Name: Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Poznaj mikroiniekcję zarodków Diabrotica virgifera virgifera do transformacji linii zarodkowej i edycji genomu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia badania funkcjonalne genomu szkodników kukurydzy.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant z Monsanto Corn Rootworm Knowledge Research Program, grant numer AG/1005 (dla MDL i YC) oraz fundusze na start dla MDL z NCSU. FC był wspierany przez granty z Monsanto's Corn Rootworm Knowledge Research Program (AG/1005) oraz National Science Foundation, grant numer MCB-1244772 (dla MDL). Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów. FC i MDL wymyśliły i zaprojektowały eksperymenty; Eksperymenty przeprowadzili FC, PW i SP; FC i MDL przeanalizowały wyniki; a FC, NG i MDL napisali manuskrypt. Dziękujemy Teresie O'Leary, Williamowi Klobasie i Stephanie Gorski za ich ekspercką pomoc w badaniach przesiewowych WCR. Dziękujemy również dr Wade'owi Frenchowi (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) za transport jaj w celu założenia kolonii laboratoryjnych i dostarczenie protokołów hodowlanych.

1. Hodowla dorosłych osobników WCR na poziomie kolonii
<ol>
	<li>Zaopatrz się w wystarczającą ilość dorosłych osobników WCR (500 - 1,000) od wiarygodnej firmy lub laboratorium badawczego (patrz przykład w Tabeli materiałów) i umieść w klatce o długości30 cm 3. 
	UWAGA: Zdecydowanie zaleca się stosowanie szczepu bez diapauzy.</li>
	<li>Przygotuj sztuczną dietę WCR zgodnie z protokołem producenta i wlej warstwę o grubości 1 cm do pojemnika o pojemności 38 uncji (patrz Tabela Materiałów). Po wymieszaniu niewykorzystaną dietę należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 2 miesięcy.</li>
	<li>Umieść szalkę Petriego (100 x 15 mm) z dietą dla dorosłych (10 - 15 g) w klatce o długości 30 cm3. Dodaj więcej diety, gdy jedzenie jest niskie lub suche.</li>
	<li>Umieść kolbę (300 ml) z wodą, pokrytą wacikiem, który służy do przytrzymywania na miejscu bawełnianej rolki (6 "x 3/8"), która ma służyć jako źródło wody. Zmień wodę, gdy się wyczerpie.</li>
	<li>Utrzymuj WCR na poziomie 26 °C przy wilgotności 60% i cyklu świetlnym 14:10 w inkubatorze do hodowli owadów.</li>
</ol>
2. Pobieranie i wyrównywanie zarodków
<ol>
	<li>Przygotuj komorę na jaja, używając 1% agaru w wodzie na sterylnej szalce Petriego o wymiarach 100 x 15 mm2. Przechowywać w temperaturze 4 °C po zestaleniu się agaru.</li>
	<li>Aby zebrać nowo złożone jaja, umieść pojedynczą warstwę bibuły filtracyjnej, a następnie 4 warstwy gazy (każda przycięta na wymiar) na powierzchni agaru (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). 
	UWAGA: Gaza może być ponownie użyta, po umyciu w wybielaczu i autoklawowaniu, ale nie jest to konieczne przy pierwszym użyciu. Bibuła filtracyjna nie powinna być ponownie używana i nie musi być sterylizowana.</li>
	<li>Umieść talerz do zbierania jaj w klatce WCR tak późno, jak to możliwe (koniec dnia pracy) i przykryj namiotem z folii aluminiowej. Pozostaw na noc. 
	UWAGA: Włączenie świateł od 10 rano do 12 rano (14 godzin) opóźnia składanie jaj, ułatwiając w ten sposób zbieranie młodszych jaj do mikroiniekcji bez konieczności umieszczania przez personel laboratoryjny komory zbiorczej w klatce późno w nocy.</li>
	<li>Wyjmij komorę na jajka około 8 lub 9 rano.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy zbieraj po 1 warstwie gazy na raz i umieszczaj w zlewce (500 ml) wody. Zmyj jajka z gazy, delikatnie mieszając (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B i 1C).</li>
	<li>Za pomocą pipety gruszkowej przenieś jaja do innej zlewki (500 ml) z wodą. Powtórz 2-3 razy, aby oczyścić jajka.</li>
	<li>Użyj pipety z bańką, aby przenieść jaja na bibułę filtracyjną (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D), minimalizując przy tym ilość przenoszonej wody.</li>
	<li>Pokrój czarną bibułę filtracyjną na paski o szerokości szkiełka i mocno przyklej do szkiełka, aby upewnić się, że papier leży płasko (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A). 
	UWAGA: bibuła filtracyjna pomaga poprawić widoczność pod mikroskopem, zmniejszając ilość odbitego światła.</li>
	<li>Nałóż nietoksyczny klej (patrz Tabela materiałów dla przykładu) na bibułę filtracyjną cienkimi liniami (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2B). Utrzymuj linie kleju cieńsze niż średnica jajka, aby uniknąć pokrycia jajek klejem.</li>
