Name: Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Poznaj model uszkodzeń neuronów sensorycznych Drosophila z wykorzystaniem obrazowania in vivo i laserowej dwufotonowej aksonomii. Ta metoda umożliwia szybkie i tanie przesiewanie czynników neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Jessice Goldshteyn za wsparcie techniczne. Praca w laboratorium Song jest finansowana przez R00NS088211 grantowy NIH oraz Nagrodę za Rozwój Nowego Programu Centrum Badań nad Niepełnosprawnością Intelektualną i Rozwojową (IDDRC).

1. Przygotowanie płytek i butelek do hodowli
<ol>
	<li>Przygotowanie talerzy agarowych z sokiem winogronowym
	<ol>
		<li>Dodaj 10 g proszku agarowego, 200 ml soku winogronowego i 192 ml ddH2O do zlewki i mikrofalówki przez około 4-5 minut, mieszając z przerwami, aż agar całkowicie się rozpuści.</li>
		<li>W dygestorium schłodzić roztwór do temperatury ok. 60 °C. Dodać 4,2 ml 95% etanolu i 4,0 ml lodowatego kwasu octowego. Doprowadzić całkowitą objętość roztworu do 400 ml za pomocą ddH2O. Dobrze wymieszać.</li>
		<li>Na każdą płytkę o średnicy 35 mm dodaj około 2-3 ml roztworu. Przygotuj około 120-150 talerzy, aby uzyskać łącznie 400 ml roztworu agaru z sokiem winogronowym.</li>
		<li>Odczekaj 10 minut, aby ostudzić płytki i zestalić roztwór agaru. Zapakuj talerze agarowe z sokiem winogronowym w samozamykające się torebki strunowe i przechowuj w temperaturze 4°C do wykorzystania w przyszłości.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie butelek z kulturą Drosophila
	<ol>
		<li>Za pomocą ostrza przebij trójkątny otwór o długości 1,5 cm z boku na jednej ściance butelki z kulturą Drosophila i wypełnij otwór kulką bawełny o średnicy 2-2,5 cm w celu wentylacji.</li>
		<li>Zatkaj butelkę talerzem agarowym z sokiem winogronowym uzupełnionym około 0,5cm3 pasty drożdżowej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Kolekcja larw Drosophila
<ol>
	<li>Ustaw krzyżówki dorosłych much
	<ol>
		<li>Umieść 10 dziewiczych samic i 5 dorosłych samców much razem w butelce hodowlanej zatkanej talerzem z agarem z sokiem winogronowym.</li>
		<li>Umieść dno butelki do góry w temperaturze 25°C, aby muchy złożyły jaja na talerzu z sokiem winogronowym. Zmieniaj talerz pastą drożdżową przynajmniej raz dziennie. W przypadku 2-godzinnego okresu zbioru, który pozwala na zbieranie larw o jednorodnym stadium rozwojowym, należy rozpocząć od ponad 20 dziewiczych samic i 10 samców w kroku 2.1.1.</li>
		<li>Wyhodować szalkę w temperaturze 25°C na 60-milimetrowej szalce Petriego z mokrą chusteczką, na przykład nasączoną 0,5% roztworem kwasu propionowego. Ułóż tkankę tak, aby nie blokowała przepływu tlenu. 
		UWAGA: Roztwór kwasu propionowego służy do utrzymania wilgotności w naczyniu i uniknięcia rozwoju pleśni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbieraj larwy w określonym wieku
	<ol>
		<li>Użyj pary kleszczy, aby przenieść larwy w pożądanym stadium, na przykład larwy w 2. do 3. stadium po 48-72 godzinach od złożenia jaj (AEL), na nową płytkę agarową z sokiem winogronowym bez pasty drożdżowej.</li>
		<li>Usuń drożdże ze skóry larw, pozwalając im czołgać się po nowej płytce, aby zapobiec potencjalnym zakłóceniom drożdży podczas aksotomii laserowej i obrazowania. Alternatywnie, dokładnie oczyść larwy, myjąc je w naczyniu z PBS i krótko susząc na kawałku bibuły.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Uszkodzenie dwufotonowe i obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Konfiguracja mikroskopu 
	UWAGA: Do tego eksperymentu użyto konfokalnego laserowego mikroskopu skaningowego z laserem dwufotonowym, ale inne systemy o równoważnej konfiguracji również wystarczą. Laser dwufotonowy (930 nm) został użyty do zadawania obrażeń, a laser argonowy (488 nm) został użyty do konfokalnego obrazowania GFP.
	<ol>
		<li>Na początku każdej sesji włącz laser dwufotonowy i/lub laser konfokalny oraz mikroskop. Otwórz oprogramowanie do obrazowania.</li>
		<li>W przypadku uszkodzeń dwufotonowych należy ustawić następujące parametry obrazowania GFP za pomocą lasera dwufotonowego o długości fali 930 nm (1 950 mW).
		<ol>
			<li>Wybierz tryb skanowania linii. Otwórz otwór do końca. Zwiększ intensywność lasera do ~20% (390 mW).</li>
			<li>Wybierz 512 x 512 jako skan klatek. Użyj maksymalnej szybkości skanowania (zwykle przy czasie zatrzymania piksela wynoszącym 0,77 μs). Upewnij się, że średnia liczba wynosi 1, a głębia bitowa wynosi 8 bitów.</li>
			<li>Ustaw wzmocnienie na ~750, a przesunięcie na 0.</li>
			<li>Zapisz ten wstępnie ustawiony protokół eksperymentalny jako ablację 2P GFP 930, co pozwoli na łatwe ponowne wykorzystanie w przyszłych eksperymentach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>W przypadku obrazowania konfokalnego należy ustawić następujące parametry obrazowania GFP za pomocą lasera argonowego przy długości fali 488 nm:
		<ol>
			<li>Wybierz kartę Akwizycja, a następnie Stos Z.</li>
			<li>W sekcji "Laser" włącz zasilanie lasera argonowego 488 nm.</li>
			<li>Przejdź do Kanały, wybierz laser 488 mm i zwiększ moc lasera do 5-10%. Do otworu użyj przewiewnej jednostki 1-2 (AU). Ustaw wzmocnienie na 650.</li>
			<li>W trybie akwizycji wybierz 1024 x 1024 jako skanowaną klatkę, użyj maksymalnej szybkości skanowania, średniej liczby 2 i głębi bitowej 8 bitów.</li>
			<li>Zapisz ten wstępnie ustawiony protokół eksperymentalny jako obrazowanie GFP.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Znieczulenie larw eterem dietylowym i mocowaniem
	<ol>
		<li>W dygestorii umieść szklane naczynie o średnicy 60 mm w plastikowej szalce Petriego o średnicy 15 cm. Złóż i połóż kawałek bibuły na dnie szklanego naczynia, a następnie połóż na chusteczce talerz z agarem z sokiem winogronowym. Dodaj eter dietylowy do szklanego naczynia do punktu, w którym bibułka jest nasączona i w naczyniu pozostaje warstwa ciekłego eteru. Trzymaj pokrywę założoną przez cały czas.</li>
		<li>Przygotuj szkiełko z jedną kroplą oleju halocarbon 27 w środku. Dodaj 4 plamy smaru próżniowego na cztery rogi szkiełka, aby później podeprzeć szkiełko nakrywkowe.</li>
		<li>Za pomocą kleszczy podnieś oczyszczoną larwę i umieść ją na płytce agarowej w szklanym naczyniu o średnicy 60 mm. Przykryj szklane naczynie pokrywką i poczekaj, aż larwa przestanie się poruszać. W przypadku urazu/obrazowania PNS wyjmij larwę, gdy tylko jej ogon przestanie drgać. W przypadku OUN poczekaj, aż cała larwa stanie się nieruchoma, zwłaszcza segmenty głowy. 
		UWAGA: Czas ekspozycji na eter ma kluczowe znaczenie. Zobacz Dyskusja.</li>
		<li>Ostrożnie podnieś znieczuloną larwę i umieść ją głową do pozycji pionowej w kropli oleju halowęglowego na zjeżdżalni. Dodaj szkiełko nakrywkowe na wierzchu szkiełka. Użyj delikatnego nacisku, aby docisnąć szkiełko nakrywkowe, aż dotknie larwy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A).</li>
		<li>Dostosuj pozycję larwy, delikatnie popychając szkiełko nakrywkowe w lewo lub w prawo, aby zwinąć larwę, tak aby interesujący neuron/akson/dendryt znajdował się na górze i najbliżej soczewki mikroskopu.</li>
