Name: Alternatywne podejście do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji przy użyciu wycinków mózgu szczurów ex vivo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Poznaj metodę wycinków mózgu szczurów ex vivo do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji. Technika umożliwia porównanie warunków kontrolnych i traktowanych w tej samej płaszczyźnie anatomicznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca została sfinansowana przez Neuro-Bio Ltd. Chcielibyśmy podziękować dr Giovanniemu Ferratiemu i dr Sergio Rotondo (Neuro-Bio) za ich komentarze i porady dotyczące manuskryptu.

Wszystkie badania na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzonymi protokołami.
UWAGA: W tej sekcji podana jest sekwencja głównych faz przeprowadzanych podczas procedury eksperymentalnej oraz sugerowany przedział czasowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1). Co więcej, opis protokołu krok po kroku jest uzupełniony panelem ilustracyjnym, pokazującym krytyczne działania, począwszy od usunięcia mózgu, a skończywszy na homogenizacji tkanek po okresie inkubacji (<silna klasa="xfig">Rysunek 2). Szczegóły dotyczące materiałów i instrukcji budowy aparatury oraz późniejszej fazy analizy WB są wcześniej opisane w 22.
1. Narzędzia chirurgiczne, ustawienia wibratomu i przygotowanie do leczenia
UWAGA: Wykonaj następujące kroki przed rozpoczęciem procedury eksperymentalnej:
<ol>
	<li>Przygotuj dwa różne sztuczne płyny mózgowo-rdzeniowe (aCSF), jeden używany do krojenia mózgu, a drugi do etapu inkubacji, jak opisano wcześniej29. Krótko mówiąc, stężenia robocze (w mmol) dwóch aCSF są przeznaczone do "krojenia" aCSF: 120 NaCl, 5 KCl, 20 NaHCO3, 2,4 CaCl2, 2MgSO4, 1,2 KH2PO4 i 10 glukozy; 6,7 soli HEPES i 3,3 kwasu HEPES; pH: 7,1. Natomiast do "zapisu" aCSF: 124 NaCl, 3,7 KCl, 26 NaHCO3, 2 CaCl2, 1,3 MgSO4, 1,3 KH2PO4 i 10 glukozy; pH: 7,1.</li>
	<li>Dobrze wymieszaj roztwory, a następnie połóż na lodzie i natlenić plasterkowany aCSF, aby był zimny, jednocześnie usuwając mózg i następujące po nim sekcje. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) i dostarczać tlen do nagrania aCSF.</li>
	<li>Umieść narzędzia pod kapturem sekcyjnym w celu dekapitacji i usunięcia mózgu, tj. gilotynę, zestaw do chirurgicznego wypreparowania (nożyczki, kleszcze, ostrza) i szpatułkę.</li>
	<li>Ustaw parametry wibratomu, wybierając grubość plastra (300 μm w tym preparacie) oraz częstotliwość na 7 i prędkość na 6. Włóż komorę wibratomu w odpowiednie miejsce i otocz ją lodem.</li>
	<li>Otwórz zawór karbogenu (95%O2, 5% CO2 ), aby natlenić "krojenie" (aCSF) podczas sekcji mózgu. Wybierz minimalne natężenie przepływu, około 2 ml/min.</li>
	<li>Weź dwie probówki o pojemności 15 ml, aby przygotować warunki do testu. Dodać do jednej probówki 10 ml samego "rejestrującego" aCSF (grupa kontrolna), a do drugiej 10 ml "rejestrującego" aCSF wzbogaconego T30 w stężeniu 2 μM (grupa traktowana). Zwirować obie probówki i trzymać je na lodzie do czasu ich użycia w fazie przygotowania do przygotowania (sekcja 3).</li>
</ol>
2. Znieczulenie, ekstrakcja mózgu i krojenie
UWAGA: W tym badaniu wykorzystano 9 dzikich samców szczurów rasy Wistar typu P14. Ekstrakcja mózgu, a następnie krojenie go na plasterki stanowią krytyczną część protokołu, ponieważ powinny być wykonane szybko (w ciągu 10 minut), aby zapobiec lub przynajmniej spowolnić procesy degeneracji tkanek.
<ol>
	<li>Dodaj 1,5 ml izofluranu o stężeniu 100% wag. na warstwie bawełny do komory indukcyjnej, umieść zwierzę w środku i zamknij pokrywkę. Poczekaj, aż zwierzę zostanie głęboko znieczulone, potwierdzając brak odruchu pedałowania, a następnie odetnij zwierzę za pomocą gilotyny.</li>
	<li>Trzymaj głowę zwierzęcia w doniczce zawierającej lodowate krojenie CSF podczas etapu usuwania mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A - C).</li>