	<li>Za pomocą cienkiej szczotki delikatnie przesuwaj jajka WCR jedno po drugim z bibuły filtracyjnej do linii kleju. Staraj się ułożyć jajka na kleju, zanim wyschnie i zachowaj co najmniej jedną odległość jajka między każdym jajkiem.</li>
	<li>Zmaksymalizuj wydajność iniekcji, umieszczając wiele linii jaj na jednym szkiełku z bibuły filtracyjnej (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Po ułożeniu wszystkich jaj na bibule filtracyjnej poczekaj, aż cały klej wyschnie przed mikroiniekcją. 
	UWAGA: W celu transformacji linii zarodkowej i edycji genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, wstrzyknij wszystkie zarodki do południa (12 po południu), tak aby najstarszy zarodek nie miał więcej niż 19 godzin. Jednak w przypadku RNAi nie ma ograniczeń czasowych, ponieważ w WCR dsRNA może przemieszczać się między komórkami. W rzeczywistości, w przypadku RNAi, starzenie się zarodków może skutkować lepszymi wskaźnikami przeżycia.</li>
</ol>
3. Przygotowanie plazmidowego DNA i igieł iniekcyjnych
<ol>
	<li>Przygotuj wysokiej jakości superskręcone plazmidowe DNA za pomocą komercyjnego zestawu wolnego od endotoksyn (patrz Tabela materiałów dla przykładu).</li>
	<li>Aby przygotować roztwór do wstrzykiwań, należy sprawdzić stężenie każdego plazmidu, a następnie połączyć plazmid pomocniczy (stężenie końcowe 250 ng/μl), plazmid dawcy (stężenie końcowe 750 ng/μl) i bufor czerwieni fenolowej (stężenie końcowe 20%). Krótko zmieszać roztwór i wirować przez 3 minuty z maksymalną prędkością, aby wytrącić cząstki, które mogłyby zatkać igłę.</li>
	<li>Pociągnij igły ze szkła borokrzemianowego (średnica zewnętrzna 1 mm, średnica wewnętrzna 0,58 mm, długość 10 cm) za pomocą ściągacza do mikropipet typu Flaming/Brown. Do przechowywania zabezpiecz wyciągnięte igły dwustronną taśmą klejącą na szalce Petriego lub innym przezroczystym pojemniku. 
	UWAGA: W przypadku systemu ściągacza do mikropipet stosowane są następujące ustawienia: Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Napełnij igłę iniekcyjną za pomocą końcówki do mikroładowarki (patrz Tabela materiałów), aby odpipetować 0,5 - 1,0 μl do wnętrza igły, w pobliżu stożkowego końca. Usunąć pęcherzyki z końcówki igły, jeśli takie wystąpią.</li>
	<li>Wprowadzić igłę do wstrzykiwań do uchwytu igły.</li>
	<li>Otwórz końcówkę igły, delikatnie łamiąc cienką parą kleszczyków lub delikatnie dotykając/przeciągając końcówkę na szkiełku nakrywkowym lub szkiełku podstawowym. 
	UWAGA: Celem jest uzyskanie najmniejszego otworu, który nadal umożliwia wydostanie się mieszanki wtryskowej (mniejsze otwory zazwyczaj wymagają wyższego ciśnienia wtrysku). Igły skośne nie wymagają tego kroku, ponieważ są już otwarte.</li>
</ol>
4. Mikroiniekcja i pielęgnacja po iniekcji
<ol>
	<li>Za pomocą cienkiego pędzla ostrożnie zwilż powierzchnię 1-3 jajek sterylną wodą, włóż igłę i wstrzyknij roztwór. Wstrzyknąć każde jajko, zanim powierzchnia wyschnie. Zwróć uwagę na pojawienie się niewielkiej ilości czerwonego koloru wewnątrz jaj podczas wstrzykiwania, aby wskazać na udane mikrowstrzyknięcie. Zmiażdż lub usuń jaja, które wyglądają na uszkodzone, puste lub w inny sposób nie mogą zostać wstrzyknięte. 
	UWAGA: Chociaż ciśnienie wtrysku różni się w zależności od rozmiaru otworu igły, 10 - 13 psi jest dobrym punktem wyjścia.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu wszystkich jaj usuń bibułę filtracyjną ze szkiełka podstawowego.</li>
	<li>Umieść bibułę filtracyjną na powierzchni 1% naczynia agarowego (opisanego powyżej).</li>
	<li>Użyj plastikowej folii parafinowej do uszczelnienia naczynia i umieść w inkubatorze do hodowli owadów w temperaturze 26 °C na 12 dni. 
	UWAGA: Folia parafinowa pomoże zapobiec zanieczyszczeniu krzyżowemu pleśni między naczyniami. Jednak każde inne leczenie zapobiegające rozwojowi pleśni i bakterii może zmniejszyć przeżywalność wstrzykniętych zarodków.</li>
</ol>
5. Hodowla i wylęg zarodków
<ol>
	<li>Badanie zarodków należy rozpocząć 12 dni po wstrzyknięciu pod kątem nowo wyklutych larw i kontynuować codziennie przez następne 2 tygodnie.</li>
	<li>Przenieś larwy za pomocą cienkiej szczotki do pudełka hodowlanego z kiełkującą kukurydzą i ziemią. 
	UWAGA: W naczyniu agarowym może rozwijać się pleśń, ale w większości przypadków larwy nadal się wykluwają. Uważnie szukaj larw w pleśni, aby złapać je wszystkie. Niektóre larwy mogą przesunąć się na pokrywę naczynia i utknąć w kondensacji.</li>
	<li>Larwy z tyłu w temperaturze 26 °C zgodnie ze standardowymi metodami hodowli WCR25.</li>
</ol>