		<li>W przypadku uszkodzenia PNS zamontuj larwę grzbietową stroną do góry, tak aby obie tchawice były widoczne. Następnie obróć larwę ~30 stopni w lewo, aby uszkodzić aksony neuronów klasy III da (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B i 1C), 90 stopni w celu uszkodzenia aksonów neuronów klasy IV da (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B i 1E) lub ~30 stopni w celu uszkodzenia dendrytów neuronów klasy IV da (<silna klasa = "xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>W przypadku uszkodzenia ośrodkowego układu nerwowego należy ustawić larwę idealnie brzuszną stroną do góry (<silna klasa="xfig">Rysunek 3A), tak aby obszar zainteresowania znajdował się najbliżej soczewki mikroskopu w płaszczyźnie z.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Uraz spowodowany laserem dwufotonowym
	<ol>
		<li>Umieść szkiełko z larwą pod mikroskopem i zabezpiecz je na miejscu za pomocą uchwytu szkiełka na stoliku. Użyj obiektywu 10X (0,3 NA), aby znaleźć larwę.</li>
		<li>Dodaj 1 kroplę oleju do obiektywów na szkiełko nakrywkowe, przełącz się na obiektyw 40X (1,3 NA) i wyreguluj ostrość.</li>
		<li>Przełącz się w tryb skanowania i ponownie użyj eksperymentalnego protokołu 2P GFP 930 Ablation. Upewnij się, że otwór jest całkowicie otwarty. 
		UWAGA: Konfiguracja musi być zoptymalizowana w oparciu o poszczególne systemy.</li>
		<li>Uruchom tryb Na żywo, aby zlokalizować obszar zainteresowania (ROI) i dostosuj ustawienia, aby uzyskać dobrą jakość obrazu przy odpowiednim powiększeniu. 
		UWAGA: Celem tego kroku jest znalezienie neuronu/aksonu/dendrytu do uszkodzenia, a nie wykonanie obrazu o najlepszej jakości. Dlatego użyj minimalnych ustawień wystarczających do wizualizacji obszaru docelowego, aby uniknąć prześwietlenia lub fotowybielania.</li>
		<li>Zatrzymaj skanowanie na żywo, aby przycisk Przytnij stał się dostępny. Niech nieruchomy obraz posłuży jako mapa drogowa. Wybierz funkcję Crop (Przytnij) i dostosuj okno skanowania, aby ustawić ostrość na celu, który ma zostać zraniony.</li>
		<li>Zmniejsz zwrot z inwestycji, aby był rozmiarem potencjalnego miejsca urazu. Na przykład wystarczy pokryć szerokość aksonu lub dendrytu, aby zapewnić precyzję urazu i zmniejszyć uszkodzenia sąsiednich tkanek. W razie potrzeby powiększ ROI przed przycięciem, co pozwoli na dokładniejsze obrażenia.</li>
		<li>Otwórz nowe okno obrazowania. Zmniejsz prędkość skanowania i zwiększ intensywność lasera. Określ wzrost intensywności lasera na podstawie sygnału fluorescencji tkanek skanowanego w trybie Na żywo.</li>
		<li>Zazwyczaj ustawia się intensywność lasera dwufotonowego, zaczynając od 25% w przypadku uszkodzenia PNS i 50-100% w przypadku uszkodzenia VNC. W przypadku uszkodzenia aksonu PNS upewnij się, że natężenie lasera wynosi ~ 480 mW, a czas przebywania pikseli wynosi 8.19 μs. W przypadku uszkodzenia aksonu VNC upewnij się, że intensywność lasera i czas przebywania pikseli wynoszą zwykle odpowiednio 965-1930 mW i 8.19-32.77 μs.</li>
		<li>Rozpocznij skanowanie ciągłe. Pozostaw kursor najeżdżający na przycisk Ciągłe. Uważnie obserwuj obraz i przerwij skanowanie, gdy tylko zauważysz drastyczny wzrost fluorescencji. 
		UWAGA: Pojawienie się kolca fluorescencji jest spowodowane autofluorescencją w miejscu urazu.</li>
		<li>Przełącz się z powrotem do trybu Na żywo, ponownie używając ustawień. Znajdź obszar zainteresowania, który właśnie został docelowy, dostosowując fokus. 
		UWAGA: Dobrym wskaźnikiem udanego urazu jest pojawienie się małego krateru, struktury przypominającej pierścień lub zlokalizowanych szczątków w miejscu urazu.</li>
		<li>Przejdź do następnego neuronu i powtórz krok 3.3.5, aby uszkodzić wiele neuronów u jednego zwierzęcia. Lub powtórz krok 3.3.5, stopniowo zwiększając moc i/lub zmniejszając prędkość skanowania, jeśli początkowe obrażenia były niewystarczające. 
		UWAGA: W przypadku, gdy moc lasera jest zbyt wysoka, na obrazie skanowania na żywo po urazie widoczny będzie duży uszkodzony obszar. Zbyt duże obrażenia mogą spowodować śmierć larwy.</li>
		<li>Odzyskaj larwę, ostrożnie usuwając szkiełko nakrywkowe i przenosząc zranioną larwę na nową płytkę z pastą drożdżową. Wykop kilka jaskiń na płycie agarowej za pomocą kleszczy; Alternatywnie, zrób wyspę agaru na płytce zamiast używać całej płytki, aby zmniejszyć możliwość wypełzania larwy z płytki.</li>
		<li>Umieść płytkę na 60-milimetrowej szalce Petriego z mokrą chusteczką (nasączoną 0,5% roztworem kwasu propionowego) i kulturą w temperaturze pokojowej lub 25°C. 
		UWAGA: Larwa pozostanie w stadium larwalnym przez około dodatkowy dzień w temperaturze pokojowej (22°C) w porównaniu do 25°C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Obrazowanie konfokalne po urazie
	<ol>
		<li>Zobrazuj zranioną larwę w żądanych punktach czasowych, przygotowując larwę przy użyciu tej samej procedury znieczulenia i montażu, co w kroku 3.2, a następnie obrazując za pomocą lasera konfokalnego. 
		UWAGA: Zobrazuj larwę po 24 godzinach od urazu (AI), aby potwierdzić uszkodzenie aksonów i po 48 godzinach AI (neurony da klasy IV) lub 72 godziny AI (neurony klasy III da), aby ocenić regenerację.</li>
		<li>Zlokalizuj larwę za pomocą obiektywu 10X, a następnie przełącz się na obiektyw 25X (0,8 NA). Ponowne użycie eksperymentalnego protokołu obrazowania GFP.</li>
		<li>Kliknij przycisk Na żywo i znajdź ten sam neuron, który został wcześniej uszkodzony.</li>
		<li>Ustaw pierwszą i ostatnią pozycję Z w oknie skanowania na żywo. Naciśnij przycisk Stop i kliknij przycisk Rozpocznij eksperyment, aby uzyskać obraz stosu Z. 
		UWAGA: Upewnij się, że punkt normalizacji (punkt zbieżności aksonów) jest uwzględniony podczas robienia obrazów, aby możliwa była kwantyfikacja regeneracji (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1D, 1F) – jest to omówione w dalszej części sekcji analizy danych.</li>
		<li>Przełącz się na Przetwarzanie obrazu, wybierz właśnie zrobione zdjęcie i wygeneruj projekcję o maksymalnej intensywności. Zapisz zarówno obrazy projekcji z stosem z, jak i maksymalną intensywnością.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Analiza danych
<ol>
	<li>Przetwarzanie i ilościowe określanie obrazów za pomocą oprogramowania do obrazowania lub ImageJ.</li>
	<li>Kwantyfikacja regeneracji aksonów w PNS
	<ol>
		<li>Obliczać Procent regeneracji, który odnosi się do procentu regenerujących się aksonów wśród wszystkich aksonów, które zostały uszkodzone. Oceń akson jako regenerujący się, o ile odrasta poza miejsce urazu.</li>
		<li>Zmierz długość regeneracji, czyli wzrost długości aksonu. W przypadku kwantyfikacji za pomocą ImageJ użyj narzędzia Linia segmentowana, aby prześledzić zregenerowany akson, a następnie użyj opcji Zmierz w menu rozwijanym Analizuj, aby uzyskać długość linii reprezentującej zregenerowany akson.</li>
		<li>Obliczać Wskaźnik regeneracji, który jest wzrostem znormalizowanej długości aksonów. 
		UWAGA: Długość aksonu jest normalizowana przez odległość między ciałem komórki a punktem zbieżnym aksonu (DCAC) – długość aksonu/DCAC (<silna klasa="xfig">Rysunek 1D i 1F). Ta wartość pomaga wyjaśnić wszelki wzrost aksonów, który jest spowodowany łuszczeniem się larw. Wartość dodatnia oznacza regenerację, wartość 0 oznacza brak regeneracji, a wartość ujemna oznacza wycofanie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja regeneracji dendrytów
	<ol>
		<li>Obliczać Procent regeneracji, który jest procentem neuronów da wśród wszystkich odciętych, które wykazują oczywisty odrost dendrytów. 
		UWAGA: Odrost dendrytów jest oceniany jako dodatni, jeśli nowe dendryty wyrastają z cofniętej łodygi dendrytycznej i poza miejsce urazu. Miejsce urazu jest określone przez punkty orientacyjne, a w niektórych przypadkach jest łatwo widoczne ze względu na szczątkową autofluorescencję wywołaną urazem.</li>
