Name: Generowanie natywnego, nieznakowanego monomeru i włókien eksonu huntingtyny1 przy użyciu strategii fuzji SUMO (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Poznaj metodę produkcji natywnego, nieznakowanego eksonu 1 huntingtyny przy użyciu fuzji SUMO. Protokół zapewnia wysoką czystość białka i umożliwia powtarzalne badania struktury oraz funkcji w kontekście chorób neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana głównie z grantów fundacji CHDI i Szwajcarskiej Narodowej Fundacji Nauki. Dziękujemy dr Sophie Vieweg za przydatne dyskusje podczas opracowywania tego nowego systemu odciągania pokarmu oraz pozostałym członkom grupy Lashuel za podzielenie się swoimi doświadczeniami z tym systemem odciągania pokarmu oraz za ich wkład i cenne informacje zwrotne. Dziękujemy również prof. Oliverowi Hantschelowi za dostarczenie plazmidu ULP1. Autorzy dziękują dr. Johnowi B. Warnerowi i dr. Senthilowi K. Thangarajowi za krytyczną recenzję manuskryptu

<ol><li>Saudou, F., Humbert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Biology+of+Huntingtin%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Biology of Huntingtin.</a> Neuron. 89 (5), 910-926 (2016).</li>
<li>MacDonald, M. E., Gines, S., Gusella, J. F., Wheeler, V. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/14528049">Huntington's disease.</a> Neuromolecular Medicine. 4 (1-2), 7-20 (2003).</li>
<li>Li, S., Li, X. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+pathways+contribute+to+the+pathogenesis+of+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Multiple pathways contribute to the pathogenesis of Huntington disease.</a> Molecular Neurodegeneration. 1, 19(2006).</li>
<li>DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Huntingtin+in+Neuronal+Intranuclear+Inclusions+and+Dystrophic+Neurites+in+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Sathasivam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+of+HTT+generates+the+pathogenic+exon+1+protein+in+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).</li>
<li>Mangiarini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+1+of+the+HD+gene+with+an+expanded+CAG+repeat+is+sufficient+to+cause+a+progressive+neurological+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice.</a> Cell. 87 (3), 493-506 (1996).</li>
<li>El-Daher, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+proteolysis+releases+non-polyQ+fragments+that+cause+toxicity+through+dynamin+1+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation.</a> EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).</li>
<li>Lunkes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+acting+on+mutant+Huntingtin+generate+cleaved+products+that+differentially+build+up+cytoplasmic+and+nuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions.</a> Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intein-based+Strategy+for+the+Production+of+Tag-free+Huntingtin+Exon+1+Proteins+Enables+New+Insights+into+the+Polyglutamine+Dependence+of+Httex1+Aggregation+and+Fibril+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
<li>Georgalis, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+aggregation+monitored+by+dynamic+light+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Huntingtin aggregation monitored by dynamic light scattering.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 95 (11), 6118-6121 (1998).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin-encoded+polyglutamine+expansions+form+amyloid-like+protein+aggregates+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Huntingtin-encoded polyglutamine expansions form amyloid-like protein aggregates in vitro and in vivo.</a> Cell. 90 (3), 549-558 (1997).</li>
<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+polyglutamine-containing+huntingtin+fragments+into+amyloid-like+fibrils%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).</li>
<li>Muchowski, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+hsp40+chaperones+can+inhibit+self-assembly+of+polyglutamine+proteins+into+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and hsp40 chaperones can inhibit self-assembly of polyglutamine proteins into amyloid-like fibrils.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (14), 7841-7846 (2000).</li>
<li>Heiser, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+huntingtin+fibrillogenesis+by+specific+antibodies+and+small+molecules%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inhibition of huntingtin fibrillogenesis by specific antibodies and small molecules: implications for Huntington's disease therapy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 97 (12), 6739-6744 (2000).</li>
<li>Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+nuclear+or+cytoplasmic+protein+aggregates+precedes+inclusion+body+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation.</a> Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).</li>
<li>Tam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chaperonin+TRiC+blocks+a+huntingtin+sequence+element+that+promotes+the+conformational+switch+to+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">The chaperonin TRiC blocks a huntingtin sequence element that promotes the conformational switch to aggregation.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 16 (12), 1279-1285 (2009).</li>
<li>Nekooki-Machida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+conformations+of+in+vitro+and+in+vivo+amyloids+of+huntingtin-exon1+show+different+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).</li>
<li>Wacker, J. L., Zareie, M. H., Fong, H., Sarikaya, M., Muchowski, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+and+Hsp40+attenuate+formation+of+spherical+and+annular+polyglutamine+oligomers+by+partitioning+monomer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 and Hsp40 attenuate formation of spherical and annular polyglutamine oligomers by partitioning monomer.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 11 (12), 1215-1222 (2004).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+recognize+distinct+conformational+epitopes+formed+by+polyglutamine+in+a+mutant+huntingtin+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).</li>
<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+huntingtin+fragments+form+oligomers+in+a+polyglutamine+length-dependent+manner+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mutant huntingtin fragments form oligomers in a polyglutamine length-dependent manner in vitro and in vivo.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (19), 14777-14790 (2010).</li>
<li>Nucifora, L. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+potentially+toxic+oligomers+formed+in+vitro.+from+mammalian-derived+expanded+huntingtin+exon-1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Identification of novel potentially toxic oligomers formed in vitro. from mammalian-derived expanded huntingtin exon-1 protein.</a> Journal of Biological Chemistry. 287 (19), 16017-16028 (2012).</li>
<li>Dahlgren, P. R., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17292058">Atomic force microscopy analysis of the Huntington protein nanofibril formation.</a> Nanomedicine. 1 (1), 52-57 (2005).</li>