<ol><li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm%3A+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li>
<li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629(2011).</li>
<li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19991107592">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li>
<li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="https://digitalcommons.unl.edu/entomologyfacpub/87/">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li>
<li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoselle%2C+R+%22Annual+report+for+1959%2C+cooperative+extension+work+in+entomology%22">Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology</a>. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).</li>
<li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).</li>
<li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li>
<li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li>
<li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162(2010).</li>
<li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li>
<li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li>
<li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li>
<li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li>
<li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li>
<li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li>
<li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breakage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li>
<li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction%3A+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/81/1/410/935020">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li>
<li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li>
<li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li>
<li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+marker+for+transgenic+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li>
<li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1570-7458.1976.tb02591.x/abstract">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li>
<li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium+embryogenesis%3A+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+transgenesis%3A+methods+and+applications%22">Insect transgenesis: methods and applications</a>. , CRC Press. (2000).</li>
<li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor%2Fhelper+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li>
<li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li>
<li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11(2007).</li>
<li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgene-based%2C+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Chociaż mikroiniekcja WCR z dsRNA w celu RNAi została zgłoszona9, jest to pierwszy protokół, który ustanawia najlepsze praktyki w zakresie mikroiniekcji przedkomórkowych zarodków WCR, krytycznego procesu przeprowadzania transformacji linii zarodkowej i/lub edycji genomu CRISPR/Cas9 u tego gatunku. Udana mikroiniekcja zarodków WCR zależy od wielu czynników, podobnie jak od wydajności transformacji. Poniżej omówiono niektóre z głównych problemów wpływających na wynik stosowania tego protokołu do tra...

