Name: Wsteczne wstrzyknięcie nanocząstek do mysiego gruczołu podżuchwowego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Poznaj technikę wstecznego wstrzyknięcia nanocząstek do mysiego gruczołu podżuchwowego, omijającą krążenie ogólne. Ta metoda umożliwia precyzyjne dostarczanie leków w badaniach nad funkcją gruczołów ślinowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) oraz National Cancer Institute (NCI) of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R56 DE025098, UG3 DE027695 i F30 CA206296. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Prace te były również wspierane przez NSF DMR 1206219 oraz nagrodę IADR Innovation in Oral Care Award (2016). 
Chcielibyśmy podziękować Jayne Gavrity za pomoc w przeprowadzaniu eksperymentów IVIS. Chcielibyśmy podziękować Karen Bentley za jej wkład i pomoc w wykonaniu EM. Chcielibyśmy podziękować Pei-Lun Wengowi za jego pomoc w IHC. Serdecznie dziękujemy Matthew Ingallsowi za pomoc w przygotowaniu figury. Chcielibyśmy podziękować dr Elaine Smolock i Emily Wu za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Wszystkie procedury in vivo opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Uniwersytecką Komisję ds. Zasobów Zwierzęcych na Uniwersytecie Rochester, Rochester, NY.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Używając rurki cewnika wewnątrzczaszkowego 32G z wkładką drucianą, odetnij 3 cm rurki, aby utworzyć ścięty koniec, około 45° do długiej osi. Upewnij się, że drut jest co najmniej 1 cm dłuższy niż rurka.</li>
	<li>Załaduj 50 μl roztworu nanocząstek PSMA (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1) lub innego materiału iniekcyjnego do strzykawki Hamiltona. Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo wystąpienia barotraumy podczas wstrzyknięcia, należy przymocować rurkę cewnika z usuniętym trzpieniem do strzykawki i usunąć martwą objętość.</li>
	<li>Należy sprawdzić roztwór do wstrzykiwań, aby upewnić się, że nanocząstka jest w pełni rozpętniowana, aby zapobiec niedrożności przewodów po podaniu.</li>
	<li>Przygotować roztwór atropiny w stężeniu 0,1 mg/ml. 
	UWAGA: Ponieważ atropina jest wrażliwa na światło i ulega degradacji z czasem, roztwór ten należy przygotować w dniu wstrzyknięcia i chronić przed światłem do momentu podania.</li>
</ol>
2. Dostęp i wizualizacja punktu wejściowego kanału
<ol>
	<li>Zważyć myszy C57/BL6 za pomocą wagi analitycznej.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 0,5 ml z igłą 29G x 1/2" znieczulić myszy sterylnym roztworem soli fizjologicznej 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Przejdź do następnego kroku, gdy mysz przestaje reagować na bodźce, co zwykle następuje w ciągu 5 do 10 minut po wstrzyknięciu. 
	UWAGA: Ta procedura może być również wykonywana pod izofluranem, ale będzie wymagała niestandardowego stożka nosowego, który umożliwia dostęp do jamy ustnej.</li>
	<li>Aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu, nałóż lubrykant na oczy i umieść mysz w pozycji leżącej na niestandardowym scenie. 
	UWAGA: Aby utrzymać odpowiednie warunki do zabiegu wewnątrzustnego, narzędzia powinny być dezynfekowane lub sterylizowane przed każdym użyciem.</li>
	<li>Otwórz jamę ustną, zabezpieczając siekacze szczęki na metalowej belce i użyj elastycznej opaski, aby przyłożyć napięcie w dół za siekaczami żuchwy (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Ustaw mysz pod mikroskopem preparacyjnym tak, aby uwidocznić podstawę szczęki.</li>
	<li>Aby poszerzyć usta, użyj niestandardowego, zakrzywionego stalowego zwijacza, aby naprężyć obustronnie błonę śluzową policzka.</li>
	<li>Aby uwidocznić brodawki podżuchwowe, chwyć i delikatnie unieś język z dna jamy ustnej za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: Brodawki pojawią się jako dwa blade wypukłości pod językiem (<silna klasa="xfig">Ryc. 2B).</li>
	<li>Aby ułatwić wizualizację i dalszą manipulację w obrębie jamy ustnej, umieść bawełnę między językiem a błoną śluzową policzka.</li>
</ol>
3. Kaniulacja kanałowa i umieszczenie linii
<ol>
	<li>Za pomocą cienkich, zakrzywionych kleszczyków chwyć rurkę cewnika z wkładką drucianą. Aby uzyskać optymalną kontrolę ręczną podczas kaniulacji, dopasuj rurkę do krzywizny kleszczy (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A).</li>
