Name: Ocena funkcjonalna śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną po frakcjonowanym promieniowaniu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Poznaj metodę oceny funkcji gruczołów ślinowych myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną. Technika obejmuje tracheotomię, zbieranie śliny i preparowanie gruczołów, co pozwala badać suchość w jamie ustnej i nadprodukcję śliny.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania opisane w tej publikacji były wspierane przez National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) oraz National Cancer Institute (NCI) of the National Institutes of Health pod numerem nagrody R56 DE025098, UG3 DE027695 i F30 CA206296. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health. Prace te były również wspierane przez NSF DMR 1206219 oraz nagrodę IADR Innovation in Oral Care Award (2016). 
Chcielibyśmy podziękować dr Eri Maruyamie i Andrew Hollomonowi za pomoc w pobieraniu śliny. Chcielibyśmy podziękować Pei-Lun Wengowi za pomoc w rozwarstwieniu gruczołów. Serdecznie dziękujemy Matthew Ingallsowi za pomoc w przygotowaniu figury. Chcielibyśmy podziękować dr Elaine Smolock i Emily Wu za krytyczną lekturę tego manuskryptu.

Wszystkie procedury in vivo opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Uniwersytecką Komisję ds. Zasobów Zwierzęcych na Uniwersytecie w Rochester, Rochester. Ny.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Za pomocą wagi analitycznej odważyć 20 mg pilokarpiny. Rozpuścić go w 2 ml sterylnego roztworu soli fizjologicznej w probówce do mikrowirówki. 
	UWAGA: Ponieważ pilokarpina jest wrażliwa na światło i z czasem traci aktywność, roztwór ten należy przygotować w dniu wstrzyknięcia i chronić przed światłem do czasu podania.</li>
	<li>Za pomocą wagi analitycznej zważ i zidentyfikuj wszystkie probówki zbiorcze i szklane kapilary. Liczba probówek i szklanych naczyń włosowatych powinna odpowiadać liczbie myszy.</li>
</ol>
2. Tracheostomia
<ol>
	<li>Zważyć myszy C57/BL6 za pomocą wagi analitycznej.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki o pojemności 0,5 ml z igłą 29G x 1/2" znieczulić myszy sterylnym roztworem soli fizjologicznej 100 mg/kg ketaminy i 10 mg/kg ksylazyny. Przejdź do następnego kroku, gdy mysz nie reaguje już na bodźce (np. brak odruchu wycofania pedału), który zwykle występuje w ciągu 5 do 10 minut po wstrzyknięciu.</li>
	<li>Po nałożeniu lubrykantu na aplikator z bawełnianą końcówką, delikatnie nałóż go na oczy i umieść mysz w pozycji leżącej na scenie. Znieczulone zwierzę należy trzymać na ciepłej powierzchni. 
	UWAGA: Wszystkie kroki są wykonywane w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Przymocuj nos, kończyny i ogon do sceny za pomocą taśmy chirurgicznej.</li>
	<li>Oczyść i zwilż szyję chusteczką nasączoną alkoholem. 
	UWAGA: Pomoże to zapobiec przedostawaniu się futra do kolejnych nacięć.</li>
	<li>Podnosząc brzuszną skórę szyi w linii środkowej za pomocą kleszczy, wykonaj małe, powierzchowne cięcie za pomocą nożyczek preparujących. Wsuń nożyczki do otworu i powoli otwieraj ostrza podskórnie, aby oddzielić płaszczyzny tkanek.</li>
	<li>Trzymając skórę uniesioną, ostrożnie przyciąć do 1 cm poniżej ust.</li>
	<li>Wykonaj dwa boczne nacięcia w dolnej i górnej części pierwszego cięcia. Za pomocą kleszczy delikatnie odbij skórę, aby umożliwić dostęp do struktur głowy i szyi.</li>
	<li>Używając mikroskopu preparacyjnego przy 8-krotnym powiększeniu, uwidocznij gruczoły podżuchwowe (linia środkowa: <silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie unieś gruczoły, aby odsłonić cztery mięśnie podgnykowe (paski) leżące nad tchawicą. Unikaj rozrywania lub przerywania otaczających naczyń krwionośnych lub przewodów wydalniczych.</li>
	<li>Jeśli zbierasz ślinę z więcej niż jednej myszy, powtórz kroki 2.1 - 2.10 dla każdej myszy przed kontynuowaniem. 
	UWAGA: Tę procedurę można bezpiecznie wykonać na maksymalnie 5 myszach jednocześnie.</li>
	<li>Za pomocą małych nożyczek preparacyjnych usuń przyśrodkową część mięśni paska, pozostając jak najbliżej linii środkowej. Wytnij tylko tyle, ile jest to konieczne, aby uwidocznić tchawicę i utrzymać mięśnie paska z dala od drogi podczas zabiegu. Należy unikać nacinania pobliskich naczyń, ponieważ jeśli występuje zmniejszenie objętości wtórne do znacznego krwotoku, pilokarpina nie będzie skuteczna w indukowaniu wydzielania.</li>
	<li>Odbij mięśnie paska od tchawicy.</li>
	<li>Wizualizuj krtań, tchawicę i tarczycę. Upewnij się, że tchawica jest wolna od leżącej na niej tkanki.</li>
	<li>Wykonaj poziome nacięcie w tchawicy dolnej/tylnej do tarczycy za pomocą małych nożyczek preparacyjnych. Upewnij się, że drogi oddechowe są drożne i wolne od płynu.</li>
</ol>
3. Zbieranie śliny
<ol>
	<li>Usuń taśmę w pobliżu ust i pod kątem rozwarstwienia w dół (45°, czaszka), aby wspomóc przepływ śliny.</li>
	<li>Za pomocą strzykawki 0,5 ml z igłą 29G x 1/2" wykonać dootrzewnowe wstrzyknięcie 10 μl/g pilokarpiny o masie ciała w całkowitej dawce 100 mg/kg.</li>
	<li>Uruchom minutnik. W przypadku dawkowania wielu myszom skróć czas realizacji, poruszając się szybko i jednocześnie wstrzykując pozostałym myszom asystenta.</li>
	<li>Za pomocą standardowych kleszczy otwórz usta, aby uzyskać dostęp do rurki kapilarnej.</li>
	<li>Po zaobserwowaniu kropli śliny w jamie ustnej umieść proksymalny koniec rurki kapilarnej w płynie, a dystalny koniec umieść w probówce zbiorczej umieszczonej poniżej etapu sekcji (obie probówki są wstępnie zważone). 
	UWAGA: U samic myszy C57/BL6 w wieku 6 - 10 tygodni duże ślinotok pojawia się w ciągu 2 minut od wstrzyknięcia pilokarpiny.</li>
	<li>Jeśli ślina gromadzi się w jamie ustnej, ale nie przepływa przez rurkę, spróbuj ponownie wykonać poprzedni krok. Upewnij się, że rurka nie jest umieszczona bezpośrednio na powierzchni błony śluzowej, co może blokować wlot.</li>
	<li>Zbieraj ślinę przez łącznie 12 minut po stymulacji pilokarpiną. Upewnij się, że stomia pozostaje czysta. 
	UWAGA: Zwiększona objętość oddechowa i wydzieliny (ślina, mocz, kał) są w tym czasie normalne.</li>
	<li>Jeśli myszy mają obniżoną czynność śliny (np. z powodu urazu lub interwencji), przenieś pozostały płyn z jamy ustnej do probówki zbiorczej za pomocą mikropipety P200. W przypadku zbierania od wielu myszy upewnij się, że końcówki zostały zmienione.</li>
	<li>Zapisz masę pobranej śliny wraz z probówkami 12 minut po wstrzyknięciu pilokarpiny.</li>
</ol>
4. Rozwarstwienie gruczołów
<ol>
	<li>Eutanazja myszy przez eutanazję CO2 (zgodnie z opisem w wytycznych AVMA dotyczących eutanazji zwierząt: wydanie 2013), a następnie torakotomię, zwracając uwagę na zachowanie struktur głowy i szyi. Z tego powodu należy unikać zwichnięcia szyjki macicy jako metody eutanazji.</li>
	<li>Umieść mysz w pozycji leżącej na stole montażowym. Zmień położenie gruczołów w pierwotnym miejscu nad tchawicą (<silna klasa="xfig">Ryc. 1).</li>
	<li>Używając mikroskopu preparacyjnego pod 8-krotnym powiększeniem, zwizualizuj główne gruczoły: PG, SMG i SLG. Aby odróżnić gruczoły podczas sekcji, zidentyfikuj, że PG jest rozlany, leżący bocznie w stosunku do SMG i SLG. 
	UWAGA: W przypadku preparowania PG należy to zrobić najpierw, ponieważ jest on najmniej zdefiniowany i najbardziej prawdopodobne, że zostanie rozerwany.</li>
	<li>Chwyć ogon PG kleszczami, odciągając go od leżących pod spodem struktur i delikatnie napręż przed przecięciem głowy PG nożyczkami preparującymi.</li>
	<li>Przebij się przez kapsułę otaczającą pistolety maszynowe za pomocą kleszczy. Delikatnie oddziel lewy i prawy pistolet maszynowy.</li>
	<li>Uwolnij grzbietową część SMG od przylegającej tkanki niegruczołowej za pomocą kleszczy.</li>
	<li>Usuń pistolet maszynowy z szyi, naciągając przewód Whartona za pomocą kleszczy i przecinając kanał nożyczkami preparacyjnymi.</li>
	<li>Delikatnie oddziel SLG od pistoletu maszynowego za pomocą kleszczy. 
	UWAGA: SLG znajduje się w superobocznym aspekcie pistoletu maszynowego.</li>
	<li>Korzystając z wagi analitycznej, zapisz masy pistoletów maszynowych.</li>
</ol>