Zachodnia kukurydziana stonka korzeniowa (WCR), Diabrotica virgifera virgifera, jest ważnym szkodnikiem kukurydzy1. Co ciekawe, WCR wydaje się pokonywać środki zwalczania szybciej niż większość szkodników rolniczych, ponieważ nie tylko dostosowują się fizjologicznie, ale także behawioralnie2,3,4,5,6. W ciągu ostatniej dekady interferencja RNA (RNAi), potężne funkcjonalne narzędzie genomiczne, była badana jako potencjalna metoda kontroli WCR7,8, a także była używana jako środek do badania funkcji genów9. Jednakże, podczas gdy RNAi jest często wykonywane przez mikroiniekcję dwuniciowego RNA (dsRNA) u innych gatunków, RNAi oparte na iniekcji jest rzadkie w WCR. W rzeczywistości istnieje tylko kilka doniesień o RNAi poprzez mikrowstrzyknięcie dsRNA do WCR9. Powodem jest to, że WCR może osiągnąć wysoki poziom knockdownu genów poprzez spożycie dsRNA7,10, nawet pozwalając na badanie skutków embrionalnych poprzez podawanie dsRNA matce11. Chociaż metoda ta sprawia, że WCR jest doskonałym obiektem do funkcjonalnej analizy genomowej za pomocą RNAi, spowolniła ona postęp w rozwoju metodologii mikroiniekcji embrionalnej u tego gatunku.
Pomimo mocy RNAi, istnieje kilka wad. Na przykład nie wszystkie geny reagują jednakowo na RNAi. Ta zmienność może utrudnić interpretację wyników funkcjonalnego testu genomicznego. Ponadto RNAi jest przejściowe i nie generuje dziedzicznych mutacji. Z drugiej strony, transformacja linii zarodkowej, inne funkcjonalne narzędzie genomiczne, może generować dziedziczne mutacje poprzez wstawienie oznaczonego elementu transpozycyjnego do genomu12,13. To sprawia, że transformacja linii zarodkowej jest doskonałym narzędziem do tworzenia zmutowanych szczepów do wykorzystania w długoterminowych badaniach genetycznych. Transformacja może być również wykorzystana do uratowania mutacji poprzez dostarczenie funkcjonalnej kopii genu do zmutowanego genomu14. Co więcej, transformacja linii zarodkowej jest podstawą szerokiej gamy technik genetyki molekularnej. Oprócz wyciszania i/lub ratowania funkcji genów, transformacja linii zarodkowej może być wykorzystana do wychwytywania wzmacniaczy15, pułapkowania genów16, ekspresji ektopowej opartej na Gal417 oraz mutagenezy całego genomu18.
Ostatnio opracowano narzędzia umożliwiające zaawansowaną edycję genomu. Narzędzia te obejmują nukleazy efektorowe podobne do aktywatora transkrypcji (TALEN) oraz system nukleazy CRISPR/Cas919,20. Zaletą tych nowych narzędzi jest to, że oferują one naukowcom możliwość wywołania pęknięcia dwuniciowego DNA w prawie każdym miejscu w prawie każdym genomie. Po wywołaniu, pęknięcia te mogą być naprawione przez niehomologiczne łączenie końców, co może wprowadzić delecje lub insercje w docelowym genie, lub przez naprawę kierowaną homologią, która w obecności zmodyfikowanego konstruktu może katalizować wymianę całych genów lub regionów genetycznych21,22. Metody te wymagają jednak mikroiniekcji DNA, RNA i/lub białka do bardzo młodych zarodków.
Ważne, w przeciwieństwie do dsRNA używanych dla RNAi, kwasy nukleinowe i białka używane do transformacji linii zarodkowej i edycji genomu nie mogą łatwo przenikać przez błony komórkowe. Dlatego mikroiniekcja plazmidowego DNA, mRNA i/lub białek musi odbywać się w fazie blastodermy syncytialnej (tj. przed celularyzacją zarodka owada). To sprawia, że czas wstrzyknięć jest czynnikiem krytycznym. Na przykład u Drosophila melanogaster zarodki muszą zostać wstrzyknięte w ciągu dwóch godzin po złożeniu jaja12. W związku z tym opracowanie skutecznego protokołu mikroiniekcji embrionalnej dla WCR musi uwzględniać najlepsze warunki do składania jaj przez samice, a także najlepszą metodę pobierania wystarczającej ilości zarodków przedkomórkowych.
Próba wykorzystania szerokiego zakresu narzędzi genetyki molekularnej do biologii WCR wymaga opracowania metod pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków WCR. Tutaj podajemy szczegółowe instrukcje wraz ze wskazówkami i poradami, aby pomóc innym w stosowaniu technik opartych na transformacji w badaniach WCR. Oprócz rozszerzenia technologii transgenicznych na WCR w celu wykorzystania ich w funkcjonalnych badaniach genomicznych, techniki te umożliwiają również przetestowanie nowych potężnych strategii zwalczania szkodników, takich jak gen drive23,24 do przetestowania na tym ważnym gospodarczo szkodniku.