	<li>Za pomocą mikroskopu preparacyjnego przesuń kleszcze i drut w pole view. 
	UWAGA: Drut powinien wystawać z rurki.</li>
	<li>Delikatnie dociśnij podstawę jednej brodawki podżuchwowej za pomocą wkładki drucianej, aby wykonać małe, powierzchowne nakłucie błony śluzowej (średnica 0,076 mm), które ułatwi późniejsze wprowadzenie rurki cewnika (średnica 0,25 mm). Jeśli napotkasz opór, odetnij świeże skośne końcówki zarówno na rurce, jak i na wstawce drutu ostrymi nożyczkami do preparowania.</li>
	<li>Po wprowadzeniu należy wyjąć sztyft i za pomocą mikroskopu preparacyjnego potwierdzić obecność śliny w miejscu nakłucia. Należy unikać mocnych lub nagłych ruchów (zarówno wyjęcia, jak i włożenia) trzpienia, które mogą spowodować krwawienie lub zagrozić integralności przewodowej.</li>
	<li>Wsuń trzpień w rurce (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3B).</li>
	<li>Aby upewnić się, że rurka iniekcyjna będzie pasować do otworu kanału Whartona, włóż rurkę zawierającą spód jako sztywną prowadnicę do wcześniej wykonanego nakłucia (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2C). 
	UWAGA: Jeśli nie zostanie wykonany szybko, miejscowy obrzęk może uniemożliwić ponowne wprowadzenie.</li>
	<li>Aby zapobiec ciśnieniu wstecznemu spowodowanemu długotrwałą niedrożnością kanałową, należy wyciągnąć rurkę. Sprawdź, czy w brodawce podżuchwowej można zobaczyć otwór widoczny pod mikroskopem. Jeśli wystąpi widoczne krwawienie, usuń sztyft i spróbuj ponownie od kroku 3.2 na przeciwległych brodawkach podżuchwowych.</li>
	<li>Nie ruszając myszą, należy podać dootrzewnowe wstrzyknięcie roztworu atropiny w dawce 1 mg/kg mc., aby zmniejszyć wydzielanie śliny podczas zabiegu. Odczekaj 5 - 10 min.</li>
	<li>Chwyć koniec rurki strzykawki i włóż do otworu za pomocą mikroskopu preparacyjnego (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 3C). Jeśli napotkasz opór, odetnij świeży skośny koniec rurki i spróbuj ponownie.</li>
	<li>Gdy rurka znajdzie się na miejscu w brodawce podżuchwowej, powoli wsuń się 3-5 mm do kanału. Zdejmij rurkę z kleszczy.</li>
	<li>Aby poprawić szczelność między rurką a brodawką podżuchwową, osusz granicę fazy, delikatnie osuszając gazą przez 1 minutę.</li>
	<li>Sprawdź, aby upewnić się, że pozycja rurki nie zmieniła się podczas suszenia.</li>
</ol>
4. Wtrysk
<ol>
	<li>Wstrzyknąć materiał z szybkością 10 μl/min. Sprawdź, czy mysz pozostaje pod wpływem środków uspokajających i nie wykazuje oznak niepokoju (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 2D). 
	UWAGA: Zastrzyki o objętości 15 - 50 μL są dobrze tolerowane. Wstrzyknięcie większych objętości może spowodować barotraumę.</li>
	<li>Po wstrzyknięciu należy utrzymać ciśnienie w strzykawce przez 5 minut, aby poprawić zatrzymywanie materiału w kanale Whartona i SMG (<silna klasa = "xfig">Rysunek 4). Okresowo sprawdzaj brodawkę podżuchwową, aby upewnić się, że rurka nie wychodzi z otworu przewodowego.</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy chwyć i delikatnie wyjmij rurkę z brodawek podżuchwowych. 
	UWAGA: To normalne, że z brodawek wydostaje się pewien płyn</li>.
	<li>Wyjmij retraktor i bawełnę z jamy ustnej przed przeniesieniem myszy ze sceny. 
	UWAGA: Zwierzę nie powinno być pozostawiane bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. Ponadto upewnij się, że mysz nie jest trzymana z innymi myszami, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.</li>
</ol>
5. Weryfikacja i analiza
Uwaga: System obrazowania in vivo (IVIS) może być użyty do oceny retencji fluorescencyjnie znakowanych nanocząstek po wstrzyknięciu (jak pokazano 1 h i 24 h po wstrzyknięciu w Rysunek 5).
<ol>
	<li>Aby lepiej zobrazować sygnał fluorescencyjny w SMG przez skórę, usuń brzuszne futro pokrywające SMG poprzez golenie lub użycie depilacji chemicznej. 
	Uwaga: Po eutanazji tkanka SMG może być również pobrana, utrwalona (przez noc w 4% paraformaldehydzie) i wybarwiona za pomocą immunohistochemii, aby potwierdzić trwałość fluorescencyjnie znakowanego NP jeden dzień po wstrzyknięciu (<silna klasa = "xfig">Ryc. 6).</li>
</ol>

