Name: Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Poznaj test Milesa do oceny nadprzepuszczalności naczyń krwionośnych w skórze myszy przy użyciu barwnika Evans Blue. Ta metoda pozwala badać regulację przepuszczalności naczyń i testować inhibitory w modelu in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Laurze Denti, Valentinie Senatore i personelowi Jednostki Zasobów Biologicznych w Instytucie Okulistyki UCL za pomoc w hodowli myszy oraz Camille Charoy za wsparcie techniczne. Praca ta została wsparta grantem Rady ds. Badań Medycznych (MR/N011511/1) dla C. Ruhrberga oraz stypendium doktoranckim British Heart Foundation dla J.T. Brasha (FS/13/59/30649).

Wszystkie prace na zwierzętach zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi brytyjskiego Ministerstwa Spraw Wewnętrznych oraz instytucjonalnego Organu ds. Dobrostanu Zwierząt i Oceny Etyki (AWERB).
1. Przygotowanie myszy
UWAGA: Przeprowadzaj eksperymenty na dorosłych myszach w wieku co najmniej 8 tygodni, do 6 miesięcy. W celu wykazania technicznej odtwarzalności i spójnego czasu dla każdego etapu tej procedury u różnych zwierząt, należy użyć co najmniej 2 i maksymalnie 6 myszy do każdej sesji doświadczalnej. Aby ocenić wpływ mutacji na substancję wywołującą przepuszczalność u genetycznie zmodyfikowanych myszy, najlepiej użyć 2 zmutowanych myszy i 2 kontrolnych miotu na eksperyment.
<ol>
	<li>Na 24 godziny przed stymulacją nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych znieczulić myszy odpowiednim środkiem znieczulającym wziewnym, takim jak izofluran. Stosować 3% izofrunu do indukcji znieczulenia, aż do utraty odruchu prostowania i przestania reagować na bodźce zewnętrzne. Użyj 1,5% izofluranu do utrzymania znieczulenia (upewnij się, że mysz ma stałą częstość oddechów). W znieczuleniu ostrożnie ogol obie boki każdej myszy golarką elektryczną, unikając obrażeń skóry. 
	UWAGA: Znieczulenie stosuje się, aby uniknąć powodowania stresu u zwierzęcia i zminimalizowania ruchu podczas golenia, co może skutkować uszkodzeniem skóry.</li>
	<li>Umieść ogoloną mysz z powrotem w klatce domowej. W przypadku samców myszy umieść każdego samca w osobnej klatce po odzyskaniu znieczulenia, aby zapobiec walce, a tym samym uszkodzeniu skóry. W przypadku samic myszy należy je umieścić w grupie w klatce domowej. 
	UWAGA: Jeśli wśród samców myszy w klatce zaobserwuje się zachowanie bojowe, przed zabiegiem należy je podzielić na indywidualne klatki na 3 dni przed eksperymentem, aby umożliwić zagojenie się potencjalnych uszkodzeń skóry.</li>
	<li>Monitoruj myszy, aż odzyskają przytomność (zwykle w ciągu kilku sekund) i poruszaj się po klatce (zwykle w ciągu 1 minuty).</li>
</ol>
2. Dożylne wstrzyknięcie niebieskiego barwnika Evansa
<ol>
	<li>W komorze z przepływem laminarnym przygotuj oddzielne sterylne roztwory inhibitora histaminy maleinianu pirylaminy (4 μg/μl w 0,9% soli fizjologicznej) i niebieskiego barwnika Evansa (1% w/v w 0,9% soli fizjologicznej). Sterylizować, przepuszczając roztwory przez filtr 22 μm.</li>
	<li>Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30 G, aby wstrzyknąć dootrzewnowo każdej myszy 10 μl roztworu maleinianu pirylaminy/gram masy ciała (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1A). Aby wykonać wstrzyknięcie, należy najpierw pochylić mysz, a następnie przechylić ją tak, aby głowa była skierowana w stronę ziemi, a brzuch skierowany do góry. Wstrzyknąć w dolne ćwiartki brzucha z dala od linii środkowej, aby uniknąć uderzenia w pęcherz. 
	UWAGA: Waga myszy w wieku od 8 tygodni do 6 miesięcy zwykle waha się od 15 do 30 g. Maleinian pirylaminy hamuje uwalnianie endogennej histaminy, która w przeciwnym razie sprzyjałaby przeciekaniu naczyń krwionośnych niezależnie od badanego środka.</li>
	<li>Umieść mysz w komorze grzewczej o temperaturze 37 °C na 10 minut, aby pobudzić rozszerzenie naczyń krwionośnych. Alternatywnie, użyj odpowiedniej lampy grzewczej skoncentrowanej na ogonie, aby promować rozszerzenie naczyń krwionośnych, jeśli użycie lampy grzewczej jest dozwolone przez lokalne wytyczne etyczne.</li>
	<li>Przesuwaj jedną mysz na raz do unieruchomienia myszy i przetrzyj ogon 70% etanolem, aby oczyścić obszar wstrzyknięcia i dodatkowo przyspieszyć rozszerzenie naczyń krwionośnych.</li>
	<li>Użyj sterylnej strzykawki o pojemności 1 ml z igłą 30G, aby podać dożylnie 100 μl niebieskiego barwnika Evansa przez żyłę ogonową (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1B). Natychmiast należy przyłożyć ucisk do miejsca wstrzyknięcia, trzymając ogonek między palcem a kciukiem, aby zapobiec krwawieniu. 
	UWAGA: Wizualizację żyły ogonowej można poprawić, kierując światło lampy na obszar iniekcji. Więcej szczegółów na temat wykonywania iniekcji dożylnych do żyły ogonowej myszy można znaleźć w opublikowanym protokole18.</li>
	<li>Pozwól barwnikowi krążyć przez 30 minut.</li>
</ol>
3. Stymulowanie nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych
<ol>
	<li>Stosując sterylne roztwory w komorze z przepływem laminarnym, rozcieńczyć czynnik indukujący przepuszczalność do stężenia umożliwiającego dostarczenie dawki końcowej w objętości 20 μl. 
	UWAGA: W przykładowym eksperymencie pokazanym na Rysunek 1-<silna klasa="xfig">Rysunek 2, VEGFA jest stosowany do stymulowania nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych w stężeniu 2,5 ng/μL w PBS, dając całkowitą dawkę 50 ng, a PBS jest używany jako kontrola nośnika.</li>