<li>Poirier, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+spheroids+and+protofibrils+as+precursors+in+polyglutamine+fibrilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Huntingtin spheroids and protofibrils as precursors in polyglutamine fibrilization.</a> Journal of Biological Chemistry. 277 (43), 41032-41037 (2002).</li>
<li>Duim, W. C., Chen, B., Frydman, J., Moerner, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sub-diffraction+imaging+of+huntingtin+protein+aggregates+by+fluorescence+blink-microscopy+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Sub-diffraction imaging of huntingtin protein aggregates by fluorescence blink-microscopy and atomic force microscopy.</a> Chemphyschem. 12 (13), 2387-2390 (2011).</li>
<li>Pieri, L., Madiona, K., Bousset, L., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+alpha-synuclein+and+huntingtin+exon+1+assemblies+are+toxic+to+the+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Fibrillar alpha-synuclein and huntingtin exon 1 assemblies are toxic to the cells.</a> Biophysical Journal. 102 (12), 2894-2905 (2012).</li>
<li>Monsellier, E., Redeker, V., Ruiz-Arlandis, G., Bousset, L., Melki, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+interaction+between+the+chaperone+Hsc70+and+the+N-terminal+flank+of+huntingtin+exon+1+modulates+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular interaction between the chaperone Hsc70 and the N-terminal flank of huntingtin exon 1 modulates aggregation.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (5), 2560-2576 (2015).</li>
<li>Isas, J. M., Langen, R., Siemer, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-State+Nuclear+Magnetic+Resonance+on+the+Static+and+Dynamic+Domains+of+Huntingtin+Exon-1+Fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Solid-State Nuclear Magnetic Resonance on the Static and Dynamic Domains of Huntingtin Exon-1 Fibrils.</a> Biochemistry. 54 (25), 3942-3949 (2015).</li>
<li>Malakhov, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUMO+fusions+and+SUMO-specific+protease+for+efficient+expression+and+purification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Function+Genomics%22%5BJournal%5D)">SUMO fusions and SUMO-specific protease for efficient expression and purification of proteins.</a> Journal of Structural Function Genomics. 5 (1-2), 75-86 (2004).</li>
<li>Mossessova, E., Lima, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ulp1-SUMO+crystal+structure+and+genetic+analysis+reveal+conserved+interactions+and+a+regulatory+element+essential+for+cell+growth+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Ulp1-SUMO crystal structure and genetic analysis reveal conserved interactions and a regulatory element essential for cell growth in yeast.</a> Molecular Cell. 5 (5), 865-876 (2000).</li>
<li>Kumari, S., Pal, R. K., Gupta, R., Goel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+Resolution+X-ray+Diffraction+Dataset+for+Bacillus+licheniformis+Gamma+Glutamyl+Transpeptidase-acivicin+complex%3A+SUMO-Tag+Renders+High+Expression+and+Solubility%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Journakl%22%5BJournal%5D)">High Resolution X-ray Diffraction Dataset for Bacillus licheniformis Gamma Glutamyl Transpeptidase-acivicin complex: SUMO-Tag Renders High Expression and Solubility.</a> Protein Journakl. 36 (1), 7-16 (2017).</li>
<li>Zhang, J., Sun, A., Dong, Y., Wei, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+Production+and+Characterization+of+SAC%2C+the+Core+Domain+of+Par-4%2C+by+SUMO+Fusion+System%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Biochemistry+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Recombinant Production and Characterization of SAC, the Core Domain of Par-4, by SUMO Fusion System.</a> Applied Biochemistry and Biotechnology. , (2017).</li>
<li>Reif, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semisynthesis+of+biologically+active+glycoforms+of+the+human+cytokine+interleukin+6%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition+English%22%5BJournal%5D)">Semisynthesis of biologically active glycoforms of the human cytokine interleukin 6.</a> Angewandte Chemie International Edition English. 53 (45), 12125-12131 (2014).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> Journal of Visualized Experiments. (6), 253(2007).</li>
<li>Smith, B. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20512673">SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis of Proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 1, 41-55 (1984).</li>
<li>Lawrence, A. M., Besir, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+proteins+in+gels+with+Coomassie+G-250+without+organic+solvent+and+acetic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Staining of proteins in gels with Coomassie G-250 without organic solvent and acetic acid.</a> Journal of Visualized Experiments. (30), (2009).</li>
<li>Block, H., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19892187">Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review.</a> Methods in Enzymology. 463, 439-473 (2009).</li>
<li>Chen, S. M., Wetzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+disaggregation+of+polyglutamine+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides.</a> Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).</li>
<li>Booth, D. S., Avila-Sakar, A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+proteins+and+macromolecular+complexes+by+negative+stain+EM%3A+from+grid+preparation+to+image+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Visualizing proteins and macromolecular complexes by negative stain EM: from grid preparation to image acquisition.</a> Journal of Visualized Experiments. (58), (2011).</li>
<li>O'Nuallain, B., et al. Kinetics and thermodynamics of amyloid assembly using a high-performance liquid chromatography-based sedimentation assay. Amyloid, Prions, and Other Protein Aggregates, Pt C. 413, 34-74 (2006).</li>
<li>Greenfield, N. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15063655">Analysis of circular dichroism data.</a> Methods in Enzymology. 383, 282-317 (2004).</li>
<li>Aiken, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+threonine+3%3A+implications+for+Huntingtin+aggregation+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of threonine 3: implications for Huntingtin aggregation and neurotoxicity.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (43), 29427-29436 (2009).</li>
<li>Satakarni, M., Curtis, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+peptides+as+fusions+with+SUMO%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant peptides as fusions with SUMO.</a> Protein Expression and Purification. 78 (2), 113-119 (2011).</li>
<li>Davies, H. A., Wilkinson, M. C., Gibson, R. P., Middleton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+aortic+amyloid+polypeptide+medin%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the aortic amyloid polypeptide medin.</a> Protein Expression and Purification. 98, 32-37 (2014).</li>
<li>Chen, S., Wetzel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubilization+and+disaggregation+of+polyglutamine+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Science%22%5BJournal%5D)">Solubilization and disaggregation of polyglutamine peptides.</a> Protein Science. 10 (4), 887-891 (2001).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie pozostają w konflikcie interesów z treścią niniejszego artykułu.