<ol><li>Miranda-Rius, J., Brunet-Llobet, L., Lahor-Soler, E., Farre, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+Secretory+Disorders%2C+Inducing+Drugs%2C+and+Clinical+Management%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+Of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Salivary Secretory Disorders, Inducing Drugs, and Clinical Management.</a> International Journal Of Medical Sciences. 12 (10), 811-824 (2015).</li>
<li>Acauan, M. D., Figueiredo, M. A. Z., Cherubini, K., Gomes, A. P. N., Salum, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiotherapy-induced+salivary+dysfunction%3A+Structural+changes%2C+pathogenetic+mechanisms+and+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Radiotherapy-induced salivary dysfunction: Structural changes, pathogenetic mechanisms and therapies.</a> Archives of Oral Biology. 60 (12), 1802-1810 (2015).</li>
<li>Dirix, P., Nuyts, S., Vander Poorten, V., Delaere, P., Van den Bogaert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+xerostomia+after+radiotherapy+on+quality+of+life%5BTitle%5D)+AND+%22Supportive+Care+in+Cancer%22%5BJournal%5D)">The influence of xerostomia after radiotherapy on quality of life.</a> Supportive Care in Cancer. 16 (2), 171-179 (2008).</li>
<li>Vissink, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+management+of+salivary+gland+hypofunction+and+xerostomia+in+head-and-neck+cancer+patients%3A+successes+and+barriers%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Clinical management of salivary gland hypofunction and xerostomia in head-and-neck cancer patients: successes and barriers.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (4), 983-991 (2010).</li>
<li>Delporte, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+fluid+secretion+after+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+to+irradiated+rat+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Increased fluid secretion after adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA to irradiated rat salivary glands.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 94 (7), 3268-3273 (1997).</li>
<li>Samuni, Y., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+in+salivary+glands%3A+from+the+bench+to+the+clinic%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Gene delivery in salivary glands: from the bench to the clinic.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1812 (11), 1515-1521 (2011).</li>
<li>Beahm, D. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+approaches+to+the+submandibular+gland%3A+A+review+of+literature%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">Surgical approaches to the submandibular gland: A review of literature.</a> International Journal of Surgery. 7 (6), 503-509 (2009).</li>
<li>Zheng, C., Shinomiya, T., Goldsmith, C. M., Di Pasquale, G., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convenient+and+reproducible+in+vivo+gene+transfer+to+mouse+parotid+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+diseases%22%5BJournal%5D)">Convenient and reproducible in vivo gene transfer to mouse parotid glands.</a> Oral diseases. 17 (1), 77-82 (2011).</li>
<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+Radiation-Induced+Salivary+Hypofunction+Following+hKGF+Gene+Delivery+to+Murine+Submandibular+Glands%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Prevention of Radiation-Induced Salivary Hypofunction Following hKGF Gene Delivery to Murine Submandibular Glands.</a> Clinical Cancer Research. 17 (9), 2842-2851 (2011).</li>
<li>Okazaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+rat+salivary+gland+tissue+repair+by+basic+fibroblast+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Acceleration of rat salivary gland tissue repair by basic fibroblast growth factor.</a> Archives of Oral Biology. 45 (10), 911-919 (2000).</li>
<li>Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+gene+silencing+confers+radioprotection+to+salivary+glands+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo.</a> Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).</li>
<li>Cotrim, A. P., Sowers, A., Mitchell, J. B., Baum, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+irradiation-induced+salivary+hypofunction+by+microvessel+protection+in+mouse+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Prevention of irradiation-induced salivary hypofunction by microvessel protection in mouse salivary glands.</a> Molecular Therapy. 15 (12), 2101-2106 (2007).</li>
<li>Redman, R. S., Ball, W. D., Mezey, E., Key, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispersed+donor+salivary+gland+cells+are+widely+distributed+in+the+recipient+gland+when+infused+up+the+ductal+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">Dispersed donor salivary gland cells are widely distributed in the recipient gland when infused up the ductal tree.</a> Biotechnic & Histochemistry. 84 (6), 253-260 (2009).</li>
<li>Grundmann, O., Fillinger, J. L., Victory, K. R., Burd, R., Limesand, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+radiation+therapy-induced+salivary+gland+dysfunction+in+mice+by+post+therapy+IGF-1+administration%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Restoration of radiation therapy-induced salivary gland dysfunction in mice by post therapy IGF-1 administration.</a> BMC Cancer. 10, 417-417 (2010).</li>
<li>Limesand, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-Like+Growth+Factor-1+Preserves+Salivary+Gland+Function+After+Fractionated+Radiation%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">Insulin-Like Growth Factor-1 Preserves Salivary Gland Function After Fractionated Radiation.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 78 (2), 579-586 (2010).</li>
