Name: Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 50 s
Description: Poznaj metodę implantacji komórek neuroblastoma sterowaną ultradźwiękami do gruczołu nadnerczowego myszy. Technika ta umożliwia tworzenie biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów ortotopowych bez otwartej chirurgii, poprawiając wiarygodność badań przedklinicznych i wspierając odkrywanie nowych leków przeciwnowotworowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca otrzymała wsparcie od Fundacji Roberta Wooda Johnsona/Amos Medical Faculty Development Program, Taubman Research Institute, oraz Sekcji Chirurgii Dziecięcej, The University of Michigan. Autorzy pragną podziękować Kimber Converso-Baran i dr Marcusowi Jarboe za pomoc w procedurach iniekcji ultradźwiękowych i platformie obrazowania. Dziękujemy Paulowi Trombleyowi za pomoc przy grafice figurek. Dziękujemy również Wydziałowi Radiologii Uniwersytetu Michigan za korzystanie z Centrum Obrazowania Molekularnego i Tumor Imaging Core, które są częściowo wspierane przez Comprehensive Cancer Center NIH, grant P30 CA046592. University of Michigan Physiology Phenotyping Core, który jest częściowo wspierany przez dotacje z NIH (OD016502) i Frankel Cardiovascular Center. Uwierzytelnianie linii komórkowych przeprowadzono w IDEXX RADIL Bioresearch Facilities, Columbia, MO. Dziękujemy Tammy Stoll, dr Rajenowi Mody i programowi onkologii guzów litych Mott. Nasi pacjenci i ich rodziny są wdzięczni za ich inspirację, odwagę i nieustanne wsparcie dla naszych badań.

Wszystkie prace zostały wykonane zgodnie z Instytucjonalną Komisją Rewizyjną Uniwersytetu Michigan (HUM 00052430) i są zgodne z procedurami zatwierdzonymi przez Uniwersytecką Komisję ds. Użytkowania i Opieki nad Zwierzętami (UCUCA). Zakład Laboratorium Medycyny Zwierząt (ULAM) nadzorował opiekę nad zwierzętami.
Wszystkie prace zostały wykonane za zgodą The University of Michigan Institutional Review Board (HUM 00052430) i są zgodne ze wszystkimi regulacjami komisji etyki badań na ludziach. Ludzkie komórki są uważane za materiał potencjalnie biologicznie niebezpieczny, więc przestrzegaj wszystkich specjalnych środków ostrożności i odpowiednich praktyk bezpieczeństwa biologicznego, które są wymagane przez twoją instytucję. Myszy NSG mają poważnie obniżoną odporność i są podatne na choroby wywoływane przez bakterie powszechnie występujące w środowisku. 
Zawsze należy stosować ścisłą sterylną technikę podczas przygotowywania materiałów do implantacji i wykonywania iniekcji.
1. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hoduj ugruntowane ludzkie linie komórek NB (SH-SY5Y, SK-N-BE2 i IMR32) w minimalnej pożywce niezbędnej, uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą, 2 mM glutaminy, 100 jednostek/ml penicyliny i 100 μg/ml streptomycyny. Uzupełnij komórki IMR32 o 1 mM pirogronian i 0,075% NaHCO3. Utrzymuj wszystkie komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i 70-80% konfluencji.</li>
	<li>Hoduj ludzkie linie komórek ES (TC32, A673,-25 i A4573) w pożywce RPMI uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 6 mM L-glutaminy. Utrzymuj wszystkie komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przy zbieganiu 70-80%.</li>
	<li>Wyślij wszystkie linie komórkowe do uwierzytelnienia. 
	UWAGA: Uwierzytelnianie komórek odbywa się w placówce zewnętrznej, zapoznaj się z potwierdzeniami.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pierwotnych komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta
<ol>
	<li>Za zgodą i zgodą pacjenta należy pobrać wyrzuconą ludzką tkankę nowotworową NB od pacjentów poddawanych resekcji chirurgicznej w celu kontroli miejscowej i transportu do laboratorium w roztworze do przechowywania tkanek w celu konserwacji. 