W tym protokole przedstawiliśmy skuteczną procedurę uzyskiwania miligramowych ilości natywnego, nieoznakowanego Httex1 zawierającego 23 lub 43 reszty glutaminy. Osiągnięto to poprzez ekspresję Httex1 jako C-końcowej fuzji do znacznika His 6-SUMO, który jest używany do izolowania białka fuzyjnego z lizatu komórkowego przez IMAC i jest rozszczepiany przed oczyszczaniem Httex1 metodą HPLC. Podczas gdy strategia SUMO została wykorzystana do produkcji kilku innych białek, nasza metoda pokazuje, że unikalne właściwości SUMO mogą być również wykorzystane do generowania wewnętrznie nieuporządkowanego, podatnego na agregację, amyloidogennego białka, które wcześniej okazało się niezwykle trudne w obsłudze i produkcji43,44. Przedstawiamy protokół, który jest prosty, łatwy w użyciu i porównywalny z protokołem wytwarzania "dobrze zachowującego się" białka. Fuzja SUMO rozpuszcza i stabilizuje Httex1 podczas etapu odciągania i oczyszczania IMAC. Przedwczesne rozszczepienie znacznika, zaobserwowane w przypadku strategii intein10 i agregacji, nie stanowiło już problemu.
Białka wewnętrznie nieuporządkowane są szczególnie podatne na degradację. Chociaż degradacja N-terminala w regionie N17 nie stanowi problemu przy użyciu tego protokołu, mogą wystąpić obcięcia w PRD Httex1. Ponieważ obcięte białka są bardzo podobne do Httex1 pod względem hydrofobowości, ładunku i wielkości, usunięcie ich za pomocą środków chromatograficznych jest trudne, dlatego najlepiej jest w pierwszej kolejności zapobiec ich powstawaniu. Ścisłe trzymanie się protokołu, zawsze praca na lodzie i stosowanie wystarczającej ilości inhibitora proteazy powinno pomóc w utrzymaniu obserwowanego obcięcia na bardzo niskim poziomie. Zastosowanie znacznika fuzyjnego na C-końcu Httex1 może łatwo usunąć obcięcia w PRD, ponieważ obcięte białko również straciłoby znacznik powinowactwa. Jeśli jednak sekwencja natywna musi zostać zachowana, opcja ta nie może być zastosowana, ponieważ Httex1 kończy się proliną i zgodnie z naszą najlepszą wiedzą nie ma C-końcowych znaczników fuzji, o których wiadomo, że indukują bezśladowe i skuteczne rozszczepienie po prolinie.
Najbardziej krytyczną częścią protokołu jest obsługa Httex1 uwolnionego po rozszczepieniu znacznika SUMO przez ULP1. Białko należy natychmiast oczyścić za pomocą RP-HPLC. Na szczęście jest to wydajna i szybka reakcja, która zwykle kończy się w ciągu 10-20 minut w temperaturze 4 °C. W przeciwieństwie do tego, strategia inteiny wymagała kilku godzin na całkowite rozszczepienie inteiny, co wymagało kompromisu między niepełnym rozszczepieniem a początkową agregacją w celu maksymalizacji wydajności. W przypadku zmutowanego Httex1 wymagana jest szybka obróbka, ponieważ zacznie on agregować przy stosunkowo wysokim stężeniu obecnym w reakcji rozszczepienia, podczas gdy wariant 23Q jest stabilny przez dłuższy czas. Podczas oczyszczania RP-HPLC uwidacznia się kolejna zaleta SUMO: podczas gdy inteina Ssp DnaB jest hydrofobowa i silnie przylega do kolumny, SUMO jest bardziej hydrofilowa i całkowicie wymywa się z kolumny C4 o odwróconej fazie. Chociaż komercyjny ULP1 jest dość kosztowny, białko można łatwo wyprodukować z wysoką wydajnością zgodnie z wcześniej opublikowanymi protokołami29.
Nie można wystarczająco podkreślić krytycznego znaczenia zastosowania protokołu dezagregacji przed użyciem Httex1. Liofilizowane białka polyQ, takie jak Httex1, są stabilne i mogą być przechowywane przez długi czas, ale nie są całkowicie rozpuszczalne w wodzie i. Obecność wstępnie uformowanych oligomerów lub włókienek może mieć znaczący wpływ na kinetykę agregacji i właściwości biofizyczne białka45. Opisany tutaj protokół dezagregacji pozwala na dezagregację białka, usunięcie wstępnie uformowanych agregatów i wytworzenie roztworu monomerycznego Httex1 z liofilizowanej próbki. Zaobserwowaliśmy podobną kinetykę agregacji i morfologię włókienek dla Httex1 uzyskanych za pomocą SUMO i strategii inteiny.
W porównaniu z poprzednimi metodami wytwarzania Httex1, opisana tutaj strategia SUMO oferuje kilka zalet i rozszerza zakres możliwych badań w celu zbadania struktury i właściwości funkcjonalnych tego białka w zdrowiu i chorobie. Białko fuzyjne SUMO-Httex1 jest łatwe w obsłudze, można je zamrozić i przechowywać lub przechowywać w roztworze przez 24 godziny w temperaturze otoczenia, podczas gdy wolny mHttex1 szybko się agreguje. Stabilność i wysoka rozpuszczalność białek fuzyjnych SUMO-Httex1 zapewnia większą elastyczność w manipulowaniu białkiem i/lub wprowadzaniu modyfikacji enzymatycznych i chemicznych do mHttex1, które w innym przypadku nie byłyby możliwe po rozszczepieniu. Obejmuje to wprowadzenie modyfikacji potranslacyjnych, fluoroforów, znaczników spinowych, znaczników biotyny itp. Zaprezentowane tutaj postępy powinny 1) ułatwić przyszłe badania w celu wyjaśnienia zależności struktura-funkcja Httex1; 2) opracowanie nowych narzędzi do badania agregacji Htt i rozprzestrzeniania się patologii; 3) umożliwienie opracowania nowych testów w celu identyfikacji cząsteczek stabilizujących zmutowany Httex1 i zapobiegających jego agregacji; oraz 4) zachęcić naukowców z innych dziedzin do podjęcia prac nad tym białkiem i przyłączenia się do naszego dążenia do znalezienia lekarstwa na chorobę Huntingtona.