	<li>Naciąć skórę nad czaszką za pomocą ostrza chirurgicznego, a następnie przeciąć czaszkę nożyczkami wzdłuż linii środkowej, od tylnej części i postępować do przodu, aż dotrze do kości powyżej OB (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Pociągnij na boki obie strony czaszki za pomocą kleszczy, aby mieć dostęp do mózgu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Włóż szpatułkę brzusznie do mózgu, delikatnie ją zgarnij i utrzymuj nawodnioną w lodowatym "krojeniu" aCSF przez około 5 minut (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2C).</li>
	<li>Umieść mózg na bibule filtracyjnej i wytnij móżdżek za pomocą ostrza (<silna klasa = "xfig" > Rysunek 2D). Przyklej mózg pionowo do krążka wibratomu i włóż go do komory sekcyjnej, napełnij go lodowatym "plastrem" aCSF i dostarcz tlen (<silna klasa="xfig">Rysunek 2E).</li>
	<li>Dostosuj interwał cięcia i kontynuuj sekcję mózgu (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2F). Zbierz sekcje zawierające obszar zainteresowania, taki jak przegroda przyśrodkowa (MS), ukośne pasmo Broki (DBB) i istota wewnętrzna (SI), zgodnie z wcześniejszym opisem22. Od góry do dołu, trzy plasterki zawierają rostralną (R), pośrednią (I) i ogonową (C) część BF (<silna klasa="xfig">Rysunek 2G).</li>
	<li>Podziel wzdłuż linii środkowej każdą sekcję małymi nożyczkami, uzyskując dwie półkrople zwierciadlane (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2H), używane indywidualnie jako stan kontrolny i leczony na tej samej płaszczyźnie anatomicznej.</li>
	<li>Trzymaj hemisekcje w komorze wibratomu przez 5 - 10 minut, a następnie przenieś je szklaną pipetą do garnka z bulgoczącym dźwiękiem CSF. Trzymaj w temperaturze RT przez około 30 minut, aby dojść do siebie.</li>
	<li>W międzyczasie napełnij trzy szklane fiolki 3 ml samego zapisu aCSF (uprzednio przygotowanego w kroku 1.6) dla grupy kontrolnej i trzy fiolki z 3 ml aCSF wzbogaconego o T30 (poprzednio przygotowanego w kroku 1.6) dla grupy leczonej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie do konfiguracji
<ol>
	<li>Przenieś półsekcje do odpowiadających im szklanych fiolek (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2I) w celu uzyskania trzech kolejnych półkropek (w tym rostralnego, pośredniego i ogonowego obszaru BF) dla grupy kontrolnej (zielona ramka, <silna klasa = "xfig" >Rysunek 2J) i ich pasujące odpowiedniki dla leczonej grupy (czerwona ramka, <silna klasa = "xfig">Rysunek 2J).</li>
	<li>Przenieś tkankę mózgową za pomocą dwóch różnych szczotek, jednej dla półplasterków kontrolnych, a drugiej dla leczonych odpowiedników, aby zapobiec jakiemukolwiek zanieczyszczeniu między stanami.</li>
	<li>Zamknij każdą szklaną fiolkę odpowiednią pokrywką, przykładając igłę do natleniania (21G) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2J). Podłącz główną rurkę aparatu do źródła karbogenu (<klasa silna = "xfig" > Rysunek 2K). Dostarczaj tlen do półplasterków przez cały okres inkubacji z minimalnym natężeniem przepływu 2 ml/min, aby uniknąć jakiegokolwiek ruchu tkanki mózgowej i możliwych uszkodzeń mechanicznych podczas eksperymentu. Rozpocznij 5 godzinną inkubację. Wykonaj kroki 3.1 - 3.3 w ciągu 5 minut. 
	UWAGA: Sprawdzaj często (co 15 - 20 minut), czy tlen jest dostarczany do wszystkich fiolek i czy jego przepływ nie przesuwa tkanki od dna.</li>
</ol>
4. Homogenizacja próbki
<ol>
	<li>Po inkubacji zatrzymać przepływ tlenu i zdjąć wszystkie pokrywki z fiolek. Przenieś półplasterki, używając odpowiednich szczotek, do probówek o pojemności 1,5 ml zawierających 250 μl buforu do lizy, utrzymując probówki na lodzie (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2L). Aby uzyskać bufor do lizy, wymieszaj PBS 1x z koktajlami inhibitorów fosfatazy i proteazy, oba rozcieńczone w stosunku 1:100, i homogenizuj tkankę różnymi tłuczkami, aby zapobiec zanieczyszczeniu próbek. Wykonaj te czynności w ciągu 10 - 15 minut.</li>
	<li>Odwirować lizat mózgu przy stężeniu 1 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Przenieść supernatant do nowych probówek i utrzymywać próbki w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
5. Odczyt stężenia białka i analiza Western Blot
<ol>
	<li>Określ stężenie białka w każdej próbce, a następnie przygotuj podwielokrotności do analizy Western blot, jak opisano wcześniej22.</li>
	<li>Wykonaj analizę statystyczną w celu oceny wpływu leczenia na ekspresję białek.</li>
</ol>

