Name: Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji ex utero i organotypowych kultur warstwowych mózgów myszy do obrazowania migrujących interneuronów GABA-ergicznych. Technika ta umożliwia badanie wpływu mutacji genowych na rozwój mózgu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty operacyjne z Fundacji Savoy i Fundacji CURE Epilepsy oraz przez dotacje sprzętowe od Kanadyjskiej Fundacji Innowacji dla E.R (mikroskop konfokalny) i G.H (mikroskop konfokalny z wirującym dyskiem). E.R. otrzymuje nagrodę za karierę od Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S; Nagroda dla klinicysty-naukowca), a także od Kanadyjskich Instytutów Badań nad Zdrowiem (CIHR; Nagroda dla Młodego Badacza). G.H. jest starszym pracownikiem naukowym FRQ-S. L.E jest laureatem nagrody Steriade-Savoy w zakresie stażu podoktorskiego przyznawanej przez Fundację Savoy, nagrody za staż podoktorski Fundacji CHU Sainte-Justine oraz nagrody za staż podoktorski FRQ-S we współpracy z Fundacją Gwiazd. Projekt ten był możliwy dzięki Brain Canada za pośrednictwem Kanadyjskiego Funduszu Badań nad Mózgiem, przy wsparciu finansowym Health Canada, przyznanym L.E.

