Zligowany model pętli jelitowej u znieczulonych kurczaków wolnych od specyficznych patogenów w celu zbadania zjadliwości Clostridium perfringens
October 11th, 2018
Tutaj prezentujemy protokół chirurgicznego tworzenia 'podwiązanych pętli jelitowych' w jelicie cienkim kurczaka. Procedura ta pozwala na porównanie zjadliwości wielu szczepów Clostridium perfringens in situ w jednym żywicielu. Metoda ta znacznie zmniejsza liczbę kurcząt zwykle niezbędnych do podobnych eksperymentów in vivo.
Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad martwiczym zapaleniem jelit u kurczaków. Na przykład porównanie zjadliwości określonych szczepów Clostridium perfringens wywołujących tę chorobę. Główną zaletą tej techniki jest to, że znacznie zmniejsza liczbę kurczaków, które są zwykle niezbędne do podobnych eksperymentów obubójczych.
Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat potencjału wirulencji szczepów Clostridium perfringens, można ją również zastosować do innych patogenów jelitowych, takich jak Clostridium difficile lub Salmonella enterica. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ zabiegi chirurgiczne wymagają specjalnego szkolenia i powinny być wykonywane tylko przez tych, którzy nabyli umiejętności, takie jak szycie, techniki przed eksperymentem. Po znieczuleniu 10-tygodniowego kurczaka leghorn wolnego od specyficznych patogenów, ustaw monitory do ważnych pomiarów i zacznij ręcznie usuwać pióra z brzucha za pomocą delikatnego pociągnięcia.
Następnie wyszoruj miejsce operowane za pomocą glukonianu chlorheksydyny za pomocą miękkiej szczotki z włosia. Delikatnie szoruj skórę od środka do obrzeży przez pięć minut, nie zmieniając kursu. Następnie wykonaj trzy naprzemienne przejścia w miejscu operacyjnym z roztworem glukonianu chlorheksydyny i alkoholu izopropylowego przy użyciu sterylnych gaz.
Ponownie przejdź od środka do peryferii, a następnie udrapuj kurczaka. Zacznij od otwarcia zasłony nad polem operacyjnym, a następnie wykonaj nacięcie skóry w kształcie litery L za pomocą skalpela numer trzy, zaczynając od jednego centymetra przytulania do mostka, a kończąc na jednym centymetrze czaszki do kloichy. Następnie kontynuuj nacięcie w kształcie litery L prostopadle do pierwszego, wykonując drugie nacięcie, zaczynając od końca pierwszego nacięcia i kontynuuj pięć centymetrów w lewo od brzucha, podążając za linią miednicy.
Ten otwór pozwoli na łatwe pobranie jelit. Następnie otwórz otrzewną i mięśnie brzucha, używając tego samego wzoru w kształcie litery L, aby uzyskać dostęp do jamy brzusznej. Worki powietrzne będą teraz odsłonięte i muszą być wilgotne za pomocą gazy nasączonej solą fizjologiczną.
Następnie włóż haczyk do kastracji Snook do jamy brzusznej, podążając za lewą ścianą brzucha i przesuwając haczyk wokół worków powietrznych brzucha, aby usunąć jelita. Następnie, używając suchej gazy, kontynuuj delikatne zewnętrznianie jelit, aby odsłonić jelita moczowe. Rozłóż jelita i utrzymuj je wilgotne poprzez częste spryskiwanie solą fizjologiczną i przykrywanie gazą nasączoną solą fizjologiczną.
Ważne jest, aby zachować bardzo delikatność podczas wyjmowania jelit, ponieważ nadmierne napięcie może spowodować pęknięcie naczyń krezkowych, co może prowadzić do zmian niedokrwiennych jelit i znacznie pogorszyć wynik zabiegu. Po zewnętrzeniu jelit wykonaj serię pętli w jelitach, zaczynając w Jejunum. Każda pętla może być używana do innego leczenia.
W bliższym odcinku drogi drogowej umieść prostą ligaturę z syntetycznym materiałem wchłanialnym Polyglutamine Multifilament, unikając podwiązania głównych naczyń krezkowych. Następnie umieść dystalną ligaturę w odległości dwóch centymetrów od bliższej ligatury, aby zakończyć pierwszą pętlę. Wszystkie ligatury proksymalne i dystalne powinny być oddalone od siebie o około dwa centymetry.
Każda para ligatur tworzy pętlę, która jest hermetycznym segmentem. Następnie utwórz interloop lub odcinek jelita między pętlami. Umieść prostą ligaturę pół centymetra w odległości pół centymetra od dystalnej ligatury pierwszej pętli.
Ligatura ta znajduje się w środku pętli międzypętlowej i zmniejszy możliwe zanieczyszczenie krzyżowe między pętlami. Teraz kontynuuj wzór tworzenia kolejnej pętli pół centymetra w odległości pół centymetra od ligatury międzypętlowej. Tutaj tworzy się dziewięć pętli i osiem pętli obejmujących 26 centymetrów jelita.
