Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa
19 czerwca 2018
Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru przecieku naczyniowego wywołanego śródskórnym podawaniem środków zwiększających przepuszczalność do skóry myszy. Technika ta może być wykorzystana do określenia zdolności cząsteczek do promowania lub hamowania przecieku naczyniowego lub do badania mechanizmów molekularnych regulujących przepuszczalność naczyń.
Ogólnym celem tej procedury jest pomiar nieszczelności naczyniowej w skórze właściwej myszy, która jest indukowana przez śródskórne wstrzyknięcie środków zwiększających przepuszczalność. Procedura ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji przepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo, takie jak to, które cząsteczki mogą stymulować lub hamować przeciek naczyniowy i jakie są zaangażowane szlaki sygnałowe. Główną zaletą tej procedury jest to, że jest szybka i stosunkowo prosta oraz wykorzystuje głównie popularne odczynniki i materiały laboratoryjne.
Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób z patologicznym obrzękiem. W szczególności naukowcy mogą wykorzystać ten test do identyfikacji nowych celów molekularnych i przetestowania odpowiednich leków pod kątem ich zdolności do hamowania przepuszczalności naczyń krwionośnych w stosunkowo szybki i prosty sposób. Przygotuj oddzielne roztwory inhibitora histaminy maleinianu pirylaminy i niebieskiego barwnika Evansa, oba w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.
Następnie pracując w komorze z przepływem laminarnym, wysterylizuj roztwory, przechodząc przez filtr 0,22 mikrometra. Załadować oba roztwory do oddzielnych strzykawek o pojemności jednego mililitra wyposażonych w igły o rozmiarze 30. Następnie zachlap myszą.
Następnie przechyl mysz tak, aby głowa była skierowana w stronę ziemi, a brzuch do góry. Po ustawieniu myszy należy podać 10 mikrolitrów na gram masy ciała roztworu maleinianu pirylaminy we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Następnie, aby pobudzić rozszerzenie naczyń krwionośnych, umieść mysz w komorze grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut.
Następnie przesuń mysz do ogranicznika myszy. Następnie natrzyj ogon 70% etanolem w celu dalszego rozszerzenia naczyń krwionośnych. Podawać dożylnie 100 mikrolitrów roztworu Evans Blue Dye przez żyłę ogonową.
Aby zapobiec krwawieniu, należy szybko przytrzymać ogonek między palcem a kciukiem i uciskać miejsce wstrzyknięcia. Dożylne wstrzyknięcie niebieskiego barwnika Evansa do żyły ogonowej myszy jest trudnym i krytycznym krokiem w tej procedurze. W związku z tym ważne jest, aby badacze byli kompetentni w wykonywaniu tego zastrzyku przed przystąpieniem do dalszej części procedury.
Ustalenie kompetencji będzie wymagało wcześniejszej praktyki. Użyć sterylnych roztworów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do rozcieńczenia odczynnika VEGF tak, aby końcowa objętość dawki wynosiła 20 mikrolitrów. Następnie załaduj odczynnik indukujący przepuszczalność VEGF i kontrolę pojazdu do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 300 mikrolitrów wyposażonych w igły o rozmiarze 31.
Trzymaj igłę pod kątem 15 stopni ze skórą i wstrzyknij śródskórnie 20 mikrolitrów VEGF w bok myszy. Zlokalizuj wypukły pęcherzyk w skórze, aby potwierdzić powodzenie wstrzyknięcia. Wykonać wstrzyknięcia śródskórne w dwóch dodatkowych miejscach oddalonych od siebie o co najmniej jeden centymetr.
Następnie obrócić mysz, aby odsłonić drugą flankę i powtórzyć trzykrotne wstrzyknięcia roztworu podłoża. Należy prowadzić zapis dla każdego z miejsc wstrzyknięcia na papierze oraz czasu zakończenia procedury wstrzykiwania. Następnie przenieś mysz do klatki domowej.
Kontynuuj monitorowanie myszy, aż odzyska przytomność i zacznie poruszać się po klatce. Pozwól roztworowi VEGF działać przez 20 minut przed wywołaniem myszy. Na tym etapie należy kolejno wstrzyknąć VEGFA i nośnik wszystkim myszom, postępując zgodnie z tą samą procedurą.
Po 20 minutach połóż każdą uśpioną mysz na plecach i przypnij jej stopy do tablicy korkowej owiniętej czystą chusteczką. Następnie za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie o długości od trzech do czterech centymetrów od dolnej części brzucha do klatki piersiowej martwej myszy. Następnie użyj kleszczy i skalpela, aby drażnić skórę z obu stron boku.
Użyj skalpela, aby usunąć tłuszcz, jeśli jest obecny w obszarach wokół miejsca wycieku. Następnie użyj kleszczy i skalpela, aby wyciąć obszary skóry za pomocą wyciekającego barwnika Evans Blue Dye. Wycięte obszary skóry muszą być podobnej wielkości.