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Comité Institutionnel des Bonnes Pratiques avec les Animaux de Recherche (CIBPAR) w Centrum Badawczym CHU Sainte-Justine i zostały przeprowadzone zgodnie z przewodnikiem Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (Ed. 2) Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami (Ed. 2).
Opisany tutaj protokół został zoptymalizowany pod kątem elektroporacji zarodków w dniu embrionalnym (e) 13,5, w czasie, gdy aktywnie generowane są INs pochodzące z MGE, przed szczytem produkcji INs pochodzących z CGE45,46. Ponadto, aby skierować elektroporację w kierunku GABAergicznych IN, używamy promotora selektywnie wyrażanego w INs (na przykład promotor Dlx5/6 z minimalnym wzmacniaczem)47.
1. Przygotowanie roztworów do elektroporacji i organotypowych kultur warstwowych
<ol>
	<li>Przygotuj 125 ml sterylnej pożywki hodowlanej.
	<ol>
		<li>Odmierz 125 ml zwykłej pożywki hodowlanej specyficznej dla neuronów (patrz Tabela materiałów dla formulacji) w wysterylizowanej butelce w uprzednio wysterylizowanej promieniami UV komorze bezpieczeństwa biologicznego, spryskanej 70% etanolem. Dodaj 2,25 ml 50-krotnego suplementu specyficznego dla neuronów bez surowicy, 1,75 ml 200 ml glutaminy (końcowe stężenie 0,5 mM) i 6,25 ml inaktywowanej termicznie surowicy końskiej, wcześniej podanej w sterylnych warunkach. Dokładnie wymieszać, podwielokrotność porcji w sterylnych stożkowych probówkach o pojemności 15 ml i przechowywać w temperaturze 4 °C. 
		UWAGA: Przygotowaną pożywkę hodowlaną można przechowywać do 3 tygodni w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Podzielić 100-krotny roztwór podstawowy preparatu N-2 Botteinsteina48 na 150 μl porcji w sterylnych warunkach i zamrozić w temperaturze -20°C do momentu użycia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj 1 l sterylnego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF).
	<ol>
		<li>Odmierz 800 ml wody destylowanej w zlewce o pojemności 1 l. Dodać 25,67 g sacharozy, 5,08 g chlorku sodu (NaCl), 2,18 g wodorowęglanu sodu (NaHCO3), 1,80 g glukozy, 0,19 g chlorku potasu (KCl), 0,15 g jednozasadowego bezwodnego fosforanu sodu (NaH2PO4), 1 ml 1M zapasu CaCl2,2H 2O i 2 ml 1M zapasu MgSO4,7H 2O. Mieszać do rozpuszczenia w temperaturze pokojowej. Dodaj wodę destylowaną, aby osiągnąć całkowitą objętość 1 l.</li>
		<li>Za pomocą filtra 0,22 μm przefiltrować roztwór do sterylnej butelki w wysterylizowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego i przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przed każdym eksperymentem przygotuj świeży roztwór 4% agarozy w ACSF.
	<ol>
		<li>Odmierz 25 ml wcześniej przygotowanego ACSF w sterylnej stożkowej probówce o pojemności 50 ml i dodaj 1 g agarozy o niskiej temperaturze topnienia.</li>
		<li>Podgrzewaj przez 45 s w kuchence mikrofalowej. Aby uniknąć rozlania, przerywaj ogrzewanie co 3 - 4 sekundy, gdy zacznie się gotowanie, otwórz rurkę, aby wypuścić ciśnienie, zamknij ją ponownie i zamieszaj ręcznie, aby wymieszać agarozę. Powtarzaj, aż roztwór agarozy będzie jednorodny. Roztwór agarozy należy przechowywać w temperaturze 42 °C przez pozostałą część doświadczenia, aby uniknąć zestalenia. 
		UWAGA: Wyższe temperatury uszkadzają tkanki mózgowe.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie plazmidów do iniekcji
<ol>
	<li>Wyciągnij szklaną pipetę do mikroiniekcji
	<ol>
		<li>Ustaw ściągacz do mikropipet na odpowiednie parametry, zabezpiecz szklaną kapilarnę w przewidzianym do tego miejscu i upewnij się, że jest wyśrodkowana z filamentem.</li>
		<li>Naciśnij przycisk ciągnięcia.</li>
		<li>Ostrożnie wyjmij nowo wykonane pipety do mikroiniekcji ze ściągacza ciepła i umieść je w pudełku lub czystej szalce Petriego do czasu dalszego użycia, aby uniknąć uszkodzenia końcówki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw szafę bezpieczeństwa biologicznego ze wszystkimi instrumentami potrzebnymi do tego eksperymentu (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1A), obficie spryskaj wszystkie narzędzia w komorze bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i sterylizuj narzędzia i otoczenie światłem UV przez 15 - 20 minut.</li>
	<li>Na etapie sterylizacji rozmrozić plazmidy na lodzie (4 °C).</li>
	<li>Odmierzyć 10 μl plazmidu z roztworu podstawowego (4 μg/μl) do czystej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodaj 0,01% Fast Green FCF. Delikatnie wymieszaj, krótko odwiruj i trzymaj na lodzie do użycia. 
	UWAGA: Maxi-prep DNA powinno być przygotowane zgodnie z protokołem producenta przy użyciu zestawu maxi-prep wolnego od endotoksyn. DNA można rozpuszczać w buforze TE lub H2Owolnym od nukleaz, a przygotowanie plazmidu roztworem barwnika może, ale nie musi być wykonywane w sterylnych warunkach. Plazmidy z Maxi-prep powinny być porcjowane, aby uniknąć wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania. Hiperidy należy mieszać z barwnikiem nie później niż 2 godziny przed użyciem i nie należy ich ponownie zamrażać do dalszego użycia.</li>
	<li>Po sterylizacji przygotuj nano-wtryskiwacz w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Wybierz jedną z wcześniej przygotowanych szklanych pipet do mikroiniekcji przechowywanych w czystym pudełku lub na szalce Petriego i za pomocą małej pęsety przeciąć końcówkę pipety w ukośny sposób, aby uzyskać średnicę zewnętrzną około 15 μm. 
		UWAGA: Podana tutaj średnica zewnętrzna jest przybliżoną miarą, która daje użytkownikowi wyobrażenie o tym, czego używamy w naszych eksperymentach i została zoptymalizowana w celu ułatwienia przekłucia czaszki w celu wstrzyknięcia plazmidu bez uszkadzania mózgu, jednocześnie umożliwiając ładowanie płynem i uwalnianie DNA. Średnicę zewnętrzną można zmierzyć, patrząc na odciętą końcówkę szklanej pipety do mikroiniekcji przymocowaną do skali mikrometrycznej pod mikroskopem jasnego pola.</li>
		<li>Za pomocą strzykawki napełnić mikropipetę olejem mineralnym z jej niewyciągniętego końca (aby usunąć całe powietrze).</li>
		<li>Włóż napełnioną szklaną mikropipetę do nanowtryskiwacza, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Opróżnij 2/3 szklanej mikropipety (zachowując wystarczającą ilość oleju, aby zapobiec przedostawaniu się powietrza).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ostrożnie włożyć przygotowaną mikropipetę do probówki zawierającej roztwór plazmidu/barwnika i napełnić szklaną mikropipetę roztworem plazmidu/barwnika.</li>
</ol>
3. Pobieranie embrionów myszy od ciężarnych samic
<ol>
	<li>Codziennie monitoruj samice hodowlane, aby ocenić ich obecność w pochwie, najlepiej codziennie o tej samej porze (wczesnym popołudniem). Dzień e0,5 odpowiada pierwszemu dniu, w którym obserwuje się czop pochwowy. 
	UWAGA: Opisane tutaj eksperymenty można przeprowadzić na myszach typu dzikiego. Jednakże, aby ułatwić identyfikację MGE i oznaczyć wszystkie GABA-ergiczne INs (lub określone podzbiory, takie jak INs pochodzące z MGE), można wykorzystać zwierzęta transgeniczne (np.: GAD67EGFP; Dlx5/6Cre z allelem Cre-reporter itd.47,49). W takiej sytuacji wstrzyknięty eksperymentalny plazmid powinien wyrażać inny fluorofor (na przykład mCherry lub TdTomato), aby umożliwić wizualizację transfekowanych INs (żółty), które można porównać z nietransfekowanymi INs (zielony).</li>
	<li>Złożyć w ofierze samicę w dniu embrionalnym e13.5, przez zwichnięcie szyi. 
	UWAGA: Środki znieczulające podawane w momencie składania ofiary mogą mieć wpływ na migrację IN i przeżycie50,51 i należy ich unikać.</li>
	<li>Pobrać zarodki przez cesarskie cięcie w następujący sposób.
	<ol>
		<li>Obficie spryskaj kobiecy brzuch 70% etanolem. Podciągnij skórę brzucha za pomocą wysterylizowanych kleszczy, a drugą ręką użyj wysterylizowanych nożyczek chirurgicznych, aby odciąć skórę od brzucha.</li>
		<li>Za pomocą drugiej pary wysterylizowanych kleszczy i nożyczek pociągnij powięź brzuszną do góry i przetnij ją, ostrożnie omijając macicę.</li>
		<li>Za pomocą trzeciej pary wysterylizowanych kleszczy i nożyczek wyciągnij rogi macicy i wytnij je z jamy miednicy. Umieść wypreparowane rogi macicy na sterylnej szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej pożywką hodowlaną na bazie neuronów uzupełnioną aminokwasami, witaminami i solami nieorganicznymi (patrz tabela materiałów dla produktu dostępnego na rynku).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj dwóch par cienkich pęset (po jednej w każdej ręce), aby wypreparować zarodki z łożyska i odizolować głowy przez ścięcie.</li>
	<li>Odetnij ukośnie końcówkę sterylnej plastikowej pipety transferowej o pojemności 3 ml, odessaj głowice i przenieś je na nową, sterylną 60-milimetrową szalkę Petriego, pokrytą zestalonym czarnym woskiem i wypełnioną tą samą pożywką z uzupełnieniem na bazie neuronów, jak powyżej. 
	UWAGA: Ten krok minimalizuje przenoszenie zanieczyszczeń (włosów myszy, krwi). wosk służy do stabilizacji głowy podczas sekcji. Pożywki hodowlane nie muszą być natleniane podczas tych procedur.</li>
