Kwantyfikacja wzrostu wewnątrzkomórkowego wewnątrz makrofagów jest szybką i wiarygodną metodą oceny zjadliwości pasożytów Leishmania
16 marca 2018
Wszystkie chorobotwórcze gatunki Leishmania rezydują i rozmnażają się wewnątrz makrofagów swoich kręgowców gospodarzy. W tym miejscu przedstawiamy protokół infekowania mysich makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego w hodowli Leishmania, a następnie precyzyjne określenie ilościowe kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta jest przydatna do badania poszczególnych czynników wpływających na interakcję gospodarz-patogen i zjadliwość Leishmania.
Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena zjadliwości różnych szczepów Leishmania poprzez zakażenie makrofagami pochodzącymi ze szpiku kostnego myszy in vitro, a następnie ilościowe określenie kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego pasożyta. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące czynników pochodzących zarówno z makrofagów gospodarza, jak i patogenu, które decydują o zjadliwości zakaźnych pasożytów Leishmania. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest to szybka, ekonomiczna i niezawodna metoda, która wymaga znacznie mniejszej liczby zwierząt w porównaniu z badaniami in vivo.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku terapii leiszmaniozy, ponieważ można ją wykorzystać do oceny zakaźności zmutowanych szczepów Leishmania lub skuteczności związków terapeutycznych. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ etapy izolacji makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego i kwantyfikacji pasożytów wewnątrzkomórkowych są trudne do nauczenia się na podstawie samych pisemnych protokołów. Zacznij od przymocowania cztero- do sześciotygodniowej samicy myszy do deski sekcyjnej i zdezynfekowania zwierzęcia 70% etanolem.
Użyj nożyczek, aby wykonać jednocentymetrowe nacięcie w pobliżu jednego stawu biodrowego i przeciąć skórę na całej długości stawu. Pociągnij skórę od nogi w kierunku kostki, aby ostrożnie odciąć kończynę, i odetnij stopę na lub poniżej stawu skokowego, aby pozostawić kość piszczelową w takcie. Aby zlokalizować staw biodrowy, manipuluj kością udową, aby zidentyfikować punkt obrotu, i użyj nożyczek, aby odciąć nogę powyżej stawu biodrowego, pozostawiając bliższą głowę kości udowej w takcie.
Usuń jak najwięcej mięśni i tkanki łącznej z nogi i umieść oczyszczone kości na szalce Petriego zawierającej sterylny RPMI uzupełniony antybiotykami na lodzie. Po pobraniu drugiego zestawu kości nóg użyj wysterylizowanych kleszczy i ostrza numer dziesięć, aby usunąć wszelkie pozostałe mięśnie i tkankę łączną. Przenieś oczyszczone kości do pustej pokrywki szalki Petriego i użyj skalpela, aby usunąć oba końce każdej kości piszczelowej, aby uzyskać dostęp do szpiku.
Za pomocą kleszczy umieść jedną piszczel nad ujściem 50-mililitrowej stożkowej rurki na lodzie i włóż końcówkę igły o rozmiarze 25 przymocowaną do 10-mililitrowej strzykawki wypełnionej pożywkami uzupełnionymi antybiotykami do jednego końca kości piszczelowej. Przepłukać około pięciu do 10 mililitrów podłoża przez kość do stożkowej probówki, aż cała czerwona tkanka szpiku kostnego zostanie pobrana, a kość stanie się biała. Po zebraniu całego szpiku odwiruj pulę szpiku kostnego i ponownie zawiesić paletę komórek szpiku kostnego w pięciu mililitrach pożywki makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego.
Przenieś zawiesinę komórek szpiku kostnego do kolby do hodowli komórek o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych zawierającej 60 mililitrów sterylnej pożywki makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego i przepłucz probówkę dwa razy pożywką z kolby hodowlanej, aby zapewnić maksymalny odzysk komórek. Po drugim przepłukaniu przenieść 30-mililitrową porcję komórek do drugiej kolby do hodowli komórek o powierzchni 175 centymetrów kwadratowych i zamknąć każdą kolbę nasadką filtrującą. Następnie inkubuj obie kultury przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, aby umożliwić oddzielenie rezydujących makrofagów od wszelkich zanieczyszczających fibroblastów lub innych przylegających komórek.