<ol><li>Braak, H., Braak, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropathological+stageing+of+Alzheimer-related+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes.</a> Acta Neuropathologica. 82 (4), 239-259 (1991).</li>
<li>Schliebs, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+forebrain+cholinergic+dysfunction+in+Alzheimer%27s+disease--interrelationship+with+beta-amyloid%2C+inflammation+and+neurotrophin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemical+Research%22%5BJournal%5D)">Basal forebrain cholinergic dysfunction in Alzheimer's disease--interrelationship with beta-amyloid, inflammation and neurotrophin signaling.</a> Neurochemical Research. 30 (6-7), 895-908 (2005).</li>
<li>Schmitz, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+forebrain+degeneration+precedes+and+predicts+the+cortical+spread+of+Alzheimer%27s+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Basal forebrain degeneration precedes and predicts the cortical spread of Alzheimer's pathology.</a> Nature Communications. 7, 13249(2016).</li>
<li>Fjell, A. M., McEvoy, L., Holland, D., Dale, A. M., Walhovd, K. B. Alzheimer's Disease Neuroimaging Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+is+normal+in+normal+aging%3F+Effects+of+aging%2C+amyloid+and+Alzheimer%27s+disease+on+the+cerebral+cortex+and+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+neurobiology%22%5BJournal%5D)">What is normal in normal aging? Effects of aging, amyloid and Alzheimer's disease on the cerebral cortex and the hippocampus.</a> Progress in neurobiology. 117, 20-40 (2014).</li>
<li>Kovács, T., Cairns, N. J., Lantos, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olfactory+centres+in+Alzheimer%27s+disease%3A+olfactory+bulb+is+involved+in+early+Braak%27s+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroreport%22%5BJournal%5D)">Olfactory centres in Alzheimer's disease: olfactory bulb is involved in early Braak's stages.</a> Neuroreport. 12 (2), 285-288 (2001).</li>
<li>Winblad, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defeating+Alzheimer%27s+disease+and+other+dementias%3A+a+priority+for+European+science+and+society%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet+Neurology%22%5BJournal%5D)">Defeating Alzheimer's disease and other dementias: a priority for European science and society.</a> The Lancet Neurology. 15 (5), 455-532 (2016).</li>
<li>Herrup, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+case+for+rejecting+the+amyloid+cascade+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The case for rejecting the amyloid cascade hypothesis.</a> Nat Neurosci. 18 (6), 794-799 (2015).</li>
<li>De Strooper, B., Karran, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cellular+Phase+of+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Cellular Phase of Alzheimer's Disease.</a> Cell. 164 (4), 603-615 (2016).</li>
<li>Scheltens, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.thelancet.com/journals/lancet/article/PIIS0140-6736(15)01124-1/abstract">Alzheimer's disease.</a> Lancet. 388 (10043), 505-517 (2016).</li>
<li>Arendt, T., Brückner, M. K., Lange, M., Bigl, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+acetylcholinesterase+and+butyrylcholinesterase+in+Alzheimer%27s+disease+resemble+embryonic+development-A+study+of+molecular+forms%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochemistry+International%22%5BJournal%5D)">Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development-A study of molecular forms.</a> Neurochemistry International. 21 (3), 381-396 (1992).</li>
<li>Auld, D. S., Kornecook, T. J., Bastianetto, S., Quirion, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alzheimer%27s+disease+and+the+basal+forebrain+cholinergic+system%3A+relations+to+%CE%B2-amyloid+peptides%2C+cognition%2C+and+treatment+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Alzheimer's disease and the basal forebrain cholinergic system: relations to β-amyloid peptides, cognition, and treatment strategies.</a> Progress in Neurobiology. 68 (3), 209-245 (2002).</li>
<li>Arendt, T., Bruckner, M. K., Morawski, M., Jager, C., Gertz, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+neurone+loss+in+Alzheimer%27s+disease%3A+cortical+or+subcortical%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Early neurone loss in Alzheimer's disease: cortical or subcortical?</a> Acta Neuropathol Commun. 3, 10(2015).</li>
<li>Mesulam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+Pivotal+Factor+or+The+Cholinergic+Lesion+of+Alzheimer%27s+Disease%3A+Pivotal+Factor+or+Side+Show%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or The Cholinergic Lesion of Alzheimer's Disease: Pivotal Factor or Side Show?</a> Learn Mem. , 43-49 (2004).</li>
<li>Schliebs, R., Arendt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cholinergic+system+in+aging+and+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioural+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">The cholinergic system in aging and neuronal degeneration.</a> Behavioural Brain Research. 221 (2), 555-563 (2011).</li>
<li>Mesulam, M. M., Mufson, E. J., Wainer, B. H., Levey, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+cholinergic+pathways+in+the+rat%3A+An+overview+based+on+an+alternative+nomenclature+%28Ch1-Ch6%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Central cholinergic pathways in the rat: An overview based on an alternative nomenclature (Ch1-Ch6).</a> Neuroscience. 10 (4), 1185-1201 (1983).</li>
<li>Mesulam, M., Mufson, E. J., Levey, A. I., Wainer, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholinergic+innervation+of+cortex+by+the+basal+forebrain%3A+cytochemistry+and+cortical+connections+of+the+septal+area%2C+diagonal+band+nuclei%2C+nucleus+basalis+%28substantia+innominata%29%2C+and+hypothalamus+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cholinergic innervation of cortex by the basal forebrain: cytochemistry and cortical connections of the septal area, diagonal band nuclei, nucleus basalis (substantia innominata), and hypothalamus in the rhesus monkey.</a> J Comp Neurol. 214 (2), 170-197 (1983).</li>