</ol>
4. Dokomorowe iniekcje plazmidu i elektroporacja ex vivo MGE
UWAGA: Następujące kroki muszą być wykonywane w sterylnych warunkach w wcześniej przygotowanej komorze bezpieczeństwa biologicznego.
<ol>
	<li>Umieść 60-milimetrową szalkę Petriego pokrytą czarnym woskiem i zawierającą ścięte głowy w pożywce z uzupełnionymi kulturami na bazie neuronów pod lornetką w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	<li>Ustabilizuj głowę, część rostralną skierowaną w prawo, za pomocą cienkiej pęsety lewą ręką i użyj nano-wstrzykiwacza w prawej ręce, aby wstrzyknąć 1 - 2 μl roztworu plazmidu/barwnika do prawej bocznej komory. 
	UWAGA: Eksperymenty z koekspresją można przeprowadzić poprzez koelektroportację plazmidu ratunkowego i plazmidu eksprymującego shRNA poprzez zmieszanie obu plazmidów w stężeniach równomolowych.</li>
	<li>Elektroporuj wstrzyknięty mózg.
	<ol>
		<li>Umieść głowę między elektrodami z elektrodą ujemną umieszczoną grzbietowo i równolegle do głowy, a elektrodą dodatnią w kierunku brzusznej strony głowy, aby celować w MGE.</li>
		<li>Gdy elektrody są dobrze ustawione, dostarczaj 4 impulsy kwadratowe o napięciu 40 V przez 50 ms w odstępach międzyimpulsowych 500 ms.</li>
		<li>Usuń wszelkie resztki tkanki z elektrod za pomocą pęsety już umieszczonej w komorze bezpieczeństwa biologicznego. 
		UWAGA: Parametry te zostały zoptymalizowane specjalnie dla elektroporatora używanego w naszych eksperymentach. Zalecamy, aby użytkownicy wykonali wcześniej testy optymalizacyjne w przypadku korzystania z innego typu elektroporatora.</li>
		<li>Powtórz kroki od 4.1 do 4.3 dla wszystkich pozostałych mózgów. 
		UWAGA: Chociaż ten protokół opisuje manipulacje wymagane dla jednego mózgu, możliwe jest wstrzyknięcie do 4 mózgów sekwencyjnie przed elektropolacją każdego mózgu, zwiększając w ten sposób wydajność. Strategia ta jest szczególnie korzystna, gdy 2 lub więcej różnych plazmidów jest wstrzykiwanych sekwencyjnie (np. plazmid kontrolny lub eksperymentalny) podczas tego samego eksperymentu (co pozwala na porównanie między rodzeństwem z miotu). Ponadto możliwe jest wstrzykiwanie i elektroportowanie jednocześnie po obu stronach mózgu w celu zwiększenia wydajności, poprzez ustawienie elektrod całkowicie równolegle do powierzchni mózgu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Sekcja mózgu i organotypowe kultury plastrów
<ol>
	<li>Nadal manipulując w sterylnym środowisku kabiny bezpieczeństwa biologicznego, wypreparuj mózg z czaszki.
	<ol>
		<li>Ustabilizuj głowę na warstwie czarnego wosku, wkładając igłę do każdego oka, ostrożnie omijając mózg.</li>
		<li>Użyj cienkiej pęsety, aby przytrzymać lewą stronę szyi i drugiej pary cienkich pęset, aby oderwać skórę od czaszki, od tyłu do przodu.</li>
		<li>Trzymając głowę z boku za pomocą pęsety w jednej ręce, użyj drugiej pęsety w drugiej ręce, aby ostrożnie przeciąć czaszkę na poziomie pnia mózgu i delikatnie pociągnij czaszkę do góry. Każdą pęsetą przetnij czaszkę w płaszczyźnie strzałkowej (linii środkowej) do przodu, a następnie naciąć bocznie, aby uwolnić fragmenty czaszki.</li>
		<li>Podnieś pień mózgu i ostrożnie przetnij opony mózgowe i nerwy czaszkowe, aż mózg całkowicie wyjdzie z czaszki. 
		UWAGA: Wszystkie czynności opisane w ppkt 5.1 powinny być wykonywane w rygorystycznych sterylnych warunkach w komorze bezpieczeństwa biologicznego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Osadź mózg w 4% agarozie o niskiej temperaturze topnienia w celu przekrojenia.
	<ol>
		<li>Napełnić szalkę Petriego o średnicy 35 mm przygotowanym powyżej roztworem agarozy (w płynie prowadzonym w temperaturze 42 °C).</li>
		<li>Szybko przenieś elektroporowany mózg do naczynia wypełnionego agarozą za pomocą wcześniej przeciętej pipety transferowej. Przechowuj naczynie w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wymieszaj agarozę metalowym patyczkiem, aby utrzymać mózg w środku studzienki (aby zapobiec zatonięciu) i ustaw mózg w płaszczyźnie rostro-ogonowej równolegle do naczynia. Przestań mieszać, gdy agaroza zacznie krzepnąć, aby uniknąć uszkodzenia mózgu.</li>
		<li>Użyj żyletki, aby przeciąć agarozę otaczającą mózg, aby utworzyć prostokątny blok, pozostawiając margines 1-2 milimetrów wokół mózgu. Upewnij się, że rostralna część mózgu jest prostopadła do przedniej granicy bloku, aby ułatwić orientację w kolejnych krokach sekcji.</li>
		<li>Powtórz te czynności dla każdego mózgu. 
		UWAGA: Możliwe jest cięcie więcej niż jednego mózgu na raz (maksymalnie 3) poprzez formowanie oddzielnych bloków agarozy, ustawiając każdy mózg na różnych wysokościach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wibratome, przekroje koronalne i kultura plastrowa.
	<ol>
		<li>Rozmrozić jedną porcję 100X suplementu N-2 (150 μl) na lodzie i dodać do 15 ml podzielonej pożywki hodowlanej w sterylnych warunkach.</li>
		<li>Przenieś 750 μl pożywki hodowlanej (z 1X dodatkiem N2) do każdego dołka 6-dołkowej płytki hodowlanej.</li>
		<li>Za pomocą zakrzywionej pęsety umieść jedną wkładkę do hodowli komórkowej (średnica 30 mm, wielkość porów 0,4 μm, PTFE) w każdym dołku wypełnionym pożywką.</li>
		<li>Napełnij wannę wibratomową stale natlenionym ACSF. Schłodzić do 4 °C z lodem otaczającym wannę lub użyć wibratomu w lodówce.</li>
		<li>Ustaw prędkość wibratomu na 0,150 mm/s, a częstotliwość na 80 Hz.</li>
		<li>Przyklej blok agarozy na platformie wibratomu, krawędzią rostralną skierowaną w dół i krawędzią brzuszną skierowaną w stronę użytkownika.</li>
		<li>Przeciąć mózg na skrawki czołowe, aby uzyskać skrawki o grubości 250 μm (w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Za pomocą wysterylizowanych szpatułek zbierz 2-3 sekcje zawierające MGE i umieść wszystkie skrawki mózgu jednego zwierzęcia na jednej 30-milimetrowej wkładce membranowej, ostrożnie unikając nakładania się na sekcje. Umieścić wkładkę w jednym dołku 6-dołkowej płytki hodowlanej (zawierającej 750 μl uzupełnionej pożywki hodowlanej, jak opisano powyżej). Alternatywnie, każdą sekcję można umieścić na oddzielnej membranie o średnicy 13 mm na 12-dołkowej płytce hodowlanej wypełnionej 500 μl uzupełnionej pożywki hodowlanej. Ilość pożywki zalecana dla każdej studzienki pozwala na odżywianie części mózgu przez pożywkę bez zanurzania. 
		UWAGA: Czynności opisane w ppkt 5.3.6 i 5.3.7 nie są wykonywane w całkowicie sterylnych warunkach, chyba że wibratom można wysterylizować i użyć w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Dlatego ważne jest, aby wykonać te kroki ostrożnie, aby uniknąć zanieczyszczenia. Odpowiedni sprzęt ochronny (czysta maska, rękawice chirurgiczne i fartuch laboratoryjny) powinien być noszony przez cały czas, a części ciała, nawet zakryte, takie jak włosy, twarz i dłonie, nigdy nie powinny przechodzić przez płytki hodowlane (z pożywką hodowlaną lub bez). Zaleca się również częste rozpylanie 70% etanolu na rękawice i szpatułki używane do pobierania skrawków mózgu.</li>
		<li>Umieścić płytkę hodowlaną w wentylowanym, sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 °C przy wilgotności 60% i 5% CO2 przez 48 lub 72 godziny 
		UWAGA: Te czasy inkubacji zostały zoptymalizowane odpowiednio pod kątem obrazowania poklatkowego INs pochodzących z MGE i obrazowania konfokalnego stałych plasterków. Optymalne czasy inkubacji powinny być wcześniej przetestowane dla każdego projektu eksperymentalnego. Ponadto, jeśli wybrana inkubacja trwa 72 godziny i mniej, nie ma potrzeby zmiany pożywki hodowlanej. W przypadku dłuższych czasów inkubacji pożywkę hodowlaną należy wymieniać co 2 - 3 dni.</li>
		<li>Po pożądanym czasie inkubacji przenieść interesujące nas skrawki do 8-komorowego szkiełka nakrywkowego i dodać 3 - 5 μl pożywki hodowlanej. Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze środowiskowej (37 °C, 60% wilgotności, 5% CO2) połączonej z odwróconym konfokalnym dyskiem wirującym wyposażonym w oprogramowanie do akwizycji wspomaganej komputerowo w celu skonfigurowania sesji obrazowania poklatkowego. 
		UWAGA: Alternatywnie, skrawki można utrwalić za pomocą 4% paraformaldehydu (przez noc w temperaturze 4 °C lub 2 godziny w temperaturze pokojowej), a następnie wybarwić immunologicznie różnymi przeciwciałami w celu wizualizacji cech morfologicznych elektropostowanych INs pod mikroskopem konfokalnym. Chociaż eGFP i mCherry można uwidocznić za pomocą mikroskopii konfokalnej bez żadnej procedury barwienia przeciwstawnego, zalecamy wykonanie immunohistochemii przeciwko GFP i mCherry w celu wzmocnienia sygnału, ponieważ proces fiksacji może zmniejszyć fluorescencję, zmniejszając wykrywanie drobniejszych składników neuronów embrionalnych, takich jak mniejsze gałęzie w procesach wiodących lub końcowych.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia. Poglądy wyrażone w niniejszym dokumencie niekoniecznie reprezentują poglądy Ministra Zdrowia lub Rządu Kanady.