<ol><li>Bradley, P., O'Hara, J. <a target="_blank" href="http://www.surgeryjournal.co.uk/article/S0263-9319(15)00194-5/pdf">Diseases of the salivary glands.</a> Surgery (Oxford). 33 (12), 614-619 (2015).</li>
<li>Fox, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+enhancement+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Caries+Research%22%5BJournal%5D)">Salivary enhancement therapies.</a> Caries Research. 38 (3), 241-246 (2004).</li>
<li>Konings, A. W. T., Coppes, R. P., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+salivary+gland+radiosensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Oncology+Biology+Physics%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of salivary gland radiosensitivity.</a> International Journal of Radiation Oncology Biology Physics. 62 (4), 1187-1194 (2005).</li>
<li>Burlage, F. R., Coppes, R. P., Meertens, H., Stokman, M. A., Vissink, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parotid+and+submandibular%2Fsublingual+salivary+flow+during+high+dose+radiotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Parotid and submandibular/sublingual salivary flow during high dose radiotherapy.</a> Radiotherapy and Oncology. 61 (3), 271-274 (2001).</li>
<li>Aure, M. H., Konieczny, S. F., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+gland+homeostasis+is+maintained+through+acinar+cell+self-duplication%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Salivary gland homeostasis is maintained through acinar cell self-duplication.</a> Developmental Cell. 33 (2), 231-237 (2015).</li>
<li>Aure, M. H., Arany, S., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salivary+Glands%3A+Stem+Cells%2C+Self-duplication%2C+or+Both%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Salivary Glands: Stem Cells, Self-duplication, or Both?</a> Journal of Dental Research. 94 (11), 1502-1507 (2015).</li>
<li>Ono, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+effects+of+cevimeline+and+pilocarpine+on+salivary+mechanisms%2C+cardiovascular+response+and+thirst+sensation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct effects of cevimeline and pilocarpine on salivary mechanisms, cardiovascular response and thirst sensation in rats.</a> Archives of Oral Biology. 57 (4), 421-428 (2012).</li>
<li>Proctor, G. B., Carpenter, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+salivary+gland+function+by+autonomic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Auton+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of salivary gland function by autonomic nerves.</a> Auton Neuroscience. 133 (1), 3-18 (2007).</li>
<li>Nezu, A., Morita, T., Tojyo, Y., Nagai, T., Tanimura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+agonistic+effects+of+pilocarpine+on+Ca%282%2B%29+responses+and+salivary+secretion+in+the+submandibular+glands+of+live+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Physiology%22%5BJournal%5D)">Partial agonistic effects of pilocarpine on Ca(2+) responses and salivary secretion in the submandibular glands of live animals.</a> Experimental Physiology. 100 (6), 640-651 (2015).</li>
<li>Urita, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rebamipide+and+mosapride+enhance+pilocarpine-induced+salivation%5BTitle%5D)+AND+%22North+American+Journal+of+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Rebamipide and mosapride enhance pilocarpine-induced salivation.</a> North American Journal of Medical Sciences. 1 (3), 121-124 (2009).</li>
<li>Arany, S., Benoit, D. S., Dewhurst, S., Ovitt, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoparticle-mediated+gene+silencing+confers+radioprotection+to+salivary+glands+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Nanoparticle-mediated gene silencing confers radioprotection to salivary glands in vivo.</a> Molecular Therapy. 21 (6), 1182-1194 (2013).</li>
<li>Kondo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+in+the+acinar+cells+of+the+murine+major+salivary+glands%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dental+Research%22%5BJournal%5D)">Functional differences in the acinar cells of the murine major salivary glands.</a> Journal of Dental Research. 94 (5), 715-721 (2015).</li>
<li>Evans, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+impairment+of+salivation+in+Na%2B%2FK%2B%2F2Cl-+cotransporter+%28NKCC1%29-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Severe impairment of salivation in Na+/K+/2Cl- cotransporter (NKCC1)-deficient mice.</a> Journal of Biological Chemistry. 275 (35), 26720-26726 (2000).</li>
<li>Delanian, S., Lefaix, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radiation-induced+fibroatrophic+process%3A+therapeutic+perspective+via+the+antioxidant+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">The radiation-induced fibroatrophic process: therapeutic perspective via the antioxidant pathway.</a> Radiotherapy and Oncology. 73 (2), 119-131 (2004).</li>
<li>Guchelaar, H. J., Vermes, A., Meerwaldt, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation-induced+xerostomia%3A+pathophysiology%2C+clinical+course+and+supportive+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Support+Care+Cancer%22%5BJournal%5D)">Radiation-induced xerostomia: pathophysiology, clinical course and supportive treatment.</a> Support Care Cancer. 5 (4), 281-288 (1997).</li>
<li>Lin, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+short-term+%CE%B3-irradiation+effects+on+mouse+salivary+gland+function+using+a+new+saliva+collection+device%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Measuring short-term γ-irradiation effects on mouse salivary gland function using a new saliva collection device.</a> Archives of Oral Biology. 46 (11), 1085-1089 (2001).</li>
<li>Montenegro, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profound+differences+between+humans+and+rodents+in+the+ability+to+concentrate+salivary+nitrate%3A+Implications+for+translational+research%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+biology%22%5BJournal%5D)">Profound differences between humans and rodents in the ability to concentrate salivary nitrate: Implications for translational research.</a> Redox biology. 10, 206-210 (2016).</li>