Htt jest białkiem o masie 348 kDa i bierze udział w kilku funkcjach fizjologicznych1. Gdy Htt zawiera rozszerzony region polyQ składający się z więcej niż 36 reszt na swoim N-końcu, powoduje HD2,3. Patologia HD charakteryzuje się inkluzjami komórkowymi w prążkowiu i korze, co prowadzi do śmierci neuronów i atrofii dotkniętych tkanek4,5. Kilka N-końcowych fragmentów Htt, które zawierają drogę powtórzeń polyQ, zostało wykrytych w pośmiertnych mózgach pacjentów z HD i uważa się, że są generowane przez proteolityczne przetwarzanie białka huntingtyny6. Ostatnie badania sugerują, że Httex1 może również powstawać w wyniku nieprawidłowego splicingu mRNA. Httex1 zawiera patologiczną mutację polyQ, a jej nadekspresja u zwierząt może podsumować wiele kluczowych cech HD7, podkreślając w ten sposób możliwą centralną rolę tego fragmentu w patologii HD i progresji choroby6,8,9.
Ze względu na wysoką skłonność do agregacji zmutowanego Httex1 (mHttex1) z ekspandowanym traktem polyQ, większość istniejących systemów ekspresji opiera się na przejściowej fuzji Httex1 z białkami (takimi jak S-transferaza glutationu (GST), tioredoksyna (TRX) lub białko wiążące maltozę (MBP) i/lub peptydy (polihistydyna), które w różny sposób poprawiają jego ekspresję, stabilność, oczyszczanie i/lub rozpuszczalność10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28. Partner fuzyjny jest połączony z Httex1 krótką sekwencją zawierającą miejsce rozszczepienia proteaz, takich jak trypsyna, proteaza wirusa wytrawiania tabakowego (TEV) lub PreScission, aby umożliwić rozszczepienie i uwolnienie Httex1 przed rozpoczęciem agregacji lub oczyszczania. Do wad tych metod należy możliwość pozostawienia dodatkowych pozostałości z powodu nieśladowego rozszczepienia oraz tworzenia ściętych fragmentów z powodu nieprawidłowego rozszczepienia w sekwencji Httex1, a także niejednorodność spowodowana niepełnym rozszczepieniem (zobacz Vieweg et al., aby uzyskać bardziej szczegółowe omówienie zalet i ograniczeń tego podejścia)10. Aby rozwiązać te problemy, niedawno opracowaliśmy strategię ekspresji, która po raz pierwszy umożliwia wygenerowanie natywnego Httex1 bez znaczników poprzez wykorzystanie przejściowej N-końcowej fuzji Synechocystis sp. (Jednoodparty) DnaB intein do Httex110. Podczas gdy rozszczepienie inteiny jest bezśladowe i specyficzne i daje mg ilości białek, nadal ma dwie wady, które mogą zmniejszyć wydajność: a mianowicie przedwczesne rozszczepienie inteiny, które może wystąpić podczas odciągania, oraz fakt, że rozszczepienie następuje w ciągu kilku godzin, co może prowadzić do utraty białka w wyniku agregacji, szczególnie w przypadku Httex1 z ekspandowanymi powtórzeniami poliQ.
Aby rozwiązać te ograniczenia i udoskonalić naszą strategię produkcji natywnego, wolnego od tagów Httex1, opracowaliśmy nowy system ekspresji oparty na przejściowym połączeniu SUMO, a dokładniej na homologu drożdży Smt3 do Httex1. Zastosowanie systemu SUMO do produkcji białek rekombinowanych zostało po raz pierwszy opublikowane w 2004 roku29, gdzie wykazano zwiększoną szybkość ekspresji i rozpuszczalności białka fuzyjnego SUMO. Znacznik SUMO może zostać rozszczepiony przez ubikwitynę, podobną do białka proteazy 1 (ULP1), która nie wymaga miejsca rozpoznania, ale rozpoznaje trzeciorzędową strukturę SUMO i praktycznie eliminuje możliwość błędnego rozszczepienia30. Co więcej, rozszczepienie, w którym pośredniczy ULP1, jest szybkie i bezśladowe oraz nie pozostawia dodatkowych pozostałości. Przedwczesne rozszczepienie znacznika fuzyjnego, obserwowane w przypadku autokatalitycznego intein10, jest całkowicie unikane dzięki wymogowi zewnętrznej proteazy. Podczas gdy strategia SUMO jest obecnie szeroko stosowana do produkcji białek rekombinowanych31,32,33, w tym artykule pokazujemy, że jest ona szczególnie przydatna do generowania wewnętrznie nieuporządkowanego, podatnego na agregację, amyloidogennego białka, takiego jak Httex1. Wierzymy, że prostota, wydajność i solidność naszej metody opartej na syntezie jądrowej SUMO sprawi, że natywny, wolny od znaczników Httex1 będzie bardziej dostępny dla badaczy z różnych dyscyplin i wyeliminuje potrzebę stosowania nienatywnych sekwencji Httex1 in vitro. Jest to ważny postęp, który ułatwi przyszłe badania w celu wyjaśnienia zależności struktura-funkcja Httex1.
Protokół opisuje oczyszczanie Httex1 z 12 L kultury bakteryjnej, ale protokół może być łatwo dostosowany do produkcji na mniejszą lub większą skalę. Protokół opisuje produkcję Httex1 typu dzikiego (wtHttex1) o długości powtórzeń polyQ poniżej (23Q) i zmutowanego Httex1 (mHttex1) o długości powtórzeń polyQ powyżej (43Q) progu patogennego (36Q).

