukleinowym. Ta wiedza może przyczynić się do opracowania nowych metod leczenia leiszmaniozy.

Ocena zjadliwości Leishmania w hodowlanych makrofagach

Ten film demonstruje test do ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożytów w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego (BMM). Komórki makrofagów są zakażone ruchliwymi i nieruchliwymi stadiami inwazyjnymi Leishmania, odpowiednio promastigotykami metacyklicznymi i amastigotami. Pasożyty atakują makrofagi, uwewnętrzniając się w parazytoforycznej wakuoli i namnażając się w środku. Wewnątrzkomórkowy wzrost pasożyta określa się ilościowo za pomocą mikroskopu po fluorescencyjnym...

Test in vitro w celu ilościowego określenia wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta w makrofagach

Opisujemy zarówno testy infekcji in vitro, jak i in vivo, które mogą być użyte do analizy aktywności czynników kodujących gospodarza.

Wykorzystanie patogenu bakteryjnego do badania odpowiedzi gospodarza na poziomie komórkowym i organizmowym

Tutaj prezentujemy skompilowany protokół do oceny infekcji skórnej myszy Leishmania amazonensis. Jest to wiarygodna metoda badania zjadliwości pasożytów, pozwalająca na systemowy wgląd w reakcję kręgowców gospodarza na infekcję.

Zakażenie in vivo Leishmania amazonensis w celu oceny zjadliwości pasożyta u myszy

Mechanizm związany z fagocytozą w zakażeniu Leishmania pozostaje słabo poznany. W tym miejscu opisujemy metody oceny wczesnych zdarzeń zachodzących podczas interakcji Leishmania z komórkami gospodarza.

Badanie fagocytozy Leishmania za pomocą mikroskopii konfokalnej

Tutaj prezentujemy podłużną ocenę chomików złocistych zakażonych dootrzewnowo (IP) lub dodziąsłowy (IG) L. infantum-Luc za pomocą obrazowania bioluminescencyjnego i PCR. Chomiki oceniano 1 dzień po zakażeniu (1 dpi), 1 tydzień po zakażeniu (8 dpi) i 3 tygodnie po zakażeniu (22 dpi) i usypano w 50. dpi i 8 miesięcy po zakażeniu.

In vivo (in vivo) Obrazowanie chomików zakażonych Leishmania infantum przez inokulację dziąseł aksenicznych amastigotów eksprymujących lucyferazy

Krzyżowanie genetyczne pasożytów malarii gryzoni przeprowadza się poprzez podanie dwóch genetycznie odmiennych pasożytów komarom. Potomstwo rekombinacyjne jest klonowane z krwi mysiej po tym, jak komary ukąsiły zainfekowane myszy. Niniejszy film pokazuje, jak przeprowadzić krzyżowanie genetyczne Plasmodium yoelii; metoda ta ma zastosowanie również do innych pasożytów malarii gryzoni.

Protokół otrzymywania krzyżówki genetycznej pasożytów malarii gryzoni

Poznaj metodę kwantyfikacji wzrostu wewnątrzkomórkowego Leishmania w makrofagach mysich. Ta szybka i niezawodna technika pozwala ocenić zjadliwość pasożytów oraz czynniki gospodarz-patogen w badaniach nad leiszmaniozą.

Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania (Wideo) | JoVE Journal

Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania

Przeglądaj więcej filmów