<li>Choi, J. S., Park, I. S., Kim, S. K., Lim, J. Y., Kim, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphometric+and+Functional+Changes+of+Salivary+Gland+Dysfunction+After+Radioactive+Iodine+Ablation+in+a+Murine+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Thyroid%22%5BJournal%5D)">Morphometric and Functional Changes of Salivary Gland Dysfunction After Radioactive Iodine Ablation in a Murine Model.</a> Thyroid. 23 (11), 1445-1451 (2013).</li>
<li>Imamura, T. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+pilocarpine-induced+saliva+secretion+by+adrenergic+agonists+in+ICR+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Pharmacology+and+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of pilocarpine-induced saliva secretion by adrenergic agonists in ICR mice.</a> Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology. 39 (12), 1038-1043 (2012).</li>
<li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+Secretion+of+Saliva+in+Transgenic+Mice+Lacking+Aquaporin-5+Water+Channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Defective Secretion of Saliva in Transgenic Mice Lacking Aquaporin-5 Water Channels.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (29), 20071-20074 (1999).</li>
<li>Parkes, M. W., Parks, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supersensitivity+of+salivation+in+response+to+pilocarpine+after+withdrawal+of+chronically+administered+hyoscine+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Supersensitivity of salivation in response to pilocarpine after withdrawal of chronically administered hyoscine in the mouse.</a> British Journal of Pharmacology. 46 (2), 315-323 (1972).</li>
<li>Nishiyama, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-Regulated+PAR-2-Mediated+Salivary+Secretion+in+Mice+Deficient+in+Muscarinic+Acetylcholine+Receptor+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmacology+and+Experimental+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Up-Regulated PAR-2-Mediated Salivary Secretion in Mice Deficient in Muscarinic Acetylcholine Receptor Subtypes.</a> Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 320 (2), 516(2007).</li>
<li>Yang, B., Song, Y., Zhao, D., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotype+analysis+of+aquaporin-8+null+mice%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Phenotype analysis of aquaporin-8 null mice.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 288 (5), C1161-C1170 (2005).</li>
<li>Kamiya, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((X-Ray-Induced+Damage+to+the+Submandibular+Salivary+Glands+in+Mice%3A+An+Analysis+of+Strain-Specific+Responses%5BTitle%5D)+AND+%22BioResearch+Open+Access%22%5BJournal%5D)">X-Ray-Induced Damage to the Submandibular Salivary Glands in Mice: An Analysis of Strain-Specific Responses.</a> BioResearch Open Access. 4 (1), 307-318 (2015).</li>
<li>Patel, R. M., Varma, S., Suragimath, G., Zope, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+and+Comparison+of+Salivary+Calcium%2C+Phosphorous%2C+Alkaline+Phosphatase+and+pH+Levels+in+Periodontal+Health+and+Disease%3A+A+Cross-sectional+Biochemical+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+and+Diagnostic+Research%22%5BJournal%5D)">Estimation and Comparison of Salivary Calcium, Phosphorous, Alkaline Phosphatase and pH Levels in Periodontal Health and Disease: A Cross-sectional Biochemical Study.</a> Journal of Clinical and Diagnostic Research. 10 (7), ZC58-ZC61 (2016).</li>
<li>Droebner, K., Sandner, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+salivary+secretion+assay+in+F508del+mice--the+murine+equivalent+of+the+human+sweat+test%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cystic+Fibrosis%22%5BJournal%5D)">Modification of the salivary secretion assay in F508del mice--the murine equivalent of the human sweat test.</a> Journal of Cystic Fibrosis. 12 (6), 630-637 (2013).</li>
<li>Lamy, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+mouse+whole+saliva+soluble+proteome+induced+by+tannin-enriched+diet%5BTitle%5D)+AND+%22Proteome+Science%22%5BJournal%5D)">Changes in mouse whole saliva soluble proteome induced by tannin-enriched diet.</a> Proteome Science. 8 (1), 65(2010).</li>
<li>Mahomed, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+mucin+immunohistochemistry+in+salivary+gland+tumors+and+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oral+Oncology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in mucin immunohistochemistry in salivary gland tumors and head and neck squamous cell carcinoma.</a> Oral Oncology. 47 (9), 797-803 (2011).</li>
<li>Kohlgraf, K. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitation+of+SPLUNC1+in+saliva+with+an+xMAP+particle-based+antibody+capture+and+detection+immunoassay%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Oral+Biology%22%5BJournal%5D)">Quantitation of SPLUNC1 in saliva with an xMAP particle-based antibody capture and detection immunoassay.</a> Archives of Oral Biology. 57 (2), 197-204 (2012).</li>
<li>Maimets, M., Bron, R., de Haan, G., van Os, R., Coppes, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similar+ex+vivo+expansion+and+post-irradiation+regenerative+potential+of+juvenile+and+aged+salivary+gland+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Radiotherapy+and+Oncology%22%5BJournal%5D)">Similar ex vivo expansion and post-irradiation regenerative potential of juvenile and aged salivary gland stem cells.</a> Radiotherapy and Oncology. , (2015).</li>
<li>Lombaert, I. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rescue+of+salivary+gland+function+after+stem+cell+transplantation+in+irradiated+glands%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rescue of salivary gland function after stem cell transplantation in irradiated glands.</a> PLoS One. 3 (4), e2063(2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiamy wieloetapową metodę oceny funkcji gruczołów ślinowych, która może być zastosowana do badania uszkodzeń gruczołów i terapii. Nasza procedura obejmuje tracheostomię, pobranie śliny i rozwarstwienie gruczołów, z których każdy ma zastosowania eksperymentalne, które mogą wspierać zintegrowane badanie biologii gruczołów ślinowych. Na przykład tracheostomia mysia jest stosowana do ogólnego udrażniania dróg oddechowych podczas zabiegów niedrożności jamy ustnej.
Prawidłowe rozwarstwienie ...