	UWAGA: Wszystkie próbki od pacjentów są pozbawione elementów pozwalających na identyfikację i traktowane zgodnie z wytycznymi Instytucjonalnej Komisji Rewizyjnej.</li>
	<li>Wygeneruj zawiesinę komórek rakowych (UMNBL001, UMNBL002) pochodzącą od pojedynczego pacjenta z tkanki nowotworowej za pomocą zestawu do dysocjacji guza. Przenieś około 0,5 g guza do 100-milimetrowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej 5 ml buforu RPMI, 200 μl enzymu H, 100 μl enzymu R i 25 μl enzymu A z zestawu do dysocjacji ludzkiego guza</li>.
	<li>Zmiel guz na małe kawałki (2-4 mm każdy) za pomocą nożyczek i kleszczy do tkanek. Wymieszaj te fragmenty z roztworami w kroku 2.2.</li>
	<li>Odpipetować mieszaninę guza do probówki dysocjacyjnej i zamknąć probówkę. Odwróć rurkę i przymocuj do tulei dysocjatora tkankowego. Uruchom program h_tumor_01.</li>
	<li>Zawiesinę komórek nowotworowych otrzymaną powyżej inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę na obrotowym stojaku z przerywanym rozcieraniem co 15 minut.</li>
	<li>Przenieś zawiesinę komórek do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml i dodaj 10 ml RPMI. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 314 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Usunąć supernatant i zawiesić osad w 5 ml RPMI. Przepuść ten roztwór przez sitko o wielkości 40 μm i zbierz odcedzony roztwór do świeżej stożkowej probówki o pojemności 50 ml. Umyj to sitko raz 5 ml pożywki RPMI i odwiruj mieszaninę o sile 314 x g przez 5 minut, aby zebrać granulkę.</li>
	<li>Zmierz gęstość komórek za pomocą hemacytometru15. Zawiesić otrzymany od góry osad w RPMI, aby uzyskać końcowe stężenie 4 × 105 komórek/10 μL. Weź 5 μl tej zawiesiny komórkowej i 5 μl matrigelu, aby przygotować 10 μl roztworu komórkowego do każdego wstrzyknięcia. 
	UWAGA: Ilość używanych obrotów na minutę zależy od pomiaru gęstości komórek. Na przykład, jeśli zmierzona gęstość komórek otrzymanego osadu wynosi 4 x 105 komórek, zawieś osad w 10 μL RPMI.</li>
</ol>
3. Znakowanie komórek rakowych lucyferazy
<ol>
	<li>Przygotować 10 ml pożywki transdukcyjnej z 5 ml supernatantu wirusowego EF1a-Luc2-IRES-mCherry i 5 ml pożywki z komórek macierzystych. Dodaj 7,5 μl 1x polybrene.</li>
	<li>Wymieszaj 5 × 106 komórek rakowych w pożywce transdukcyjnej i płytce w 100 mm bardzo niskiej płytce mocującej. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez noc. 
	UWAGA: Ponieważ stosowane są niskie płytki mocujące, komórki nie będą przylegać do płyty.</li>
	<li>Po upływie 24 godzin umieścić 100-milimetrową płytkę zawierającą komórki pod kapturem do hodowli tkankowej i przenieść mieszaninę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 314 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy. Przemyć osad komórkowy raz 1 ml soli fizjologicznej buforowanej 1x fosforanem (PBS) i zawiesić osad komórkowy w 1 ml HBSS zawierającym 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
	<ol>
		<li>Sortuj komórki lucyferazy na podstawie sygnału GFP-dodatniego w analizie sortowania komórek aktywowanego fluorescencją (FACS). Posortowane komórki umieścić na 100-milimetrowym szalku poddanym działaniu kultur tkankowych i utrzymywać w temperaturze 70-80% konfluencji, 37 °C i 5% CO2 do momentu, gdy będzie to wymagane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Potwierdź sygnał lucyferazy za pomocą zestawu do oznaczania lucyferazy. Płytka 10 x 104 posortowane komórki na basenik w kompatybilnej z iluminometrem 96-dołkowej płytce i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Po 24 godzinach doprowadzić 96-dołkową płytkę do temperatury pokojowej i dodać odczynnik Steady-Glo do pożywek hodowlanych w studzienkach w stosunku 1:1. Pozwól komórkom na lizę przez 5 minut i odczytaj luminescencję w spektrofotometrze.</li>