		<li>Obliczać Zwiększenie punktów rozgałęzień, które zlicza dodanie nowych punktów rozgałęzień dendrytycznych po urazie.</li>
		<li>Obliczać Zwiększenie całkowitej długości dendrytu, która jest skumulowaną długością wszystkich nowych dendrytów dodanych po urazie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kwantyfikacja regeneracji aksonów w CNS 
	UWAGA: Jeśli miejsce zmiany chorobowej wykazuje zwyrodnienie w pierwszym zobrazowanym punkcie czasowym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3B), zostanie ono uwzględnione w analizie długości i szybkości regeneracji.
	<ol>
		<li>Zmierz długość regeneracji, która jest długością odrastającego aksonu. 
		UWAGA: Odrastający akson pojedynczego miejsca zmiany jest identyfikowany jako pochodzący z pierwotnej trasy aksonu przed urazem.</li>
		<li>Obliczać Znormalizowana długość regeneracji, która normalizuje długość regeneracji do długości segmentu spoidła - podłużna odległość między spoidłami ("Y" w <silna klasa="xfig">Rysunek 3A i 3B). 
		UWAGA: Ta wartość pomaga skorygować wpływ różnic w wielkości larw.</li>
		<li>Obliczać Współczynnik regeneracji, który jest procentem segmentów regenerujących się wśród wszystkich segmentów, które zostały uszkodzone, aby odzwierciedlić zdolność regeneracji określonego genotypu.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Yakura, J. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYakura%2C+JS+%22Recovery+following+spinal+cord+injury%22">Recovery following spinal cord injury</a>. , (1996).</li>
<li>Harel, N. Y., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+regenerating+axons+recapitulate+developmental+guidance+during+recovery+from+spinal+cord+injury%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Can regenerating axons recapitulate developmental guidance during recovery from spinal cord injury?</a> Nature reviews. Neuroscience. 7, 603-616 (2006).</li>
<li>Jurewicz, A., Matysiak, M., Raine, C. S., Selmaj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Nogo-A%2C+an+inhibitor+of+axonal+regeneration%2C+as+a+biomarker+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurology%22%5BJournal%5D)">Soluble Nogo-A, an inhibitor of axonal regeneration, as a biomarker for multiple sclerosis.</a> Neurology. 68, 283-287 (2007).</li>
<li>Yiu, G., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+inhibition+of+CNS+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glial inhibition of CNS axon regeneration.</a> Nat Rev Neurosci. 7, 617-627 (2006).</li>
<li>Sun, F., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+intrinsic+barriers+for+axon+regeneration+in+the+adult+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Neuronal intrinsic barriers for axon regeneration in the adult CNS.</a> Curr Opin Neurobiol. , (2010).</li>
<li>Liu, B. P., Cafferty, W. B., Budel, S. O., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+regulators+of+axonal+growth+in+the+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Extracellular regulators of axonal growth in the adult central nervous system.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 361, 1593-1610 (2006).</li>
<li>Liu, K., Tedeschi, A., Park, K. K., He, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+intrinsic+mechanisms+of+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neuronal intrinsic mechanisms of axon regeneration.</a> Annu Rev Neurosci. 34, 131-152 (2011).</li>
<li>Schwab, M. E., Strittmatter, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nogo+limits+neural+plasticity+and+recovery+from+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Nogo limits neural plasticity and recovery from injury.</a> Curr Opin Neurobiol. 27, 53-60 (2014).</li>
<li>He, Z., Jin, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27151637">Intrinsic Control of Axon Regeneration.</a> Neuron. 90, 437-451 (2016).</li>
<li>Park, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Promoting+axon+regeneration+in+the+adult+CNS+by+modulation+of+the+PTEN%2FmTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway.</a> Science. 322, 963-966 (2008).</li>
<li>Geoffroy, C. G., Hilton, B. J., Tetzlaff, W., Zheng, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+an+Age-Dependent+Decline+in+Axon+Regeneration+in+the+Adult+Mammalian+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Evidence for an Age-Dependent Decline in Axon Regeneration in the Adult Mammalian Central Nervous System.</a> Cell Rep. 15, 238-246 (2016).</li>
<li>Geoffroy, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+PTEN+and+Nogo+Codeletion+on+Corticospinal+Axon+Sprouting+and+Regeneration+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Effects of PTEN and Nogo Codeletion on Corticospinal Axon Sprouting and Regeneration in Mice.</a> J Neurosci. 35, 6413-6428 (2015).</li>
<li>Jin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restoration+of+skilled+locomotion+by+sprouting+corticospinal+axons+induced+by+co-deletion+of+PTEN+and+SOCS3%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Restoration of skilled locomotion by sprouting corticospinal axons induced by co-deletion of PTEN and SOCS3.</a> Nat Commun. 6, 8074(2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+regeneration+induced+by+blockade+of+glial+inhibitors+coupled+with+activation+of+intrinsic+neuronal+growth+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Axonal regeneration induced by blockade of glial inhibitors coupled with activation of intrinsic neuronal growth pathways.</a> Exp Neurol. 237, 55-69 (2012).</li>
<li>Fang, Y., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+degeneration+and+regeneration%3A+insights+from+Drosophila+models+of+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+cell+and+developmental+biology%22%5BJournal%5D)">Axon degeneration and regeneration: insights from Drosophila models of nerve injury.</a> Annual review of cell and developmental biology. 28, 575-597 (2012).</li>
<li>Venken, K. J., Simpson, J. H., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+genes+and+cells+in+the+nervous+system+of+the+fruit+fly%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of genes and cells in the nervous system of the fruit fly.</a> Neuron. 72, 202-230 (2011).</li>
<li>Leyssen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid+precursor+protein+promotes+post-developmental+neurite+arborization+in+the+Drosophila+brain%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+journal%22%5BJournal%5D)">Amyloid precursor protein promotes post-developmental neurite arborization in the Drosophila brain.</a> The EMBO journal. 24, 2944-2955 (2005).</li>
<li>MacDonald, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+cell+corpse+engulfment+receptor+Draper+mediates+glial+clearance+of+severed+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The Drosophila cell corpse engulfment receptor Draper mediates glial clearance of severed axons.</a> Neuron. 50, 869-881 (2006).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+of+Drosophila+sensory+neuron+axons+and+dendrites+is+regulated+by+the+Akt+pathway+involving+Pten+and+microRNA+bantam%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Regeneration of Drosophila sensory neuron axons and dendrites is regulated by the Akt pathway involving Pten and microRNA bantam.</a> Genes Dev. 26, 1612-1625 (2012).</li>