W tym artykule przedstawiamy wiarygodną metodę wykonywania elektroporacji ex utero myszy MGE w temperaturze e13.5 oraz generowania kultur organotypowych embrionalnych wycinków mózgu. Chociaż metody in vitro, takie jak test komory Boydena, są stosunkowo łatwe do wykonania i mogą być stosowane do oceny specyficznych ról różnych genów i białek bez ingerencji innych czynników, wykluczają one badanie dynamiki migracji IN w odniesieniu do kierunkowości i ścieżki migracji25. Eksplantaty...

Korowe interneurony GABAergiczne (INs) są zróżnicowane pod względem właściwości biochemicznych, fizjologicznych i łączności, a także pośredniczą w różnych funkcjach w dojrzałych sieciach1,2,3,4,5. Specyfikacja różnych podtypów korowych IN jest ściśle regulowana przez kaskady genetyczne, które zostały szeroko zbadane1,2. Większość (70%) korowych GABAergicznych IN pochodzi od przodków w przyśrodkowej wyniosłości zwojowej (MGE), brzusznie zlokalizowanej strukturze embrionalnej, i musi migrować na stosunkowo duże odległości, aby dotrzeć do płytki korowej1,2,6. Podczas gdy korowe komórki piramidalne migrują promieniście ze strefy komorowej (VZ) do płytki korowej wzdłuż promieniowego rusztowania glejowego, styczna migracja IN, które nie są przymocowane do takiego rusztowania, wymaga różnych wewnętrznych i zewnętrznych wskazówek, aby przyciągnąć migrujące neurony w kierunku płytki korowej, jednocześnie kierując je z dala od struktur niekorowych2, 7,8. Po wyjściu z cyklu komórkowego, INs są odpychane od MGE przez sygnały chemo-odpychające wyrażone w VZ MGE, co wyzwala styczną migrację w kierunku płytki korowej9,10. Migrujące INs omijają prążkowie za pomocą różnych odpychających sygnałów11, a po dotarciu do płytki korowej przełączają się z trybu migracji stycznej na radialną i osiągają swoją ostateczną pozycję laminarną, częściowo w odpowiedzi na sygnały z komórek piramidalnych12 i innych populacji komórkowych13. Migracja IN, podobnie jak w przypadku innych populacji neuronów, obejmuje różne dynamiczne zmiany morfologiczne, aby umożliwić rzeczywisty ruch neuronu. Ta tak zwana lokomocja neuronalna charakteryzuje się powtarzającymi się cyklami składającymi się z trzech następujących po sobie etapów: wydłużenia procesu wiodącego, aktywnego ruchu następczego jądra (nukleokinezy) i wycofania procesu końcowego14. Migracja IN jest regulowana przez liczne wewnętrzne i zewnętrzne wskazówki, które napędzają rozgałęzianie i aktywne przemodelowanie procesu wiodącego, aby skierować IN-y we właściwym kierunku, określając zarówno orientację, jak i szybkość migracji14,15,16.
Determinanty regulujące migrację kory mózgowej IN były szeroko badane w ostatnich latach1,2,7,17,18,19,20Postulowano, że zakłócenia u niektórych z tych czynników molekularnych prowadzą do zaburzeń neurorozwojowych, takich jak padaczka oporna na leczenie u dzieci lub zaburzenia ze spektrum autyzmu1,2,21,22,23,24. W związku z tym kontynuowano rozwój różnych podejść in vitro i in vivo, aby znacznie zwiększyć naszą zdolność do badania tego dynamicznego procesu, jak wcześniej recenzowano25. Metody in vitro, w tym test komorowy Boydena i test Stripe Choice, zapewniają najszybszy i najbardziej powtarzalny sposób oceny zapotrzebowania i autonomicznego wpływu określonych genów lub białek na komórkę podczas migracji neuronów, bez wpływu innych czynników25. Testy te są szczególnie przydatne w połączeniu z obrazowaniem na żywo8,26,27. Dzięki tym technikom IN można łatwo pobrać z e13.5 MGE i wyizolować przez dysocjację enzymatyczną i mechaniczną, po czym można zbadać różne szlaki sygnałowe i wskazówki naprowadzające, jak pokazano wcześniej8,28. Jednak testy te odbywają się w sztucznej macierzy zewnątrzkomórkowej przy braku trójwymiarowej architektury tkanki, która może zmieniać zachowanie neuronów i właściwości komórek, potencjalnie wpływając na migrację komórek i/lub przeżycie25. Aby obejść te ograniczenia, eksplantaty MGE ex vivo zostały opracowane jako alternatywne narzędzie do ilościowego określania dynamicznych zmian morfologicznych zachodzących podczas migracji wraz z parametrami takimi jak prędkość i orientacja14,29. Generowanie eksplantatów MGE jest stosunkowo proste i zostało obszernie opisane w innym miejscu30. Polega to na posiewaniu małego ekstraktu MGE na monowarstwie mieszanych komórek korowych lub w mieszaninie matrigelu i kolagenu w obecności atrakcyjnych lub odpychających wskazówek25, chociaż te ostatnie są opcjonalne31. Eksplantaty MGE pozwalają na obrazowanie w wysokiej rozdzielczości słabo znakowanych komórek, upraszczając badanie procesów wewnątrzkomórkowych, takich jak przebudowa cytoszkieletu podczas rozgałęziania się procesu wiodącego, jak pokazano wcześniej32,33,34 oraz w niniejszym badaniu. Eksplantaty MGE są z powodzeniem stosowane do oceny dynamicznych zmian cytoszkieletu podczas migracji IN w środowisku 2D, na przykład po określonych manipulacjach farmakologicznych lub chemotaktycznych (patrz na przykład Tielens i in. 201633). Jednak przy takim podejściu IN migrują w obrębie sztucznej matrycy, co może zmienić zachowanie IN oraz odtwarzalność i znaczenie wyników eksperymentalnych.
Dla kontrastu, elektroporacja in utero umożliwia manipulację genetyczną INs w ich naturalnym środowisku i jest szeroko stosowaną metodą szybkiej i efektywnej oceny wpływu zysków i strat funkcji genów, przy jednoczesnym obejściu ograniczeń kosztownych i czasochłonnych strategii nokautowania i knock-in25,35. Elektroporacja in utero może być stronnicza w kierunku progenitorów IN za pomocą promotorów specyficznych dla typu komórki i poprzez ustawienie elektrod w kierunku struktur brzuszno-przyśrodkowych, w tym klasy MGE<sup="xref">36. Co więcej, elektroporacja in utero pozwala na terminową ekspresję konstruktów eksperymentalnych w ciągu 1 - 2 dni, w porównaniu do 7 - 10 dni wymaganych do ekspresji konstruktu przy użyciu wektorów wirusowych25. Jednak elektroporacja in utero przodków IN ma tendencję do niskiej wydajności. Rzeczywiście, chociaż komórki progenitorowe piramid zlokalizowane w strefie grzbietowej komory mogą być skutecznie transfekowane za pomocą elektroporacji in utero, celowanie w struktury bardziej brzusznie położone, takie jak MGE, jest trudniejsze technicznie, szczególnie w małych zarodkach e13.5, a wysoki wskaźnik śmiertelności zarodków dodatkowo zmniejsza wydajność eksperymentalną25.
Aby obejść niektóre ograniczenia techniczne związane z eksperymentami in vitro z eksplantatami MGE i elektroporacją in vivo in utero, opracowano organiczne kultury warstwowe ex vivo8,37,38,39. Organotypowe kultury warstwowe mózgu mają tę zaletę, że naśladują warunki in vivo, a jednocześnie są tańsze i bardziej czasochłonne niż generowanie modeli zwierzęcych25. Rzeczywiście, preparaty te umożliwiają łatwy dostęp do MGE, wraz ze specyficzną wizualizacją IN, i mogą być połączone z elektroporacją ogniskową w celu zbadania określonych szlaków molekularnych w INs migrujących w bardziej fizjologicznym środowisku8,39,40,41. W związku z tym zoptymalizowaliśmy podejście do kultur organotypowych38, które połączyliśmy z elektroporacją ex utero i poklatkowym obrazowaniem konfokalnym, aby dokładniej ocenić morfologiczny i dynamiczny proces zachodzący podczas migracji stycznej MGE-IN. Obecny protokół został zaadaptowany i zoptymalizowany na podstawie innych, którzy używali elektroporacji mózgu ex utero lub in utero i organotypowych kultur warstwowych do badania migracji komórek piramidalnych42,43 and cortical INs36,39,44. W szczególności zarodki myszy są dekapitacjonowane, a MGE jest elektropostowany ex vivo po dokomorowym wstrzyknięciu eksperymentalnych plazmidów, co pozwala na bardziej efektywne i precyzyjne celowanie w progenitory MGE niż to, co można osiągnąć za pomocą elektroporacji w macicy. Mózgi są następnie ekstrahowane i dzielone na całe wycinki koronalne mózgu, które można hodować przez kilka dni, umożliwiając w ten sposób ciągłe śledzenie i obrazowanie transfekowanych IN. Podejście to zazwyczaj oznacza od 5 do 20 stycznie migrujących INs na wycinek mózgu, minimalizując liczbę iteracji eksperymentalnych wymaganych do osiągnięcia istotności statystycznej, jednocześnie oznaczając wystarczająco rzadką populację neuronów, aby zapewnić łatwą separację poszczególnych neuronów w celu rekonstrukcji i dokładnej oceny morfologicznej. Ponadto, w porównaniu z eksplantatami MGE, kultury organotypowe zapewniają, że migrujące INs są narażone na bardziej naturalne środowisko, w tym lokalnie wydzielane chemokiny i dane wejściowe ze wzgórza aferentnego. Podejście to jest zatem dobrze przystosowane do ilościowego określenia kierunkowości i ścieżki migracji przyjętej przez transfekowane IN, oferując jednocześnie wystarczające szczegóły anatomiczne, aby umożliwić scharakteryzowanie drobniejszych procesów dynamicznych, takich jak rozgałęzianie się procesu wiodącego, nukleokineza i retrakcja procesu końcowego.