	<li>Umieścić naczynie o średnicy 100 mm pod okapem do hodowli tkankowych. Odrzucić pożywkę sklarowaną nad osadem. Umyj komórki raz 2 ml 1x PBS.</li>
	<li>Dodaj 2 ml 0,25% trypsyny i włóż naczynie o średnicy 100 mm do inkubatora na 2-3 minuty. Po 2-3 minutach sprawdź, czy komórki nie zostały usunięte pod mikroskopem i dodaj 8 ml RPMI, aby dezaktywować trypsynę.</li>
	<li>Zebrać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować przy 314 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad. Odrzucić supernatant. Umyj osad komórkowy 1 ml 1x PBS, zawiesić osad w 5 ml RPMI i określić gęstość komórek za pomocą hemacytometru15. Odwirować pozostały roztwór komórkowy o sile 314 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad.</li>
	<li>Zawiesić osad w RPMI, aby uzyskać stężenie 4 x 105 komórek/10 μL. Pobrać 5 μl zawiesiny komórkowej i 5 μl matrigelu, aby przygotować 10 μl roztworu komórkowego do każdego wstrzyknięcia.</li>
</ol>
4. Implantacja nadnerczy (NB) lub nerki (ES) pod kontrolą USG
UWAGA: Wszystkie procedury ultrasonograficzne są wykonywane przy użyciu systemu obrazowania in vivo o wysokiej rozdzielczości. Do opisanych procedur zastosowano przetwornik, który ma częstotliwość środkową 40 MHz i szerokość pasma 22-55 MHz.
<ol>
	<li>Wykorzystaj 6-8-tygodniowe myszy NSG z niedoborem odporności do wszystkich procedur iniekcyjnych.</li>
	<li>Schłodzić matrigel i autoklawowane strzykawki Hamilton wyposażone w igłę 27G (1,25") i cewniki 22G (średnica zewnętrzna 0,9 mm, długość 25 mm) przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Umieść roztwór komórkowy przygotowany w kroku 3 na lodzie.</li>
	<li>Znieczulić myszy w komorze indukcyjnej za pomocą 2% izofluranu wO2 dostarczanego w ilości 2 l/min. 
	UWAGA: Odpowiednie znieczulenie określa się przy braku aktywnego ruchu i utrzymaniu spontanicznego oddychania.</li>
	<li>Po znieczuleniu należy zdepilować grzbiet i bok zwierząt za pomocą balsamu do depilacji (takiego jak Nair) i golarki.</li>
	<li>Przenieść zwierzę na platformę obrazowania brzuszkiem do dołu, gdzie nos zwierzęcia umieszcza się w stożku nosowym i zabezpiecza podczas wdychania izofluranu.</li>
	<li>Umieść maść optyczną w oczach zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu. Przyklej mysz taśmą na miejscu, aby zapobiec przypadkowemu ruchowi.</li>
	<li>Zidentyfikuj mysią wątrobę, żyłę główną, śledzionę, lewą nerkę i sąsiednie lewe nadnercza za pomocą wizualizacji ultrasonograficznej.</li>
	<li>Używaj sterylnych rękawiczek, maski i czepka do ochrony osobistej i utrzymania sterylnych warunków. Pod kontrolą ultradźwięków delikatnie wprowadzić cewnik 22G przez skórę i mięsień pleców bezpośrednio do lewego nadnercza, aby zapewnić kanał do wstrzykiwania komórkowego. Wyjąć igłę i pozostawić cewnik na miejscu.</li>
	<li>Załadować schłodzoną strzykawkę Hamiltona wyposażoną w igłę o małym otworze z 10 μl roztworu komórkowego, a następnie przeprowadzić strzykawkę stereotaktycznie przez cewnik umieszczony w środku nadnerczy.</li>
	<li>Wstrzyknąć komórki do docelowej tkanki nadnerczy. Pozostaw igłę na miejscu na 1-2 minuty, aby matryca stężała. Powoli wyjmij igłę, a następnie usuń cewnik.</li>
	<li>Umieść myszy z powrotem w klatce i upewnij się, że mysz odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać pozycję leżącą mostka. 