Przenieś próbki skóry do 1,5 mililitrowych probówek i odpowiednio oznacz. Wysuszyć próbkę, umieszczając otwartą probówkę w bloku grzewczym na noc. Po zakończeniu suszenia dodać 250 mikrolitrów dejonizowanego formamidu do próbki w dygestorium.
Zamknij pokrywę probówki i umieść ją na noc w bloku grzewczym, aby wyekstrahować barwnik Evansa. Odwirować próbki o masie 10 000 g lub większej przez 40 minut w wirówce stołowej. Po odwirowaniu przenieść 100 mikrolitrów każdego supernatantu zawierającego barwnik z odwirowanej próbki do studzienek 96-dołkowej płytki działającej w dygestorium.
Odczytaj absorbancję błękitu Evansa za pomocą spektrofotometru. Aby zbadać przeciek naczyniowy wywołany przez VEGF, myszowi wstrzykuje się 50 nanogramów VEGFA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub tylko soli fizjologicznej buforowanej fosforanem jako nośniku. Obraz pokazuje wzrost akumulacji wyciekającego barwnika Evans Blue Dye w próbkach skóry, którym wstrzyknięto VEGFA, w porównaniu z kontrolą nośnika in situ.
Ten obraz z 96-dołkową płytką pokazuje załadowany niebieski barwnik Evansa wyekstrahowany w formamidzie z próbki skóry. Ten wykres graficzny przedstawia znormalizowane wartości absorbancji sparowanych próbek kontrolnych VEGFA i samych nośników. Wykres pokazuje, że wstrzyknięcie 50 nanogramów VEGFA znacznie zwiększa wyciek barwnika Evansa w porównaniu z samym pojazdem.
Wykres ten uzyskuje się po ilościowym określeniu zmian krotności gęstości optycznej dla VEGFA w porównaniu z próbkami nośników. Wykres przedstawia średnio trzykrotny wzrost przecieku naczyniowego po podaniu VEGFA w porównaniu z samym podłożem. Po opanowaniu główny segment tej techniki można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby znormalizować przeciek naczyniowy wywołany przez czynnik do przecieku naczyniowego wywołanego przez nośnik, aby uwzględnić niespecyficzny przeciek naczyniowy i różnice między myszami. Procedura ta może być łączona z innymi metodami, takimi jak podawanie leków, w celu uzyskania odpowiedzi na pytania, takie jak to, czy białko może być ukierunkowane na hamowanie przepuszczalności naczyń. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią naczyniową do zbadania molekularnych mechanizmów nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych u genetycznie zmodyfikowanych myszy, identyfikując kluczowe składniki sygnalizacyjne, które są wymagane do przecieku naczyniowego.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować i mierzyć nieszczelność naczyniową w skórze właściwej myszy.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół pomiaru przecieku naczyniowego w skórze myszy indukowanego przez czynniki zwiększające przepuszczalność. Technika ta pomaga w zrozumieniu regulacji przepuszczalności naczyniowej oraz efektów działania różnych cząsteczek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia naczyniowa
- Farmakologia
- Medycyna eksperymentalna
Wprowadzenie
- Przepuszczalność naczyniowa odgrywa kluczową rolę w różnych procesach fizjologicznych i patologicznych.
- Zrozumienie mechanizmów przeciekania naczyniowego może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych w chorobach przebiegających z obrzękami.
- W tej procedurze wykorzystuje się powszechnie stosowane odczynniki laboratoryjne.
- Szybka i prosta realizacja sprawia, że metoda ta jest dostępna dla badaczy.
Cel badania
- Pomiar wpływu czynników zwiększających przepuszczalność na przesiąkanie naczyniowe.
- Identyfikacja celów molekularnych w celu hamowania przepuszczalności naczyniowej.
- Badanie szlaków sygnalizacyjnych zaangażowanych w regulację naczyniową.
Zastosowane metody
- Iniekcje śródskórne i dożylne substancji u myszy.
- Zastosowanie barwnika Evans Blue w celu ilościowego oznaczenia przecieku naczyniowego.
- Monitorowanie i zapisywanie miejsc wstrzyknięcia oraz uzyskanych wyników.
- Wirowanie i analiza spektrofotometryczna próbek.
Główne wyniki
- VEGF znacząco zwiększa przeciekanie naczyniowe w porównaniu z kontrolą pojazdu.
- Analiza ilościowa wykazuje trzykrotny wzrost przeciekania po podaniu VEGFA.
- Procedurę można przeprowadzić w ciągu około dwóch godzin.
- Normalizacja danych dotyczących przeciekania jest niezbędna dla uzyskania dokładnych wyników.
Wnioski
- Technika ta dostarcza wiedzy na temat biologii naczyniowej oraz regulacji przepuszczalności naczyń.