Następnego ranka przenieś 10 mililitrów niezróżnicowanego supernatantu zawierającego komórki szpiku kostnego z każdej kolby do indywidualnych szalek Petriego o wymiarach 100 na 15 milimetrów bez hodowli tkankowej i wróć do inkubatora hodowli komórkowej na kolejne dwa do trzech dni. Następnie nakarm kultury pięcioma mililitrami świeżej pożywki makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego o temperaturze 37 stopni Celsjusza na naczynie i włóż płytki z powrotem do inkubatora. W siódmym lub ósmym dniu po hodowli użyj końcówki zasysającej zamontowanej na linii próżniowej, aby przenieść cztery sterylizowane w autoklawie 12-milimetrowe szklane szkiełka na dno każdego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej bez nakładania się na siebie.
Przygotuj identyczne płytki dla każdego punktu czasowego eksperymentu. Następnie przemyj kultury makrofagów pochodzące ze szpiku kostnego dwa razy świeżym PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięcioma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu uzupełnionymi jednym milimolowym EDTA na każdą płytkę. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza połącz odłączone komórki w stożkowej probówce o pojemności 50 mililitrów, przepłukując każdą płytkę dwa razy dodatkowymi pięcioma mililitrami PBS bez wapnia i magnezu.
Po odwirowaniu ponownie zawiesić makrofagi w pięciu do 10 mililitrach świeżej pożywki makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego na lodzie. Po policzeniu rozcieńczyć komórki do pięciu razy od 10 do jednej piątej na mililitr stężenia w świeżej pożywce makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego i dodać dwa mililitry komórek na studzienkę do płytki z sześcioma dołkami. Następnie inkubuj komórki przez noc w inkubatorze do hodowli komórkowych.
Aby zainfekować komórki L.amazonezą, należy rozcieńczyć zawiesinę pasożyta do odpowiedniej eksperymentalnej wielokrotności infekcji i dodać od 50 do 100 mikrolitrów pasożytów do każdej studzienki ze wszystkich sześciu płytek dołkowych, w tym we wszystkich punktach czasowych eksperymentu. Inkubować makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego przez odpowiedni okres infekcji i temperaturę. Następnie umyj studzienki trzy razy dwoma mililitrami świeżego PBS o temperaturze 37 stopni Celsjusza bez wapnia lub magnezu na studzienkę i utrwal początkowe próbki punktu czasowego za pomocą 1,5 do 2 mililitrów 2% paraformaldehydu przez 10 minut.
W przypadku płytek odpowiadających późniejszym punktom czasowym dodać dwa mililitry świeżej pożywki makrofagowej pochodzącej ze szpiku kostnego do każdej studzienki i zwrócić płytki do odpowiedniego inkubatora. Następnie utrwal i umyj komórki dla każdego z pozostałych punktów czasowych, jak właśnie pokazano, i przechowuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w świeżym PBS. Aby zabarwić komórki DAPI, zastąp supernatant 1,5 mililitra świeżego PBS bez wapnia i magnezu, uzupełniony 0,1% niejonowym detergentem przez 10 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wykonaj trzy dwumililitrowe płukania PBS bez wapnia i magnezu.
Następnie wybarwić komórki dwoma mikrogramami na mililitr DAPI w jednym mililitrze PBS przez godzinę w temperaturze pokojowej. Po trzech praniach umieść szkiełka nakrywkowe komórką do dołu na pojedynczym szklanym szkiełku mikroskopowym zamontowanym za pomocą dostępnego w handlu odczynnika do montażu zapobiegającego blaknięciu. Następnie, aby określić ilościowo liczbę zainfekowanych komórek, użyj 100-krotnego obiektywu oleju emergijowego mikroskopu fluorescencyjnego i ręcznego licznika, aby zidentyfikować liczbę mniejszych jąder amastigotów skupionych wokół każdego dużego jądra barwionego DAPI.
Leishmania ma dwie formy zakaźne, metacykliczne promastigoty, które różnią się od procyklicznych promastigotów w stacjonarnej fazie hodowli, oraz amastigotę, wewnątrzkomórkową formę zakaźną występującą w organizmie kręgowca. W tym przypadku osiowo zróżnicowane amastigoty można uwidocznić w makrofagach pochodzących ze szpiku kostnego godzinę po początkowej infekcji i przed utworzeniem parazytoforycznych wakuoli poprzez fuzję fagolizosomalną. Po 48 godzinach można zaobserwować wyraźne duże wakuole parazytoforyczne zawierające wiele pasożytów, co jest charakterystyczne dla zjadliwej infekcji Leishmania.