<table><tbody><tr><td>Mrówczan uranylu (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, siatki Cu 50</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell wykonany z kwarcu SUPRASIL 1 mm ścieżka światła od Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Substancja buforowa Dulbecco's (PBS w/o Ca i Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Rosół Luria (bulion Miller's LB)</td><td>&nbsp; Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>Izopropyl &beta;-D-1-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cKompletny&nbsp; Koktajl inhibitorów proteazy</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało przeciw huntingtynie, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat anty-mysie IgG (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 kolumna&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna HPLC C4</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168. P0</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 10 &mikro; m C4 300 & Aring;, Kolumna LC 250 x 21,2 mm, Phenomenex, 19x10 mm kolumna ochronna, bez płaszcza temperaturowego</td></tr><tr><td>Acetonitryl HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre sterile</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr pół-mikro kuweta</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, Złączki 1/16" (&Auml; KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Probówki do FPLC 16 x 100 mm, kapsel 12,0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 100 kD Microcon&nbsp; filtry szybkiego przepływu</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 ultradźwiękowy procesor cieczy</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA 900 wyposażony w kolektor frakcji&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 System UPLC do dichroizmu cyrkularnego</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters&nbsp;</td><td>Wody</td><td></td><td>C8 BEH uniewinnienie 2,1x100 mm kolumna 1,7 mikrona&nbsp; , kolumna podgrzewana (40 &deg; C), natężenie przepływu 0,6 ml/min, objętość wtrysku 4 &mu; System</td></tr><tr><td>HPLC L waters</td><td>Detektor UV Waters</td><td></td><td>2489 i moduł gradientu czwartorzędowego 2535, pętla 20 mL w obudowie FlexInject</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher Naukowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>przyrząd do liofilizacji</td><td>FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN&nbsp;</td>Mikroskop elektronowy <td>FEI</td><td></td><td>wyposażony w pistolet LaB6 i kamerę CCD 4K x 4K FEI Eagle (FEI) i pracujący przy napięciu 80 kV</td></tr><tr><td>37 & stopni; C drżenie&nbsp; inkubator</td><td>Infors HT multitron Biofotometr standardowy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

generowanie natywnego, nieznakowanego monomeru i włókien eksonu huntingtyny1 przy użyciu strategii fuzji sumo

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Choroba Huntingtona (HD) jest dziedziczną śmiertelną chorobą neurodegeneracyjną spowodowaną ekspansją CAG (≥36) w pierwszym eksonie genu HD, co skutkuje ekspresją białka huntingtyny (Htt) lub jego N-końcowych fragmentów z ekspandowanym odcinkiem poliglutaminy (polyQ).
Ekson1 białka huntingtyny (Httex1) jest najmniejszym fragmentem Htt, który podsumowuje wiele cech HD w modelach komórkowych i zwierzęcych i jest jednym z najczęściej badanych fragmentów Htt. Niewielki rozmiar Httex1 sprawia, że jest on eksperymentalnie bardziej podatny na charakterystykę biofizyczną przy użyciu technik standardowych i wysokorozdzielczych w porównaniu z dłuższymi fragmentami lub pełnowymiarowymi Htt. Jednak wysoka skłonność do agregacji zmutowanego Httex1 (mHttex1) ze zwiększoną zawartością polyQ (≥42) utrudniła opracowanie wydajnych systemów ekspresji i oczyszczania w celu wytworzenia tych białek w wystarczających ilościach i udostępnienia ich naukowcom z różnych dyscyplin bez użycia białek fuzyjnych lub innych strategii zmieniających natywną sekwencję białka. Przedstawiamy tutaj solidną i zoptymalizowaną metodę produkcji miligramowych ilości natywnego, bezznacznikowego Httex1 opartego na przejściowym połączeniu małego modyfikatora związanego z ubikwityną (SUMO). Prostota i skuteczność strategii wyeliminuje potrzebę stosowania nienatywnych sekwencji Httex1, dzięki czemu białko to stanie się bardziej dostępne dla badaczy i poprawi odtwarzalność eksperymentów w różnych laboratoriach. Wierzymy, że te postępy ułatwią również przyszłe badania mające na celu wyjaśnienie zależności struktura-funkcja Htt, a także opracowanie nowych narzędzi diagnostycznych i terapii do leczenia lub spowolnienia postępu HD.