<li>Song, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+axon+regeneration+by+the+RNA+repair+and+splicing+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Regulation of axon regeneration by the RNA repair and splicing pathway.</a> Nat Neurosci. 18, 817-825 (2015).</li>
<li>Kato, K., Forero, M. G., Fenton, J. C., Hidalgo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+regenerative+response+to+central+nervous+system+injury+is+enabled+by+pros-notch+and+pros-NFkappaB+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The glial regenerative response to central nervous system injury is enabled by pros-notch and pros-NFkappaB feedback.</a> PLoS Biol. 9, e1001133(2011).</li>
<li>Fang, Y., Soares, L., Teng, X., Geary, M., Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+Drosophila+model+of+nerve+injury+reveals+an+essential+role+of+Nmnat+in+maintaining+axonal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel Drosophila model of nerve injury reveals an essential role of Nmnat in maintaining axonal integrity.</a> Curr Biol. 22, 590-595 (2012).</li>
<li>Xiong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+turnover+of+the+Wallenda%2FDLK+kinase+regulates+a+retrograde+response+to+axonal+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein turnover of the Wallenda/DLK kinase regulates a retrograde response to axonal injury.</a> J Cell Biol. 191, 211-223 (2010).</li>
<li>Brace, E. J., DiAntonio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Models+of+axon+regeneration+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Models of axon regeneration in Drosophila.</a> Exp Neurol. 287, 310-317 (2017).</li>
<li>Hao, Y., Collins, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+mechanisms+for+axon+regeneration%3A+insights+from+injured+axons+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Intrinsic mechanisms for axon regeneration: insights from injured axons in Drosophila.</a> Curr Opin Genet Dev. 44, 84-91 (2017).</li>
<li>Galbraith, J. A., Terasaki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+damage+in+thick+specimens+by+multiphoton+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Controlled damage in thick specimens by multiphoton excitation.</a> Mol Biol Cell. 14, 1808-1817 (2003).</li>
<li>Sugimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+developmental+modes+and+lesion-induced+reactions+of+dendrites+of+two+classes+of+Drosophila+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct developmental modes and lesion-induced reactions of dendrites of two classes of Drosophila sensory neurons.</a> J Neurosci. 23, 3752-3760 (2003).</li>
<li>Yanik, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurosurgery%3A+functional+regeneration+after+laser+axotomy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neurosurgery: functional regeneration after laser axotomy.</a> Nature. 432, 822(2004).</li>
<li>Wu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+neuronal+regeneration+is+influenced+by+life+stage%2C+ephrin+signaling%2C+and+synaptic+branching%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 15132-15137 (2007).</li>
<li>Stone, M. C., Nguyen, M. M., Tao, J., Allender, D. L., Rolls, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+up-regulation+of+microtubule+dynamics+and+polarity+reversal+during+regeneration+of+an+axon+from+a+dendrite%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Global up-regulation of microtubule dynamics and polarity reversal during regeneration of an axon from a dendrite.</a> Mol Biol Cell. 21, 767-777 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Kang, H., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+axon+regeneration+and+muscle+reinnervation+in+young+adult+and+aged+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Motor axon regeneration and muscle reinnervation in young adult and aged animals.</a> J Neurosci. 33, 19480-19491 (2013).</li>
<li>Duan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subtype-specific+regeneration+of+retinal+ganglion+cells+following+axotomy%3A+effects+of+osteopontin+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Subtype-specific regeneration of retinal ganglion cells following axotomy: effects of osteopontin and mTOR signaling.</a> Neuron. 85, 1244-1256 (2015).</li>
<li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+a+repressible+cell+marker+for+studies+of+gene+function+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis.</a> Neuron. 22, 451-461 (1999).</li>
<li>Grueber, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Buss, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2+and+phosphacan+are+present+in+the+astroglial+scar+after+human+traumatic+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurol%22%5BJournal%5D)">NG2 and phosphacan are present in the astroglial scar after human traumatic spinal cord injury.</a> BMC Neurol. 9, 32(2009).</li>
<li>McKeon, R. J., Jurynec, M. J., Buck, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chondroitin+sulfate+proteoglycans+neurocan+and+phosphacan+are+expressed+by+reactive+astrocytes+in+the+chronic+CNS+glial+scar%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The chondroitin sulfate proteoglycans neurocan and phosphacan are expressed by reactive astrocytes in the chronic CNS glial scar.</a> J Neurosci. 19, 10778-10788 (1999).</li>
<li>Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+nanosurgery+and+cell+enucleation+using+a+picosecond+laser%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser.</a> J Microsc. 234, 1-8 (2009).</li>
<li>Hutson, M. S., Ma, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+and+cavitation+dynamics+during+pulsed+laser+microsurgery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo.</a> Phys Rev Lett. 99, 158104(2007).</li>
<li>Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+laser-induced+plasma+formation+in+pulsed+cellular+microsurgery+and+micromanipulation%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation.</a> Phys Rev Lett. 88, 078103(2002).</li>
<li>Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+nanoaxotomy+properties+and+their+effect+on+axonal+recovery+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans.</a> Opt Express. 16, 5963(2008).</li>
<li>O'Brien, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Tsai, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma-mediated+ablation%3A+an+optical+tool+for+submicrometer+surgery+on+neuronal+and+vascular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 20, 90-99 (2009).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neurosci. 7, 30(2006).</li>
<li>Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+a+low-budget+laser+axotomy+system+to+study+axon+regeneration+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Constructing a low-budget laser axotomy system to study axon regeneration in C. elegans.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Podczas zakładania krzyżówek muchowych liczba użytych samic i samców może się różnić w zależności od genotypów i liczby larw potrzebnych do określonych eksperymentów. W przypadku much WT typowa krzyżówka wykorzystuje 10 samic i 5 samców. Okno pobierania może być zawężone, w zależności od wymaganej dokładności wieku larw. Na przykład 2-godzinny okres zbierania da larwy o bardziej jednorodnej populacji. W takim przypadku użycie 20 lub więcej dziewiczych samic do założenia krzyżówek pomoże uzyskać wystarczającą ilość jaj. P...