<li>Greenfield, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovering+and+targeting+the+basic+mechanism+of+neurodegeneration%3A+The+role+of+peptides+from+the+C-terminus+of+acetylcholinesterase%3A+Non-hydrolytic+effects+of+ache%3A+The+actions+of+peptides+derived+from+the+C-terminal+and+their+relevance+to+neurodegenerat%5BTitle%5D)+AND+%22Chemico-Biological+Interactions%22%5BJournal%5D)">Discovering and targeting the basic mechanism of neurodegeneration: The role of peptides from the C-terminus of acetylcholinesterase: Non-hydrolytic effects of ache: The actions of peptides derived from the C-terminal and their relevance to neurodegenerat.</a> Chemico-Biological Interactions. 203 (3), 543-546 (2013).</li>
<li>Garcia-Ratés, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28I%29+Pharmacological+profiling+of+a+novel+modulator+of+the+%CE%B17+nicotinic+receptor%3A+Blockade+of+a+toxic+acetylcholinesterase-derived+peptide+increased+in+Alzheimer+brains%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">(I) Pharmacological profiling of a novel modulator of the α7 nicotinic receptor: Blockade of a toxic acetylcholinesterase-derived peptide increased in Alzheimer brains.</a> Neuropharmacology. 105, 487-499 (2016).</li>
<li>Eimerl, S., Schramm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantity+of+calcium+that+appears+to+induce+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neurochemistry%22%5BJournal%5D)">The quantity of calcium that appears to induce neuronal death.</a> Journal of neurochemistry. 62 (3), 1223-1226 (1994).</li>
<li>Greenfield, S., Vaux, D. J. <a target="_blank" href="https://pdfs.semanticscholar.org/0d25/c7e053b9eed98e759c2e2879cb53195c084e.pdf">Commentary Parkinson's Disease, Alzheimer's Disease and Motor Neurone Disease: Identifying a Common Mechanism.</a> Science. 113 (3), 485-492 (2002).</li>
<li>Badin, A. S., Morrill, P., Devonshire, I. M., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%28II%29+Physiological+profiling+of+an+endogenous+peptide+in+the+basal+forebrain%3A+Age-related+bioactivity+and+blockade+with+a+novel+modulator%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">(II) Physiological profiling of an endogenous peptide in the basal forebrain: Age-related bioactivity and blockade with a novel modulator.</a> Neuropharmacology. 105, 47-60 (2016).</li>
<li>Brai, E., Stuart, S., Badin, A. -S., Greenfield, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ex+Vivo+Model+to+Investigate+the+Underlying+Mechanisms+in+Alzheimer%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A Novel Ex Vivo Model to Investigate the Underlying Mechanisms in Alzheimer's Disease.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 11, 291(2017).</li>
<li>Cho, S., Wood, A., Bowlby, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+slices+as+models+for+neurodegenerative+disease+and+screening+platforms+to+identify+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Brain slices as models for neurodegenerative disease and screening platforms to identify novel therapeutics.</a> Current neuropharmacology. 5 (1), 19-33 (2007).</li>
<li>Humpel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organotypic+brain+slice+cultures%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Organotypic brain slice cultures: A review.</a> Neuroscience. 305, 86-98 (2015).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+physiology%22%5BJournal%5D)">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual review of physiology. 46, 455-472 (1984).</li>
<li>Jensen, M. S., Lambert, J. D. C., Johansen, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+rat+hippocampus+slices+following+in+vivo+brain+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from rat hippocampus slices following in vivo brain ischemia.</a> Brain Research. 554 (1-2), 166-175 (1991).</li>
<li>Ferrati, G., Martini, F. J., Maravall, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Adenosine+Receptor-Mediated+Regulation+of+Diverse+Thalamocortical+Short-Term+Plasticity+in+the+Mouse+Whisker+Pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neural+Circuits%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Adenosine Receptor-Mediated Regulation of Diverse Thalamocortical Short-Term Plasticity in the Mouse Whisker Pathway.</a> Frontiers in Neural Circuits. 10, 1-9 (2016).</li>
<li>Grinvald, A., Hildesheim, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VSDI%3A+a+new+era+in+functional+imaging+of+cortical+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">VSDI: a new era in functional imaging of cortical dynamics.</a> Nature Reviews Neuroscience. 5 (11), 874-885 (2004).</li>
<li>Badin, A. S., John, E., Susan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+spatio-temporal+bioactivity+of+a+novel+peptide+revealed+by+optical+imaging+in+rat+orbitofrontal+cortex+in+vitro%3A+Possible+implications+for+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">High-resolution spatio-temporal bioactivity of a novel peptide revealed by optical imaging in rat orbitofrontal cortex in vitro: Possible implications for neurodegenerative diseases.</a> Neuropharmacology. 73, 10-18 (2013).</li>
<li>Greenfield, S. A., Badin, A. S., Ferrati, G., Devonshire, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+rat+brain+suggests+a+previously+missing+link+between+top-down+and+bottom-up+nervous+system+function%5BTitle%5D)+AND+%22Neurophotonics%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the rat brain suggests a previously missing link between top-down and bottom-up nervous system function.</a> Neurophotonics. 4, 31213(2017).</li>
<li>Opitz-Araya, X., Barria, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3197400/">Organotypic hippocampal slice cultures.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (48), (2011).</li>
<li>Gong, C. -X., Lidsky, T., Wegiel, J., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolically+active+rat+brain+slices+as+a+model+to+study+the+regulation+of+protein+phosphorylation+in+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Research+Protocols%22%5BJournal%5D)">Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain.</a> Brain Research Protocols. 6 (3), 134-140 (2001).</li>
</ol>