<li>Marmary, Y., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26759233">Radiation-induced loss of salivary gland function is driven by cellular senescence and prevented by IL-6 modulation.</a> Cancer Research. , (2016).</li>
<li>Baum, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+responses+to+adenoviral-mediated+transfer+of+the+aquaporin-1+cDNA+for+radiation-induced+salivary+hypofunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Early responses to adenoviral-mediated transfer of the aquaporin-1 cDNA for radiation-induced salivary hypofunction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (47), 19403-19407 (2012).</li>
<li>Arany, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-apoptotic+gene+knockdown+mediated+by+nanocomplexed+siRNA+reduces+radiation+damage+in+primary+salivary+gland+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Pro-apoptotic gene knockdown mediated by nanocomplexed siRNA reduces radiation damage in primary salivary gland cultures.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 113 (6), 1955-1965 (2012).</li>
<li>Benoit, D. S. W., Henry, S. M., Shubin, A. D., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pH-responsive+polymeric+siRNA+carriers+sensitize+multidrug+resistant+ovarian+cancer+cells+to+doxorubicin+via+knockdown+of+polo-like+kinase+1%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">pH-responsive polymeric siRNA carriers sensitize multidrug resistant ovarian cancer cells to doxorubicin via knockdown of polo-like kinase 1.</a> Molecular pharmaceutics. 7 (2), 442-455 (2010).</li>
<li>Malcolm, D. W., Varghese, J. J., Sorrells, J. E., Ovitt, C. E., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Effects+of+Biological+Fluids+on+Colloidal+Stability+and+siRNA+Delivery+of+a+pH-Responsive+Micellar+Nanoparticle+Delivery+System%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">The Effects of Biological Fluids on Colloidal Stability and siRNA Delivery of a pH-Responsive Micellar Nanoparticle Delivery System.</a> ACS Nano. , (2017).</li>
<li>Baranello, M. P., Bauer, L., Benoit, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28styrene-alt-maleic+anhydride%29-based+diblock+copolymer+micelles+exhibit+versatile+hydrophobic+drug+loading%2C+drug-dependent+release%2C+and+internalization+by+multidrug+resistant+ovarian+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Poly(styrene-alt-maleic anhydride)-based diblock copolymer micelles exhibit versatile hydrophobic drug loading, drug-dependent release, and internalization by multidrug resistant ovarian cancer cells.</a> Biomacromolecules. 15 (7), 2629-2641 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fracture-Targeted+Delivery+of+%CE%B2-Catenin+Agonists+via+Peptide-Functionalized+Nanoparticles+Augments+Fracture+Healing%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Fracture-Targeted Delivery of β-Catenin Agonists via Peptide-Functionalized Nanoparticles Augments Fracture Healing.</a> ACS Nano. 11 (9), 9445-9458 (2017).</li>
<li>Baranello, M. P., Bauer, L., Jordan, C. T., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/s12195-015-0391-x">Micelle Delivery of Parthenolide to Acute Myeloid Leukemia Cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 8 (3), 455-470 (2015).</li>
<li>Kuriki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cannulation+of+the+Mouse+Submandibular+Salivary+Gland+via+the+Wharton%27s+Duct%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Cannulation of the Mouse Submandibular Salivary Gland via the Wharton's Duct.</a> Journal of Visualized Experiments. (51), e3074(2011).</li>
<li>Nair, R. P., Zheng, C., Sunavala-Dossabhoy, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroductal+Submandibular+Gland+Instillation+and+Localized+Fractionated+Irradiation+in+a+Rat+Model+of+Salivary+Hypofunction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Retroductal Submandibular Gland Instillation and Localized Fractionated Irradiation in a Rat Model of Salivary Hypofunction.</a> Journal of Visualized Experiments. (110), (2016).</li>
<li>Wang, Y., Malcolm, D. W., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+and+sustained+delivery+of+siRNA%2FNPs+from+hydrogels+expedites+bone+fracture+healing%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled and sustained delivery of siRNA/NPs from hydrogels expedites bone fracture healing.</a> Biomaterials. 139 (Supplement C), 127-138 (2017).</li>
<li>Hoffman, M. D., Van Hove, A. H., Benoit, D. S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Degradable+hydrogels+for+spatiotemporal+control+of+mesenchymal+stem+cells+localized+at+decellularized+bone+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomaterialia%22%5BJournal%5D)">Degradable hydrogels for spatiotemporal control of mesenchymal stem cells localized at decellularized bone allografts.</a> Acta Biomaterialia. 10 (8), 3431-3441 (2014).</li>
<li>Nguyen, C. Q., Yin, H., Lee, B. H., Chiorini, J. A., Peck, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL17%3A+potential+therapeutic+target+in+Sjogren%27s+syndrome+using+adenovirus-mediated+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%22%5BJournal%5D)">IL17: potential therapeutic target in Sjogren's syndrome using adenovirus-mediated gene transfer.</a> Laboratory Investigation. 91 (1), 54-62 (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Wstrzyknięcie wsteczne ma kluczowe znaczenie dla miejscowego dostarczania leku do gruczołu ślinowego. Technika ta ma zastosowanie w badaniach przesiewowych środków terapeutycznych w kierunku schorzeń, takich jak zespół Sjögrena i RIH 9,10,28. Bezpośrednie dostarczanie leku do SMG poprzez wstrzyknięcie wsteczne zapewnia kluczową przewagę nad podawaniem ogólnoustrojowym pod względem potencjału do zmniejszania efektów poza celem, w...