	<li>Załadować interesujący nas czynnik indukujący przepuszczalność i kontrolę nośnika do 2 oddzielnych sterylnych strzykawek o pojemności 300 μl z igłą 31 G. Umieścić roztwór w ilości wystarczającej do wstrzyknięcia każdej myszy z 20 μl roztworu w trzech egzemplarzach (tj. przygotować 60 μl środka i nośnika na mysz plus dodatkową objętość w celu uwzględnienia martwej objętości igły).</li>
	<li>Pierwszą badaną mysz należy znieczulić izofluranem (3% w przypadku indukcji znieczulenia do momentu utraty odruchu prostego i przestania reakcji myszy na bodźce zewnętrzne oraz 1,5% w celu utrzymania znieczulenia, upewniając się, że mysz ma stałą częstość oddechów).</li>
	<li>Śródskórnie wstrzyknąć 20 μl środka zwiększającego przepuszczalność w bok myszy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C). Upewnij się, że igła jest ustawiona pod kątem 15° do skóry. Sprawdzić, czy w skórze nie tworzy się wypukły pęcherzyk, który wskazuje na udane wstrzyknięcie. Powtórzyć wstrzyknięcie śródskórne w 2 dodatkowych miejscach w odległości co najmniej 1 cm od siebie.</li>
	<li>Obrócić mysz, aby odsłonić 2. bok i powtórzyć trzykrotne wstrzyknięcia roztworu pojazdu kontrolnego. Zapisać na papierze położenie każdego miejsca wstrzyknięcia, aby ułatwić jego identyfikację w celu późniejszego pobrania próbek skóry. 
	UWAGA: Na tym etapie należy obchodzić się ze skórką myszy ostrożnie; Na przykład należy unikać szczypania skóry podczas wykonywania wstrzyknięć śródskórnych.</li>
	<li>Umieść mysz z wstrzykniętą wstrzyknięciem w klatce domowej i monitoruj ją, aż odzyska przytomność (zwykle w ciągu kilku sekund) i zacznie poruszać się po klatce.</li>
	<li>Podczas gdy pierwsza mysz wraca do zdrowia, natychmiast powtórz kroki 3.3 i 3.5 z drugą myszą i tak dalej (maksymalnie do 6 myszy na sesję). Zapisuj czas, w którym każda mysz została wstrzyknięta, aby dostosować czas, w którym należy przejść do następnego kroku.</li>
</ol>
4. Kwantyfikacja nagromadzonego błękitu Evansa w skórze właściwej
<ol>
	<li>Każdą mysz należy usunąć przez zwichnięcie szyjki macicy 20 minut po otrzymaniu wstrzyknięć śródskórnych, przestrzegając tej samej kolejności, w jakiej wstrzyknięto myszy. 
	UWAGA: Czas trwania przecieku naczyniowego może się różnić w zależności od zastosowanego środka indukującego przepuszczalność, a zatem czas między wstrzyknięciem śródskórnym a ubojem może wymagać optymalizacji.</li>
	<li>Połóż każdą zabitą mysz na grzbiecie i przypnij jej stopy do tablicy korkowej owiniętej czystą chusteczką (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D).</li>
	<li>Za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie o długości około 3 - 4 cm od dolnej części brzucha do klatki piersiowej martwej myszy. Za pomocą kleszczy i skalpela oderwij skórę z obu boków, aby odsłonić wewnętrzną stronę skóry właściwej i miejsca nagromadzenia niebieskiego Evansa (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1E). Przygnij luźną skórę i usuń tłuszcz z obszarów wokół miejsca wycieku za pomocą skalpela. W razie potrzeby zrób reprezentatywne zdjęcie, aby zademonstrować wielkość przeciekania niebieskiego Evansa do skóry.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy i skalpela wyciąć obszary skóry zawierające wyciekający niebieski barwnik Evansa dla każdego miejsca, w którym wstrzyknięto środek lub nośnik indukujący przepuszczalność. 
	UWAGA: Należy zwrócić uwagę na wycięcie obszarów skóry o podobnej wielkości, aby upewnić się, że w kolejnym Kroku 4.7 podobna część objętości formamidu zostanie zaadsorbowana przez każdą próbkę skóry, co pozwoli na rozcieńczenie wyekstrahowanego barwnika w podobnej objętości pozostałego formamidu. Mapa iniekcji zapisana w kroku 3.5 pomoże określić obszar do wycięcia.</li>
	<li>Umieść każdą próbkę w probówce o pojemności 1,5 ml i odpowiednio ją oznacz, upewniając się, że każda próbka spoczywa na dnie probówki. Próbki należy przechowywać w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Jeśli przetwarzasz natychmiast, wykonaj poniższe czynności.</li>
	<li>Wysuszyć próbki skóry przez noc, umieszczając otwarte probówki w piecu lub w studzience bloku grzewczego w temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Aby wyekstrahować niebieski barwnik Evansa, dodaj 250 μl dejonizowanego formamidu do próbek w dygestorium, zamknij probówki. Upewnij się, że wszystkie próbki skóry są pokryte formamidem i inkubować przez noc w piecu lub bloku grzewczym w temperaturze 55 °C.</li>
	<li>Odwirować próbki w wirówce stołowej z maksymalną prędkością (>10 000 x g) przez 40 minut.</li>
	<li>W dygestorium przenieść 100 μl supernatantu zawierającego barwnik z każdej próbki do oddzielnego dołka przezroczystej, 96-dołkowej płytki o płaskim dnie (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2A).</li>
	<li>Zmierzyć szczytową absorbancję niebieskiego Evansa przy 620 nm z odczytem referencyjnym 740 nm na spektrofotometrze. 
	UWAGA: 620 nm to szczyt absorbancji niebieskiego Evansa, podczas gdy 740 nm nie jest absorbowane przez błękit Evansa i działa jako referencyjna długość fali.</li>
	<li>Uśrednić odczyty absorbancji trzykrotnych wstrzyknięć tego samego czynnika lub nośnika dla każdej myszy, aby uwzględnić zmienność techniczną (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B).</li>
	<li>Oblicz różnicę zagięć odczytów środka indukującego przepuszczalność w porównaniu ze sterowaniem pojazdem (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C).</li>
</ol>