Niezdolność aksonów do regeneracji po urazie ośrodkowego układu nerwowego (OUN), może prowadzić do trwałego niepełnosprawności u pacjentów, a także odgrywa rolę w nieodwracalnych deficytach neurologicznych w chorobach neurodegeneracyjnych1,2,3,4,5. Środowisko OUN, a także wewnętrzna zdolność neuronów do wzrostu, decyduje o tym, czy aksony są w stanie zregenerować się po urazie. Wykazano, że czynniki zewnątrzkomórkowe ze źródeł oligodendrocytów, astrogleju i fibroblastów hamują wzrost neuronów4,6,7,8, ale eliminacja tych cząsteczek pozwala tylko na ograniczone kiełkowanie5. Wewnętrzne sygnały regeneracyjne mogą wpływać na sukces regeneracyjny5,9 i stanowić potencjalne cele terapeutyczne, ale procesy te nadal nie są dobrze zdefiniowane na poziomie molekularnym. Zwiększenie sygnalizacji czynników troficznych lub eliminacja hamulców endogennych, takich jak klasa fosfatazy Pten <sup="xref">10, może w pewnych okolicznościach powodować regenerację aksonów. Kombinacje różnych metod, które okazały się indywidualnie skuteczne, również zapewniają do tej pory tylko ograniczoną ogólną regenerację11,12,13,14. W związku z tym istnieje pilna potrzeba zidentyfikowania dodatkowych ścieżek terapii celowanej. Oprócz inicjacji odrastania aksonów, to, czy i w jaki sposób aksony ponownie łączą się z właściwym celem, reformują specyficzność synaps i osiągają funkcjonalne odzyskiwanie, są ważnymi pytaniami bez odpowiedzi.
Podsumowując, obecne zrozumienie maszynerii dyktującej regenerację aksonów jest nadal bardzo fragmentaryczne. Częścią problemu jest techniczna trudność w badaniu regeneracji aksonów u ssaków w czasie rzeczywistym, co jest kosztowne, czasochłonne i trudne do przeprowadzenia badań genetycznych na dużą skalę. Z drugiej strony Drosophila melanogaster okazał się wyjątkowo potężnym systemem do badania złożonych zagadnień biologicznych. Muszka owocowa odegrała zasadniczą rolę w definiowaniu genów i szlaków sygnałowych, które są uderzająco konserwatywne u ludzi i była udanym modelem do badania ludzkich schorzeń, takich jak choroby neurodegeneracyjne, dzięki szerokim narzędziom genetyki molekularnej dostępnym do manipulowania funkcją genów15. W szczególności muszki owocowe są uważane za idealne narzędzie do odkrywania genów zaangażowanych w uszkodzenia i odrastanie neuronów15,16. Opracowano kilka modeli uszkodzeń nerwowych much, w tym dźganie igłami brzucha głowy lub larwy dorosłego człowieka lub larwy za pomocą igieł, larwalne VNC lub zmiażdżenie nerwu kleszczami, laserowa akskotomia neuronów larwalnych, usunięcie neuronu receptora węchowego, uszkodzenie eksplantatu mózgu i uszkodzenie nerwu obwodowego przez odcięcie skrzydła15,17,18,19,20,21,22,23. Co ciekawe, ostatnie prace wykorzystujące modele uszkodzeń Drosophila pogłębiły naszą wiedzę na temat szlaków komórkowych i genetycznych wykorzystywanych przez układ nerwowy do reagowania na urazy nerwowe, z których niektóre okazały się konserwatywne u ssaków24,25. Ponownie podkreśla to użyteczność tego modelowego organizmu do identyfikacji nowych mechanizmów naprawy neuronów.
Opisany tutaj jest dwufotonowy laserowy model uszkodzenia neuronów czuciowych larw Drosophila. Laser dwufotonowy został po raz pierwszy użyty do cięcia aksonów u danio pręgowanego in vivo w 2003 roku26. W tym samym roku przeprowadzono pierwszą dendrytomię laserową u Drosophila przy użyciu pulsacyjnego lasera azotowego27. Wkrótce potem kilka laboratoriów C. elegans użyło laserów femtosekundowych do stworzenia modeli regeneracji aksonów28. W 2007 roku Wu i jego współpracownicy porównali i opisali różnice między uszkodzeniami laserowymi u C. elegans wywołanymi przez różne typy laserów29. W 2010 roku po raz pierwszy wykazano, że regeneracja aksonów po aksotomii laserowej występuje u Drosophila30. Opierając się na tej obszernej literaturze dotyczącej urazów laserowych, opracowaliśmy model uszkodzenia neuronów muchy przy użyciu lasera dwufotonowego, który umożliwia precyzyjną indukcję urazu w docelowych miejscach przy minimalnych zaburzeniach sąsiednich tkanek, zapewniając stosunkowo czysty system do badania zarówno wewnętrznych, jak i zewnętrznych właściwości neuroregeneracji z rozdzielczością pojedynczej komórki. W szczególności ustaliliśmy zestaw metod uszkodzeń neuronów czuciowych arborycji dendrytycznej (da) zarówno w obwodowym układzie nerwowym (PNS), jak i w OUN. Neurony da można podzielić na cztery odrębne klasy, wyróżniające się przede wszystkim złożonością rozgałęzień dendrytów: klasa od I do IV31. Nasza opublikowana praca pokazuje, że regeneracja neuronów da przypomina modele urazów ssaków na poziomie fenotypowym i molekularnym: neurony da wykazują właściwości regeneracyjne specyficzne dla klasy, przy czym neurony da klasy IV, ale nie klasy I lub III, wykazują regenerację w PNS; aksony neuronów klasy IV da regenerują się silnie na obrzeżach, ale ich potencjał regeneracyjny jest dramatycznie zmniejszony w OUN, przypominając w ten sposób neurony zwoju korzenia grzbietowego (DRG) u ssaków; zwiększenie aktywności mTOR poprzez delecję Pten lub nadekspresję Akt zwiększa regenerację aksonów w klasie CNS<sup="xref">19. Korzystając z tego modelu uszkodzeń, przeprowadziliśmy genetyczne badania przesiewowe i zidentyfikowaliśmy enzym przetwarzający RNA Rtca jako ewolucyjnie konserwatywny czynnik hamujący regenerację aksonów, łącząc uszkodzenie aksonów ze stresem komórkowym i modyfikacją RNA20.
W prezentowanym paradygmacie, uraz jest indukowany przez laserową aksotomię/dendriotomię larwalnych neuronów da IV lub III klasy, oznaczonych odpowiednio przez ppk-CD4-tdGFP lub 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80. Uraz wykonuje się na larwach w2-3 stadium rozwojowym około 48 - 72 godzin po złożeniu jaj (h AEL). W przypadku aksotomii PNS zmiana jest ukierunkowana na odcinek aksonu ~20 - 50 μm od ciała komórki, w przypadku aksotomii OUN na obszar o średnicy ~20 μm w złączu spoidła w VNC, a w przypadku dendriotomii do pierwotnych punktów rozgałęzień dendrytycznych. Ten sam neuron jest obrazowany po 8 - 24 godzinach od urazu (AI) w celu potwierdzenia całkowitej transsekcji, a po 48 - 72 godzinach AI w celu oceny regeneracji. Dzięki poklatkowemu obrazowaniu konfokalnemu można monitorować degenerację i regenerację poszczególnych aksonów/dendrytów, które zostały uszkodzone in vivo.