Z kolei niezjadliwe promastigoty w fazie logarytmicznej nie są w stanie zainicjować rozwoju parazytoforowej wakuoli, nie replikują się i ostatecznie zostają zabite w makrofagach gospodarza. W tym eksperymencie zaobserwowano stały wzrost liczby wewnątrzkomórkowych metacyklicznych pasożytów Leishmania typu dzikiego do 72 godzin po zakażeniu, podczas gdy zmierzono niewielki lub zerowy wzrost wewnątrzkomórkowy zmutowanych pasożytów z upośledzonym importem żelaza w mitochondriach, co sugeruje, że aktywność mitochondriów jest wymagana do wzrostu pasożyta w makrofagach. Zakażenia makrofagami przeprowadzone za pomocą amastigotów typu dzikiego i zmutowanego aksenu wykazały wewnątrzkomórkowy wzorzec wzrostu podobny do obserwowanego w przypadku metacyklicznych promastigoty, ale z jeszcze wyższą zakaźnością pasożytów typu dzikiego niż obserwowano w przypadku promastigotów metacyklicznych.
Ważne jest, aby pamiętać, że istnieje początkowe 24-godzinne opóźnienie w przypadku infekcji metacyklicznymi promastigotami, co stanowi czas potrzebny zinternalizowanym metacyklicznym promastigotom na pierwsze różnicowanie się w amastigoty przed rozpoczęciem replikacji. Po opanowaniu tej techniki można ją ukończyć w ciągu 15 dni, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas próby tej procedury ważne jest, aby użyć odpowiednich szczepów myszy i przeprowadzić staranną kwantyfikację zarówno makrofagów, jak i komórek pasożyta, aby zapewnić spójne MOI we wszystkich eksperymentach.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować makrofagi pochodzące ze szpiku kostnego i zakażać je Leishmania w celu ilościowego określenia ich wewnątrzkomórkowego wzrostu pasożyta, po barwieniu jądrowym za pomocą DAPI. Nie zapominaj, że praca z Leismania może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak korzystanie z szafy bezpieczeństwa biologicznego i środków ochrony osobistej oraz unikanie ostrych narzędzi.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejsze badanie przedstawia protokół infekcji makrofagów pochodzących z szpiku kostnego myszy przy użyciu Leishmania w celu ilościowego określenia kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego. Metoda ta pomaga w zrozumieniu interakcji między gospodarzem a patogenem oraz zjadliwości Leishmania.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Immunologia
- Interakcje patogen-gospodarz
Wstęp
- Gatunki Leishmania replikują się wewnątrz makrofagów kręgowców.
- Zrozumienie czynników wirulencji jest kluczowe dla opracowania terapii.
- Metody in vitro ograniczają potrzebę stosowania modeli zwierzęcych.
- Demonstracje wizualne usprawniają naukę złożonych technik.
Cel badania
- Ocena zjadliwości różnych szczepów Leishmania.
- Ilościowe określenie kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego pasożytów.
- Badanie czynników gospodarza i patogenu wpływających na zjadliwość.
Zastosowane metody
- Izolacja makrofagów pochodzących z szpiku kostnego myszy.
- Zakażanie makrofagów szczepami Leishmania.
- Ilościowe oznaczenie wzrostu wewnątrzkomórkowych pasożytów.
- Wizualna prezentacja protokołu w celu zapewnienia przejrzystości.
Główne wyniki
- Skuteczna infekcja makrofagów różnymi szczepami Leishmania.
- Uzyskanie danych ilościowych dotyczących kinetyki wzrostu wewnątrzkomórkowego.
- Wgląd w czynniki wpływające na wirulencję Leishmania.
- Metoda okazała się wydajna i niezawodna w badaniach.
Wnioski
- Protokół ten jest cennym narzędziem do badania zjadliwości Leishmania.
- Może on ułatwić ocenę związków terapeutycznych.
- Zmniejsza zależność od badań in vivo, wspierając etyczne prowadzenie badań.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejszy test infekcji makrofagów in vitro stanowi szybką i kosztowo efektywną alternatywę dla modeli zwierzęcych w ocenie wirulencji Leishmania, umożliwiając wczesną walidację punktów uchwycia oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego w procesie poszukiwania leków przeciwpasożytniczych. Dzięki kwantyfikacji kinetyki wzrostu pasożytów wewnątrzkomórkowych, metoda ta zwiększa pewność prognostyczną w identyfikacji związków wiodących oraz w selekcji portfela związków ukierunkowanych na interakcje gospodarz-patogen. Powtarzalność i skalowalność testu ułatwiają międzyfunkcyjną współpracę zespołów biologii odkrywczej, rozwoju testów oraz badań translacyjnych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez powiązanie czynników genetycznych (np. delekcji LMIT1) z defektami replikacji wewnątrzkomórkowej i osłabieniem zjadliwości.