<ol><li>Nagy, J. A., Benjamin, L., Zeng, H. Y., Dvorak, A. M., Dvorak, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability%2C+vascular+hyperpermeability+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Angiogenesis%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability, vascular hyperpermeability and angiogenesis.</a> Angiogenesis. 11, 109-119 (2008).</li>
<li>Engelhardt, B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12955493">Development of the blood-brain barrier.</a> Cell and Tissue Research. 314, 119-129 (2003).</li>
<li>Ruhrberg, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growing+and+shaping+the+vascular+tree%3A+multiple+roles+for+VEGF%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Growing and shaping the vascular tree: multiple roles for VEGF.</a> Bioessays. 25, 1052-1060 (2003).</li>
<li>Risau, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+Endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Differentiation of Endothelium.</a> FASEB Journal. 9, 926-933 (1995).</li>
<li>Strbian, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+blood-brain+barrier+is+continuously+open+for+several+weeks+following+transient+focal+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The blood-brain barrier is continuously open for several weeks following transient focal cerebral ischemia.</a> Neuroscience. 153, 175-181 (2008).</li>
<li>Weis, S. M., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathophysiological+consequences+of+VEGF-induced+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pathophysiological consequences of VEGF-induced vascular permeability.</a> Nature. 437, 497-504 (2005).</li>
<li>Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+pathogenesis+of+retinal+and+choroidal+vascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Molecular pathogenesis of retinal and choroidal vascular diseases.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 49, 67-81 (2015).</li>
<li>Aman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+Treatment+of+Edema+and+Endothelial+Barrier+Dysfunction+with+Imatinib%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Effective Treatment of Edema and Endothelial Barrier Dysfunction with Imatinib.</a> Circulation. , 126(2012).</li>
<li>Claesson-Welsh, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+permeability-the+essentials%5BTitle%5D)+AND+%22Upsala+J+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Vascular permeability-the essentials.</a> Upsala J Med Sci. 120, 135-143 (2015).</li>
<li>Schulte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Embo+Journal%22%5BJournal%5D)">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> Embo Journal. 30, 4157-4170 (2011).</li>
<li>Heinolainen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR3+Modulates+Vascular+Permeability+by+Controlling+VEGF%2FVEGFR2+Signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">VEGFR3 Modulates Vascular Permeability by Controlling VEGF/VEGFR2 Signaling.</a> Circulation Research. 120, (2017).</li>
<li>Eliceiri, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+requirement+for+Src+kinases+during+VEGF-induced+angiogenesis+and+vascular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Selective requirement for Src kinases during VEGF-induced angiogenesis and vascular permeability.</a> Molecular Cell. 4, 915-924 (1999).</li>
<li>Sun, Z. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR2+induces+c-Src+signaling+and+vascular+permeability+in+vivo+via+the+adaptor+protein+TSAd%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">VEGFR2 induces c-Src signaling and vascular permeability in vivo via the adaptor protein TSAd.</a> Journal of Experimental Medicine. 209, 1363-1377 (2012).</li>
<li>Fantin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF165-induced+vascular+permeability+requires+NRP1+for+ABL-mediated+SRC+family+kinase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">VEGF165-induced vascular permeability requires NRP1 for ABL-mediated SRC family kinase activation.</a> Journal of Experimental Medicine. 214, 1049-1064 (2017).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGFR2+pY949+signalling+regulates+adherens+junction+integrity+and+metastatic+spread%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">VEGFR2 pY949 signalling regulates adherens junction integrity and metastatic spread.</a> Nat Commun. 7, (2016).</li>
<li>Senger, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+cells+secrete+a+vascular+permeability+factor+that+promotes+accumulation+of+ascites+fluid%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Tumor cells secrete a vascular permeability factor that promotes accumulation of ascites fluid.</a> Science. 219, 983-985 (1983).</li>
<li>Miles, A. A., Miles, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vascular+Reactions+to+Histamine%2C+Histamine-Liberator+and+Leukotaxine+in+the+Skin+of+Guinea-Pigs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol-London%22%5BJournal%5D)">Vascular Reactions to Histamine, Histamine-Liberator and Leukotaxine in the Skin of Guinea-Pigs.</a> J Physiol-London. 118, 228-257 (1952).</li>
<li>Radu, M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vivo+Assay+to+Test+Blood+Vessel+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability.</a> Jove-J Vis Exp. , e50062(2013).</li>
<li>Roth, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+mediates+vascular+permeability+independently+of+vascular+endothelial+growth+factor+receptor-2+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 mediates vascular permeability independently of vascular endothelial growth factor receptor-2 activation.</a> Sci Signal. 9, (2016).</li>
<li>Acevedo, L. M., Barillas, S., Weis, S. M., Gothert, J. R., Cheresh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+3A+suppresses+VEGF-mediated+angiogenesis+yet+acts+as+a+vascular+permeability+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 3A suppresses VEGF-mediated angiogenesis yet acts as a vascular permeability factor.</a> Blood. 111, 2674-2680 (2008).</li>
<li>Teesalu, T., Sugahara, K. N., Kotamraju, V. R., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-end+rule+peptides+mediate+neuropilin-1-dependent+cell%2C+vascular%2C+and+tissue+penetration%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">C-end rule peptides mediate neuropilin-1-dependent cell, vascular, and tissue penetration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106, 16157-16162 (2009).</li>
<li>Ho, V. C., Duan, L. J., Cronin, C., Liang, B. T., Fong, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-2+Abundance+Contributes+to+Increased+Angiogenesis+in+Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Receptor-1-Deficient+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Elevated Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Abundance Contributes to Increased Angiogenesis in Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1-Deficient Mice.</a> Circulation. 126, (2012).</li>
<li>Chislock, E. M., Pendergast, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abl+Family+Kinases+Regulate+Endothelial+Barrier+Function+In+Vitro+and+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Abl Family Kinases Regulate Endothelial Barrier Function In Vitro and in Mice.</a> PLoS ONE. 8, e85231(2013).</li>
<li>Busch, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+ketamine+on+hypoxic+pulmonary+vasoconstriction+in+the+isolated+perfused+lungs+of+endotoxaemic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Anaesth%22%5BJournal%5D)">Effects of ketamine on hypoxic pulmonary vasoconstriction in the isolated perfused lungs of endotoxaemic mice.</a> Eur J Anaesth. 27, 61-66 (2010).</li>
<li>Sinclair, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+the+physiological+effects+of+alpha2-agonists+related+to+the+clinical+use+of+medetomidine+in+small+animal+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Vet+J%22%5BJournal%5D)">A review of the physiological effects of alpha2-agonists related to the clinical use of medetomidine in small animal practice.</a> Can Vet J. 44, 885-897 (2003).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania sprzecznych interesów.