<table><tbody><tr><td>Eter dietylowy, odczynnik ACS, bezwodny</td><td>Acros Organics</td><td>AC615080010</td><td></td></tr><tr><td>Olej Halocarbon 27</td><td>Genesee Scientific</td><td>59-133</td><td></td></tr><tr><td>Solanka fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), 20x Koncentrat, pH 7,5, dostawca # E703-1L</td><td>VWR</td><td>97062-948&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Proszek agarowy, Alfa Aesar, 500GM</td><td>VWR</td><td>AAA10752-36</td><td></td></tr><tr><td>Sok winogronowy</td><td>Welch' s</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol 95% (odczynnik alkoholowy 95%)</td><td>VWR</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Kwas octowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Kwas propionowy</td><td>J.T.Baker</td><td>U33007</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe: prostokąty</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-D</td><td>50 mm X 22 mm</td></tr><tr><td>Laserowy mikroskop skaningowy Zeiss LSM 880</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td><td>Zen Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra II</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

model uszkodzeń drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

A Drosophila In Vivo Injury Model for Studying Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System

Zdolność do odrastania uszkodzonych neuronów reguluje neuroregenerację i regenerację funkcjonalną po urazie układu nerwowego. W ciągu ostatnich kilku dekad zidentyfikowano różne wewnętrzne i zewnętrzne czynniki hamujące zaangażowane w ograniczenie regeneracji aksonów. Jednak samo usunięcie tych hamujących sygnałów jest niewystarczające do udanej regeneracji, co wskazuje na istnienie dodatkowej maszynerii regulacyjnej. Muszka owocowa Drosophila melanogaster ma identycznie zachowane geny i szlaki sygnałowe z kręgowcami, w tym z ludźmi. Łącząc potężny zestaw narzędzi genetycznych much z dwufotonową laserową aksotomią/dendriotomią, opisujemy tutaj model uszkodzenia neuronów Drosophila sensory neuron – arboryzacja dendrytyczna (da) jako platformę do systematycznych badań przesiewowych pod kątem nowych regulatorów regeneracji. Krótko mówiąc, paradygmat ten obejmuje a) przygotowanie larw, b) indukcję zmian chorobowych do dendrytów lub aksonów za pomocą lasera dwufotonowego, c) obrazowanie konfokalne na żywo po urazie oraz d) analizę danych. Nasz model umożliwia wysoce powtarzalne uszkodzenie pojedynczych znakowanych neuronów, aksonów i dendrytów dobrze zdefiniowanych podtypów neuronów, zarówno w obwodowym, jak i ośrodkowym układzie nerwowym.

Neurony Da wykazują zróżnicowany potencjał regeneracyjny pomiędzy obwodowym a ośrodkowym układem nerwowym, a także specyficzność klasową. Stwarza to unikalne możliwości przesiewania nowych czynników niezbędnych do regeneracji aksonów (wykorzystując uszkodzenia PNS w klasie IV), a także tych, które hamują regenerację (w przypadku uszkodzeń CNS w klasie IV oraz uszkodzeń PNS w klasie III).
Regeneracja aksonów w obwodowym układzie ner...

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący model uszkodzenia neuronów neuronu czuciowego Drosophila - dendrytycznej arboryzacji (da), który łączy obrazowanie na żywo in vivo, dwufotonową laserową aksotomię/dendriotomię oraz potężny zestaw narzędzi genetycznych much, jako platformę do badań przesiewowych potencjalnych promotorów i inhibitorów neuroregeneracji.

Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

The regrowth capacity of damaged neurons governs neuroregeneration and functional recovery after nervous system trauma. Over the past few decades, various ...