Dysfunkcja gruczołów ślinowych ma wiele etiologii, w tym zespół Sjögrena, autoimmunologiczną utratę funkcjonalnej tkanki wydzielniczej oraz hipoślinotok wywołany promieniowaniem (RIH), częsty następstwo radioterapii raka głowy i szyi1. Utrata funkcji śliny spowodowana którymkolwiek ze schorzeń predysponuje osoby do infekcji jamy ustnej i ogólnoustrojowej, próchnicy zębów, zaburzeń trawienia i połykania, zaburzeń mowy i poważnej depresji1,2,3. W rezultacie znacząco pogarsza się jakość życia, a interwencje ograniczają się do łagodzenia objawów, a nie do leczenia4. Aby zbadać nowe terapie in vivo, interesujące jest podawanie związków bioaktywnych bezpośrednio do gruczołu ślinowego.
Retroductal injection jest cenną metodą dostarczania związków bioaktywnych bezpośrednio do gruczołów ślinowych i testowania skuteczności w chorobie, urazie lub przy normalnej homeostazie tkanek. Trzy główne gruczoły ślinowe to ślinianka przyuszna (PG), ślinianka podżuchwowa (SMG) i gruczoł podjęzykowy (SLG), z których wszystkie opróżniają się do jamy ustnej przez przewody wydalnicze. Anatomia mysiego pistoletu maszynowego umożliwia bezpośredni dostęp poprzez kaniulację przewodu Whartona, znajdującego się w dnie jamy ustnej pod językiem5. Po kanelacji leki solwatowane mogą być podawane bezpośrednio do pistoletu maszynowego. Po dostarczeniu wstecznym, dyfuzja pozagruczołowa jest ograniczona przez otaczającą torebkę tkankową, która reguluje wymianę materiału z otaczającymi strukturami6. SMG i jego przewód mają podobną strukturę u ludzi i są rutynowo dostępne podczas operacji SMG i sialoendoskopii7. U ludzi i myszy PG jest również dostępny przez przewód Stensena w błonie śluzowej policzka8.
W mysich modelach RIH, wstrzyknięcie retroductal SMG zostało wykorzystane do dostarczania środków terapeutycznych, w tym czynników wzrostu, komórek pierwotnych, wektorów adenowirusowych, cytokin i związków przeciwutleniających, aby modulować odpowiedź komórkową na uraz i zmniejszać wynikowe uszkodzenia tkanek5,9,10,11,12,13,14,15,16. Najbardziej znaczącym sukcesem klinicznym iniekcji retroductal jest podanie wektora adenowirusowego do bezpośredniej ekspresji kanału wodnego (Aquaporin 1; AQP1) u pacjentów po radioterapii z powodu raka głowy i szyi17.
Poprzednio opracowaliśmy i pokazaliśmy skuteczność systemu nanocząsteczek i siRNA wstrzykiwanego wstecznie w celu ochrony funkcji gruczołów ślinowych przed RIH11,18,19,20. Jako rozszerzenie naszej wcześniejszej pracy, tutaj demonstrujemy nasz protokół retroductal SMG injection za pomocą fluorescencyjnie znakowanej nanocząstki (NP) zdolnej do ładowania i dostarczania słabo rozpuszczalnych leków21,22,23.
Zsyntetyzowaliśmy NP z kopolimeru diblokowego składającego się z bezwodnika poli(styreno-alt-maleinowego)-b-poli(styrenu) (PSMA) poprzez polimeryzację odwracalnego fragmentacji łańcucha addycji (RAFT), jak opisano wcześniej21. Poprzez wymianę rozpuszczalnika, polimery te spontanicznie samoorganizują się w struktury NP miceli o hydrofobowym wnętrzu i hydrofilowym wyglądzie zewnętrznym21. Nanocząsteczki są znakowane fluoroforem Texas-Red, aby umożliwić weryfikację dostarczenia NP do gruczołów bez poświęcania zwierzęcia. Obrazowanie na żywych zwierzętach i immunohistochemia SMG są pokazane po 1 godzinie i 1 dniu po wstrzyknięciu.
Ten zaktualizowany i powtarzalny protokół kaniulacji powinien umożliwić innym osiągnięcie iniekcji retrodukcyjnej. Oczekujemy, że ta udoskonalona technika stanie się kluczowa dla badań in vivo i rozwoju terapeutycznego24,25.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek pilokarpiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpine</td></tr><tr><td>Student Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki o naukach</td><td>91500-9</td><td>Nożyczki sprężynowe do tracheostomii</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór soli fizjologicznej</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>Sól</td></tr><tr><td>fizjologiczna Dumont #7</td><td>Kleszcze Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Zakrzywione kleszcze</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Kleszcze proste</td></tr><tr><td>Kleszcze o standardowym wzorze</td><td>Narzędzia do nauki</td> o wysokiej jakości <td>11000-12</td><td>kleszcze</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki - narzędzia z węglika wolframu</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Nożyczki preparacyjne</td></tr><tr><td>Mikrohematokryt Heparynizowane rurki kapilarne</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Rurki kapilarne</td></tr><tr><td>Smar Maść</td> <td>do oczuRefresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat poliklonalny anty-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Przeciwciało</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>Oprogramowanie statystyczne</td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Aplikator do maści do oczu</td></tr><tr><td>0,5 ml Strzykawka insulinowa, 29G x 1/2 "</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Strzykawka do wstrzykiwań dootrzewnowych</td></tr></tbody></table>