<table><tbody><tr><td>Pożywka neuropodstawowa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Dostępna na rynku pożywka hodowlana specyficzna dla neuronów. Kompletna formuła dostępna na tej stronie internetowej: https://www.thermofisher.com/ca/en/home/technical-resources/media-formulation.251.html</td></tr><tr><td>Suplement bez surowicy B-27</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504044</td><td>50X Bezemisyjny suplement specyficzny dla neuronów</td></tr><tr><td>15 ml sterylne probówki wirówkowe</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1X) L-15 Medium (+ L-glutamina)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11415064</td><td>Dostępna w handlu pożywka do hodowli neuronów uzupełniona aminokwasami, witaminami i solami nieorganicznymi. Kompletny preparat dostępny na stronie dystrybutora&nbsp;</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Surowica końska, inaktywowana termicznie</td><td>Millipore-Sigma</td><td>H1138-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Suplement Neurocell N-2 100X</td><td>Żubr</td><td>305-016</td><td>Preparat Botteinsteina N-2 Kwadratowe</td></tr><tr><td>butelki na podłoża VWR PETG 125 ml</td><td>VWR</td><td>89132-062</td><td></td></tr><tr><td>Szafa bezpieczeństwa biologicznego klasy II typu A</td><td>Nuaire</td><td>NU-540</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>BioShop</td><td>SUC700.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>BioShop</td><td>SOD001.1</td><td></td></tr><tr><td>Wodorowęglan sodu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S233-500</td><td></td></tr><tr><td>D+ glukoza</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G7528-250G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P217-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosforan sodu jednozasadowy bezwodny</td><td>BioShop</td><td>SPM400.500</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek wapnia dwuwodny&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>BiosShop</td><td>MAG522</td><td></td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>BioShop</td><td>AGA002.500</td><td></td></tr><tr><td>50 ml sterylne probówki wirówkowe</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml probówki wirówkowe</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>P-97 Flaming/Brown Ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instrumenty Co.</td><td>Model P-97</td><td></td></tr><tr><td>0,4 mm ID x 75 mm Rurka kapilarna</td><td>Drummond scientific</td><td>1-000-800/12</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>E193</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 5 ml</td><td>Becton Dickinson & Co</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny (ciężki)</td><td>Pęseta szwajcarska Rougier Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>WPI #5</td><td>World Precision Instruments</td><td>504511</td><td>11 cm, prosta, końcówki 0,06x0,07mm, antymagnetyczna. Będziesz potrzebował 2 z nich.</td></tr><tr><td>Pęseta szwajcarska WPI #7</td><td>World Precision Instruments</td><td>504504</td><td>11,5 cm, 0,18x0,2mm, zakrzywione końcówki,</td></tr><tr><td>Pęseta</td><td>HTC World Precision Instruments</td><td>504617</td><td>11 cm, prosta, płaska</td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>World Precision Instruments</td><td>501225</td><td>16 cm, Ostra/ostra, prosta. Będziesz potrzebował 3 z nich.</td></tr><tr><td>Kleszcze opatrunkowe</td><td>World Precision Instruments</td><td>501217</td><td>12,5 cm, proste, ząbkowane</td></tr><tr><td>Kleszcze do tęczówki</td><td>World Precision Instruments</td><td>504478</td><td>10,2 cm, pełna krzywa, ząbkowana</td></tr><tr><td>Kleszcze do tkanek DeBakey</td><td>World Precision Instruments</td><td>501996</td><td>15 cm, kąt 45 stopni, delikatna szczęka, szerokość 1,5 mm</td></tr><tr><td>Mikroszpatułka Fisherbran z zaokrąglonymi końcami</td><td>FisherScientific</td><td>21-401-5</td><td>Będziesz potrzebował 2 z nich.</td></tr><tr><td>Nanoject II Auto-Nanolitr Injector</td><td>Drummond scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 60, Standard</td><td>Sarstedt</td><td>83.3901</td><td>Talerz 60 mm</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli</td><td>tkankowych Sarstedt</td><td>83.1800</td><td>Talerz 35 mm</td></tr><tr><td>Black Wax</td><td>FisherScientific</td><td>S17432</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe&nbsp;</td><td>Ultident</td><td>170-CTB700-212</td><td>3 mL, mała żarówka</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Leica Biosystems</td><td>Leica M80</td><td>W zamienniku naszego mikroskopu stereoskopowego, który został wycofany przez producenta (StereoMaster od FisherScientific)</td></tr><tr><td>Electro Square Porator</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>ECM 830</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta, platerowana plattyną, 3mm</td><td>BTX Harvard Apparatus</td><td>45-0487</td><td></td></tr><tr><td>25G 1 1/2</td><td>Becton Dickinson & Co</td><td>305127</td><td></td></tr><tr><td>Leica VT1000S Mikrotom z wibrującymi ostrzami</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1000S</td><td></td></tr><tr><td>GEM - Jednoostrzowa żyletka</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>71952-10</td><td>Usuń koniec przed włożeniem do ostrza wyznaczonego miejsca wibratomu</td></tr><tr><td>&mikro;-Slide 8 well</td><td>Ibidi</td><td>80827</td><td>Zestaw 15</td></tr> sztuk <tr><td>Wkładka</td> <td>do hodowli komórek milikomórkowychMillipore-Sigma</td><td>PICM0RG50</td><td>30 mm, hydrofilowy PTFE, 0,4 i mikro; m pore, opakowanie 50 szt.;</td></tr><tr><td>Mikroskop Leica DMi6000</td><td>Leica Microsystems</td><td>N/A Głowica</td><td></td></tr><tr><td>konfokalna z wirującym dyskiem Ultraview Vox</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do akwizycji Volocity 6.0</td><td>Improvision/Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>LiveCell Stage system inkubacji Top</td><td>Urządzenia patologiczne</td><td>LC30030</td><td>Zapewnia kontrolę temperatury, CO2 i wilgotności.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny SP8</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mCherry-Lifeact-7</td><td>Addgene</td><td>54491</td><td>Prezent od Michaela Davidsona</td></tr><tr><td>Butelka Fast Green</td><td>FCF Millipore-Sigma</td><td>F7258-25G</td><td>25G, certyfikowana przez Komisję ds. Barwień Biologicznych</td></tr></tbody></table>