Zaburzenia gruczołów ślinowych obejmują zespoły rozregulowanego lub upośledzonego wydzielania, prowadzące do nadprodukcji (sialorrhea) lub niedostatecznej produkcji (kserostomia i hipoślinotok) śliny1. W obu przypadkach istnieje zainteresowanie pogłębieniem naszej wiedzy na temat biologii gruczołów ślinowych w kierunku ostatecznego celu, jakim jest rozwój terapeutyczny2.
Gruczoły ślinowe są bardzo wrażliwymi na promieniowanie narządami i często ulegają uszkodzeniu podczas radioterapii raka głowy i szyi, co prowadzi do trwałej suchości w jamie ustnej (xerostomia)3,4. Jednak w przeciwieństwie do innych tkanek wrażliwych na promieniowanie ślinowe tempo rotacji gruczołów ślinowych jest stosunkowo niskie, a mechanizm utraty wydzieliny jest słabo poznany5,6. W tym wyjątkowym urazie strategie regeneracji tkanek i radioprotekcji wymagają oceny funkcjonalnej śliny. Eksperymentalnie zbieranie śliny mysiej jest szczególnie cennym narzędziem w ocenie odpowiedzi gruczołu zarówno na promieniowanie, jak i środki terapeutyczne.
Tutaj prezentujemy metodę wykonywania i ilościowego oznaczania stymulowanego wydzielania śliny za pomocą pilokarpiny, silnego agonisty muskaryny7. Pilokarpina stymuluje autonomiczny układ nerwowy do indukowania wydzielania gruczołów8,9. Aby prawidłowo wykonać ten test, wymagana jest tracheostomia, aby upewnić się, że mysz utrzymuje drożność dróg oddechowych przez cały czas trwania procedury oraz zmniejszyć ryzyko zadławienia i zachłyśnięcia się z powodu nagromadzonych wydzielin w jamie ustnej10.
To jest procedura terminalna, której kulminacją jest usunięcie trzech głównych gruczołów ślinowych: ślinianki przyusznej (PG), podżuchwowej (SMG) i podjęzykowej (SLG). W badaniach funkcjonalnych rejestrowane są masy gruczołów, które są często używane do normalizacji pomiaru śliny11,12,13. Dane te są szczególnie ważne w badaniach nad promieniowaniem, w których atrofia gruczołów jest oczekiwanym wynikiem14,15
W literaturze istnieje zmienność w odniesieniu do tego, jak stymulowane wydzielanie śliny jest wykonywane i raportowane16. Na przykład dawki pilokarpiny w literaturze obejmują co najmniej trzy rzędy wielkości17,18,19,20,21,22,23. W tym miejscu przedstawiamy zoptymalizowany protokół stosowania pilokarpiny w wysokich dawkach w celu poprawy odtwarzalności w wykonywaniu metody, a także zapewnienia modułowej platformy technik (tracheostomia, pobieranie śliny i wypreparowanie gruczołów), które można dostosować w razie potrzeby.
Oprócz demonstracji protokołu, dołączamy reprezentatywne dane funkcjonalne dotyczące przepływu śliny po 2 tygodniach od frakcjonowanego promieniowania (4 dawki 6,85 Gy) do regionu SMG.