	UWAGA: Ze względu na minimalnie inwazyjny charakter tej techniki, ból pozabiegowy jest minimalny, ale nadal monitorowany na co dzień za pomocą kontroli stanu zdrowia myszy." powinno być poprzedzone zdaniem: "Jeśli w trakcie eksperymentu zostaną zidentyfikowane nieoczekiwane oznaki bólu lub niepokoju, skonsultuj się z instytucjonalną jednostką wsparcia weterynaryjnego w celu uzyskania informacji na temat analgezji lub innej opieki medycznej. 
	</li>
</ol>

<ol><li>Sanmamed, M. F., Chester, C., Melero, I., Kohrt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+optimal+murine+models+to+investigate+immune+checkpoint+blockers+and+their+combination+with+other+immunotherapies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Defining the optimal murine models to investigate immune checkpoint blockers and their combination with other immunotherapies.</a> Ann Oncol. 27 (7), 1190-1198 (2016).</li>
<li>Fidler, I. J., Hart, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+diversity+in+metastatic+neoplasms%3A+origins+and+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biological diversity in metastatic neoplasms: origins and implications.</a> Science. 217 (4564), 998-1003 (1982).</li>
<li>Bibby, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+models+of+cancer+for+preclinical+drug+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Orthotopic models of cancer for preclinical drug evaluation.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 852-857 (2004).</li>
<li>Killion, J. J., Radinsky, R., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthotopic+Models+are+Necessary+to+Predict+Therapy+of+Transplantable+Tumors+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">Orthotopic Models are Necessary to Predict Therapy of Transplantable Tumors in Mice.</a> Cancer Metastasis Rev. 17 (3), 279-284 (1998).</li>
<li>Daniel, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primary+xenograft+model+of+small-cell+lung+cancer+reveals+irreversible+changes+in+gene+expression+imposed+by+culture+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro.</a> Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).</li>
<li>Khanna, C., Jaboin, J. J., Drakos, E., Tsokos, M., Thiele, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+relevant+orthotopic+neuroblastoma+xenograft+models%3A+Primary+adrenal+tumor+growth+and+spontaneous+distant+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Biologically relevant orthotopic neuroblastoma xenograft models: Primary adrenal tumor growth and spontaneous distant metastasis.</a> In Vivo. 16 (2), 77-85 (2002).</li>
<li>Stewart, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+human+orthotopic+neuroblastoma+xenograft%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a human orthotopic neuroblastoma xenograft.</a> Dev Biol. 407, 344-355 (2015).</li>
<li>Jäger, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimally+Invasive+Establishment+of+Murine+Orthotopic+Bladder+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Minimally Invasive Establishment of Murine Orthotopic Bladder Xenografts.</a> J. Vis. Exp. (84), e51123(2014).</li>
<li>Teitz, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+Models+for+Neuroblastoma%3A+Establishing+a+Baseline+for+Treatment%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Preclinical Models for Neuroblastoma: Establishing a Baseline for Treatment.</a> PLoS ONE. 6 (4), e19133(2011).</li>
<li>Braekeveldt, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblastoma+patient-derived+orthotopic+xenografts+retain+metastatic+patterns+and+geno-+and+phenotypes+of+patient+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Neuroblastoma patient-derived orthotopic xenografts retain metastatic patterns and geno- and phenotypes of patient tumours.</a> International Journal of Cancer. 136 (5), 252-261 (2015).</li>
<li>Van Noord, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-directed+Implantation+Using+Ultrasound+Visualization+for+Development+of+Biologically+Relevant+Metastatic+Tumor+Xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vivo%22%5BJournal%5D)">Tissue-directed Implantation Using Ultrasound Visualization for Development of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts.</a> In Vivo. 31 (5), 779-791 (2017).</li>
<li>Vormoor, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Preclinical+Orthotopic+Xenograft+Model+of+Ewing+Sarcoma+and+Other+Human+Malignant+Bone+Disease+Using+Advanced+In+Vivo+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a Preclinical Orthotopic Xenograft Model of Ewing Sarcoma and Other Human Malignant Bone Disease Using Advanced In Vivo Imaging.</a> PLoS ONE. 9 (1), e85128(2014).</li>
<li>Hakky, T. S., Gonzalvo, A. A., Lockhart, J. L., Rodriguez, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Ewing+sarcoma+of+the+kidney%3A+a+symptomatic+presentation+and+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Adv+Urol%22%5BJournal%5D)">Primary Ewing sarcoma of the kidney: a symptomatic presentation and review of the literature.</a> Ther Adv Urol. 5 (3), 153-159 (2013).</li>
<li>Cheng, H., Clarkson, P. W., Gao, D., Pacheco, M., Wang, Y., Nielsen, T. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+Antibodies+Targeting+CSF1+Impede+Macrophage+Recruitment+in+a+Xenograft+Model+of+Tenosynovial+Giant+Cell+Tumor%5BTitle%5D)+AND+%22Sarcoma%22%5BJournal%5D)">Therapeutic Antibodies Targeting CSF1 Impede Macrophage Recruitment in a Xenograft Model of Tenosynovial Giant Cell Tumor.</a> Sarcoma. 2010, 174528(2010).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Using a Hemacytometer to Count Cells. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology%22">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology</a>. , JoVE. Cambridge, MA. (2018).</li>
</ol>

Autorzy nie ujawnili żadnych informacji.