<table><tbody><tr><td>Jakościowa bibuła filtracyjna ()</td> <td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>Do mikroiniekcji jaj</td></tr><tr><td>1 uncja Pojemniki&nbsp;</td><td>Plastikowa zastawa stołowa Anny's</td><td>ASET101</td><td>Pojemnik na jajka</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Typ II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Podłoże do naczynia do składania jaj WCR</td></tr><tr><td>Kleszcze do piórek&nbsp;</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Obchodzenie się z larwami i poczwarkami&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Mycie kukurydzy i potraw</td></tr><tr><td>Ulubiona żółta</td><td>farma Coor Trucker</td><td>502</td><td>Kukurydza do karmienia</td></tr><tr><td>WCR System mikroiniekcji (domowej roboty)</td> <td>NA</td><td>Części i instrukcje dostępne na żądanie</td><td>Kontroluje ciśnienie wtrysku (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Nietoksyczny klej Elmer's Products</td><td>, Inc.</td><td>E304</td><td>Klej jaj na bibule filtracyjnej</td></tr><tr><td>epTIPS Końcówki do mikroładowarek</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Końcówki do zasypywania igłami</td></tr><tr><td>Falcon Naczynia do kultur tkankowych Falcon</td><td></td><td>25383-103</td><td>Kiełkowanie kukurydzy /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Ilościowe koła z bibuły filtracyjnej</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Robienie naczynia agarowego do składania jaj / 9cm</td></tr><tr><td>Sparkleen</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Zmywanie naczyń</td></tr><tr><td>Zwykłe szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Przechowywanie bibuły filtracyjnej i jaj do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Western Corn Rootworm bez substytutu pyłku</td><td>Frontier Agricultural Sciences&nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR Sztuczna dieta dla dorosłych</td></tr><tr><td>Waciki, duże</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Zamknij kolbę</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3,0 mL Pipety transferowe do małych baniek</td><td>Globe Scientific 137035</td><td></td><td>Zbieraj i przenoś jaja</td></tr><tr><td>Stereomikroskop fluorescencyjny Leica M165 FC&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>Badania przesiewowe WCR</td></tr><tr><td>Zestaw filtrów DsRed do stereomikroskopu fluorescencyjnego</td> Filtr wzbudzenia <td>Leica</td><td>DSR</td><td>: 510-560 nm, filtr emisyjny: 590-650 nm</td></tr><tr><td>Filtr EGFP</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Filtr wzbudzenia: 440&ndash; 520 nm, filtr emisyjny: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Klatka dla dorosłej kolonii</td></tr><tr><td>Miniaturowy pędzel</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&nbsp;</td></tr><tr><td>Joystick Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Mikromanipulator i uchwyt igły</td></tr><tr><td>Mikroskop XY Stage</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Stolik mikroskopowy (przystosowany do użytku ze stereoskopem)</td></tr><tr><td>Klasa 90 Gaza</td><td>Internetowy sklep z tkaninami</td><td>CHEE90</td><td>Do składania jaj</td></tr><tr><td>Plastikowa folia parafinowa&nbsp;</td><td>Opakowanie z tworzywa sztucznego Pechiney</td><td>PM-996</td><td>Uszczelnij miskę agarową po mikroiniekcji / Rozmiar rolki 4 cale x 125 stóp</td></tr><tr><td>Inkubator Percival Percival</td><td>&nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>Komora uprawowa WCR (inkubator do hodowli owadów)</td></tr><tr><td>Kolby Erlenmeyera z wąskimi ustami</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Pojemnik na wodę dla dorosłej kolonii&nbsp;</td></tr><tr><td>Zlewki Griffin Low Form</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>Do mycia jaj</td></tr><tr><td>Plecione rolki bawełniane</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Zastosowanie w zaopatrzeniu w wodę dla dorosłej kolonii&nbsp;</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>Na talerze dietetyczne</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Bufor do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Laserowy ściągacz Micropipiette</td><td>Instrument Sutter</td><td>P-2000/G</td><td>Ściągacz igieł/Heat = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Premium Wierzchnia warstwa gleby</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Gleba do uprawy</td></tr> <tr><td>cronWorki na zamek błyskawiczny Reloc Zippit 2 mil</td><td>Stany Zjednoczone Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Naczynie agarowe w worku po mikroiniekcji/5x7</td></tr><tr><td>Szalki Petriego (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Robienie naczynia agarowego do składania jaj / 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 uncji Pojemniki</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR komora łączeniowa jednoparowa&nbsp;</td></tr><tr><td>38 uncji Pojemniki</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Pudełko do hodowli larw/38 uncji</td></tr><tr><td>ChoiceHD 16 uncji Półprzezroczysty plastikowy pojemnik delikatesowy do kuchenki mikrofalowej</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Pudełko do hodowli larw/16 uncji</td></tr><tr><td>Zakres mikroiniekcji&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Luneta do mikroiniekcji wyposażona w stolik XY</td></tr><tr><td>Standardowe szklane kapilary</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Igły do mikroiniekcji</td></tr><tr><td>Dorosła zachodnia kukurydziana dżdżownica korzeniowa North</td><td>Centeral Aqricultural Reasearch Laboratory</td><td>Szczep bez diapazy</td><td>Prośba od laboratorium dr Bryana Wade'a Frencha</td></tr><tr><td>Zestaw Midi Plasmid DNA</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Oczyszczanie plazmidowych DNA gotowych do wstrzyknięcia</td></tr></tbody></table>

mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu crispr/cas9

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Zachodnia kukurydziana stonka korzeniowa (WCR) jest ważnym szkodnikiem kukurydzy i jest dobrze znana ze swojej zdolności do szybkiego dostosowywania się do strategii zwalczania szkodników. Chociaż interferencja RNA (RNAi) okazała się potężnym narzędziem do badania biologii WCR, ma swoje ograniczenia. W szczególności RNAi samo w sobie jest przejściowe (tj. nie powoduje długoterminowego dziedziczenia mendlowskiego związanego fenotypu) i wymaga znajomości sekwencji DNA docelowego genu. To ostatnie może być ograniczające, jeśli fenotyp zainteresowania jest kontrolowany przez słabo zachowane lub nawet nowe geny, ponieważ identyfikacja użytecznych celów byłaby trudna, jeśli nie niemożliwa. W związku z tym liczba narzędzi w zestawie narzędzi genomicznych WCR powinna zostać rozszerzona poprzez opracowanie metod, które mogłyby być wykorzystane do tworzenia stabilnych zmutowanych szczepów i umożliwienia niezależnych od sekwencji badań genomu WCR. W niniejszym artykule szczegółowo opisujemy metody stosowane do pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków WCR z kwasami nukleinowymi. Podczas gdy opisane w niniejszym dokumencie protokoły mają na celu stworzenie transgenicznego WCR, edycja genomu CRISPR/Cas9 może być również przeprowadzona przy użyciu tych samych protokołów, przy czym jedyną różnicą jest skład roztworu wstrzykiwanego do zarodków.