ex utero elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów gaba-ergicznych

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Cultures of Embryonic Mouse Brains for Live-Imaging of Migrating GABAergic Interneurons

Interneurony GABAergiczne (INs) są kluczowymi składnikami sieci neuronowych, które napędzają poznanie i zachowanie. IN, które mają zasiedlić korę mózgową, migrują stycznie ze swojego miejsca pochodzenia w brzusznej kresomózgowiu (w tym z wypukłości przyśrodkowych i ogonowych zwojów (MGE, CGE)) do grzbietowej płytki korowej w odpowiedzi na różne sygnały wewnętrzne i zewnętrzne. Na przestrzeni lat opracowano różne metodologie w celu genetycznego manipulowania określonymi szlakami i zbadania, w jaki sposób regulują one dynamiczne zmiany cytoszkieletu wymagane do prawidłowej migracji IN. Elektroporacja in utero jest szeroko stosowana do badania wpływu represji lub nadekspresji genów w określonych podtypach IN, jednocześnie oceniając wpływ na morfologię i ostateczną pozycję. Jednakże, chociaż podejście to jest chętnie stosowane do modyfikowania promieniście migrujących komórek piramidowych, jest ono trudniejsze technicznie w przypadku celowania w IN. Elektroporacja w macicy generuje niską wydajność, biorąc pod uwagę zmniejszone wskaźniki przeżywalności młodych, gdy elektroporacja jest przeprowadzana przed e14.5, jak to zwykle bywa podczas badania INs pochodzących z MGE. W alternatywnym podejściu, eksplantaty MGE zapewniają łatwy dostęp do MGE i ułatwiają obrazowanie genetycznie modyfikowanych IN. Jednak w tych eksplantatach INs migrują do sztucznej matrycy, pozbawionej endogennych wskazówek naprowadzających i wejść wzgórzowych. To skłoniło nas do optymalizacji metody, w której INs mogą migrować w bardziej naturalistycznym środowisku, jednocześnie omijając wyzwania techniczne związane z podejściem in utero. W tym artykule opisujemy kombinację elektroporacji ex utero embrionalnych mózgów myszy, a następnie organotypowych kultur warstwowych, aby łatwo śledzić, obrazować i rekonstruować genetycznie zmodyfikowane IN migrujące wzdłuż swoich naturalnych ścieżek w odpowiedzi na endogenne sygnały. Podejście to pozwala zarówno na ilościowe określenie dynamicznych aspektów migracji IN za pomocą poklatkowego obrazowania konfokalnego, jak i na szczegółową analizę różnych parametrów morfologicznych za pomocą rekonstrukcji neuronalnych na utrwalonej tkance znakowanej immunologicznie.

W tej sekcji przedstawiamy reprezentatywne wyniki uzyskane po elektroporacji ex utero plazmidu kontrolnego lub plazmidu eksperymentalnego nakierowanego na wybrany gen w MGE embrionów myszy w stadium e13.5, a następnie w organotypowych kulturach skrawków inkubowanych w temperaturze 37 °C przez 48 h (do obrazowania time-lapse) lub 72 h (do fiksacji i znakowania immunohistochemicznego) (schemat protokołu przedstawiono na Rysunku 1B). Dla porównania z op...

Tutaj oferujemy tanią i niezawodną metodę generowania elektroporowanych organicznych kultur warstwowych mózgu z mysich zarodków, odpowiednich do mikroskopii konfokalnej i technik obrazowania na żywo.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