Implantacja komórek NB i ES pod kontrolą ultradźwięków jest skuteczną i bezpieczną metodą tworzenia wiarygodnych mysich ksenoprzeszczepów do badań przedklinicznych w biologii nowotworów. Kluczowe znaczenie dla powodzenia implantacji tkankowej pod kontrolą ultradźwięków ma obecność i dostępność przeszkolonego personelu posiadającego doświadczenie w anatomicznej lokalizacji narządu będącego przedmiotem zainteresowania oraz w stereotaktycznym wstrzykiwaniu komórek nowotworowych.
Dysocjacja tkanki...

Modele ksenoprzeszczepów zwierzęcych są niezbędnymi narzędziami do badań przedklinicznych nad nowymi terapiami przeciwnowotworowymi. Standardowe ksenoprzeszczepy mysie polegają na podskórnej implantacji komórek z boku, zapewniając wydajne i łatwo dostępne miejsce do monitorowania wzrostu guza. Wadą modeli podskórnych jest brak cech biologicznych specyficznych dla nowotworu, co może ograniczać ich potencjał do przerzutów1. Takie ograniczenia są pokonywane przez zastosowanie ksenoprzeszczepów ortotopowych, w których komórki nowotworowe są wszczepiane w natywne miejsca tkankowe, zapewniając odpowiednie mikrośrodowisko z potencjałem przerzutowym2. Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów zachowują oryginalne cechy biologiczne i dostarczają wiarygodnych modeli do przedklinicznego odkrywania leków3,4. Komórki rakowe wykorzystywane do implantacji kierowanej tkankami są albo ustalonymi liniami komórkowymi, albo komórkami pochodzącymi od pacjenta z guzów pacjenta. Ksenoprzeszczepy wywodzące się z linii komórek nowotworowych mogą wykazywać dużą rozbieżność genetyczną od guza pierwotnego w porównaniu z ksenoprzeszczepami pochodzącymi od pacjenta5. Biorąc to pod uwagę, tworzenie ksenoprzeszczepów ortotopowych pochodzących od pacjentów stało się preferowanym standardem testowania nowych terapii w odkrywaniu leków przeciwnowotworowych.
W neuroblastomie dziecięcej (NB), ortotopowe modele ksenoprzeszczepów podsumowują biologię pierwotnego guza i rozwijają przerzuty do typowych miejsc rozprzestrzeniania się NB6,7. NB rozwija się w nadnerczach lub wzdłuż przykręgowego łańcucha współczulnego. Najczęstsze metody implantacji ortotopowej wymagają otwartych zabiegów chirurgicznych przezbrzusznych. Takie metody są często żmudne, mają wysoką zachorowalność na zwierzęta i złożone okresy rekonwalescencji. Ultradźwięki o wysokiej rozdzielczości zostały ostatnio wykorzystane do implantacji komórek nowotworowych kierowanej tkankami w ramach opracowywania kilku modeli mysich do badań nad rakiem8,9. Technika ta jest niezawodna, powtarzalna, wydajna i bezpieczna w tworzeniu odpowiednich ksenoprzeszczepów guza z przerzutami10,11.