Ogólnym celem tego modelu uszkodzenia neuronów czuciowych larw Drosophila jest połączenie obrazowania na żywo in vivo, aksotomii laserowej z dwoma fotonami/dendryriotomią oraz potężnego zestawu narzędzi genetycznych much w platformę do badań przesiewowych potencjalnych promotorów i inhibitorów neuroregeneracji. Metoda ta pomoże odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neurogeneracji, na przykład poprzez identyfikację nowego wewnętrznego i zewnętrznego regulatora neurogeneracji, zarówno w obwodowym, jak i centralnym układzie nerwowym. Główną zaletą tej techniki jest to, że nowi kandydaci do neuroregeneracji mogą być badani przesiewowo w łatwy, szybki i tani sposób.Chociaż system ten może zapewnić wgląd w neuroregenerację, może być również stosowany do innych systemów, takich jak choroby neurodegeneracyjne i interakcje neuron-glej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ różne konfiguracje eksperymentalne, które wykorzystują różne typy neuronów, są używane do modelowania regeneracji aksonów i dendrytów. Do zbierania larw przygotuj butelki hodowlane w następujący sposób.Użyj ostrza, aby przebić 1,5-centymetrowy otwór w jednej ściance butelki z kulturą Drosophila i wypełnij otwór wacikiem w celu wentylacji. Następnie nałóż odrobinę pasty drożdżowej na talerz agarowy z sokiem winogronowym i użyj płytki, aby zatkać główny otwór butelki. W takiej butelce umieść krzyżówkę 10 dziewiczych samic i pięciu samców i codziennie zmieniaj talerz podczas hodowli w temperaturze 25 stopni Celsjusza.Wyhodować zebrane płytki z mokrą chusteczką nasączoną łagodnym kwasem propionowym, aby zapobiec zanieczyszczeniu. Z hodowanych płytek zbierz larwy na wymaganym etapie za pomocą kleszczy. Delikatnie przenieś zebrane larwy na nowy talerz agarowy z sokiem winogronowym bez pasty drożdżowej.Po tym, jak oczyszczą się przez czołganie się, można je zobrazować. Aby rozpocząć każdą sesję obrazowania, włącz lasery obrazujące i mikroskop. W przypadku urazu należy użyć mikroskopu dwufotonowego.W oprogramowaniu do obrazowania ustaw laser tak, aby wyświetlał GFP na 930 nanometrach z maksymalną mocą 1950 miliwatów. Wybierz tryb skanowania linii i otwórz otwór do końca. Następnie zwiększ intensywność lasera do około 20% pełnej mocy, aby spowodować uraz PNS, lub do 50% do 100% pełnej mocy, aby spowodować uraz VNC.Następnie wybierz ramkę o rozmiarze 512 pikseli kwadratowych do skanowania i użyj najwyższej możliwej prędkości skanowania. Użyj średniej liczby jeden i głębi bitowej wynoszącej osiem bitów. Następnie ustaw wzmocnienie na około 750 i ustaw przesunięcie na zero.Teraz zapisz ten wstępnie ustawiony protokół eksperymentalny jako ablację 2P GFP 930, co pozwala na łatwe ponowne wykorzystanie w dalszych eksperymentach. Do obrazowania po urazie należy użyć mikroskopu konfokalnego. Najpierw ustaw laser argonowy na 488 nanometrach.Wybierz kartę Akwizycja, a następnie wybierz pozycję Stos Z. W obszarze Laser włącz laser argonowy o długości fali 488 nanometrów. Następnie przejdź do Kanały, wybierz laser 488 nanometrów i zwiększ moc lasera do pięciu do 10%W przypadku otworka użyj opcji dla jednej lub dwóch jednostek powierzchni.Następnie ustaw wzmocnienie na 650. Teraz w trybie akwizycji wybierz 1024 piksele kwadratowe jako skan klatki. Użyj maksymalnej szybkości skanowania.Użyj średniej liczby dwóch i głębi bitowej wynoszącej osiem bitów. Zapisz ten protokół przedeksperymentalny jako obrazowanie GFP. Zacznij od znieczulenia larw.W dygestorium umieść 60-milimetrowe szklane naczynie w 15-centymetrowej plastikowej szalce Petriego. Następnie złóż kawałek bibuły i umieść go w szklanym naczyniu. Umieść płytkę z agarem winogronowym na tkance, po dodaniu eteru dietylowego.Następnie na szkiełku umieść jedną kroplę oleju Halocarbon 27 na środku i umieść plamę smaru próżniowego na każdym z czterech rogów. Następnie za pomocą kleszczy przenieś jedną larwę na płytkę agarową i przykryj szklane naczynie, aby znieczulić larwę. Gdy tylko larwa przestanie się poruszać, ostrożnie przenieś ją do oleju halowęglowego, trzymając głowę w pozycji pionowej.Następnie umieść szkiełko nakrywkowe na szkiełku i delikatnie dociśnij, aż dotknie larwy. Następnie użyj delikatnej siły, aby przesunąć szkiełko nakrywkowe, aby przetoczyć komórki, które mają zostać poddane ablacji, do miejsca, w którym laser dwufotonowy najłatwiej w nie uderzy. Lokalizacja będzie się różnić w zależności od tego, jakie neurony są celem ataku.Teraz zabezpiecz zespół na stoliku mikroskopu dwufotonowego i skup się na interesujących nas komórkach za pomocą 40-krotnego obiektywu zanurzeniowego w olejku. W oprogramowaniu przełącz się w tryb skanowania i załaduj zapisany protokół. Upewnij się, że otwór jest całkowicie otwarty.Następnie w trybie na żywo uzyskaj dobre zdjęcie interesującego Cię regionu. Następnie zatrzymaj skanowanie na żywo, aby przycisk Przytnij stał się dostępny. Korzystając z funkcji Przytnij, dostosuj okno skanowania, aby skupić obszar docelowy tylko na potencjalnym miejscu urazu.Następnie otwórz nowe okno obrazowania. Teraz zmniejsz prędkość skanowania i zwiększ intensywność lasera. Następnie przełącz przycisk Ciągły, aby rozpocząć i zatrzymać skanowanie.Obserwuj uważnie. Gdy tylko nastąpi drastyczny wzrost kwitnienia, zakończ skanowanie. Następnie wróć do oryginalnego okna obrazowania i wybierz tryb na żywo, a następnie znajdź obszar, który był właśnie celem, dostosowując ostrość.Dobrym wskaźnikiem udanego urazu jest pojawienie się małego krateru, struktury przypominającej pierścień lub zlokalizowanych szczątków bezpośrednio w miejscu urazu. Jeśli moc lasera była zbyt wysoka, widoczny będzie duży uszkodzony obszar, co może być śmiertelne. Teraz ostrożnie usuń szkiełko nakrywkowe i przenieś zranioną larwę na nową płytkę z pastą drożdżową.Umieść płytkę w 60-milimetrowym naczyniu wraz z chusteczką nasączoną kwasem propionowym. Następnie przywróć płytkę do temperatury hodowli. Do późniejszego obrazowania larwy skorzystaj z zapisanej konfiguracji konfokalnej i zbierz obrazy stosu Z za pomocą obiektywu 25X.Pamiętaj, aby podać punkt normalizacji, aby można było określić ilościowo regenerację. Za pomocą opisanego protokołu badano regenerację neuronów DA klasy trzeciej i czwartej. Zazwyczaj trzy lub cztery neurony po prawej stronie segmentów brzusznych od A7 do A2 były uszkodzone.W szczególności celem były neurony DDAF klasy trzeciej i klasy czwartej V Prime ADA. Larwy zostały sfotografowane po 24, 48 i 72 godzinach od urazu. Po 24 godzinach dystalne aksony zwykle kończyły degenerację, a trzon aksonu był łatwo widoczny.Po 48 godzinach można było ocenić regenerację neuronów DA klasy czwartej. Około 70% tych neuronów zregenerowało się poza miejscem urazu. Nawet po 72 godzinach było jasne, że neurony DA klasy trzeciej nie odrosły.Oceniono to na podstawie wielokrotnych obserwacji stożków wzrostu, które utknęły w martwym punkcie. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować eksperyment, wykonać uszkodzenie dwufotonowe i ocenić wyniki. Po opanowaniu ta technika zajmuje 15 minut na larwę, jeśli jest wykonywana prawidłowo.Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby porównać eksperymentalny wzrost z odpowiednimi kontrolami, obok siebie. Po tej procedurze można przeprowadzić metodę taką jak barwienie immunologiczne, aby odpowiedzieć na więcej pytań, takich jak to, czy uszkodzenie aksonów może powodować translokację białka, powodując zmianę szlaku. Od momentu opracowania, technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie neuronauki do zbadania neuroregeneracji w neuronach czuciowych larw Drosophila.Wreszcie, nie zapominaj, że praca z eterem dietylowym może być niezwykle niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak znieczulenie larw w dygestorium.