Ważnym aspektem podczas opracowywania tego protokołu był etap rozwoju embrionalnego w momencie mikroiniekcji. W szczególności transformacja linii zarodkowej wymaga mikroiniekcji DNA przed procesem celularyzacji embrionalnej, ponieważ cząsteczki DNA nie mogą łatwo przenikać przez błony komórkowe. Próby wizualizacji etapów rozwoju embrionalnego WCR przy użyciu barwienia jąder komórkowych zakończyły się niepowodzeniem, ponieważ dechorionacja embrionów WCR w zasadzie rozpuszcza wszystkie błon...

Tutaj prezentujemy protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej w celu przeprowadzenia funkcjonalnych testów genomicznych, takich jak transformacja linii zarodkowej i edycja genomu CRISPR/Cas9.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Ogólnym celem tego protokołu mikroiniekcji jest modyfikacja genomu Western Corn Rootworm. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biologii Western Corn Rootworm i ich zdolności do szybkiego pokonania metod zwalczania szkodników, takich jak BT Toxin i RANI. Oprócz zachodnich stonek korzeniowych kukurydzianych metodę tę można również zastosować do podobnych gatunków, takich jak stonki korzeniowe południowe i północne.Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, kiedy poproszono mnie o pomoc w stosowaniu RANI na bazie iniekcji w Western Corn Rootworm w latach 90-tych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają korzystać z tej metody, będą miały trudności. Ponieważ hodowla zachodnich kukurydzianych stonek korzeniowych w laboratorium jest pracochłonna.Wskaźniki przeżywalności pozostają niskie przy użyciu obecnej technologii. Zdobądź od 500 do 1 000 dorosłych postaci stonki korzeniowej bez diapauzy od wiarygodnej firmy lub laboratorium badawczego. I umieść je w klatkach o pojemności 30 centymetrów sześciennych.Przechowuj standardową sztuczną dietę stonki korzeniowej w pojemnikach do przechowywania żywności o głębokości około jednego centymetra. Niewykorzystana dieta może być przechowywana w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez okres do dwóch miesięcy. Aby nakarmić stonkę korzeniową, załaduj 100-centymetrowe szalki Petriego 10 do 15 gramami diety.Załaduj jedno naczynie z jedzeniem do każdej klatki stonki korzeniowej. I uzupełniaj go, gdy zapasy się skończą lub dieta wyschnie. Trzymaj również 300-mililitrowy zbiornik na wodę, przykryty wacikiem, w każdej klatce, aby służył jako źródło wody.Zmień wodę, gdy się wyczerpie. Utrzymuj stonkę korzeniową w klatce w temperaturze 26 stopni Celsjusza przy wilgotności 60% i cyklu świetlnym 14/10 w inkubatorze do hodowli owadów. Ustaw czas wyłączania świateł później w ciągu dnia, na przykład o północy, aby jaja były składane przed porannymi godzinami pracy.Najpierw zbierz zarodki. Aby uzyskać powierzchnię do zbierania jaj, załaduj 100-milimetrową szalkę Petriego 30 mililitrami 1% agaru i wodą. Następnie umieść pojedynczą warstwę bibuły filtracyjnej na agarze , a następnie cztery warstwy gazy serowej.Każda warstwa powinna być przycięta na wymiar. Następnie, tak późno, jak to możliwe, umieść talerz do zbierania jaj w klatce dla stonki korzeniowej i przykryj go namiotem z folii aluminiowej. Następnie następnego ranka wyjmij komorę na jaja.Za pomocą kleszczy podnieś jedną warstwę gazy serowej na raz i umieść ją w 500-mililitrowej zlewce wypełnionej wodą. Zmyj jajka ze ścięty serowej, mieszając je w wodzie. Następnie użyj pipety do baruszki, aby przenieść jajka do innej zlewki z wodą jako etap mycia.Wykonaj w ten sposób dwa lub trzy prania. Następnie umieść oczyszczone jajka na bibule filtracyjnej z jak najmniejszą ilością wody. Następnie przygotuj slajd, przyklejając kawałek czarnej bibuły filtracyjnej płasko do szkiełka, aby poprawić kontrast.Następnie skrop cienkimi liniami nietoksycznego kleju papier, który posłuży do zabezpieczenia jajek. Trzymaj klej poniżej obwodu jajka. Gdy klej jest mokry, użyj cienkiej