<table><tbody><tr><td>Chlorowodorek pilokarpiny</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6503</td><td>Pilocarpine</td></tr><tr><td>Student Vannas Nożyczki sprężynowe</td><td>Narzędzia do nauki o naukach</td><td>91500-9</td><td>Nożyczki sprężynowe do tracheostomii</td></tr><tr><td>Sterylny roztwór soli fizjologicznej</td><td>Medline</td><td>RDI30296H</td><td>Sól</td></tr><tr><td>fizjologiczna Dumont #7</td><td>Kleszcze Fine Science Tools</td><td>11274-20</td><td>Zakrzywione kleszcze</td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>Kleszcze proste</td></tr><tr><td>Kleszcze o standardowym wzorze</td><td>Narzędzia do nauki</td> o wysokiej jakości <td>11000-12</td><td>kleszcze</td></tr><tr><td>Drobne nożyczki - narzędzia z węglika wolframu</td><td>Fine Science Tools</td><td>14568-09</td><td>Nożyczki preparacyjne</td></tr><tr><td>Mikrohematokryt Heparynizowane rurki kapilarne</td><td>Fisher Scientific</td><td>22362566</td><td>Rurki kapilarne</td></tr><tr><td>Smar Maść</td> <td>do oczuRefresh</td><td>N/A</td><td>Refresh Lacri-Lube</td></tr><tr><td>Goat poliklonalny anty-Nkcc1</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>SC-21545</td><td>Nkcc1 Przeciwciało</td></tr><tr><td>DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenyloindol, Dichlorowodorek)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>ver6.0</td><td>Oprogramowanie statystyczne</td></tr><tr><td>Aplikator z bawełnianą końcówką</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td>Aplikator do maści do oczu</td></tr><tr><td>0,5 ml Strzykawka insulinowa, 29G x 1/2 "</td><td>BD</td><td>7629</td><td>Strzykawka do wstrzykiwań dootrzewnowych</td></tr></tbody></table>

ocena funkcjonalna śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną po frakcjonowanym promieniowaniu

Murine Salivary Functional Assessment via Pilocarpine Stimulation Following Fractionated Radiation