wsteczne wstrzyknięcie nanocząstek do mysiego gruczołu podżuchwowego

Retroductal Nanoparticle Injection to the Murine Submandibular Gland

Dwa wspólne cele terapii gruczołów ślinowych to zapobieganie i leczenie dysfunkcji tkanek po urazie autoimmunologicznym lub popromiennym. Poprzez miejscowe dostarczanie związków bioaktywnych do gruczołów ślinowych, można bezpiecznie osiągnąć większe stężenia w tkankach w porównaniu z podawaniem ogólnoustrojowym. Co więcej, wpływ pozagruczołowej akumulacji materiału na tkanki docelowe może być znacznie zmniejszony. W związku z tym wstrzyknięcie retroductalne jest szeroko stosowaną metodą badania zarówno biologii, jak i patofizjologii gruczołów ślinowych. Wykazano, że retroductywne podawanie czynników wzrostu, komórek pierwotnych, wektorów adenowirusowych i leków małocząsteczkowych wspomaga funkcję gruczołów w przypadku urazu. Wcześniej wykazaliśmy skuteczność strategii retrodukcyjnie wstrzykiwanej nanocząstki-siRNA w celu utrzymania funkcji gruczołu po napromieniowaniu. W tym miejscu szczegółowo opisano wysoce skuteczną i powtarzalną metodę podawania nanomateriałów do mysiego gruczołu podżuchwowego przez przewód Whartona (ryc. 1). Opisujemy dostęp do jamy ustnej i nakreślamy kroki niezbędne do kaniulacji przewodu Whartona, z dalszymi obserwacjami służącymi jako kontrole jakości podczas całej procedury.

Wtryskiwanie wsteczne do przewodu wydzielniczego może być wykorzystane do podawania NP do mysich SMG (Rycina 1). W tym przypadku podajemy 50 µg NP PSMA znakowanych fluorochromem Texas Red.
Odpowiednie ułożenie myszy umożliwia łatwy dostęp i wizualizację dna jamy ustnej (Rysunek 2A-B). Brodawki podżuchwowe są identyfikowane jako dwa mięsiste wypukłości z...

Miejscowe dostarczanie leków do gruczołów podżuchwowych jest interesujące dla zrozumienia biologii gruczołów ślinowych i dla rozwoju nowych terapii. Przedstawiamy zaktualizowany i szczegółowy protokół iniekcji retrodukcyjnej, zaprojektowany w celu poprawy dokładności podawania i odtwarzalności eksperymentalnej. Przedstawione w niniejszym artykule zastosowanie polega na dostarczaniu nanocząstek polimerowych.

Wsteczne wstrzyknięcie nanocząstek do mysiego gruczołu podżuchwowego

Two common goals of salivary gland therapeutics are prevention and cure of tissue dysfunction following either autoimmune or radiation injury. By locally ...