Autorzy deklarują konkurencyjne interesy finansowe. Susan A. Greenfield jest założycielką i prezesem Neuro-Bio Limited, prywatnej firmy, i posiada udziały w spółce. Emanuele Brai i Antonella Cogoni są pracownikami firmy Neuro-Bio Sp. z o.o.

Główny aspekt tego protokołu, oparty na ugruntowanej technice mózgu ex vivo, pozwala na synchroniczne badanie dwóch półplasterków zwierciadlanych, uzyskanych z tej samej płaszczyzny anatomicznej, monitorując ich reakcję po zastosowaniu określonego schorzenia (kontrolnego lub leczonego); Oferuje to zatem paradygmat eksperymentalny tak ściśle kontrolowany, jak to tylko możliwe. Możliwość oceny w sposób specyficzny dla czasu, dawki i miejsca różnych neurochemikaliów związanych z upośledzeniem neuronów, jak widać po...

AD to przewlekła patologia charakteryzująca się stopniowym upośledzeniem neurodegeneracyjnym wpływającym na różne obszary mózgu, takie jak kora śródwęchowa (EC), BF, hipokamp (HC) i opuszka węchowa (OB)1,2,3,4,5. Późne etapy rozwoju choroby Alzheimera prowadzą do postępującego pogorszenia funkcji poznawczych, co czyni tę chorobę najczęstszą formą demencji, stanowiącą około 70% wszystkich przypadków6. Pomimo szeroko zakrojonych prób zrozumienia początkowych etapów powodujących chorobę Alzheimera, obecnie nie ma zdefiniowanych wskazań eksperymentalnych, które by je wyjaśniały. Ponadto, najpopularniejsza teoria - "hipoteza amyloidu" - jest coraz częściej kwestionowana, ponieważ nie dostarcza pełnego profilu wyjaśniającego patobiologię choroby Alzheimera, ani celu farmaceutycznego, który okazał się skuteczny7,8,9.
Alternatywna teoria, która cieszy się coraz większym zainteresowaniem, sugeruje, że początkowe mechanizmy zachodzące podczas neurodegeneracji są związane z klastrem neuronów głównie podatnym w AD3,10,11,12,13,14. Ten heterogeniczny węzeł komórkowy obejmujący BF, śródmózgowie i pień mózgu, rzutuje na wiele regionów, takich jak EC, HC i OB15,16. Pomimo różnorodności morfologii neuronów i syntezy neuroprzekaźników, ten rdzeń komórek ma wspólną cechę ekspresji AChE, która może również pełnić funkcję nieenzymatyczną17,18. Ta nieklasyczna rola jako nowej cząsteczki sygnałowej pośredniczy w przepływie wapnia (Ca2+) do neuronów, które mogą ulegać zdarzeniom troficznym lub toksycznym w związku z dawką Ca2+, dostępnością i wiekiem neuronów17,18,19.
Podczas neurodegeneracji, obserwowana utrata komórek może być zatem związana z tą nieenzymatyczną funkcją17,18,20, co można przypisać peptydowi 30merowemu (T30) odciętemu od C-końca AChE20. Zgodnie z poprzednimi wynikami, przeprowadzonymi na hodowli komórkowej i obrazowaniu optycznym18,21, wykazaliśmy, za pomocą nowatorskiego podejścia opartego na wycinkach mózgu szczura ex vivo zawierających struktury BF, że T30 indukuje profil podobny do AD22. W szczególności ta nowa metodologia oferuje bardziej fizjologiczny scenariusz niż hodowla komórkowa, ponieważ zachowuje wiele cech nienaruszonej tkanki, od anatomicznych po zachowanie obwodów, choć przez czas wielogodzinny. Zastosowaliśmy ten protokół do zbadania zdarzeń mających miejsce we wczesnych fazach neurodegeneracji, monitorując ostrą odpowiedź po zastosowaniu T30.