Httex1 jest wyrażany w E. coli z N-końcowym znacznikiem His6-SUMO. Reprezentatywne wyniki ekspresji i oczyszczania białka fuzyjnego przedstawiono na Rysunku 1. Sekwencja Httex1 składa się z reszt 2-90 białka Htt i zaczyna się od Ala2, ponieważ Met1 jest całkowicie odcinany in vivo42. Numeracja aminokwasów odnosi się do wariantu 23Q; pełna sekwencja wyrażonego białka fuzyjnego pokazana jest na Rysunku 1A. Plazmidy zostaną w najbliższym czasie zdeponowane w Addgene, aby udostępnić je społeczności naukowej. Schemat plazmidu oraz wyrażonego białka fuzyjnego przedstawiono na Rysunku 1B. His6-SUMO Httex1 wykazuje średni poziom ekspresji (Rysunek 1C), a większość białka fuzyjnego znajduje się w frakcji rozpuszczalnej po lizie, zarówno dla wariantu 23Q, jak i 43Q. Białko fuzyjne migruje wyżej niż oczekiwano na podstawie masy cząsteczkowej. Wynika to częściowo z silnego zwinięcia białka SUMO, ale głównie z nietypowego składu sekwencji Httex1, zawierającej przede wszystkim reszty glutaminy i proliny. Zarówno białko fuzyjne typu dzikiego (23Q), jak i zmutowane (43Q) można wzbogacić do czystości ok. 80% za pomocą IMAC (Rysunek 1D). Obecność współoczyszczonych białek gospodarza można wyjaśnić stosunkowo niskim poziomem ekspresji Httex1 oraz dużą objętością próbki nałożonej na kolumnę.
Odszczepienie znacznika His6-SUMO oraz oczyszczanie Httex1 przedstawiono na Rysunku 2A. UPLC jest wydajnym narzędziem do monitorowania odszczepiania znacznika His6-SUMO (Rysunek 2B). Pierwotny pik białka fuzyjnego znika, a pojawiają się dwa nowe, dobrze oddzielone piki odpowiadające znacznikowi His6-SUMO oraz białku Httex1. Reakcja odszczepiania kończy się w ciągu 10-20 min. Metoda Western Blot (WB) jest zbyt powolna, aby efektywnie monitorować reakcję odszczepiania, ale została uwzględniona na rysunku dla odniesienia i w celu wykazania kompletności odszczepienia SUMO. Zarówno Httex1 23Q, jak i 43Q można skutecznie oddzielić od znacznika His6-SUMO za pomocą RP-HPLC (Rysunek 2C), a uzyskane białka charakteryzowały się wysoką czystością, co potwierdzono w analizach UPLC, MS i SDS-PAGE (Rysunek 2D).
Aby wykazać, że białka Httex1 przygotowane tą metodą zachowują oczekiwane właściwości agregacyjne Httex1, oceniliśmy kinetykę fibrylizacji mutantu Httex1 w temperaturze 37 °C za pomocą testu sedymentacyjnego, monitorowaliśmy zmiany w strukturze drugorzędowej metodą spektroskopii CD oraz scharakteryzowaliśmy morfologię agregatów za pomocą TEM. Reprezentatywny zestaw danych dotyczących kinetyki agregacji w procesie tworzenia włókien mHttex1, wyznaczony za pomocą testu sedymentacyjnego, przedstawiono na Rysunku 3A. Ubytek rozpuszczalnego Httex1 43Q w czasie, wynikający z tworzenia się włókien, określono ilościowo za pomocą UPLC. Obserwujemy całkowite wyczerpanie rozpuszczalnego białka po 48 godzinach inkubacji. Dodatkowo, za pomocą spektroskopii CD określiliśmy strukturę drugorzędową białka (Rysunek 3B). Httex1 43Q zmienia swoją strukturę z nieuporządkowanej (λmin 205 nm) na konformację zdominowaną przez harmonijkowe struktury β (λmin 215 nm) po 48 godzinach inkubacji. Zmiana strukturalna ta wiąże się z tworzeniem długich agregatów włóknistych, co jest widoczne w TEM po 48 godzinach (Rysunek 3C).
<img alt="Ekspresja białek, rozpuszczalność, oczyszczanie; analiza elektroforetyczna, chromatografia; mapa plazmidu, indukcja IPTG." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rycina 1Ekspresja i oczyszczanie białka His6-białko fuzyjne SUMO Httex1.  
(A) sekwencja aminokwasowa His6-SUMO-Httex1-QN konstrukty fuzyjne (His6-SUMO w kolorze zielonym i Httex1-QN w kolorze pomarańczowym); (B) Schematyczny przegląd ekspresji i oczyszczania białka fuzyjnego; (C) analiza SDS-PAGE ekspresji i rozpuszczalności białka fuzyjnego po lizie; (D) Chromatogram z oczyszczania białka fuzyjnego metodą IMAC oraz analiza frakcji za pomocą SDS-PAGE (czerwony pasek: frakcja nieprzypisana, nieprzypływająca; niebieski pasek: frakcja płucząca, czarny pasek: frakcje zawierające pik elucyjny); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Oczyszczanie białek; chromatogramy HPLC, wyniki SDS-PAGE, wykazujące odszczepienie SUMO, etapy oczyszczania." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rycina 2Odcięcie znacznika His6 Znacznik SUMO i oczyszczanie białka Httex1-Q pozbawionego znacznikaN białka 
(A) schematyczny przegląd; (B) analiza odszczepienia znacznika SUMO przez ULP1 metodą UPLC (kolor niebieski: przed dodaniem ULP1; kolor czarny: odpowiednio 20 min (23Q) lub 10 min (43Q) po dodaniu ULP1) oraz WB (MAB5492 1:200, wtórne przeciwciało kozie przeciwko mysich 1:50); (C) Chromatogram preparatywnego oczyszczania Httex1 metodą RP-HPLC; D: analiza oczyszczonego Httex1 za pomocą UPLC, SDS-PAGE i ESI-MS; oczekiwana masa cząsteczkowa wynosi odpowiednio 9943 Da (23Q) i 12506 Da (43Q). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza agregacji białek; wykres, widma CD, obraz z mikroskopii elektronowej; rozpuszczalność, analiza strukturalna." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rycina 3Agregacja Httex1-43Q: (A) Analiza sedymentacyjna oparta na UPLC. (B) widma CD struktury drugorzędowej w 0 h i 48 h. (C) Mikrografie TEM agregatów po 48 h (paski skali wynoszą 20 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy solidny i zoptymalizowany protokół produkcji miligramowych ilości natywnych, bezznacznikowych monomerów i włókienek eksonu1 białka huntingtyny (Httex1) w oparciu o przejściową fuzję małego modyfikatora związanego z ubikwityną (SUMO).

Generowanie natywnego, nieznakowanego monomeru i włókien eksonu huntingtyny1 przy użyciu strategii fuzji SUMO