Wydzielanie śliny jest często obserwowane w reakcji autoimmunologicznej zespołu Sjögrena lub po popromiennym uszkodzeniu głównych gruczołów ślinowych. W takich przypadkach pozostają pytania dotyczące patogenezy choroby i skutecznych interwencji. Zoptymalizowana technika, która umożliwia funkcjonalną ocenę gruczołów ślinowych, jest nieoceniona w badaniu biologii, dysfunkcji i terapii gruczołów zewnątrzwydzielniczych. W tym miejscu przedstawiamy krok po kroku podejście do wykonywania wydzielania śliny stymulowanego pilokarpiną, w tym tracheostomię i rozwarstwienie trzech głównych mysich gruczołów ślinowych. Wyszczególniamy również odpowiednią anatomię głowy i szyi myszy dostępną podczas tych technik. Takie podejście jest skalowalne, co pozwala na jednoczesne przetwarzanie wielu myszy, poprawiając w ten sposób wydajność przepływu pracy. Naszym celem jest poprawa powtarzalności tych metod, z których każda ma dalsze zastosowania w tej dziedzinie. Oprócz pobierania śliny omawiamy wskaźniki służące do ilościowego określania i normalizacji zdolności funkcjonalnej tych tkanek. Reprezentatywne dane dotyczą gruczołów podżuchwowych z obniżoną czynnością gruczołów ślinowych 2 tygodnie po frakcjonowanym napromienianiu (4 dawki 6,85 Gy).

Podczas pobierania śliny stymulowanej wysoką dawką pilocarpiny ważne jest utrzymanie drożności dróg oddechowych, aby zapobiec aspiracji lub zadławieniu wydzielinami w jamie ustnej. Schemat tracheotomii przedstawiono na Rysunku 1. Po nacięciu tchawicy stoma musi pozostać wolna od tkanek i płynów.
Aby wzmocnić działanie kapilarne podczas pobierania śliny, myszy należy ustawić głowami w dół pod kątem 4...

Przedstawiamy szczegółowe podejście do pobierania śliny, w tym mysią tracheostomię i izolację trzech głównych gruczołów ślinowych.

Ocena funkcjonalna śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną po frakcjonowanym promieniowaniu

Hyposalivation is commonly observed in the autoimmune reaction of Sj&#246;gren's syndrome or following radiation injury to the major salivary glands. In ...