Pomimo obszernej literatury na temat używania wycinków mózgu do badania szlaków molekularnych związanych z uszkodzeniem neuronów lub neurogenezą23,24, ten protokół po raz pierwszy zapewnia bardziej natychmiastowy i czuły odczyt w porównaniu do powszechnego stosowania plastrów organotypowych. Jednak, podobnie jak w przypadku organotypowych wycinków mózgu, ta procedura ostrego plastra może być również przyjęta do kilku celów, takich jak ocena cząsteczek neuroprotekcyjnych lub neurotoksycznych, odkrywanie pierwotnych zmian molekularnych zachodzących w określonym procesie, analiza immunohistochemiczna i testy farmakologiczne patologii związanych z ośrodkowym układem nerwowym.

<table><tbody><tr><td>Chlorek sodu (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>S7653</td><td>Odczynnik do preparatu aCSF</td></tr><tr><td>Chlorek potasu (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>P9333</td><td>Odczynnik do preparatu aCSF</td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>S5761</td><td>Odczynnik do preparatu aCSF</td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny (MgSO4 (7H2O))</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>63138</td><td>Odczynnik do preparatu aCSF</td></tr><tr><td>Fosforan potasu jednozasadowy (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>P5655</td><td>Odczynnik do preparatu aCSF</td></tr><tr><td>Sól Hepes</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>H7006</td><td>Odczynnik do preparatu aCSF</td></tr><tr><td>Hepes acid</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>H3375</td><td>Odczynnik do preparatu aCSF</td></tr><tr><td>Glukoza</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>G7528</td><td>Odczynnik do preparatu aCSF</td></tr><tr><td>Odwadnianie chlorku wapnia</td><td>Sigma-Aldrich, Niemcy</td><td>223506</td><td>Odczynnik do preparatu aCSF</td></tr><tr><td>Peptyd T30</td><td>Genosphere Biotechnologies, Francja</td><td></td><td>Peptyd pochodzący z AChE testowany</td></tr><tr><td>Chirurgiczny zestaw preparacyjny</td><td>World Precision Instruments, USA</td><td>Pozycja #: MOUSEKIT</td><td>Krok usuwania mózgu</td></tr><tr><td>Ostrza</td> <td>chirurgiczneSwann-Morton, Wielka Brytania</td><td>BS 2982</td><td>Krok usuwania mózgu</td></tr><tr><td>Bibuła filtracyjna</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>11566873</td><td>Przygotowanie mózgu do krojenia</td></tr><tr><td>Klej</td><td></td><td></td><td>Przygotowanie mózgu do krojenia</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Leica, Niemcy</td><td>VT1000 S</td><td>Szczotki</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> do krojenia <td>Obsługa tkanek</td></tr><tr><td>Butla</td><td></td><td></td> <td>z tlenemFaza sekcji i inkubacji</td></tr><tr><td>1x Bufor fosforanowy soli fizjologicznej (PBS)</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>BP2438-4</td><td>Etap homogenizacji</td></tr><tr><td>Inhibitory fosfatazy</td><td>Fisher Scientific, USA</td><td>1284-1650</td><td>Etap homogenizacji</td></tr><tr><td>Inhibitory proteazy</td><td>Roche complete, USA</td><td>4693116001</td><td>Etap homogenizacji</td></tr><tr><td>Tłuczki</td><td>Starlab, Wielka Brytania</td><td>I1415-5390</td><td>Krok homogenizacji</td></tr><tr><td>Mikrowirówka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660 nm Test białka</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td>22660</td><td>Stężenie białka</td></tr></tbody></table>

alternatywne podejście do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji przy użyciu wycinków mózgu szczurów ex vivo