GABAergic interneurons (INs) are critical components of neuronal networks that drive cognition and behavior. INs destined to populate the cortex migrate ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest wizualizacja genetycznie zmodyfikowanych interneuronów korowych GABA-ergiczne podczas migracji stycznej w możliwie najbardziej naturalistycznym środowisku. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neuronaukach rozwojowych poprzez badanie przesiewowe wpływu utraty funkcji określonych genów białek podczas rozwoju mózgu. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest tania i stosunkowo łatwa do wykonania w porównaniu z innymi podobnymi metodami, takimi jak elektroporacja in utero.Technika ta może ostatecznie poprawić diagnostykę pacjentów z genetycznymi zaburzeniami neurorozwojowymi, takimi jak autyzm i padaczka, poprzez wyjaśnienie patogeneczności określonych mutacji zidentyfikowanych u pacjentów, a także roli nowych genów chorobowych podczas rozwoju mózgu. Zacznij od ustawienia szafy bezpieczeństwa biologicznego ze wszystkimi narzędziami potrzebnymi do sekcji i hodowli. Obficie spryskaj wszystkie narzędzia w komorze bezpieczeństwa biologicznego 70% etanolem i sterylizuj narzędzia i wnętrze szafki światłem UV przez 15 do 20 minut.Gdy będziesz gotowy do pobrania zarodków, obficie spryskaj brzuch matki poddanej eutanazji 70% etanolem. Podciągnij skórę brzucha za pomocą wysterylizowanych kleszczy, a drugą ręką użyj wysterylizowanych nożyczek chirurgicznych, aby odciąć skórę od brzucha. Za pomocą drugiej pary wysterylizowanych kleszczy i nożyczek pociągnij powięź brzuszną do góry i przetnij ją, ostrożnie omijając macicę.Używając trzeciej pary wysterylizowanych kleszczy i nożyczek, przytrzymaj rogi macicy i wytnij je z jamy miednicy. Umieść wypreparowane rogi macicy w sterylnym 60-milimetrowym petridish wypełnionym neuronalnym podłożem hodowlanym Lebovitz uzupełnionym aminokwasami, witaminami i solami nieorganicznymi. W sterylnej komorze bezpieczeństwa biologicznego użyj dwóch par cienkich pęset, aby wyciąć zarodki z łożyska i odizolować głowy przez ścięcie.Skos przeciął końcówkę sterylnej trzymililitrowej plastikowej pipety transferowej i użyj jej do zassania główek i przeniesienia ich na nową sterylną 60-milimetrową szalkę Petriego wypełnioną tą samą uzupełnioną pożywką do hodowli neuronowej w celu wypłukania krwi. Przenieś je ponownie na trzecią szalkę Petriego pokrytą zestalonym czarnym woskiem i wypełnioną pożywką z uzupełnionymi kulturami na bazie neuronów. Umieść 16-milimetrową szalkę Petriego pokrytą czarnym woskiem i zawierającą odcięte głowy w pożywce z uzupełnionymi kulturami na bazie neuronów pod mikroskopem preparacyjnym w komorze bezpieczeństwa biologicznego.Użyj cienkiej pęsety trzymanej w lewej ręce, aby ustabilizować głowę z częścią rostralną skierowaną w prawo. Następnie użyj nano wstrzykiwacza w prawej ręce, aby wstrzyknąć od jednego do dwóch mikrolitrów roztworu plazmidu wzbogaconego barwnikiem do prawej bocznej komory. Elektroporuj wstrzyknięty mózg, umieszczając głowę między elektrodami z elektrodą ujemną umieszczoną grzbietowo i równolegle do głowy, a elektrodą dodatnią w kierunku brzusznej strony głowy, aby celować w MGE.Gdy elektrody są dobrze ustawione, dostarczaj impulsy o napięciu czterech kwadratów 40 woltów przez 50 milisekund w odstępach 500 milisekund. Nadal pracując w sterylnym środowisku kabiny bezpieczeństwa biologicznego, zacznij wycinać mózg z czaszki. Najpierw ustabilizuj głowę na warstwie czarnego wosku, wkładając igłę do każdego oka, ostrożnie omijając mózg.Następnie użyj cienkiej pęsety, aby przytrzymać lewą stronę szyi i drugiej pary cienkiej pęsety, aby oderwać skórę od czaszki od tyłu do przodu. Trzymając głowę z boku za pomocą pęsety w jednej ręce, użyj drugiej pęsety w drugiej ręce, aby ostrożnie przeciąć czaszkę na poziomie pnia mózgu i podciągnąć czaszkę do góry. Każdą pęsetą przetnij czaszkę w płaszczyźnie strzałkowej w kierunku przodu, a następnie naciąć bocznie, aby uwolnić fragmenty czaszki.Następnie podnieś pień mózgu i ostrożnie przetnij opony mózgowe i nerwy czaszkowe, aż mózg całkowicie wyjdzie z czaszki. Napełnij 35-milimetrową szalkę Petriego stopionym roztworem agarozy utrzymywanym w płynie w temperaturze 42 stopni Celsjusza. Następnie szybko przenieś elektroporowany mózg do naczynia wypełnionego agarozą za pomocą wcześniej przeciętej pipety transferowej.Wymieszaj agarozę metalowym patyczkiem, aby utrzymać mózg w środku studzienki, aby zapobiec zapadnięciu się i ustawić mózg w rostralnej płaszczyźnie ogonowej równolegle do naczynia. Przestań mieszać, gdy agaroza zacznie krzepnąć, aby uniknąć uszkodzenia mózgu. Czekając, aż osadzająca się agaroza zestali się, przenieś 750 mikrolitrów pożywki hodowlanej uzupełnionej N2 do każdej studzienki z sześciodołkową płytką hodowlaną zgodnie z liczbą mózgów do przetworzenia.I umieść 30-milimetrową wkładkę membranową w każdej studni wypełnionej podłożem. Użyj żyletki, aby przeciąć agarozę otaczającą mózg, tworząc prostokątny blok, pozostawiając margines od jednego do dwóch milimetrów wokół mózgu. Upewnij się, że rostralna część mózgu jest prostopadła do przedniej granicy bloku, aby ułatwić orientację w kolejnych krokach sekcji.Przyklej blok agarozy na platformie wibratomu, krawędzią rostralną skierowaną w dół i krawędzią brzuszną skierowaną w stronę użytkownika. Przetnij mózg na skrawki koronalne, aby uzyskać skrawki o grubości 250 mikronów w czterech stopniach Celsjusza. Za pomocą wysterylizowanych szpatułek zbierz dwie do trzech sekcji zawierających MGE i umieść wszystkie skrawki mózgu jednego zwierzęcia na pojedynczej 30-milimetrowej wkładce membranowej.Ostrożnie unikając nakładania się sekcji. Umieść płytkę hodowlaną w wentylowanym, sterylnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy wilgotności 60% i pięcioprocentowej zawartości CO2 przez 48 lub 72 godziny. Po pożądanym czasie inkubacji przenieś interesujące Cię sekcje do ośmiokomorowego szkiełka nakrywkowego wypełnionego trzema do pięciu mikrolitrami pożywki hodowlanej.Umieść szkiełko nakrywkowe w komorze środowiskowej, podłącz je do odwróconego wirującego dysku konfokalnego, wyposażonego w oprogramowanie do akwizycji wspomaganej komputerowo, aby skonfigurować sesję obrazowania poklatkowego. Interneurony elektroporowane w E 13,5 z eksperymentalnym plazmidem wyrażającym kasetę pomidora TD i SH RNA ukierunkowane na gen będący przedmiotem zainteresowania obserwuje się w migracji stycznej w organotypowym wycinku mózgu uzyskanym z zarodka myszy DLX5 6Cre RCEE GFP po 48 godzinach hodowli. Interneurony wizualizowano za pomocą poklatkowego obrazowania na żywo przez osiem godzin.W tym przykładzie ten sam elektroporowany interneuron jest widoczny w procesie nukleokinezy. Podczas migracji stycznie w korze równolegle do powierzchni skórki. Neuron początkowo wykazuje wydłużone ciało komórkowe w procesie nukleokinezy.A także proces końcowy i rozgałęziony proces wiodący. Po trzech godzinach obrazowania na żywo nukleokineza jest zakończona. Proces końcowy został cofnięty, a proces wiodący polega na wydłużeniu dwóch długich gałęzi.Po pięciu godzinach i 30 minutach jedna z wiodących gałęzi procesu cofnęła się, a ciało komórki neuronu przesunęło się do przodu o około 10 mikronów. W końcu, po ośmiu godzinach obrazowania, migracja została wstrzymana, neuron ponownie przedłużył swój proces wiodący i pojawił się proces końcowy. Ale jądro jeszcze nie posunęło się do przodu.Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przez cały możliwy czas utrzymywać sterylne środowisko. Tak więc, zgodnie z tymi procedurami, można wykonać inne metody, takie jak elektroporacje MG, a następnie eksplantaty, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące odpowiedzi w celu wyjaśnienia dynamicznych procesów cytoszkieletu zachodzących podczas migracji neuronów na poziomie ultrakomórkowym.