Ogólnym celem tej procedury jest podanie nanomateriałów bezpośrednio do mysiego gruczołu podżuchwowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na bezpośrednie dostarczanie związków do gruczołu podżuchwowego z pominięciem krążenia ogólnoustrojowego. Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię dysfunkcji gruczołów ślinowych po radioterapii nowotworów głowy i szyi.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które dopiero zaczynają stosować tę metodę, mogą być prowokowane przez zlokalizowanie i kaniulację przewodu podżuchwowego, podczas gdy zwierzę jest uspokojone. Aby rozpocząć tę procedurę, odetnij trzy centymetry rurki cewnika wewnątrzczaszkowego o rozmiarze 32 z wkładką drucianą, aby utworzyć skośny koniec pod kątem około 45 stopni do długiej osi. Upewnij się, że drut jest co najmniej o jeden centymetr dłuższy niż rurka.Stworzenie skośnej krawędzi rurki ułatwi kaniulację przewodową. Jeśli rurka zostanie wygięta podczas zabiegu, należy przyciąć świeżą skośną krawędź. Następnie załaduj 50 mikrolitrów roztworu nanocząstek PSMA lub innego materiału iniekcyjnego do strzykawki Hamiltona.Aby zmniejszyć prawdopodobieństwo urazu nory podczas wstrzykiwania, należy przymocować rurkę cewnika do strzykawki i usunąć martwą objętość. Sprawdzić roztwór do wstrzykiwań, aby upewnić się, że nanocząstka jest w pełni rozpętniona, aby zapobiec niedrożności przewodów. Następnie przygotuj roztwór atropiny w ilości 0,1 miligrama na mililitr.Aby zobrazować kanałowy punkt wejścia, umieść znieczuloną mysz w pozycji leżącej na niestandardowym stoliku. Następnie nałóż maść na oczy, aby zapobiec wysuszeniu podczas zabiegu. Następnie zabezpiecz siekacze szczęki na metalowej belce i użyj elastycznej opaski, aby zastosować napięcie w dół za siekaczami żuchwy.Ustaw mysz pod mikroskopem preparacyjnym, aby uwidocznić podstawę szczęki. Aby poszerzyć usta, użyj niestandardowego zakrzywionego stalowego zwijacza, aby obustronnie napiąć błonę śluzową policzka. Aby uwidocznić brodawkę podżuchwową, chwyć i delikatnie unieś język z dna jamy ustnej za pomocą kleszczy.Umieść kawałek bawełny między językiem a błoną śluzową policzka, aby umożliwić dalszą manipulację w obrębie jamy ustnej. Aby wykonać kaniulację przewodową i umieszczenie linii, chwyć rurkę cewnika za pomocą wkładki drucianej. Aby uzyskać optymalną kontrolę ręczną podczas kaniulacji, dopasuj rurkę do krzywizny kleszczy.Za pomocą mikroskopu preparacyjnego przesuń kleszcze i drut w pole view. Za pomocą wkładki drucianej delikatnie dociśnij podstawę jednej brodawki podżuchwowej, aby uzyskać małe powierzchowne nakłucie błony śluzowej, które ułatwi późniejsze wprowadzenie rurki cewnika. Jeśli napotkasz opór, odetnij świeże skośne końcówki zarówno na rurce, jak i na wstawce drutu ostrymi nożyczkami do preparowania.Po wprowadzeniu należy wyjąć sztyft, a następnie za pomocą mikroskopu preparacyjnego potwierdzić obecność śliny w miejscu nakłucia. Następnie wsuń trzpień do dalszej części rurki. Unikaj mocnych lub nagłych ruchów trzpienia, które mogą spowodować krwawienie lub zagrozić integralności przewodowej.Aby upewnić się, że rurka iniekcyjna będzie pasować do otworu kanału Whartona, należy włożyć rurkę zawierającą trzpień jako sztywną prowadnicę do wcześniej wykonanego nakłucia. Aby zapobiec przedłużającej się niedrożności ciśnienia wstecznego do przeszkody kanałowej, należy wyciągnąć wężyk. Pod mikroskopem upewnij się, że w brodawce podżuchwowej widoczny jest otwór.Jeśli wystąpi widoczne krwawienie, zdejmij sztyft i ponów próbę wykonania zabiegu na przeciwległej brodawce podżuchwowej. Następnie, nie ruszając myszą, podawaj dootrzewnowo jeden miligram roztworu atropiny na kilogram, aby zmniejszyć uniesienie podczas zabiegu. Następnie odczekaj od pięciu do 10 minut.Pod mikroskopem preparacyjnym włożyć rurkę strzykawki do otworu. Jeśli napotkasz opór, odetnij świeży skośny koniec rurki i spróbuj ponownie. Gdy rurka znajdzie się na miejscu w brodawce podżuchwowej, powoli wsuń się od trzech do pięciu milimetrów w głąb kanału.Następnie zwolnij rurkę z kleszczy. Aby poprawić szczelność między rurką a brodawką podżuchwową, osusz interfejs, delikatnie osuszając gazą przez jedną minutę. Sprawdź, aby upewnić się, że pozycja rurki nie zmieniła się podczas suszenia.W tej procedurze wstrzykuje się materiał z szybkością 10 mikrolitrów na minutę. Upewnij się, że mysz pozostaje pod wpływem środków uspokajających i nie wykazuje oznak niepokoju. Po wstrzyknięciu należy utrzymać ciśnienie w strzykawce przez pięć minut, aby poprawić zatrzymywanie materiału w przewodzie Whartona i gruczole podżuchwowym.Okresowo sprawdzaj brodawkę podżuchwową, aby upewnić się, że rurka nie wychodzi z otworu przewodowego. Utrzymanie ciśnienia wtrysku zwiększy skuteczność dostarczania wstecznego. Za pomocą cienkich kleszczyków chwyć i delikatnie wyjmij rurkę z brodawki podżuchwowej.Wyjmij retraktor i bawełnę z jamy ustnej przed odsunięciem myszy od stolika. Aby zweryfikować dostarczanie nanocząstek, system obrazowania in vivo pokazuje lateralizację sygnału czerwonej fluorescencji do leczonej strony myszy godzinę po wstrzyknięciu. To zdjęcie pokazuje, że sygnał nanocząstek znacznie się zmniejszył 24 godziny po wstrzyknięciu.Aby potwierdzić trwałość nanocząstek w gruczołach podżuchwowych 24 godziny po wstrzyknięciu, zostały one pocięte i obejrzane za pomocą obrazowania fluorescencyjnego. Pokazano tutaj niewstrzyknięte kontrolne gruczoły podżuchwowe barwione na obecność akwaporyny 5 i kerityny 5, oznaczające odpowiednio komórki wydzielnicze acini i przewodowe. W retroductal nanoparticle injected subdibu gruczoły akwaporyna pięć i kerytyna pięć plamy wykazują normalną morfologię gruczołu i nanocząstki wchłonięte zarówno w acini, jak i przewodach.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w 20 minut, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby unikać wszelkich zewnętrznych ruchów, które mogłyby przesunąć kaniulę lub zakłócić uszczelnienie utworzone między rurką a brodawką podżuchwową. Po procedurze można wykonać inne metody, takie jak barwienie immunologiczne, ekstrakcja RNA lub cytometria przepływowa, w celu oceny ekspresji genów lub lokalizacji nanomateriału w gruczole podżuchwowym.Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom gruczołów ślinowych do badań przesiewowych i testowania związków w celu zapobiegania kserostomii. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak podawać nanomateriały bezpośrednio do mysiego gruczołu podżuchwowego poprzez kaniulację przewodu Whartona.