An Alternative Approach to Study Primary Events in Neurodegeneration Using Ex Vivo Rat Brain Slices

Pomimo licznych badań, które próbują stworzyć wiarygodne modele zwierzęce, które odzwierciedlają podstawowe procesy leżące u podstaw neurodegeneracji, bardzo niewiele z nich zostało powszechnie zaakceptowanych. W tym miejscu proponujemy nową procedurę zaadaptowaną z dobrze znanej techniki wycinków mózgu ex vivo, która oferuje bliższy scenariusz podobny do in vivo niż preparaty in vitro, do badania wczesnych zdarzeń wywołujących degenerację komórek, jak obserwowano w chorobie Alzheimera (AD). Wariant ten składa się z prostych i łatwych do odtworzenia kroków, które umożliwiają zachowanie anatomicznej cytoarchitektury wybranego obszaru mózgu i jego lokalnej funkcjonalności w środowisku fizjologicznym. Z tego samego mózgu można uzyskać różne obszary anatomiczne, co daje możliwość przeprowadzenia wielu eksperymentów z danymi zabiegami w sposób zależny od miejsca, dawki i czasu. Potencjalne ograniczenia, które mogą mieć wpływ na wyniki związane z tą metodologią, są związane z konserwacją tkanki, tj. utrzymaniem jej integralności anatomicznej podczas etapów krojenia i inkubacji oraz z grubością przekroju, co może mieć wpływ na analizę biochemiczną i immunohistochemiczną. Podejście to można wykorzystać do różnych celów, takich jak badanie mechanizmów molekularnych związanych ze stanami fizjologicznymi lub patologicznymi, badania przesiewowe leków lub testy dawka-odpowiedź. Wreszcie, protokół ten może również zmniejszyć liczbę zwierząt wykorzystywanych w badaniach behawioralnych. Opisywane tutaj zastosowanie zostało niedawno opisane i przetestowane po raz pierwszy na wycinkach mózgu szczurów ex vivo zawierających podstawę przodomózgowia (BF), który jest jednym z regionów mózgu dotkniętych głównie chorobą Alzheimera. W szczególności wykazano, że podanie toksycznego peptydu pochodzącego z C-końca acetylocholinoesterazy (AChE) może wywołać profil podobny do AD. wyzwalanie, wzdłuż przednio-tylnej osi BF, zróżnicowanej ekspresji białek zmienionych w AD, takich jak receptor nikotynowy alfa7 (α7-nAChR), fosforylowane Tau (p-Tau) i beta amyloid (Aβ).

Przedstawiony tutaj protokół wskazuje, że podanie toksycznego peptydu T30 moduluje w sposób zależny od lokalizacji ekspresję α7-nAChR, p-Tau oraz Aβ w przekrojach zawierających BF (Rysunek 3A). Receptor nikotynowy wykazuje istotny wzrost w rostralnej, leczonej półplastrze w porównaniu z odpowiadającą jej stroną kontrolną (przekrój 1, p = 0,0310) (Rysunek 3B), podczas gdy w przekroju pośrednim nie stwierdzono żadnych zmia...

Prezentujemy metodę, która może dostarczyć dalszych informacji na temat wczesnych zdarzeń leżących u podstaw neurodegeneracji i opiera się na uznanej technice mózgu ex-vivo, łącząc zalety eksperymentów in vivo i in vitro. Co więcej, jest to wyjątkowa okazja do bezpośredniego porównania grupy leczonej i nieleczonej na tej samej płaszczyźnie anatomicznej.

Alternatywne podejście do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji przy użyciu wycinków mózgu szczurów ex vivo

Despite&#160;numerous studies that attempt to develop reliable animal models&#160;which reflecting the primary processes underlying neurodegeneration, ...

Ogólnym celem tej procedury jest jednoczesne zbadanie dwóch półplasterków zwierciadlanych uzyskanych z tej samej płaszczyzny anatomicznej i sprawdzenie efektów po zabiegu. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurobiologii molekularnej, takie jak podstawowe zdarzenia wpływające na kluczowe cząsteczki zaangażowane w procesy neurodegeneracyjne. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona zapewnić i pośrednich przeprowadzić kaskady molekularne leżące u podstaw zdarzeń neurodegeneracyjnych.Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w pierwotne zdarzenia zachodzące w neurodegeneracji, może być również stosowana do badania modeli zwierzęcych różnych zaburzeń lub innych właściwości narządów i tkanek. Zacznij od przygotowania dwóch różnych sztucznych płynów mózgowo-rdzeniowych. Jeden używany do krojenia mózgu, a drugi do etapu inkubacji.Po przygotowaniu ACSF do krojenia wymieszaj roztwór i trzymaj go na lodzie. Podobnie przygotuj nagranie ACSF, ale przechowuj je w temperaturze pokojowej. Natlenić oba roztwory.Następnie przygotuj narzędzia do dekapitacji i usunięcia mózgu przy kapturze preparacyjnym. Następnie ustaw parametry wibratomu. Ustaw grubość plastra zgo

an-alternative-approach-to-study-primary-events-neurodegeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Organotypowe hodowle skrawków embrionalnego mózgu gryzoni są szeroko stosowane w badaniach nad rozwojem mózgu. Choć systemy in vivo często oferują pewne korzyści, ...