Liczbę pętli można dostosować w razie potrzeby. Następnie należy przystąpić do wstrzykiwania szczepu Clostridium perfringens do pętli. Do przeciwkrezkowej strony pętli użyj igły o rozmiarze 26 pod kątem 45 stopni, aby wstrzyknąć 0,2 mililitra roztworu BHI, zawierającego milion jednostek tworzących kolonie bakterii w środkowej fazie wzrostu.
W tej sytuacji, z dziewięcioma pętlami, pięć różnych szczepów jest wstrzykiwanych w naprzemiennych pętlach, przy czym pętle pośrednie są wstrzykiwane za pomocą samego nośnika jako kontroli negatywnej. Po wstrzyknięciu patogenów delikatnie przesuń przewód pokarmowy do grzbietowej części jamy brzusznej pod workami powietrznymi. Następnie zamknij jamę brzuszną.
Zszyj mięśnie otrzewnej i brzucha wzdłuż miednicy za pomocą prostego, ciągłego wzoru szwów przy użyciu syntetycznego materiału wchłanialnego Polyglutamine Multifilament. Kontynuuj, zszywając otrzewną i mięśnie brzucha od mostka do kloszu za pomocą prostych szwów ciągłych. Następnie zszyj skórę za pomocą syntetycznego materiału poliglutaminowego Multifilament i prostego ciągłego wzoru.
Najpierw zszyj wzdłuż miednicy, a następnie zszyj od mostka do kloszu. Po zamknięciu nacięć trzymaj kurczaka w znieczuleniu ogólnym z odpowiednim użyciem leków przeciwbólowych, aby zminimalizować ból zwierzęcia w czasie infekcji. Kontynuuj monitorowanie znieczulenia, aby zapewnić odpowiedni poziom znieczulenia.
Po upływie pożądanego czasu infekcji, takiego jak siedem godzin w obecnym eksperymencie, należy poddać ptaka eutanazji i pobrać tkanki jelitowe. Za pomocą skalpela numer trzy wytnij od pół do jednego centymetra odcinka pętli. Następnie przenieś wycinek do 10% Formaliny w celu ustabilizowania na noc i dalszej analizy histopatologicznej.
Następnie użyj tego samego ostrza skalpela na tej samej pętli, aby wyciąć pozostałą część pętli i przenieś tę tkankę do rurki z mikrofuzją w celu wyizolowania bakterii. Powtórz tę procedurę dla każdej pętli, używając za każdym razem nowego ostrza skalpela. Siedem godzin po wstrzyknięciu, pętla jelitowa wstrzyknięta sterylnym podłożem kontrolnym ma nienaruszoną granicę szczoteczki błony śluzowej bez martwicy.
Łagodne przekrwienie w warstwach jelitowych segmentów nie jest rzadkością. Siedem godzin po wstrzyknięciu patogenu, Clostridium perfringens, końcówki kosmków ulegają erozji z nekrotycznymi miejscami wnikania otaczającymi wierzchołki. A następnie materiał nekrotyczny otaczający kosmki, znajdują się skupiska dużych bakterii w kształcie pręcików.
Czasami martwica jest spowodowana złym wykonaniem zabiegu i może być błędnie interpretowana jako zmiany wywołane przez bakterie. Charakterystycznym objawem jest brak bakterii w sekcji histologicznej. Ponadto naczynia krwionośne w warstwie mięśniowej są silnie rozszerzone przez nagromadzenie wielu degenerujących się erytrocytów wskazujących na przekrwienie naczyń.
Było to spowodowane podwiązanymi naczyniami krwionośnymi krezki, które prawdopodobnie były podwiązane, aby nadmiernie obciążać jelita. Pętle niedokrwienne można łatwo zidentyfikować mikroskopowo podczas zabiegów chirurgicznych. Po ciężkim przekrwieniu naczyń krwionośnych kilka minut po podwiązaniu, surowicza będzie ciemnoniebieska zamiast normalnego różowego czerwonawego zabarwienia.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć wiele pętli jelitowych w modelu kurczaka, umieszczając ligatury na jelitach. Po opanowaniu zabiegi chirurgiczne, z wyłączeniem czasu infekcji, można je wykonać w czasie krótszym niż trzy godziny, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o utrzymywaniu kurczaka w głębokim znieczuleniu, aby kontrolować ból i monitorować parametry życiowe podczas wszystkich zabiegów, w tym części chirurgicznej i po czasie infekcji.
Postępując zgodnie z tą procedurą lub ich metodami, takimi jak izolacja bakterii i prosta identyfikacja, taka jak wykrywanie genów za pomocą PCR, można przeprowadzić w celu udzielenia odpowiedzi na pytania zewnętrzne, takie jak powrót do zdrowia i identyfikacja początkowego wstrzykniętego patogenu. Po tym rozwoju technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się patogenezą Clostridium perfringens do zbadania martwiczego zapalenia jelit u kurcząt. Nie zapominaj, że praca z żywymi zwierzętami może być bardzo zmienna.
Podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak ciągłe monitorowanie znieczulenia kurczaka.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten artykuł przedstawia protokół chirurgiczny do tworzenia 'zwężonych pętli jelitowych' w małych jelitach kurczaków, umożliwiając porównanie wirulencji szczepów Clostridium perfringens in situ. Ta metoda znacznie zmniejsza liczbę kurczaków potrzebnych do eksperymentów in vivo.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikrobiologia
- Nauki weterynaryjne
- Wirulencja patogenów
Tło
- Nekrotyzujące zapalenie jelit to istotna choroba drobiu wywoływana przez Clostridium perfringens.
- Zrozumienie czynników wirulencji jest kluczowe dla zarządzania chorobą.
- Tradycyjne metody często wymagają dużej liczby zwierząt do testów.
- Nowa metoda ma na celu rozwiązanie kwestii etycznych dotyczących użycia zwierząt.
Cel badania
- Porównać wirulencję różnych szczepów Clostridium perfringens.
- Zmniejszyć liczbę kurczaków potrzebnych do takich eksperymentów.
- Dostarczyć wglądu mającego zastosowanie do innych patogenów jelitowych.
Stosowane metody
- Chirurgiczne tworzenie zwężonych pętli jelitowych u kurczaków.
- Monitorowanie znaków życiowych podczas zabiegu.
- Zastosowanie metody do oceny wirulencji in situ.
- Wymagana szkolenia w zakresie technik chirurgicznych, takich jak szycie szwów.
Główne wyniki
- Metoda pozwala na efektywne porównanie wirulencji u pojedynczego gospodarza.
- Może być zaadaptowana do badań innych patogenów, takich jak Clostridium difficile i Salmonella enterica.
- Znaczące zmniejszenie liczby zwierząt używanych w badaniach.
- Potencjał poprawy zrozumienia zachowania patogenów in vivo.
Wnioski
- Protokół chirurgiczny jest cennym narzędziem do badań nad nekrotyzującym zapaleniem jelit.
- Rozwiązuje kwestie etyczne, minimalizując użycie zwierząt.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć jego zastosowanie na inne choroby jelitowe.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
The ligated intestinal loop model in anesthetized chickens enables direct, quantitative comparison of Clostridium perfringens strain virulence with reduced animal use. This approach addresses ethical imperatives while supporting robust, statistically significant outputs for pathogen characterization. The model enhances predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for enteric disease research portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of pathogen virulence mechanisms in a controlled in vivo system.
- Supports functional target validation by isolating strain-specific effects on intestinal tissue.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing procedural artifacts from true pathogenic lesions.
- Reduces animal numbers required for statistically powered comparisons, aligning with ethical mandates.
Screening & Assay Development
- Prepares standardized, reproducible biological systems for downstream pathogen or therapeutic screening.
- Enables quantitative measurement of dependent variables such as histopathological damage and bacterial recovery.
- Supports assay scalability by allowing multiple strains or controls within a single host.
- Improves screening reliability by minimizing confounding predisposing factors.
Translational & Preclinical Research
- Provides a disease-relevant model for translational studies of enteric pathogen-host interactions.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct tissue and pathogen sampling.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by clarifying strain-specific pathogenicity profiles.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates at the interface of early discovery and preclinical validation, supporting both mechanistic studies and comparative virulence screening.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing on strain virulence and host response in a controlled setting.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for cross-strain and control comparisons.
- Analytics: Enables statistical analysis of histopathology and bacterial recovery across multiple conditions.
- Translational Research: Aligns with disease-relevant endpoints for enteric pathogen research.
- Enterprise Reuse: Adaptable for other intestinal pathogens, supporting broader R&D utility.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in pathogen studies.
- Operational Value: Standardizes procedures, enhances reproducibility, and minimizes animal use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by clarifying virulence profiles early.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of strains or interventions for further development.
Implementation Considerations
- Requires specialized surgical expertise and training in avian procedures.
- Demands access to anesthesia, monitoring, and histopathological analysis infrastructure.
- Necessitates rigorous cross-team standardization to ensure reproducibility and valid comparisons.
- Adaptable to other intestinal pathogens with appropriate protocol modifications.
- Procedural artifacts such as ischemic lesions must be distinguished from true pathogen-induced effects.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:56
Preparations
1:42
Extraction of the Small Intestines from the Abdominal Cavity
3:11
Fabricating Intestinal Loops and Injecting them with Pathogens
4:58
Completing the Procedure and Collecting Results
6:44
Results: Identifying Tissue Damage Caused by Pathogens or by Vascular Congestion
8:02
Conclusion