Od czasu pierwszego opisu w 1952roku17, test Milesa dostarczył naukowcom stosunkowo szybkiej, prostej i niezawodnej metody badania molekularnych mechanizmów nadmiernej przepuszczalności naczyń. Na przykład test Milesa został wykorzystany do zbadania zdolności i/lub siły działania różnych czynników do wywoływania nadprzepuszczalności19,20,21 lub do przetestowania skuteczności środków blokujących nadprzepuszczalność 8,22,23. Jako inny przykład, czynniki indukujące przepuszczalność naczyń krwionośnych zostały przetestowane na genetycznie zmodyfikowanych myszach i ich rodzeństwie z miotu w celu określenia wymagań określonych receptorów i białek transdukujących sygnał dla odpowiedzi nadmiernej przepuszczalności wywołanej ligandem 10,11,12,13,14,15,20,23. Od tego czasu zastosowano kilka zmodyfikowanych wersji testu Miles, na przykład w odniesieniu do zastosowanego znacznika. W ten sposób Evans Blue został zastąpiony w niektórych badaniach znakowanym fluorescencyjnie dektransem o różnych rozmiarach lub mikrosferach11,13.
Główną zaletą testu Milesa w porównaniu z innymi testami do badania mechanizmów nadmiernej przepuszczalności naczyń jest to, że jest stosunkowo łatwy do wykonania i nie wymaga drogiego sprzętu. Ponadto, jako technika in vivo, test ten modeluje przeciek naczyniowy w kontekście nienaruszonych naczyń krwionośnych, w przeciwieństwie do pomiaru przecieku za pomocą testów in vitro, takich jak testy strumienia trans studziennego lub testy oporności elektrycznej śródbłonka (TEER), które koncentrują się wyłącznie na monowarstwie śródbłonka. Alternatywne testy nadprzepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo mogą różnić się od opisanego tutaj testu Milesa poprzez wykorzystanie innej drogi dostarczania czynnika indukującego nadprzepuszczalność lub poprzez analizę przecieku naczyniowego w różnych miejscach, na przykład poprzez ogólnoustrojowe dostarczanie środka przez żyłę ogonową, a następnie badanie przecieku naczyniowego w płucach lub tchawicy11, Rozdział 13,15. Jednym z ograniczeń testu Milesa jest to, że śródskórne wstrzyknięcie niektórych środków może w zasadzie wpływać na ciśnienie i przepływ krwi oprócz zakłócenia bariery śródbłonkowej, a zatem wpływać na przepuszczalność naczyń krwionośnych również pośrednio. Niemniej jednak ostatnio wykazano, że test ten mierzy przepuszczalność naczyń indukowaną przez VEGF-A niezależnie od wpływu na ogólnoustrojowe ciśnienie krwi15. Innym ograniczeniem testu Milesa jest to, że łożyska naczyniowe w różnych tkankach mogą różnie reagować na czynniki zwiększające przepuszczalność, a wyniki uzyskane za pomocą testu Milesa w skórze mogą zatem nie być reprezentatywne, na przykład, dla tego, co dzieje się w płucach lub mózgu.
Wiek i waga zwierzęcia mogą mieć wpływ na wyciek zaobserwowany w teście Milesa. Aby zminimalizować wpływ tych zmiennych, naukowcy powinni używać rodzeństwa z miotu lub myszy o podobnej wielkości i w wieku jako kontrolnych. Oceniając mutanty myszy pod kątem określonego genu będącego przedmiotem zainteresowania, myszy powinny być generowane za pomocą heterozygotycznej kontra heterozygotycznej strategii hodowlanej, a rodzeństwo z dzikiego miotu powinno być używane jako kontrole. Ponadto zaleca się stosowanie szybko odwracalnych gazowych środków znieczulających, takich jak izofluran, aby uniknąć zwężenia naczyń krwionośnych, co zostało opisane w przypadku niektórych leków znieczulających podawanych w iniekcjach pozajelitowych24,25. Wstrzyknięcie niebieskiego barwnika Evansa do bocznej żyły ogonowej myszy jest krytycznym krokiem w tym protokole i może znacznie wpłynąć na jakość eksperymentu i danych. W związku z tym badacze muszą być kompetentni w wykonywaniu iniekcji do żył ogonowych i prawdopodobnie będą potrzebować wcześniejszego doświadczenia lub praktyki przed rozpoczęciem eksperymentu z testem Milesa. Alternatywnie, naukowcy mogą użyć innych dróg dożylnych w celu dostarczenia błękitu Evansa, takich jak wstrzyknięcie retroorbitalne, jeśli mają z tym doświadczenie. Śródskórne wstrzyknięcie roztworów zwiększających przepuszczalność może spowodować uszkodzenie skóry niezależnie od środka. Dlatego wstrzyknięcia śródskórne nie powinny przekraczać objętości 20 μl, powinny być zawsze wykonywane w obecności inhibitora histaminy i znormalizowane do wstrzyknięć kontrolnych nośnika.
Test Milesa był używany przez wielu badaczy do oceny składników szlaku sygnałowego VEGF-A, na przykład dlatego, że przepuszczalność naczyń wywołana przez VEGF-A powoduje wodobrzusze u pacjentów z rakiem16 i obrzęk upośledzający widzenie w kilku neowaskularnych chorobach oczu7. W ten sposób my i inni użyliśmy testu Milesa do porównania nieszczelności naczyniowej wywołanej przez VEGF-A u myszy, które zostały genetycznie zmodyfikowane tak, aby nie zawierały określonych składników kaskady sygnalizacyjnej VEGF-A 12,13,14,15,20,23. Nasze ostatnie badanie z wykorzystaniem tego podejścia ujawniło, że główna patologiczna izoforma VEGF-A, VEGF165, sygnalizuje przez kompleks VEGFR2 i NRP1, w którym domena cytoplazmatyczna NRP1 promuje aktywację kinaz rodziny SRC za pośrednictwem kinazy ABL w celu wywołania odpowiedzi nadmiernej przepuszczalności14. VEGFA wspomaga również wzrost naczyń krwionośnych i dlatego może być stosowany terapeutycznie w celu przywrócenia przepływu krwi do niedokrwionych tkanek, jeśli jego nadmierna przepuszczalność może być wyraźnie zahamowana. Badania wyjaśniające mechanizm molekularny, który steruje odpowiedziami VEGF-A komórek śródbłonka naczyń krwionośnych w kierunku nadmiernej przepuszczalności naczyń, mogą zatem zidentyfikować szlaki, którymi można selektywnie manipulować w celu zahamowania patologicznego obrzęku wywołanego przez VEGF-A w chorobach, takich jak rak lub choroba niedokrwienna oczu. Test Milesa bez wątpienia będzie nadal pomocną metodą stanowiącą podstawę tych i wielu innych rodzajów badań funkcjonalnych w celu wyjaśnienia molekularnych regulatorów i efektorów nadmiernej przepuszczalności naczyń.