Organotypowa hodowla plastrów mózgu szczura w 18. dniu embrionalnym (E18)

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Niniejszy raport demonstruje technikę mechanicznej izolacji pojedynczych żywych neuronów z zachowaniem przytwierdzonych boutonów presynaptycznych. Neurony poddane wibrodysocjacji charakteryzują się zaletami takimi jak szybki czas przygotowania, doskonała kontrola farmakologiczna oraz usprawniona stabilizacja potencjału błonowego (space-clamp) bez wpływu komórek sąsiednich. Metoda ta może być wykorzystywana do obrazowania elementów synaptycznych oraz rejestracji metodą patch-clamp.

Wibrodysocjacja neuronów z plastrów mózgu gryzoni w celu badania transmisji synaptycznej i obrazowania terminali presynaptycznych

Ten film demonstruje technikę oceny śmierci neuronów w wycinkach organotypowych kory nosowej i hipokampa. Śmierć neuronów następuje w wyniku ewoluujących napadów padaczkowych – przypominających padaczkę in vivo – i jest wykrywana poprzez podwójne barwienie martwych komórek za pomocą jodku propidyny i immunofluorescencji.

Test śmierci neuronalnej w celu oceny śmierci komórki w modelu padaczki ex vivo

Ten film pokazuje procedurę przygotowania i leczenia półwycinków mózgu szczura neurotoksycznym peptydem w celu naśladowania neurodegeneracji. Protokół pozwala na analizę zdarzeń neurodegeneracyjnych poprzez bezpośrednie porównanie plastrów kontrolnych i leczonych w tej samej płaszczyźnie anatomicznej.

Leczenie plastrów koronalnych szczurów neurotoksycznym peptydem

Ruch błony neuronalnej dynamicznie kontroluje dostępność białek błony plazmatycznej i znacząco wpływa na neuroprzekaźnictwo. Do tej pory trudno było zmierzyć neuronalny transport endocytarny w dorosłych neuronach. W tym miejscu opisujemy wysoce skuteczną, ilościową metodę pomiaru szybkich zmian ekspresji białek powierzchniowych ex vivo w ostrych wycinkach mózgu.

Biotynylacja wycinków mózgu: podejście ex vivo do pomiaru specyficznego dla regionu transportu białek błony plazmatycznej w dorosłych neuronach

Opracowaliśmy model wycinka mózgu, który może być wykorzystany do zbadania mechanizmów molekularnych związanych z uszkodzeniem mózgu za pośrednictwem ekscytotoksyczności. Ta technika generuje żywotną dojrzałą tkankę mózgową i zmniejsza liczbę zwierząt wymaganych do eksperymentów, jednocześnie utrzymując częściowo nienaruszone obwody neuronalne, interakcje komórkowe i przedziały postsynaptyczne.

Ekscytotoksyczna stymulacja mikrowycinków mózgu jako model udaru in vitro

Ten protokół demonstruje implementację zoptymalizowanej metody ochronnego odzyskiwania N-metylo-D-glukaminy (NMDG) do przygotowania wycinków mózgu. Pojedynczy preparat podłoża jest używany do niezawodnego uzyskiwania zdrowych wycinków mózgu od zwierząt w każdym wieku i do różnych zastosowań eksperymentalnych.

Przygotowanie ostrych wycinków mózgu przy użyciu zoptymalizowanej metody odzysku ochronnego N-metylo-D-glukaminy

Ten protokół opisuje przygotowanie poziomych wycinków kory hipokampowo-śródwęchowej (HEC) od myszy wykazujących spontaniczną aktywność fal ostrych. Plastry są inkubowane w uproszczonej komorze przechowawczej, a nagrania są wykonywane w warunkach zanurzonych z szybko płynącym sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby promować dotlenienie tkanek i spontaniczne pojawienie się aktywności na poziomie sieci.

Ostre krojenie mózgu myszy w celu zbadania spontanicznej aktywności sieci hipokampa

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Poznaj metodę wycinków mózgu szczurów ex vivo do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji. Technika umożliwia porównanie warunków kontrolnych i traktowanych w tej samej płaszczyźnie anatomicznej.

Alternatywne podejście do badania pierwotnych zdarzeń w neurodegeneracji przy użyciu wycinków mózgu szczurów ex vivo

Przeglądaj więcej filmów