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Metoda ta pozwala nam na wytworzenie bezznacznikowego eksonu zawierającego natywną sekwencję białka i daje nowe możliwości badania funkcji struktury tego białka, umożliwiając nam w ten sposób zrozumienie jego funkcji w zdrowiu i chorobie. Głównymi zaletami są tutaj prostota, wydajność i solidność metody. Eliminując niejednorodność sekwencji, metoda ta umożliwi i ułatwi porównywanie i odtwarzalność w różnych laboratoriach.Chociaż metoda ta została opracowana do produkcji eksonu huntingtyny, może być również stosowana do innych systemów podatnych na agregację, takich jak peptyd beta amyloidu i alfa-synukleina. Najpierw przefiltruj wcześniej wyizolowany supernatant zawierający ekson jednego białka fuzyjnego eksonu huntingtyny His-SUMO za pomocą filtra strzykawkowego o średnicy 0,45 mikrometra. Usunąć 20-mikrolitrową próbkę przefiltrowanego supernatantu do analizy SDS-PAGE.Wlej oczyszczony lizat do Superloop. Wyizolować ekson huntingtyny His-SUMO jedno białko fuzyjne z oczyszczonego lizatu bakteryjnego za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metalu w systemie szybkiej chromatografii cieczowej w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Przepuścić 10 objętości kolumny lub 200 mililitrów buforu A z prędkością 10 mililitrów na minutę, aby wypłukać niezwiązane białka.Eluuj białko fuzyjne o objętości 2,5 kolumny lub 50 mililitrach 100% buforu B z prędkością dwóch mililitrów na minutę. Weź 20 mikrolitrów każdej frakcji do analizy SDS-PAGE. Dodaj 20 mikrolitrów barwnika ładującego do każdej próbki.Załadować dwa mikrolitry białka surowego, frakcję niezwiązaną, frakcję płuczącą i każdą frakcję piku elucji na 15% żel. Uruchom żel na 90 minut przy napięciu 180 woltów. Po zakończeniu biegu zabarwić żel barwnikiem Coomassie zgodnie z instrukcjami producenta.Zebrać frakcje zawierające białko fuzyjne zgodnie z pikiem chromatogramu. Następnie dodaj 100-milimolowy DTT i 100-milimolowy L-cysteinę do połączonych frakcji i rozpuść, delikatnie odwracając probówkę. Aby przygotować rozpuszczalnik A do oczyszczania metodą HPLC, dodaj dwa mililitry kwasu trifluorooctowego do dwulitrowej butelki wody.Aby przygotować rozpuszczalnik B, dodaj 2,5 mililitra kwasu trifluorooctowego do 2,5-litrowej butelki acetonitrylu. Przygotować system HPLC zgodnie z sugestią producenta. Wykonaj pusty przebieg, aby upewnić się, że kolumna jest czysta.Następnie należy pobrać 100 mikrolitrów białka fuzyjnego przed dodaniem ULP1, aby monitorować reakcję rozszczepienia przez UPLC. Przenieś 20 mililitrów białka fuzyjnego do nowej 50-mililitrowej probówki i dodaj 0,4 mililitra roztworu podstawowego ULP1. Inkubować próbkę na lodzie, a pozostałe białko fuzyjne utrzymywać na lodzie.Nie przechowuj białka na etapach pośrednich i kontynuuj oczyszczanie aż do zakończenia. Co 10 minut usuwaj 100 mikrolitrów reakcji rozszczepienia, aby monitorować postęp UPLC. Po odwirowaniu próbek przeanalizować dwa mikrolitry każdego supernatantu za pomocą UPLC.Porównać chromatogramy uzyskane dla próbki przed dodaniem ULP1 i próbki pobrane później. Po zakończeniu rozszczepienia SUMO przefiltruj próbkę za pomocą 22-mikrometrowego filtra strzykawkowego. Następnie oczyść przefiltrowaną próbkę za pomocą HPLC z odwróconymi fazami.Analizuj frakcje HPLC za pomocą UPLC i ESI-MS. Frakcje basenowe o podobnej czystości w 50-mililitrowych plastikowych tubach. Zamrozić próbki w ciekłym azocie i poddać liofilizowaniu.Następnie przenieś liofilizowane białko do dwumililitrowych plastikowych tubek i przechowuj w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Rozpuść 100 mikrogramów liofilizowanego eksonu huntingtyny jeden na osiem mikrolitrów czystego kwasu trifluorooctowego w 1,5-mililitrowej probówce. Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej ostrożnie odparować kwas trifluorooctowy pod wyciągiem ze strumieniem azotu lub argonu.Gdy białko wyschnie, rozpuść je w 100 mikrolitrach wody. Następnie przeanalizuj dwa mikrolitry próbki za pomocą UPLC. Teraz wymieszaj 20 mikrolitrów roztworu białkowego z 20 mikrolitrami barwnika o 2-krotnym obciążeniu.Analizuj próbki białek o wielkości od 1 do 10 mikrogramów za pomocą SDS-PAGE. Uruchom żel na 90 minut przy napięciu 180 woltów. Po zakończeniu biegu zabarwić żel barwnikiem Coomassie zgodnie z instrukcjami producenta.Przygotuj 10 mililitrów DPBS w 50-mililitrowej tubce. Przefiltruj roztwór DPBS przez filtr 2-mikrometrowy przed każdym użyciem. Następnie rozpuść 150 mikrolitrów liofilizowanego eksonu huntingtyny jeden na 12 mikrolitrów czystego kwasu trifluorooctowego w 1,5-milimetrowej probówce.Po inkubacji przez 20 minut w temperaturze pokojowej ostrożnie odparować kwas trifluorooctowy w dygestorium ze strumieniem azotu lub argonu. Rozpuść zdezagregowane białko w jednym mililitrze wstępnie schłodzonego DPBS i dostosuj pH między 7,2 a 7,4 za pomocą jednego molowego wodorotlenku sodu. Następnie przefiltruj roztwór białka przez 100-kilodaltonowy filtr odśrodkowy do 1,5-mililitrowych plastikowych rurek.Określ stężenie eksonu huntingtyny za pomocą krzywej kalibracyjnej UPLC opartej na analizie aminokwasów. Następnie oblicz ilość DPBS, którą należy dodać, aby uzyskać stężenie trzymikromolowego eksonu huntingtyny jeden. Rozcieńczyć białko do trzech mikromolów, dodając obliczoną ilość DPBS do probówki.Trzymaj probówkę na lodzie do momentu rozpoczęcia protokołu agregacji. Walidacja za pomocą elektromikroskopii i innych technik musi zostać przeprowadzona w celu sprawdzenia, czy protokół dezagregacji skutecznie usunął wszelkie wstępnie uformowane agregaty. Pełna sekwencja aminokwasowa wyrażonego białka fuzyjnego jest pokazana tutaj.Schemat plazmidu i wyrażonego białka fuzyjnego jest wyświetlany tutaj. Ekson huntingtyny His-SUMO ulega ekspresji na średnim poziomie, a większość białka fuzyjnego jest obecna we frakcji rozpuszczalnej po lizie, zarówno dla wariantu 23 glutamin, jak i 43 glutaminy. Zarówno białko fuzyjne typu dzikiego, jak i zmutowanego może być wzbogacone do około 80% czystości za pomocą unieruchomionej chromatografii powinowactwa do metali.Rozszczepienie znacznika His-SUMO i oczyszczanie pierwszego eksonu huntingtyny są pokazane tutaj. Pierwotny pik białka fuzyjnego jest konsumowany i pojawiają się dwa nowe i dobrze oddzielone piki odpowiadające znacznikowi His-SUMO i eksonowi huntingtyny jeden. Zarówno ekson huntingtyny jeden 23 glutaminy, jak i 43 glutaminy mogą być oddzielone od znacznika His-SUMO przez HPLC z odwróconymi fazami i zostały uzyskane w wysokiej czystości, jak wykazano w analizie UPLC, MS i SDS-PAGE.Kinetyka agregacji egzonu m-huntingtyny w tworzeniu jednego fibrylu określona za pomocą testu sedymentacyjnego wykazuje całkowite wyczerpanie rozpuszczalnego białka po 48 godzinach inkubacji. Spektroskopia CD drugorzędowej struktury białka pokazuje przesunięcie eksonu 43 glutaminy eksonu huntingtyny z konformacji nieustrukturyzowanej do konformacji bogatej w arkusze beta. Tej zmianie strukturalnej towarzyszy tworzenie się długich agregatów fibrylarnych, co obserwuje się za pomocą TEM.Po opanowaniu, ta metoda ekspresji i oczyszczania eksonu huntingtyny może być przeprowadzona w ciągu trzech dni, jeśli jest wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, bardzo ważne jest, aby pamiętać, że białka eksonu pierwszego huntingtyny, szczególnie białko z ekspandowanym odcinkiem poliglutaminy, mają bardzo wysoką skłonność do agregacji. Dzięki tej metodzie, jesteśmy w stanie wyprodukować wystarczającą ilość białek eksonu jednego huntingtyny i przeprowadzić wcześniej niedostępne badania w celu zbadania struktury, agregacji i toksyczności białka oraz opracowania nowych testów do wykrywania i ilościowego określania formy eksonu huntingtyny związanej z chorobą.Stabilność i wysoka rozpuszczalność białka fuzyjnego SUMO zapewnia większą elastyczność w manipulowaniu białkiem i umożliwia wprowadzenie modyfikacji w kontekście białek fuzyjnych, które w innym przypadku nie byłyby możliwe po rozszczepieniu. Mamy nadzieję, że prostota i skuteczność tej metody wyeliminuje potrzebę stosowania nienatywnych sekwencji i systemów modelowych oraz zachęci badaczy z różnych dyscyplin do przyłączenia się do naszego dążenia do zrozumienia biologii tego ważnego białka i opracowania skutecznych terapii w leczeniu choroby Huntingtona.