- Można ją łączyć z innymi metodami w celu rozszerzenia badań nad przepuszczalnością naczyniową.
- W przyszłych badaniach można wykorzystać ten protokół do testowania nowych czynników terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Test Milesa umożliwia zespołom biofarmaceutycznym ilościowe określenie nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo, co wspiera walidację celów w patologiach związanych z obrzękami. Dzięki pomiarowi wycieku barwnika jako odczytu funkcjonalnego, metoda ta dostarcza wglądu w mechanizmy szlaków regulujących przepuszczalność. Przyspiesza to proces ograniczania ryzyka w przypadku celów naczyniowych oraz wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) w programach przedklinicznych skoncentrowanych na stabilności naczyń.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wstępne odkrycia i walidacja celu
- Wartość naukowa: Pozwala na weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez identyfikację cząsteczek stymulujących lub hamujących przeciekanie naczyniowe w systemie istotnym dla danej jednostki chorobowej.
- Wartość operacyjna: Wykorzystuje powszechnie stosowane odczynniki laboratoryjne oraz zestandaryzowane procedury, co umożliwia odtwarzalną ocenę stopnia angażowania celu.
- Wartość prognostyczna: Ilościowo określa krotność zmiany przeciekania (np. trzykrotny wzrost przy VEGFA), co wspiera redukcję ryzyka mechanistycznego i wyjaśnianie szlaków sygnalizacyjnych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych badań przesiewowych poprzez ustalenie bazowych odpowiedzi w zakresie przepuszczalności naczyń.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie standaryzacji analizy poprzez normalizację względem kontroli nośnika, co redukuje zmienność międzyosobniczą zwierząt.
- Skalowalność: Wsparcie ponownego wykorzystania platformy dla wielu czynników i modeli genetycznych w celu porównawczego profilowania przepuszczalności.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Zachowuje istotność w kontekście choroby poprzez modelowanie nadmiernej przepuszczalności naczyń w skórze właściwej myszy, która jest kluczowym miejscem powstawania obrzęków.
- Wartość operacyjna: Ułatwia ciągłość translacyjną od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną dzięki ilościowym odczytom przecieku.
- Mitygacja ryzyka: Pomaga w podejmowaniu decyzji o rozwoju projektu w oparciu o analizę ryzyka poprzez identyfikację czynników zdolnych do indukowania lub blokowania nadmiernej przepuszczalności.
Integracja potoków i przepływów pracy
Analiza ta wpisuje się w proces badawczy od identyfikacji celu po ocenę przedkliniczną, dostarczając funkcjonalnych danych dotyczących przepuszczalności naczyniowej, które służą do optymalizacji wiodących związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących czynników zwiększających lub hamujących przepuszczalność poprzez bezpośredni pomiar wycieku barwnika.
- Przesiewanie: Dostarcza ilościowe, powtarzalne wyniki za pomocą analizy spektrofotometrycznej ekstrahowanego barwnika błękitu Ewansa, umożliwiając porównanie związków.
- Analityka: Generuje znormalizowane wskaźniki wycieku (np. krotność zmiany względem nośnika), które pomagają zespołom porównywać warunki i oceniać modulację celu.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez modelowanie procesu patofizjologicznego istotnego dla chorób wywołujących obrzęki.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Służy jako powtarzalna metoda w projektach badających regulatory naczyniowe, ograniczając redundancję w opracowywaniu modeli.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez powiązanie czynników molekularnych z funkcjonalnymi efektami naczyniowymi.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki kontrolowanym protokołom wstrzykiwania oraz normalizacji danych.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go poprzez redukcję niejednoznaczności mechanistycznej w szlakach przepuszczalności naczyniowej.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów naczyniowych z uwzględnieniem ryzyka na podstawie danych o funkcjonalnym przecieku.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z myszami oraz w technikach wstrzykiwań dożylnych i śródskórnych.
- Zależne od dostępu do spektrofotometru, wirówek i sprzętu do filtracji sterylnej.
- Konieczna jest standaryzacja miejsc wstrzykiwań, czasu oraz protokołów ekstrakcji barwnika pomiędzy zespołami.
- Kwestie adaptacyjne obejmują zmienność modeli genetycznych oraz rozpuszczalność substancji w nośnikach.
- Ograniczenia praktyczne obejmują trudności techniczne związane z wstrzykiwaniem do żyły ogonowej oraz zmienność ekstrakcji barwnika, zgodnie z materiałem źródłowym.
Często zadawane pytania dotyczące biofarmacji
Chapters in this video
0:04
Title
1:01
Intravenous Injection of Evans Blue Dye
2:48
Stimulation of Vascular Hyperpermeability
4:27
Quantification of the Accumulated Evans Blue within the Dermis
6:22
Results: Use of the Miles Assay to Detect Vascular Leakage Triggered by Intradermal Injection of VEGF into C57/BI6 Mice
7:39
Conclusion