Ogólnym celem tej procedury jest ocena funkcji śliny myszy poprzez stymulację pilokarpiną. Metoda ta może być stosowana zarówno do zrozumienia naturalnej historii dysfunkcji gruczołów ślinowych, jak i do przetestowania skuteczności wszelkich potencjalnych interwencji. Nasz protokół zapewnia modułową platformę technik, w tym tracheotomię u myszy, pobieranie śliny i rozwarstwienie gruczołów.Klinicznie technika ta ma implikacje dla badań oceniających suchość w jamie ustnej lub nadmierną produkcję śliny. Może być również stosowany do innych zabiegów wewnątrzustnych wymagających udrażnienia dróg oddechowych. Osoby, które po raz pierwszy uczą się tego protokołu, mogą uznać tracheostomię i rozwarstwienie gruczołów za trudne.Mamy nadzieję, że ten film pomoże Ci nauczyć się prawidłowej techniki izolacji gruczołów, a także odpowiedniej anatomii. Za pomocą wagi analitycznej odważ 20 miligramów pilokarpiny, a następnie rozpuść ją w 2 mililitrach sterylnej soli fizjologicznej. Roztwory pilokarpiny muszą być świeże w dniu ich użycia.Następnie zważ wszystkie naczynia do pobrania do zabiegu i zważ mysz, aby dokładnie ją dozować. Użyj szczepu C57 black 6. Po znieczuleniu myszy i potwierdzeniu znieczulenia za pomocą uszczypnięcia palca u nogi, nałóż maść okulistyczną za pomocą aplikatora z bawełnianą końcówką i ustaw mysz na wznak.Następnie zabezpiecz jego kończyny, nos i ogon taśmą chirurgiczną. Następnie oczyść i zwilż szyję chusteczką nasączoną alkoholem. Teraz użyj kleszczy, aby uszczypnąć brzuszną szyję linii środkowej, a nożyczkami wykonaj małe, powierzchowne cięcie.Następnie wsuń nożyczki do otworu i powoli otwórz ostrza podskórnie, aby oddzielić płaszczyzny tkanki. Trzymając skórę uniesioną, ostrożnie wykonaj kolejne nacięcie jeden centymetr poniżej ust. Następnie wykonaj dwa boczne nacięcia, dolne i górne do pierwszego cięcia.Teraz za pomocą kleszczy delikatnie rozsuń skórę, aby uzyskać dostęp do anatomii głowy i szyi. Kontynuuj przy użyciu mikroskopu preparacyjnego przy ośmiokrotnym powiększeniu. Za pomocą cienkich kleszczy delikatnie unieś gruczoł podżuchwowy, aby odsłonić cztery mięśnie podgnykowe leżące nad tchawicą.Unikaj rozrywania lub przerywania otaczających naczyń krwionośnych lub przewodów wydalniczych. Jeśli zbierasz ślinę od więcej niż jednej myszy, przygotuj wszystkie myszy do tego momentu, zanim przejdziesz dalej. Jedna osoba może obsłużyć do pięciu myszy jednocześnie.Teraz, aby kontynuować operację, użyj małych nożyczek preparacyjnych, aby usunąć przyśrodkową część mięśni paska, pozostając blisko linii środkowej. Usuń tylko tyle mięśni, aby uwidocznić tchawicę i zapobiec zakłócaniu zabiegu przez mięśnie. Podczas preparowania mięśni paska szczególnie ważne jest, aby unikać nacinania pobliskich naczyń.Nacięcie może prowadzić do zmniejszenia objętości wtórnej do krwotoku, a tym samym sprawić, że pilokarpina będzie nieskuteczna w indukcji wydzielania śliny. Aby kontynuować, odbij mięśnie paska od tchawicy, aby uwidocznić krtań, tchawicę i tarczycę. Upewnij się, że tchawica jest wolna od leżącej na niej tkanki.Na koniec wykonaj poziome nacięcie w tchawicy, poniżej tarczycy, używając małych nożyczek preparacyjnych, a nie skalpela. Upewnij się, że ta droga oddechowa jest drożna i wolna od płynu. W celu pobrania śliny najpierw usuń taśmę w pobliżu ust, a następnie przechyl etap preparacji pod kątem 45 stopni, aby skierować przepływ śliny w kierunku czaszki.Następnie użyj strzykawki o pojemności 0,5 mililitra z igłą o średnicy 29 cali, aby podać dootrzewnowe wstrzyknięcie pilokarpiny. Następnie uruchom minutnik. Jeśli wstrzykuje się wiele myszy, pracuj szybko z pomocą asystenta.Następnie użyj standardowych kleszczy, aby otworzyć usta i ustawić rurkę kapilarną na miejscu. W ciągu kilku minut powinna powstać kropla śliny. Umieść jeden koniec rurki kapilarnej w ślinie, a drugi koniec włóż do rurki zbiorczej umieszczonej poniżej etapu sekcji.W razie potrzeby zmień położenie rurki, aby pobrać ślinę. Unikaj kontaktu z tkankami błony śluzowej, ponieważ śluz może zatkać wlot. Pobieraj ślinę przez 12 minut od momentu wstrzyknięcia.Stomia powinna pozostać czysta przez cały czas. Jeśli mysz ma obniżoną czynność śliny, przenieś płyn z ust do probówki zbiorczej za pomocą mikropipety P200. Zawsze używaj innej rurki lub końcówki dla każdej myszy.Po skompletowaniu wszystkich naczyń należy ponownie zważyć naczynia zbiorcze. Po eutanazji myszy przez uduszenie dwutlenkiem węgla, wykonaj staranną torakotomię i umieść mysz na wznak na stoliku mikroskopu preparacyjnego. Następnie zmień położenie gruczołów w pierwotnym miejscu operacji.Pod ośmiokrotnym powiększeniem wizualizuj główne gruczoły, PG, SMG i SLG. PG jest rozproszony i jest umieszczony bocznie w stosunku do pistoletu maszynowego i SLG. Najpierw przeanalizuj PG.Chwyć ogon PG kleszczami, odciągając go od leżących poniżej struktur. Zbuduj do delikatnego napięcia, a następnie odetnij głowę PG nożyczkami do preparowania. Następnie przebij kleszczami kapsułę otaczającą pistolety maszynowe.Następnie delikatnie oddziel lewy i prawy pistolet maszynowy. Następnie uwolnij grzbietowy aspekt SMG od otaczającej tkanki niegruczołowej. Aby usunąć pistolet maszynowy, zaciśnij kanał Whartona kleszczami i przetnij kanał nożyczkami do preparowania.SLG znajduje się w superobocznym aspekcie pistoletu maszynowego. Aby oddzielić dwa gruczoły, chwyć każdy z nich osobnymi kleszczami i umieść jeden ząb w płaszczyźnie tkanki między gruczołami. Następnie powoli buduj napięcie, a dwa gruczoły będą się stopniowo rozłączać.Po wyizolowaniu tkanki gruczołowej należy natychmiast ponownie zważyć naczynia zbiorcze. Jako pozytywną kontrolę do analizy, mysie pistolety maszynowe zostały napromieniowane i porównane z kontrolami. Dwa tygodnie po czterech frakcjach promieniowania w temperaturze 6,85 grej, funkcja śliny znacznie się pogorszyła.Zarówno całkowite wydzielanie śliny, jak i wydzielina znormalizowana do mokrej masy gruczołu wykazały, że zdolność funkcjonalna śliny była zmniejszona, co świadczy o czułości testu. Następnie przeprowadzono sekcję pistoletów maszynowych. Można je było naprawić, podzielić na sekcje i poplamić.Barwienie hematoksyliną i eozyną zastosowano w celu porównania ogólnej architektury ze stymulacją pilokarpiną lub bez niej. Dodatkowo tkanki poddano barwieniu immunologicznemu pod kątem błonowego transportera chlorku sodu i potasu, NKCC1. W obu barwieniach tkanki wykazywały podobną morfologię komórek, niezależnie od stymulacji pilokarpiną.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak ocenić funkcję śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną. Po opanowaniu tej pełnej techniki można ją wykonać w mniej niż godzinę. Metoda ta pozwala badaczom śliny na pobranie całej śliny w celu ilościowego określenia funkcji gruczołów oraz czystego i powtarzalnego wyizolowania trzech głównych gruczołów ślinowych.Podczas próby wykonania tej procedury, zwłaszcza w przypadku więcej niż jednej myszy, ważne jest, aby poruszać się szybko i zakończyć pobieranie śliny we właściwym momencie. Po tej procedurze można określić skład i aktywność enzymatyczną z całej śliny, podczas gdy tkanki gruczołowe można przetworzyć do badania histologicznego lub barwienia immunologicznego.

murine-salivary-functional-assessment-via-pilocarpine-stimulation

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opisano protokół kaniulacji ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewód Whartona. W tym eksperymencie roztwór błękitu trypanowego został użyty jako barwnik, aby zademonstrować, w jaki sposób technika ta skutecznie dostarcza infuzje do docelowej ślinianki oraz aby wykazać niezawodność tego nowego podejścia jako potencjalnej klinicznej terapii lekowej lub komórkowej w regeneracji ślinianek.