szczotki, aby umieścić jajka na linii kleju.Zachowaj odległość co najmniej jednego jajka między każdym jajkiem. Przygotuj wiele rzędów jajek na szkiełku. Jaja należy teraz wstrzyknąć w ciągu 30 minut.Teraz połącz plazmid pomocniczy, plazmid dawcy i czerwony bufor fenolowy. Używaj wysokiej jakości, super zwijanych plazmidów wykonanych z komercyjnego zestawu wolnego od endotoksyn. Fortex krótko do mieszania.A następnie wiruj cząstki stałe przez trzy minuty z maksymalną prędkością. Następnie zasyp ciągnięte igły ze szkła borokrzemianowego 0,5 do 1 mikrolitra roztworu do wstrzykiwań. Jeśli utworzą się bąbelki, pamiętaj o ich usunięciu.Następnie przymocować igłę do wstrzykiwania do mikromanipulatora. Teraz, jeśli to konieczne, pod mikroskopem delikatnie odłamać uszczelnioną końcówkę igły za pomocą cienkich kleszczy lub delikatnie dotykając końcówki szklaną barierą. Należy starać się zrobić jak najmniejszy otwór, przez który uwalniany jest roztwór do wstrzykiwań.Przed wstrzyknięciem jaj stonki korzeniowej za pomocą drobnego pędzla ostrożnie zwilż powierzchnię jednego do trzech przygotowanych jaj sterylną wodą. Następnie wstrzyknij zwilżone zarodki. Delikatnie wprowadzić igłę w środek zarodka i wstrzyknąć niewielką objętość roztworu.Zacznij od użycia ciśnienia od 10 do 13 psi i dostosuj ciśnienie w razie potrzeby. Suche zarodki mają wyraźny okrągły kształt, dzięki wstępnemu zwilżeniu każdego zarodka wodą zmienią swój kształt i zmiękczą skorupkę jaja, umożliwiając w ten sposób łatwą penetrację igły. Pomyślnie wstrzyknięty zarodek będzie miał niewielką ilość czerwonego koloru.Jeśli jajko zostało uszkodzone, wygląda dziwnie lub nie można go wstrzyknąć, zmiażdż je lub usuń ze szkiełka. Po wstrzyknięciu wszystkich jaj przenieś bibułę filtracyjną z jajami na niej do naczynia z 1% agarem. Następnie zamknij naczynie folią parafinową i inkubuj w temperaturze 26 stopni Celsjusza, aż wyklują się larwy.12 dni po wstrzyknięciu należy codziennie przez następne dwa tygodnie sprawdzać, czy nie ma larw. Przenieś larwy za pomocą cienkiej szczotki do pudełka hodowlanego z kiełkującą kukurydzą i ziemią, aby hodować je w standardowych warunkach. Transformację linii zarodkowej stonki korzeniowej podjęto poprzez jednoczesne wstrzyknięcie plazmidu przenoszącego transpozazę z transpozonem przenoszącym plazmid do zarodków przedkomórkowych.U 26 osób, które przeżyły, każde wyrażenie EFP wykorzystano do badania przesiewowego pod kątem insercji elementu dawcy. Chociaż zidentyfikowano potomstwo klatki piersiowej, badanie zarodków stonki korzeniowej za pomocą intensywnego źródła światła okazało się śmiertelne. W kolejnej rundzie transformacji linii zarodkowej wykorzystano gen białka czerwonego fluorescencyjnego napędzany przez konstytutywnie aktywny promotor z Drosophila melanogaster.Wskaźniki przeżywalności poprawiły się, ale zarejestrowano tylko jedną larwę czerwono dodatnią DS. Następnie zarodki zostały poddane mikroiniekcji z samym buforem lub z plazmidami DNA dawcy oznaczonymi i oznaczonymi krwionośnie. Podobny stosunek zarodków wykluwających się po wstrzyknięciu plazmidów lub samego buforu.Co ciekawe, wykluła się tylko około połowa niewstrzykniętych zarodków. To sprawiło, że śmiertelność manipulowania embrionami do wstrzyknięcia była tak wysoka, jak wykonanie zastrzyku. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mikrowstrzykiwać zarodki Western Corn Rootwall.Po opanowaniu przy użyciu tej techniki można wstrzykiwać od dwustu do trzystu zarodków na godzinę. Metoda ta opiera się na technikach opracowanych do transformacji linii zarodkowej Drosophila melanogaster, które służą jako szablony mające zastosowanie dla wielu innych gatunków. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak edycja genomu oparta na CRISPR/Cas9, aby dokonać ukierunkowanych mutacji w genomie Western Corn Rootwall.Aby odpowiedzieć na konkretne pytania dotyczące funkcji genomu.