- Wartość operacyjna: Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowy pomiar przeżywalności i replikacji pasożyta w odpowiednich dla danej choroby ludzkich makrofagach zastępczych.
- Wartość prognostyczna: Pozwala na uzyskanie danych o zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowym, co służy do mechanistycznej minimalizacji ryzyka i priorytetyzacji celów niezbędnych do przeżycia wewnątrzkomórkowego.
Przesiewanie i opracowanie analizy
- Gotowość analizy: Generuje zestandaryzowane, mierzalne wyniki (liczba pasożytów wewnątrzkomórkowych w odstępach 24 h), odpowiednie do wysokoprzepustowych badań przesiewowych (high-content screening) oraz walidacji trafień.
- Powtarzalność: Zdefiniowane kontrole MOI oraz zsynchronizowany czas zakażenia zapewniają spójne wyniki w różnych eksperymentach i laboratoriach.
- Skalowalność: Kompatybilność z formatami wielodotkowych płytek umożliwia równoległą ocenę bibliotek związków lub mutantów genetycznych w kontrolowanych warunkach.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla choroby: Wykorzystuje makrofagi pochodzące z szpiku kostnego do modelowania niszy gospodarza kręgowca, w której bytują Leishmania, co zwiększa wierność translacyjną.
- Ciągłość przedkliniczna: Łączy wczesne trafienia w cele z wynikami fenotypowymi w systemie istotnym z punktu widzenia patogenezy, wspierając decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) przed walidacją in vivo.
- Zgodność z biomarkerami: Wewnątrzkomórkowe obciążenie pasożytem służy jako bezpośredni, powiązany mechanistycznie odczyt do oceny skuteczności związku i zaangażowania celu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Analiza ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków — od walidacji celu, przez identyfikację związku wiodącego, aż po badania przedklinicznej skuteczności — stanowiąc pomost między screeningiem biochemicznym a badaniami na modelach zwierzęcych dzięki dostarczeniu walidacji fenotypowej w kontekście komórkowym istotnym dla danej choroby.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotez dotyczących czynników wirulencji oraz oddziaływań gospodarz-patogen poprzez kontrolowaną manipulację genetyką pasożyta i warunkami organizmu gospodarza.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowych wyników opartych na mikroskopii, co umożliwia standaryzację testów i przesiewanie związków w formatach 6-dołkowych lub o wyższej gęstości.
- Analityka: Generuje dane dotyczące kinetyki wzrostu (liczba pasożytów w czasie), które służą do obliczeń EC50/IC50 oraz statystycznego porównania fenotypów wirulencji.
- Badania translacyjne: Wykorzystuje pierwotne makrofagi mysie do modelowania biologii infekcji u ludzi, co wspiera ekstrapolację wyników do badań przedklinicznych.
- Zastosowania systemowe: Tworzy powtarzalną platformę do oceny wielu szczepów Leishmania, mutantów lub kandydatów na leki w określonych warunkach.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną poprzez bezpośrednie powiązanie zaburzeń genetycznych lub farmakologicznych z defektami replikacji wewnątrzkomórkowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym protokołom izolacji makrofagów, infekcji i fiksacji, co minimalizuje zmienność.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez zmniejszenie zależności od kosztownych i czasochłonnych modeli zwierzęcych w ramach wczesnej oceny wirulencji.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację związków z uwzględnieniem ryzyka w oparciu o zwalidowaną skuteczność wewnątrzkomórkową, co zmniejsza ryzyko niepowodzenia na późnym etapie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu hodowli pierwotnych komórek, techniki aseptycznej oraz mikroskopii fluorescencyjnej w celu dokładnej kwantyfikacji pasożytów.
- Metoda jest zależna od dostępu do komór laminarnych, wirówek, mikroskopów fluorescencyjnych oraz standaryzowanych odczynników (DAPI, PBS, paraformaldehyd).
- Konieczna jest międzyzespołowa standaryzacja obliczeń MOI, czasu infekcji oraz kryteriów kwantyfikacji w celu zapewnienia porównywalności danych.
- W późniejszych etapach przesiewowych może być wymagana adaptacja do modeli ludzkich makrofagów lub systemów pochodzących z iPSC w celu zwiększenia istotności biologicznej dla organizmu ludzkiego.
- Metoda ogranicza się do kwantyfikacji w punkcie końcowym i określonych punktach czasowych; obrazowanie w czasie rzeczywistym wymagałoby dodatkowej optymalizacji pod kątem kompatybilności z żywymi komórkami.