Kaniulacja ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewódna Whartonowski

Funkcja neuronów u dorosłych ssaków pozostaje aktywnym obszarem badań. Promieniowanie jonizujące hamuje powstawanie nowych neuronów. Korzystając z napromieniania ogniskowego pod kontrolą tomografii komputerowej (CFIR), trójwymiarowe anatomiczne celowanie w określone populacje progenitorów nerwowych może być teraz wykorzystane do oceny funkcjonalnej roli neurogenezy dorosłych.

Funkcjonalne badanie neurogenezy podwzgórza u dorosłych z ogniskowym hamowaniem radiologicznym

Niedoczynność gruczołów ślinowych, główny niekorzystny efekt radioterapii głowy i szyi obniża jakość życia pacjenta. Wykazanie skuteczności nowych terapii na modelach zwierzęcych jest warunkiem wstępnym przed przejściem klinicznym. Protokół ten opisuje podawanie wsteczne i miejscowe napromienianie gruczołów podżuchwowych szczura.

Zaporodowe wkraplanie gruczołu podżuchwowego i miejscowe frakcjonowane napromienianie w szczurzym modelu niedoczynności śliny

Opisujemy metodę wykorzystującą ukierunkowane promieniowanie obwodowe do wywołania u myszy zachowania przypominającego zmęczenie. Wybrana, nieśmiertelna dawka napromieniania prowadzi do tygodniowego ograniczenia dobrowolnej aktywności związanej z bieganiem po kółkach.

Mysi model zmęczenia wywołanego promieniowaniem obwodowym

Niedoczynność gruczołów ślinowych jest częstą konsekwencją chorób autoimmunologicznych i radioterapii. Powtarzalna ocena funkcji gruczołów ślinowych w mysich modelach tych chorób jest wyzwaniem technicznym. W tym miejscu opisano prostą metodę dokładnego i powtarzalnego pomiaru produkcji śliny u myszy.

Metoda pomiaru funkcji gruczołów ślinowych u myszy

Miejscowe dostarczanie leków do gruczołów podżuchwowych jest interesujące dla zrozumienia biologii gruczołów ślinowych i dla rozwoju nowych terapii. Przedstawiamy zaktualizowany i szczegółowy protokół iniekcji retrodukcyjnej, zaprojektowany w celu poprawy dokładności podawania i odtwarzalności eksperymentalnej. Przedstawione w niniejszym artykule zastosowanie polega na dostarczaniu nanocząstek polimerowych.

Wsteczne wstrzyknięcie nanocząstek do mysiego gruczołu podżuchwowego

Wykorzystanie trójwymiarowych kultur organotypowych do wizualizacji morfologii i funkcjonalnych markerów gruczołów ślinowych może dostarczyć nowych informacji na temat mechanizmów uszkodzenia tkanek po promieniowaniu. Opisano tutaj protokół cięcia, hodowli, napromieniania, barwienia i obrazowania skrawków gruczołów ślinowych o grubości 50–90 μm przed i po ekspozycji na promieniowanie jonizujące.

Radioterapia kultur organotypowych z modeli gruczołów ślinowych podżuchwowych i przyusznych Kluczowe cechy in vivo

Obrazowanie immunofluorescencyjne jest ograniczone przez możliwość obserwacji złożonych, zależnych od czasu procesów biologicznych w zaledwie jednej migawce w czasie. Badanie to przedstawia podejście do obrazowania na żywo przeprowadzone na precyzyjnie wyciętych wycinkach gruczołu podżuchwowego myszy. Takie podejście pozwala na obserwację w czasie rzeczywistym interakcji komórka-komórka podczas homeostazy oraz procesów regeneracji i naprawy.

Badanie interakcji komórka-komórka w gruczole ślinowym za pomocą obrazowania żywych komórek ex vivo

Przedstawiamy tutaj protokół stosowania akupunktury ogniowej pod kontrolą ultrasonograficzną na warstwach gruczołowych lub mięśniowych w leczeniu ślinotoku u pacjentów po udarze z tracheostomią.

Ultradźwiękowo prowadzona akupunktura igiełkowa w leczeniu ślinotoku u pacjentów z tracheostomią

Opisano mysi model przezskórnej elektrycznej stymulacji nerwowo-mięśniowej (NMES), bezpiecznej i niedrogiej metody klinicznej, zastosowany do mięśni przedziału przedniego. Model ten ma tę zaletę, że wykorzystuje zmodyfikowane, powszechnie dostępne urządzenie kliniczne w celu wywołania ukierunkowanych i specyficznych skurczów mięśni u myszy.

Mysi model treningu mięśniowego za pomocą neuromuskularnej stymulacji elektrycznej

Poznaj metodę oceny funkcji gruczołów ślinowych myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną. Technika obejmuje tracheotomię, zbieranie śliny i preparowanie gruczołów, co pozwala badać suchość w jamie ustnej i nadprodukcję śliny.

Ocena funkcjonalna śliny myszy za pomocą stymulacji pilokarpiną po frakcjonowanym promieniowaniu

Przeglądaj więcej filmów