retroductal-nanoparticle-injection-to-the-murine-submandibular-gland

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Opisano protokół kaniulacji ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewód Whartona. W tym eksperymencie roztwór błękitu trypanowego został użyty jako barwnik, aby zademonstrować, w jaki sposób technika ta skutecznie dostarcza infuzje do docelowej ślinianki oraz aby wykazać niezawodność tego nowego podejścia jako potencjalnej klinicznej terapii lekowej lub komórkowej w regeneracji ślinianek.

Kaniulacja ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewódna Whartonowski

Ten film opisuje technikę iniekcji wewnątrzprzewodowych, w której dostarczamy mieszankę iniekcyjną do przewodów mysich gruczołów sutkowych.

Iniekcja doprzewodowa: dostarczanie mieszanki iniekcyjnej do przewodów gruczołu sutkowego myszy

Film demonstruje technikę iniekcji pod kontrolą ultradźwięków do podawania leków terapeutycznych do gruczołów ślinowych ludzkiego pacjenta.

Wstrzykiwanie leków terapeutycznych pod kontrolą USG do ludzkich gruczołów ślinowych

Opisano protokół nieinwazyjnego wewnątrzprzewodowego dostarczania wodnych odczynników do gruczołu sutkowego myszy. Metoda wykorzystuje miejscowe wstrzyknięcie do sutków gruczołów sutkowych, celując konkretnie w przewody sutkowe. Technika ta można dostosować do różnych związków, w tym siRNA, chemioterapeutyków i małych cząsteczek.

Wstrzyknięcie doprzewodowe w celu miejscowego dostarczania leku do mysiego gruczołu sutkowego

Węzły chłonne to tkanki immunologiczne, które koordynują odpowiedź immunologiczną i są kluczowym celem dla szczepionek. Biomateriały zostały wykorzystane do lepszego celowania w węzły chłonne i kontrolowania dostarczania antygenów lub adiuwantów. W artykule opisano technikę łączącą te idee w celu wstrzykiwania biokompatybilnych cząstek polimeru do węzłów chłonnych.

Iniekcja do węzłów chłonnych biodegradowalnych cząstek polimeru

Niedoczynność gruczołów ślinowych, główny niekorzystny efekt radioterapii głowy i szyi obniża jakość życia pacjenta. Wykazanie skuteczności nowych terapii na modelach zwierzęcych jest warunkiem wstępnym przed przejściem klinicznym. Protokół ten opisuje podawanie wsteczne i miejscowe napromienianie gruczołów podżuchwowych szczura.

Zaporodowe wkraplanie gruczołu podżuchwowego i miejscowe frakcjonowane napromienianie w szczurzym modelu niedoczynności śliny

Opisujemy protokół chirurgicznego odsłaniania i stabilizacji mysiego podżuchwowego gruczołu ślinowego do obrazowania przyżyciowego za pomocą pionowej mikroskopii przyżyciowej. Protokół ten można łatwo dostosować do innych gruczołów zewnątrzwydzielniczych okolicy głowy i szyi myszy i innych małych gryzoni.

Przygotowanie mysiego śliniaka podżuchwowego do pionowej mikroskopii przyżyciowej

Gruczoły ślinowe zostały zaproponowane jako miejsce docelowe dla terapii genowej, szczególnie w obszarze szczepienia przez transfer genów. Pokazujemy dostarczanie genów w modelu naczelnych innym niż człowiek, wykorzystując infuzję ślinianki przyusznej wstecznej.

Wsteczny wlew gruczołu przyusznego przez przewód Stensena u naczelnych innych niż człowiek w celu wektorowego dostarczania genów

W obecnym protokole, funkcja bariery śródbłonkowej gruczołu podżuchwowego (SMG) została oceniona poprzez wstrzyknięcie różnych molekularnych znaczników fluorescencyjnych do żył kątowych badanych modeli zwierzęcych in vivo pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym.

In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.

Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo

Tutaj opisujemy protokół dostarczania in vivo magnetycznych nanocząstek tlenku żelaza przenoszących oligomery RNA do przerzutowego raka piersi w modelach zwierzęcych, zapewniając klinicznie realne podejście do terapeutycznego wyciszania onkogennych kwasów nukleinowych.

Monitorowanie akumulacji nanoleków w przerzutach mysiego raka piersi

Poznaj technikę wstecznego wstrzyknięcia nanocząstek do mysiego gruczołu podżuchwowego, omijającą krążenie ogólne. Ta metoda umożliwia precyzyjne dostarczanie leków w badaniach nad funkcją gruczołów ślinowych.

Wsteczne wstrzyknięcie nanocząstek do mysiego gruczołu podżuchwowego

Przeglądaj więcej filmów