ex-utero-electroporation-organotypic-slice-cultures-embryonic-mouse

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Przedstawiamy metodę przygotowania organotypowych skrawków embrionów myszy w połowie okresu gestacji do hodowli i obrazowania time-lapse wzrostu nerwów obwodowych.

Organotypowa hodowla skrawków embrionów myszy wykazujących ekspresję GFP do obrazowania w czasie rzeczywistym wzrostu nerwów obwodowych

Opisano metodę przygotowania organotypowych skrawków z embrionalnego śródmózgowia myszy w stadium E12.5. Organotypowe hodowle skrawków mogą być wykorzystywane do obserwacji zachowania neuronów dopaminergicznych lub innych neuronów z brzusznej części śródmózgowia.

Organotypowe hodowle plastrów embrionalnego brzusznego śródmózgowia: system do badania rozwoju neuronów dopaminergicznych in vitro

W celu przeprowadzenia szybkiej oceny funkcji genów w rozwoju kory mózgu opisujemy metody obejmujące elektroporację ex vivo plazmidów koekspresujących inhibicyjne RNA (RNAi) i GFP w zarodkowej korze mysiej. Protokół ten nadaje się do badania różnych aspektów neurorozwoju, takich jak neurogeneza, migracja neuronów oraz morfogeneza neuronów, w tym wzrost dendrytów i aksonów.

Metody badania morfogenezy neuronalnej: Elektroporacja RNAi ex vivo w embrionalnej korze mózgu myszy

Źródło: Wiegreffe, C., et. al.,  Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu {{}}W macicy elektroporacji. J. Vis. exp.{{TAG_ 44}} (2017) Ten film przedstawia poklatkową mikroskopię konfokalną w celu obserwacji radialnej migracji neuronów korowych ze strefy podkomorowej do płytki korowej za pomocą promieniowych rusztowań glejowych w transdukowanych wycinkach mózgu myszy embrionalnych.

Obrazowanie poklatkowe migracji radialnej neuronów korowych w transdukowanych wycinkach mózgu embrionalnego myszy

Źródło: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineerical Interneuron Pregenitors into Early Postnatal Mouse Brains. J. Vis. Exp. (2019 rok)Ten film przedstawia procedurę wstrzykiwania wektora plazmidowego przenoszącego interesujący nas gen do progenitorów interneuronów w embrionalnym wycinku mózgu, a następnie elektroporacji w celu wejścia plazmidu i ekspresji genu. Te zmodyfikowane komórki progenitorowe mogą być później wykorzystane do leczenia zaburzeń mózgu.

Transfer genów wspomagany elektroporacją osadzony w agarozie w progenitorach interneuronów kory myszy

Migracja neuroblastów jest fundamentalnym wydarzeniem w neurogenezie poporodowej. Opisujemy protokół skutecznego znakowania neuroblastów za pomocą elektroporacji poporodowej in vivo i późniejszej wizualizacji ich migracji za pomocą obrazowania poklatkowego ostrych wycinków mózgu. Dołączamy opis do ilościowej analizy dynamiki neuroblastów za pomocą śledzenia wideo.

In vivo (in vivo) Poporodowa elektroporacja i obrazowanie poklatkowe migracji neuroblastów w ostrych wycinkach mózgu myszy

Tutaj prezentujemy protokół dostarczający narzędzie do badania mechanizmów regulacyjnych określonych genów podczas rozwoju hipokampa. Zastosowanie elektroporacji ex utero i organotypowej hodowli plastrów pozwala na regulację w górę i w dół ekspresji interesujących genów w pojedynczych komórkach i śledzenie ich losów podczas rozwoju.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowa hodowla warstwowa tkanki hipokampa myszy

Ten manuskrypt zawiera protokoły, które wykorzystują elektroporację in utero (IUE) do opisania strukturalnej łączności neuronów na poziomie pojedynczej komórki i pobudliwości neuronów znakowanych fluorescencyjnie. Histologia służy do charakteryzowania projekcji dendrytycznych i aksonalnych. Zapis całych komórek w ostrych wycinkach służy do badania pobudliwości.

In Utero (w macicy) Podejścia elektroporacyjne do badania pobudliwości subpopulacji neuronalnych i połączeń pojedynczych komórek

Ten protokół dostarcza instrukcji do bezpośredniej obserwacji promieniście migrujących neuronów korowych. Elektroporacja in utero, organotypowa hodowla plastrów i poklatkowe obrazowanie konfokalne są łączone w celu bezpośredniego i dynamicznego badania skutków nadekspresji lub regulacji w dół genów będących przedmiotem zainteresowania w migrujących neuronach oraz analizy ich różnicowania podczas rozwoju.

Poklatkowe obrazowanie konfokalne migrujących neuronów w organotypowej kulturze warstwowej embrionalnego mózgu myszy przy użyciu elektroporacji in utero

Ten protokół demonstruje prostą i solidną metodę badania dynamiki wzrostu aksonów in situ i stożka wzrostu. Opisano w nim, w jaki sposób przygotować ex vivo fizjologicznie istotne ostre wycinki mózgu i przedstawiono przyjazny dla użytkownika potok analizy.

In Situ Wizualizacja wzrostu aksonów i dynamiki stożków wzrostu w ostrych kulturach embrionalnych wycinków mózgu ex vivo

Podczas rozwoju kory mózgowej, neurony i komórki glejowe pochodzą ze strefy komorowej wyściełającej komorę i migrują w kierunku powierzchni mózgu. W proces ten zaangażowanych jest wiele genów. Protokół ten wprowadza technikę obrazowania poklatkowego migrujących neuronów i komórek progenitorowych glejowych.

Obrazowanie poklatkowe migrujących neuronów i progenitorów glejowych w embrionalnych wycinkach mózgu myszy

Poznaj metodę elektroporacji ex utero i organotypowych kultur warstwowych mózgów myszy do obrazowania migrujących interneuronów GABA-ergicznych. Technika ta umożliwia badanie wpływu mutacji genowych na rozwój mózgu.

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych (Wideo) | JoVE Journal

Ex Utero Elektroporacja i organotypowe kultury warstwowe embrionalnych mózgów myszy do obrazowania na żywo migrujących interneuronów GABA-ergicznych

Przeglądaj więcej filmów