a-drosophila-vivo-injury-model-for-studying-neuroregeneration

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Czynnikiem ograniczającym wykorzystanie oka dorosłych Drosophila w badaniach nad neurodegeneracją i biologią komórki jest trudność w obrazowaniu procesów wewnątrzkomórkowych. Opisujemy metodę preparowania pojedynczych ommatidiów w celu utworzenia właściwej pierwotnej hodowli komórek neuronalnych, która może być poddawana działaniu leków oraz zaawansowanemu obrazowaniu.

Disekcja i obrazowanie pojedynczego ommatidium Drosophila

Ten film opisuje dwufotonową laserową ablację aksonów u larwy Drosophila melanogaster oraz przykładowy protokół wywoływania obrażeń i obrazowania miejsca urazu.

Uszkodzenie neuronów wywołane laserem dwufotonowym: metoda obserwacji zwyrodnienia i regeneracji aksonów u larw Drosophila

Ten film demonstruje metodę wywoływania ukierunkowanego uszkodzenia neuronów u larw Drosophila za pomocą lasera o dużej mocy. Po umieszczeniu larwy pod mikroskopem, laser o małej mocy skanuje w poszukiwaniu neuronów fluorescencyjnych, a następnie zwiększa moc lasera w celu wywołania miejscowego uszkodzenia. Uraz potwierdza zwiększona fluorescencja i krater w miejscu urazu.

Wywoływanie ukierunkowanego uszkodzenia neuronów za pomocą lasera o dużej mocy u larwy Drosophila

Ten film pokazuje indukcję penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu w mózgu drosophila. Nowo wylęgłe muchy są selekcjonowane, znieczulane i umieszczane pod mikroskopem stereoskopowym wyposażonym we fluorescencję. Identyfikowany jest korpus grzyba wykazujący ekspresję GFP i wkładana jest szpilka Minutien w celu spowodowania obrażeń. Muchom pozwala się wyzdrowieć w celu dalszych badań.

Wywoływanie penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu u dorosłych much Drosophila

Opisano paradygmat uszkodzeń wykorzystujący brzuszny rdzeń nerwowy larw Drosophila do badania regeneracji i naprawy ośrodkowego układu nerwowego. Dźganie, a następnie laserowa skaningowa mikroskopia konfokalna w próbkach poklatkowych i utrwalonych, w połączeniu z analizą ilościową za pomocą celowo opracowanego oprogramowania i genetyki, są wykorzystywane do badania molekularnych mechanizmów regeneracji i naprawy OUN.

Paradygmat urazów do badania naprawy ośrodkowego układu nerwowego u Drosophila

Larwy Drosophila są atrakcyjnym systemem modelowym do obrazowania na żywo ze względu na ich przezroczyste naskórki i silną genetykę. Protokół ten opisuje, w jaki sposób wykorzystać jednowarstwowe urządzenie PDMS, zwane "chipem larwowym" do obrazowania na żywo procesów komórkowych w neuronach larw Drosophila w trzecim stadium rozwojowym.

Wykorzystanie chipów mikroprzepływowych do obrazowania na żywo i badania reakcji na urazy u larw Drosophila

Tutaj opisujemy prostą i powszechnie dostępną metodę uszkadzania nerwów segmentowych u larw Drosophila, aby uwidocznić i określić ilościowo neurodegenerację neuronów ruchowych w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larw trzeciego stadium rozwojowego.

Prosta metodologia mechanicznego urazu, metoda neuronów do badania zwyrodnienia neuronów ruchowych Drosophila

Ten protokół opisuje sekcję i barwienie immunologiczne tkanek mózgowych dorosłych Drosophila melanogaster. W szczególności protokół ten podkreśla wykorzystanie ciała grzyba Drosophila i neuronów fotoreceptorowych jako przykładowych podzbiorów neuronów, które można dokładnie wykorzystać do odkrycia ogólnych zasad leżących u podstaw wielu aspektów rozwoju neuronów.

Rozwarstwienie i barwienie immunofluorescencyjne neuronów ciała grzyba i fotoreceptorów w mózgach dorosłych Drosophila melanogaster

Prezentujemy protokół wykorzystujący zaawansowane podejście genetyczne do badań przesiewowych w kierunku mutantów wykazujących neurodegenerację u Drosophila melanogaster. Obejmuje on test wspinaczkowy, analizę histologiczną, mapowanie genów i sekwencjonowanie DNA, aby ostatecznie zidentyfikować nowe geny związane z procesem neuroprotekcji.

Genetyczne badania przesiewowe in vivo w celu identyfikacji nowych genów neuroprotekcyjnych u Drosophila melanogaster

Tutaj udostępniamy protokoły do przeprowadzenia trzech prostych testów degeneracji aksonów (śmierci aksonów) wywołanych urazem u Drosophila melanogaster, aby ocenić morfologiczne i funkcjonalne zachowanie odciętych aksonów i ich synaps.

Ocena morfologiczna i funkcjonalna aksonów i ich synaps podczas śmierci aksonów u Drosophila melanogaster

Ten artykuł zawiera szczegółowe protokoły zadawania penetrującego urazowego uszkodzenia mózgu (PTBI) dorosłym Drosophila i badania wynikającej z tego neurogenezy.

Stymulowanie i analiza neurogenezy dorosłych w centralnym mózgu Drosophila

Poznaj model uszkodzeń neuronów sensorycznych Drosophila z wykorzystaniem obrazowania in vivo i laserowej dwufotonowej aksonomii. Ta metoda umożliwia szybkie i tanie przesiewanie czynników neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym.

Model uszkodzeń Drosophila in vivo do badania neuroregeneracji w obwodowym i ośrodkowym układzie nerwowym

Przeglądaj więcej filmów