Podstawową funkcją układu sercowo-naczyniowego jest umożliwienie transferu gazów, składników odżywczych i produktów przemiany materii między krążeniem a tkankami we wszystkich narządach. Naczynia krwionośne mają specyficzne dla narządu poziomy podstawowej przepuszczalności, które umożliwiają taką wymianę1. Na przykład naczynia krwionośne w nerkach są wysoce przepuszczalne, podczas gdy bariera krew-mózg tworzy szczelny, wysoce nieprzenikalny interfejs2,3,4. Komórki śródbłonka, które tworzą wewnętrzną wyściółkę naczyń krwionośnych, stanowią fizyczną barierę między krążeniem a leżącymi poniżej tkankami i regulują przepuszczalność naczyń w sposób specyficzny dla narządu. Jednak niektóre bodźce powodują częściowe uszkodzenie bariery śródbłonkowej, aby zwiększyć wynaczynienie płynu z krążenia do śródmiąższu powyżej poziomów podstawowych1. Taką nadprzepuszczalność obserwuje się na przykład w miejscach urazu tkanki, w stanach zapalnych, w nowotworach, podczas sepsy, w oczach z chorobą neowaskularną lub w mózgu i sercu, gdy niedokrwienie tkanek występuje odpowiednio z powodu udaru lub zawału mięśnia sercowego5,6,7,8. Przewlekle podwyższona nadprzepuszczalność prowadzi do obrzęku, który z kolei powoduje uszkodzenie tkanek, takie jak utrata wzroku w chorobach oczu9. W związku z tym modelowanie odpowiedzi na nadmierną przepuszczalność naczyń krwionośnych jest pożądane w celu zrozumienia mechanizmów zwiększających przepuszczalność śródbłonka i przetestowania skuteczności środków zaprojektowanych w celu jej zahamowania.
Test Milesa jest dobrze znaną, powszechnie stosowaną i stosunkowo prostą techniką, która mierzy przeciek naczyniowy in vivo jako zastępczy pomiar nadmiernej przepuszczalności naczyń. Mimo że nie uwzględnia czynników narastających, które mogą zwiększać przeciek naczyniowy niezależnie od regulacji bariery śródbłonkowej, takich jak ciśnienie krwi lub przepływ krwi, ogólnie uważa się, że test Milesa zapewnia wiarygodną metodę oceny aktywności modulującej przepuszczalność substancji i identyfikacji mediatorów sygnałowych, które promują ich aktywność. W związku z tym test Milesa był integralną częścią licznych badań, które zidentyfikowały mediatory nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych i ich mechanizmy działania10,11,12,13,14,15, takie jak czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego VEGF-A, który został pierwotnie zidentyfikowany jako naczyniowy współczynnik przepuszczalności VPF16.
Pierwotnie opracowane przez Milesa i Milesa do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych u świnek morskich17, ich test został następnie dostosowany do korzystania z myszy, które są teraz modelowym organizmem z wyboru do wyjaśnienia molekularnych mechanizmów regulacji przepuszczalności naczyń ze względu na ich wyjątkową przydatność do manipulacji genetycznych. Krótko mówiąc, niebieski barwnik Evansa jest wstrzykiwany dożylnie dorosłym myszom i pozostawia się go do krążenia przez 30 minut (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Środki indukujące przepuszczalność w porównaniu z kontrolą nośnika są następnie wstrzykiwane śródskórnie w wiele miejsc na przeciwległych bokach myszy w celu wywołania przecieku naczyniowego (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1). W związku z tym niebieski barwnik Evansa związany z albuminą wynakręca się i gromadzi w skórze właściwej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1). Po humanitarnym uboju myszy, błękit Evansa jest ekstrahowany ze skóry właściwej, a poziom przecieku naczyniowego jest obliczany jako stosunek gęstości optycznej indukowanej substancją badaną do objętości optycznej wywołanej nośnikiem (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).

<table><tbody><tr><td>Sól maleinianu pirylaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5514-5G</td><td>Zawiesić w PBS</td></tr><tr><td>Dejonizowany formamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4117</td><td>Stosować w dygestoriach</td></tr><tr><td>Igły Microlance 30g x 0,5"</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>305106</tr><tr><td>Sterylny Plastipak 1ml Luer</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>309659</tr><tr><td>Sterylne strzykawki MicroFine 0,3 ml - 8 mm - 30G&nbsp;</td><td>BD&nbsp;</td><td></td><td></td>324826</tr><tr><td>Evans niebieski</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>Ogranicznik</td><td></td><td></td><td></td>myszy</tr><tr><td>Komora</td><td></td><td></td><td></td>grzewcza</tr><tr><td>Maszynka</td><td></td><td></td><td></td>do strzyżenia włosów</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Merial</td><td>ap/drugs/220/96</td><td></td></tr><tr><td>Scalpal&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>nożyczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurki Eppendorfa</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blok</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>grzewczy Tablica</td><td></td><td></td><td></td>korkowa</tr><tr><td>Wirówka</td><td></td><td></td><td></td>stołowa z chłodzeniem</tr><tr><td>Rekombinowany czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego 165</td><td>Reliatech</td><td>M30-004</td><td></td></tr></tbody></table>

ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu milesa

Evaluating Vascular Hyperpermeability-inducing Agents in the Skin with the Miles Assay

Podstawową funkcją śródbłonka naczyniowego w organizmach kręgowców jest służenie jako bariera między krwią a każdą tkanką ciała, dzięki czemu przepuszczalność śródbłonka dla komórek krwi, makrocząsteczek osocza i wody może być dostosowana do potrzeb fizjologicznych. W niektórych chorobach uwalniane są cytokiny i czynniki wzrostu, które celują w barierę śródbłonkową, aby przejściowo zwiększyć przepuszczalność naczyń; Jednak ich długotrwała obecność może powodować przewlekłą nadmierną przepuszczalność naczyń krwionośnych, a tym samym obrzęk uszkadzający tkanki. Test Milesa jest techniką in vivo, która pozwala naukowcom badać nadprzepuszczalność naczyń poprzez pomiar zastępczy przecieku naczyniowego. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół, jak wykonać tę procedurę na myszy, która jest najczęściej używanym organizmem modelowym do badania fizjologii i patologii ssaków. Procedura polega na dożylnym wstrzyknięciu niebieskiego barwnika Evansa w celu oznaczenia krążącej albuminy, a następnie wielokrotnym śródskórnym wstrzyknięciom środków indukujących przepuszczalność i roztworów kontrolujących nośnik do przeciwległych boków myszy. W związku z tym niebieski barwnik Evansa stopniowo przecieka do skóry właściwej, gdzie gromadzi się i może być ekstrahowany w celu ilościowego określenia jako wyciek wywołany przez czynnik indukujący przepuszczalność w stosunku do nośnika. Test Milesa może być wykonywany na modelach myszy typu dzikiego lub zmodyfikowanego genetycznie i może być połączony z podawaniem leków w celu zbadania mechanizmów molekularnych, które regulują przepuszczalność naczyń krwionośnych i identyfikacji czynników/celów zdolnych do indukowania lub blokowania nadmiernej przepuszczalności.

Do oceny zdolności VEGF-A do indukowania przecieku naczyniowego w porównaniu z kontrolą nośnikiem (PBS) u myszy szczepu C57/Bl6 typu dzikiego wykorzystaliśmy test Milesa. Przedstawiamy tutaj reprezentatywny eksperyment z użyciem myszy typu dzikiego stymulowanych wstrzyknięciem śródskórnym 20 µL roztworu zawierającego 50 ng VEGF-A w PBS lub samego nośnika PBS. Wyraźny wzrost wycieku barwnika błękitu Evansa w próbkach skóry wstrzykniętych VEGF-A w porównaniu z PBS był widoczny in situ (Rycina 1E>) oraz po ekstrakcji barwnika w formamidzie (Rycina 2A>). Ilościowa analiza wielu eksperymentów wykazuje, że 50 ng VEGF-A znacząco silniej indukuje wyciek błękitu Evansa niż sam PBS (Rycina 2B>), przy średnim 3-krotnym wzroście przecieku naczyniowego w porównaniu z nośnikiem (Rycina 2C>).
<img alt="Schemat znieczulenia i metody wstrzykiwania u myszy; etapy: pyrylamina i.p., błękit Evansa i.v., substancja i.d." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Indukcja przesięku naczyniowego w teście Milesa. Przedstawienie schematyczne (panele górne) i odpowiadające im obrazy (panele dolne) sekwencyjnych etapów wykonywania testu Milesa u myszy. (A) Maleinian pyrylaminy jest wstrzykiwany dootrzewnowo w celu zapobieżenia uwalnianiu endogennej histaminy od 10 do 30 minut przed (B) dożylnym wstrzyknięciem 100 µl 1% błękitu Evansa do żyły ogonowej myszy. (C) 30 min później przesięk naczyniowy jest indukowany poprzez wstrzyknięcie śródskórne substancji (50 ng VEGF-A; zielone kółka) w porównaniu z kontrolą nośnika (PBS; białe kółka). (D, E) Aby uzyskać dostęp do miejsc gromadzenia się błękitu Evansa, mysz jest uśmiercana 20 minut po wstrzyknięciach śródskórnych, a skóra obu boków jest rozcięta i rozpięta szpilkami. i.p.: dootrzewnowo; i.v.: dożylnie; i.d.: śródskórnie; paski skali, 1 cm. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Porównanie testu płytkowego dla PBS i VEGF164 wykazujące wyniki przecieku barwnika Evans blue wraz z analizą statystyczną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57524/57524fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2: Ilościowe oznaczenie przecieku naczyniowego w teście Milesa. (A) Barwnik Evans blue jest ekstrahowany do formamidyny z próbek skóry pobranych z każdego wstrzyknięcia śródskórnego przedstawionego na Rycini 1, a następnie nanoszony na płytkę 96-dołkową w celu pomiaru absorbancji za pomocą spektrofotometru. (B, C) Graficzna prezentacja pomiarów absorbancji z wielu eksperymentów poprzez wykreślenie albo (B) znormalizowanych wartości absorbancji (gęstość optyczna, OD) zarówno dla czynnika indukującego przepuszczalność (VEGF-A; ciemnozielone kółka), jak i dla nośnika (PBS; szare kółka), albo (C) krotności zmiany OD dla czynnika w stosunku do nośnika (słupki błędów: SEM). Pomiary absorbancji dla trzech powtórzeń próbek PBS i VEGF-A pokazane na (A) są uśrednione i przedstawione na (B, C) odpowiednio jako białe lub zielone kółka. <a href="/files/ftp_upload/57524/57524fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj prezentujemy protokół do pomiaru przecieku naczyniowego wywołanego śródskórnym podawaniem środków zwiększających przepuszczalność do skóry myszy. Technika ta może być wykorzystana do określenia zdolności cząsteczek do promowania lub hamowania przecieku naczyniowego lub do badania mechanizmów molekularnych regulujących przepuszczalność naczyń.

Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa

The primary function of the vascular endothelium in vertebrate organisms is to serve as a barrier between the blood and each tissue of the body, whereby ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar nieszczelności naczyniowej w skórze właściwej myszy, która jest indukowana przez śródskórne wstrzyknięcie środków zwiększających przepuszczalność. Procedura ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące regulacji przepuszczalności naczyń krwionośnych in vivo, takie jak to, które cząsteczki mogą stymulować lub hamować przeciek naczyniowy i jakie są zaangażowane szlaki sygnałowe. Główną zaletą tej procedury jest to, że jest szybka i stosunkowo prosta oraz wykorzystuje głównie popularne odczynniki i materiały laboratoryjne.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób z patologicznym obrzękiem. W szczególności naukowcy mogą wykorzystać ten test do identyfikacji nowych celów molekularnych i przetestowania odpowiednich leków pod kątem ich zdolności do hamowania przepuszczalności naczyń krwionośnych w stosunkowo szybki i prosty sposób. Przygotuj oddzielne roztwory inhibitora histaminy maleinianu pirylaminy i niebieskiego barwnika Evansa, oba w 0,9% roztworze soli fizjologicznej.Następnie pracując w komorze z przepływem laminarnym, wysterylizuj roztwory, przechodząc przez filtr 0,22 mikrometra. Załadować oba roztwory do oddzielnych strzykawek o pojemności jednego mililitra wyposażonych w igły o rozmiarze 30. Następnie zachlap myszą.Następnie przechyl mysz tak, aby głowa była skierowana w stronę ziemi, a brzuch do góry. Po ustawieniu myszy należy podać 10 mikrolitrów na gram masy ciała roztworu maleinianu pirylaminy we wstrzyknięciu dootrzewnowym. Następnie, aby pobudzić rozszerzenie naczyń krwionośnych, umieść mysz w komorze grzewczej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 10 minut.Następnie przesuń mysz do ogranicznika myszy. Następnie natrzyj ogon 70% etanolem w celu dalszego rozszerzenia naczyń krwionośnych. Podawać dożylnie 100 mikrolitrów roztworu Evans Blue Dye przez żyłę ogonową.Aby zapobiec krwawieniu, należy szybko przytrzymać ogonek między palcem a kciukiem i uciskać miejsce wstrzyknięcia. Dożylne wstrzyknięcie niebieskiego barwnika Evansa do żyły ogonowej myszy jest trudnym i krytycznym krokiem w tej procedurze. W związku z tym ważne jest, aby badacze byli kompetentni w wykonywaniu tego zastrzyku przed przystąpieniem do dalszej części procedury.Ustalenie kompetencji będzie wymagało wcześniejszej praktyki. Użyć sterylnych roztworów soli fizjologicznej buforowanej fosforanem do rozcieńczenia odczynnika VEGF tak, aby końcowa objętość dawki wynosiła 20 mikrolitrów. Następnie załaduj odczynnik indukujący przepuszczalność VEGF i kontrolę pojazdu do dwóch oddzielnych strzykawek o pojemności 300 mikrolitrów wyposażonych w igły o rozmiarze 31.Trzymaj igłę pod kątem 15 stopni ze skórą i wstrzyknij śródskórnie 20 mikrolitrów VEGF w bok myszy. Zlokalizuj wypukły pęcherzyk w skórze, aby potwierdzić powodzenie wstrzyknięcia. Wykonać wstrzyknięcia śródskórne w dwóch dodatkowych miejscach oddalonych od siebie o co najmniej jeden centymetr.Następnie obrócić mysz, aby odsłonić drugą flankę i powtórzyć trzykrotne wstrzyknięcia roztworu podłoża. Należy prowadzić zapis dla każdego z miejsc wstrzyknięcia na papierze oraz czasu zakończenia procedury wstrzykiwania. Następnie przenieś mysz do klatki domowej.Kontynuuj monitorowanie myszy, aż odzyska przytomność i zacznie poruszać się po klatce. Pozwól roztworowi VEGF działać przez 20 minut przed wywołaniem myszy. Na tym etapie należy kolejno wstrzyknąć VEGFA i nośnik wszystkim myszom, postępując zgodnie z tą samą procedurą.Po 20 minutach połóż każdą uśpioną mysz na plecach i przypnij jej stopy do tablicy korkowej owiniętej czystą chusteczką. Następnie za pomocą nożyczek wykonaj pionowe nacięcie o długości od trzech do czterech centymetrów od dolnej części brzucha do klatki piersiowej martwej myszy. Następnie użyj kleszczy i skalpela, aby drażnić skórę z obu stron boku.Użyj skalpela, aby usunąć tłuszcz, jeśli jest obecny w obszarach wokół miejsca wycieku. Następnie użyj kleszczy i skalpela, aby wyciąć obszary skóry za pomocą wyciekającego barwnika Evans Blue Dye. Wycięte obszary skóry muszą być podobnej wielkości.Przenieś próbki skóry do 1,5 mililitrowych probówek i odpowiednio oznacz. Wysuszyć próbkę, umieszczając otwartą probówkę w bloku grzewczym na noc. Po zakończeniu suszenia dodać 250 mikrolitrów dejonizowanego formamidu do próbki w dygestorium.Zamknij pokrywę probówki i umieść ją na noc w bloku grzewczym, aby wyekstrahować barwnik Evansa. Odwirować próbki o masie 10 000 g lub większej przez 40 minut w wirówce stołowej. Po odwirowaniu przenieść 100 mikrolitrów każdego supernatantu zawierającego barwnik z odwirowanej próbki do studzienek 96-dołkowej płytki działającej w dygestorium.Odczytaj absorbancję błękitu Evansa za pomocą spektrofotometru. Aby zbadać przeciek naczyniowy wywołany przez VEGF, myszowi wstrzykuje się 50 nanogramów VEGFA w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami lub tylko soli fizjologicznej buforowanej fosforanem jako nośniku. Obraz pokazuje wzrost akumulacji wyciekającego barwnika Evans Blue Dye w próbkach skóry, którym wstrzyknięto VEGFA, w porównaniu z kontrolą nośnika in situ.Ten obraz z 96-dołkową płytką pokazuje załadowany niebieski barwnik Evansa wyekstrahowany w formamidzie z próbki skóry. Ten wykres graficzny przedstawia znormalizowane wartości absorbancji sparowanych próbek kontrolnych VEGFA i samych nośników. Wykres pokazuje, że wstrzyknięcie 50 nanogramów VEGFA znacznie zwiększa wyciek barwnika Evansa w porównaniu z samym pojazdem.Wykres ten uzyskuje się po ilościowym określeniu zmian krotności gęstości optycznej dla VEGFA w porównaniu z próbkami nośników. Wykres przedstawia średnio trzykrotny wzrost przecieku naczyniowego po podaniu VEGFA w porównaniu z samym podłożem. Po opanowaniu główny segment tej techniki można wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonany prawidłowo.Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby znormalizować przeciek naczyniowy wywołany przez czynnik do przecieku naczyniowego wywołanego przez nośnik, aby uwzględnić niespecyficzny przeciek naczyniowy i różnice między myszami. Procedura ta może być łączona z innymi metodami, takimi jak podawanie leków, w celu uzyskania odpowiedzi na pytania, takie jak to, czy białko może być ukierunkowane na hamowanie przepuszczalności naczyń. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią naczyniową do zbadania molekularnych mechanizmów nadmiernej przepuszczalności naczyń krwionośnych u genetycznie zmodyfikowanych myszy, identyfikując kluczowe składniki sygnalizacyjne, które są wymagane do przecieku naczyniowego.Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak indukować i mierzyć nieszczelność naczyniową w skórze właściwej myszy.