microinjection-western-corn-rootworm-diabrotica-virgifera-virgifera

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Ten film opisuje mikroiniekcję, powszechną metodę tworzenia transgenicznych szczepów C. elegans. W przykładzie zobaczymy mikroiniekcję użytą do wprowadzenia kompleksu rybonukleoproteinowego (RNP) do edycji genów zasad CRISPR.

Mikroiniekcja gonad: metoda dostarczania związków bezpośrednio do linii rozrodczej C. elegans

Śródziemnomorska muszka owocowa (medfly) Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) jest światowym szkodnikiem rolnictwa. Głębsze zrozumienie jego biologii jest kluczem do kontrolowania populacji medfly, a tym samym zmniejszenia wpływu na gospodarkę. Mikroiniekcja zarodka jest podstawowym narzędziem umożliwiającym zarówno transformację linii zarodkowej, jak i odwrotne badania genetyczne u tego gatunku.

Dostarczanie kwasów nukleinowych poprzez mikroiniekcję zarodka u światowej populacji szkodników rolniczych, Ceratitis capitata

Mikroiniekcja zarodków Nasonia vitripennis jest podstawową metodą generowania dziedzicznych modyfikacji genomu. Opisano tutaj szczegółową procedurę mikroiniekcji i przeszczepu zarodków Nasonia vitripennis, która znacznie ułatwi przyszłą manipulację genomem w tym organizmie.

Technika mikroiniekcji i przeszczepu zarodka w celu manipulacji genomem nosa vitripennis

Ten protokół opisuje procedury mikroiniekcji dla zarodków Culex quinquefasciatus, które są zoptymalizowane do pracy z narzędziami do edycji genów CRISPR/Cas9. Technika ta może skutecznie generować specyficzne dla danego miejsca, dziedziczne mutacje linii zarodkowej, które można wykorzystać do budowy technologii genetycznych w tym niedostatecznie zbadanym wektorze choroby.

Techniki mikroiniekcji zarodków w celu skutecznej mutagenezy specyficznej dla miejsca w Culex quinquefasciatus

Udostępniamy szczegółowy protokół hodowli, mikroiniekcji jaj i efektywnego krycia ognika Thermobia domestica w celu wytworzenia i utrzymania zmutowanych szczepów po edycji genomu.

Mikroiniekcja jaj i skuteczne krycie w celu edycji genomu u Firebrat Thermobia domestica

Tutaj opisujemy metody efektywnych iniekcji poczwarek i dorosłych osobników w Nasonia vitripennis jako dostępne alternatywy dla mikroiniekcji zarodków, umożliwiając funkcjonalną analizę interesujących genów za pomocą wyciszania RNA poprzez interferencję RNA (RNAi) lub nokautowania genów za pomocą edycji genomu CRISPR/Cas9.

Zastrzyki z poczwarek i dorosłych osobników do edycji genów RNAi i CRISPR w nosonia vitripennis

Ten protokół szczegółowo opisuje etapy ukierunkowanej mutagenezy CRISPR/Cas9 u muszek piaskowych: pobieranie zarodków, wstrzykiwanie, hodowla owadów i identyfikacja, a także wybór interesujących mutacji.

Mucha piaskowa (Phlebotomus papatasi) Mikroiniekcja zarodka do mutagenezy CRISPR/Cas9

Wiele cech eusocjalności owadów opiera się na komunikacji wewnątrz kolonii i podziale pracy. Manipulacja genetyczna kluczowych genów regulatorowych w zarodkach mrówek za pomocą mikroiniekcji i mutagenezy za pośrednictwem CRISPR dostarcza informacji na temat natury zachowań altruistycznych u owadów eusocjalnych.

Iniekcje zarodków w celu mutagenezy za pośrednictwem CRISPR u mrówki Harpegnathos saltator

Prezentowany tutaj jest protokół mikroiniekcji zarodka Helicoverpa armigera (Hübner) i identyfikacji mutantów nokautujących, stworzony przez edycję genomu CRISPR/Cas9. Zmutowane owady umożliwiają dalsze badania funkcji genów i interakcji między różnymi genami in vivo.

Mikroiniekcja zarodka i identyfikacja mutanta nokautującego Helicoverpa armigera z edytowanym genomem CRISPR/Cas9 (Hübner)

To są protokoły pobierania i mikrowstrzykiwania przedkomórkowych zarodków skoczka kukurydzianego w celu modyfikacji ich genomu poprzez edycję genomu opartą na CRISPR/Cas9 lub dodawanie oznaczonych elementów transpozycyjnych poprzez transformację linii zarodkowej.

Mikroiniekcja skoczka kukurydzianego, Peregrinus maidis, zarodków do edycji genomu CRISPR/Cas9

Ten artykuł demonstruje inżynierię genomu pośredniczoną przez CRISPR-Cas9 w Steinernema hermafroditum, nicieniu entomopatogenicznym (EPN: pasożytniczym owadziem) oraz rozwijającym się modelem genetycznym. Opisana technologia jest przydatna do tworzenia mutantów, umożliwiając wyjaśnienie funkcji genów w biologii nicieni, które są istotne dla symbiozy mutualistycznej i pasożytniczej.

Mutageneza oparta na CRISPR-Cas9 w nicieniu entomopatogenicznym Steinernema hermafroditum oraz utrzymanie linii mutantów

Poznaj mikroiniekcję zarodków Diabrotica virgifera virgifera do transformacji linii zarodkowej i edycji genomu CRISPR/Cas9. Ta metoda umożliwia badania funkcjonalne genomu szkodników kukurydzy.

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9 (Wideo) | JoVE Journal

Mikroiniekcja zachodniej kukurydzianej stonki korzeniowej, Diabrotica virgifera virgifera, zarodki do transformacji linii zarodkowej lub edycja genomu CRISPR/Cas9

Przeglądaj więcej filmów