generation-native-untagged-huntingtin-exon1-monomer-fibrils-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Białka mogą albo przyjąć natywną strukturę, albo nieprawidłowo sfałdować się w nierozpuszczalny amyloid. Warunki, które sprzyjają szlakowi nieprawidłowego fałdowania, prowadzą do powstawania różnych typów włókienek amyloidowych. Opisane tu metody pozwalają na szybką konwersję natywnych białek do amyloidu in vitro.

Szybkie wytwarzanie amyloidu z białek natywnych in vitro

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

Ten raport opisuje metodę bioinżynierii do projektowania i konstruowania nowych sztucznych czynników splicingu (ASF), które specyficznie modulują splicing docelowych genów w komórkach ssaków. Metoda ta może być dalej rozszerzana w celu inżynierii różnych sztucznych czynników w celu manipulowania innymi aspektami metabolizmu RNA.

Inżynieria sztucznych czynników w celu specyficznego manipulowania alternatywnym splicingiem w komórkach ludzkich

Opisano metodę frakcjonowania nierozpuszczalnych i rozpuszczalnych gatunków zmutowanej huntingtyny z hodowli mózgów i komórek myszy. Opisana metoda jest przydatna do charakterystyki i kwantyfikacji strumienia białka huntingtyny oraz pomaga w analizie homeostazy białek w patogenezie choroby i w obecności...

Frakcjonowanie w celu rozdzielenia rozpuszczalnych i nierozpuszczalnych gatunków huntingtyny

Wykazano, że różne oligonukleotydy antysensowne (AON) indukują inkluzję eksonów (modulacja splicingu) i ratują ekspresję SMN w rdzeniowym zaniku mięśni (SMA). W tym miejscu opisujemy protokół lipotransfekcji AON w celu indukcji inkluzji eksonu w genie SMN2 oraz metody oceny w celu określenia skuteczności w fibroblastach pacjentów z SMA.

Ocena inkluzji eksonów indukowanej przez oligonukleotydy antysensowne przełączające splicing w fibroblastach pacjentów z SMA

Ten artykuł opisuje protokoły do oceny wpływu białek fluorescencyjnych na agregację i toksyczność nieprawidłowo sfałdowanej ekspansji poliglutaminy w celu szybkiej oceny nowo niescharakteryzowanego białka fluorescencyjnego w kontekście reporterów fluorescencyjnych.

Wpływ białek fluorescencyjnych na partnerów fuzji za pomocą testów toksyczności poliglutaminy w drożdżach

Celem tego artykułu jest nakreślenie kroków wymaganych do wytworzenia włókienek z monomerycznej alfa-synukleiny, późniejszej kontroli jakości i użycia wstępnie uformowanych włókienek in vivo.

Wytwarzanie włókienek preformowanych alfa-synukleiną z monomerów i stosowanie in vivo

Ten protokół opisuje konwersję fibroblastów skóry w mioblasty i ich różnicowanie w miotuby. Linie komórkowe pochodzą od pacjentów z zaburzeniami nerwowo-mięśniowymi i mogą być wykorzystywane do badania mechanizmów patologicznych i testowania strategii terapeutycznych.

Bezpośrednie przeprogramowanie ludzkich fibroblastów w mioblasty w celu zbadania terapii zaburzeń nerwowo-mięśniowych

Zapewniamy skalowalne protokoły obejmujące projektowanie konstrukcji, transfekcję przejściową oraz ekspresję i oczyszczanie pełnowymiarowych wariantów ludzkiego białka huntingtyny w komórkach HEK293.

Wydajna i skalowalna produkcja pełnowymiarowych wariantów ludzkiej huntingtyny w komórkach ssaków przy użyciu systemu ekspresji przejściowej

Opisujemy tutaj metodę identyfikacji białek wiążących małe cząsteczki za pomocą znakowania fotopowinowactwa. Zaletą tej techniki jest to, że wiązanie i znakowanie kowalencyjne białek docelowych zachodzi w żywym środowisku komórkowym, co eliminuje ryzyko zakłócenia natywnej struktury białka i warunków wiązania podczas lizy komórki.

Identyfikacja białek wiążących małe cząsteczki w natywnym środowisku komórkowym za pomocą znakowania fotopowinowactwa żywych komórek

Poznaj metodę produkcji natywnego, nieznakowanego eksonu 1 huntingtyny przy użyciu fuzji SUMO. Protokół zapewnia wysoką czystość białka i umożliwia powtarzalne badania struktury oraz funkcji w kontekście chorób neurodegeneracyjnych.

Generowanie natywnego, nieznakowanego monomeru i włókien eksonu huntingtyny1 przy użyciu strategii fuzji SUMO

Przeglądaj więcej filmów