evaluating-vascular-hyperpermeability-inducing-agents-skin-with-miles

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kapilaroskopia to nieinwazyjna, stosunkowo tania metoda bezpośredniej wizualizacji mikrokrążenia. Technika przepływu krwi w przedramieniu zapewnia akceptowane nieinwazyjne pomiary funkcji śródbłonka.

Nieinwazyjna ocena funkcji mikrokrążenia i śródbłonka

Prezentujemy test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych. Test ten opiera się na dożylnym wstrzyknięciu barwnika, a następnie wizualizacji jego dyfuzji do przestrzeni śródmiąższowych.

Test in vivo do badania przepuszczalności naczyń krwionośnych

Niniejszy artykuł opisuje metodologiczne rozważania dotyczące kilku nieinwazyjnych ocen funkcji i morfologii naczyń krwionośnych, które są powszechnie stosowane w badaniach medycznych do oceny różnych etapów miażdżycy.

Metodologiczne podejście do nieinwazyjnej oceny funkcji i morfologii naczyń krwionośnych

Zmodyfikowana technika Landisa umożliwia sparowany pomiar przewodnictwa hydraulicznego poszczególnych mikronaczyń w krezce normalnych i genetycznie zmodyfikowanych szczurów w warunkach kontrolnych i testowych przy użyciu technik mikroperfuzji. Stanowi wygodną metodę oceny mechanizmów regulujących przepuszczalność mikronaczyń i wymianę transnaczyniową w warunkach fizjologicznych.

Technika mikroperfuzji do badania regulacji przepuszczalności mikronaczyń w krezce szczura

Opisujemy dwie metody oceny przejściowej przepuszczalności naczyń krwionośnych związanych z funkcją wejścia do mikrośrodowiska guza (TMEM) i wewnątrznaczynieniem komórek rakowych za pomocą dożylnego wstrzyknięcia dekstranu o wysokiej masie cząsteczkowej (155 kDa) u myszy. Metody te obejmują obrazowanie przyżyciowe u żywych zwierząt oraz analizę tkanek utrwalonych za pomocą immunofluorescencji.

Ocena mikrośrodowiska guza przepuszczalności naczyniowej za pośrednictwem drzwi z przerzutami związanych z rozsiewaniem komórek rakowych za pomocą obrazowania przyżyciowego i analizy tkanek stałych

Protokół opisuje użycie miografii drucianej do oceny przezściennego napięcia izometrycznego tętnic krezkowych wyizolowanych od myszy, ze szczególnym uwzględnieniem modulacji przez czynniki uwalniane z komórek śródbłonka i okołonaczyniowej tkanki tłuszczowej.

Ocena reakcji na napięcie naczyniowe przy użyciu izolowanych tętnic krezkowych z naciskiem na modulację przez okołonaczyniowe tkanki tłuszczowe

W obecnym protokole, funkcja bariery śródbłonkowej gruczołu podżuchwowego (SMG) została oceniona poprzez wstrzyknięcie różnych molekularnych znaczników fluorescencyjnych do żył kątowych badanych modeli zwierzęcych in vivo pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym.

In vivo (in vivo) Wykrywanie przepuszczalności naczyń krwionośnych w mysim gruczole podżuchwowym

Przedstawiona tutaj metoda może ocenić wpływ odczynników na angiogenezę lub przepuszczalność naczyń in vivo bez barwienia. Metoda wykorzystuje wstrzyknięcie dekstranu-FITC przez żyłę ogonową w celu uwidocznienia naczyń nowych lub nieszczelności naczyniowej.

Zmodyfikowany test in vivo Matrix Gel Plug Test do badań angiogenezy

Mikrodializa śródskórna jest minimalnie inwazyjną techniką używaną do badania funkcji mikrokrążenia w zdrowiu i chorobie. Zarówno protokoły dawka-odpowiedź, jak i miejscowe ogrzewanie mogą być wykorzystane w tej technice do zbadania mechanizmów rozszerzenia naczyń krwionośnych i zwężenia naczyń krwionośnych w krążeniu skórnym.

Mikrodializa śródskórna: podejście do badania nowych mechanizmów dysfunkcji mikrokrążenia u ludzi

Niniejsze prace mają na celu służyć jako praktyczny przewodnik, umożliwiający badaczom przygotowanie własnych urządzeń DMAP przy użyciu metody odlewania rozpuszczalnika, znanej również jako mikroformowanie, oraz przeprowadzenie podstawowej charakterystyki.

Rozpuszczające plastry mikroigłowych wytwarzane techniką odlewania rozpuszczalnika oraz niezbędna charakterystyka urządzeń biomedycznych opartych na mikroigłach

Poznaj test Milesa do oceny nadprzepuszczalności naczyń krwionośnych w skórze myszy przy użyciu barwnika Evans Blue. Ta metoda pozwala badać regulację przepuszczalności naczyń i testować inhibitory w modelu in vivo.

Ocena czynników indukujących nadprzepuszczalność naczyń krwionośnych w skórze za pomocą testu Milesa

Przeglądaj więcej filmów