Pokazano tworzenie ksenoprzeszczepów nowotworowych u dzieci poprzez lokalizację narządów docelowych pod kontrolą ultradźwięków i wszczepianie igłą linii komórkowych i komórek nowotworowych pochodzących od pacjenta11. Technika ta została wykorzystana do NB ukierunkowanego na mysie nadnercza. Mięsak Ewinga (ES) jest głównie rakiem kostnym, powszechnie występującym w kościach długich, takich jak kość udowa i miedniczna12. Opisy przypadków wykazały, że w celu określenia, czy możliwy jest wzrost raka z przewagą kości w tkance nerkowej, do implantacji ortotopowej wybrano lokalizację podtorebkową nerki13. Implantacja komórek nowotworowych w nerkach podtorebkowych została wykorzystana jako obiecujący model do badania spontanicznych przerzutów dla ES14.

<table><tbody><tr><td>Mice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOD-SCID</td><td>Charles River</td><td>394</td><td></td></tr><tr><td>NSG</td><td>Laboratorium Jacksona</td><td>5557</td><td></td></tr><tr><td>Linia komórkowa&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NB</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>IMR-32</td><td>ATCC</td><td>CCL-127</td><td>Ustanowiona ludzka linia komórkowa nerwiaka zarodkowego</td></tr><tr><td>SH-SY5Y</td><td>ATCC</td><td>CRL-2266</td><td>Ustanowiona ludzka linia komórkowa nerwiaka zarodkowego</td></tr><tr><td>SK-N-Be2</td><td>ATCC</td><td>CRL-2271</td><td>Ustanowiona ludzka linia komórkowa nerwiaka zarodkowego</td></tr><tr><td><silna>ES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TC32&nbsp;</td><td></td><td></td> COGcell.ORG <td>Ustalona ludzka linia komórkowa mięsaka Ewinga</td></tr><tr><td>A673</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Ustalona ludzka linia komórkowa mięsaka Ewinga</td></tr><tr><td>-25</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Ustalona ludzka linia komórkowa mięsaka Ewinga</td></tr><tr><td>A4573</td><td>COGcell.ORG</td><td></td><td>Ustalona ludzka linia komórkowa mięsaka Ewinga</td></tr> <tr><td>pożywka linii komórkowej< / silna> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD BioSciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation</td><td></td><td></td><td></td>Dissection</tr> <tr><td>Tools</td><td>KentScientific</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do dysocjacji ludzkiego guza&nbsp;</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-095-929</td><td></td></tr><tr><td>dysocjator gentleMACS</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>probówki gentleMACS C</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>Sitko do komórek</td><td>Corning</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>Lucyferazy Tagowanie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lenti-GFP1 virus</td><td>University z Michigan, Vector Core</td><td></td><td>Lucyferase Virus</td></tr><tr><td>Steady Glo-Luciferase</td> Assay Set <td>Promega</td><td>E2510</td><td></td></tr><tr><td>Bioluminescence Imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ivis Spectrum Imaging</td><td>System PerkinElmer</td><td>124262</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin</td><td>Promega</td><td>E160X</td><td></td></tr><tr><td><silny>znieczulający</silny> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wziewny izofluran&nbsp;</td><td>Piramal Critical Care Inc</td><td>66794-0017-25</td><td></td></tr><tr><td>Ultradźwiękowe wstrzyknięcie pod kontrolą</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 Obrazowanie w wysokiej rozdzielczości</td> Strzykawki <td>Vevo</td><td>2100</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton (igła 27 G)</td><td>Angiocewnik Hamilton</td><td>80000</td><td></td></tr><tr><td>22 Gauge</td><td>BD Biosciences</td><td>381423</td><td></td></tr><tr><td>Maść optyczna</td><td>Główne firmy farmaceutyczne</td><td>301909</td><td></td></tr><tr>Kościół<td>Nair</td><td>& Dwight Co</td><td></td><td>Środek do usuwania włosów</td></tr><tr><td>Aquasonic 100 Żel do transmisji ultradźwięków</td><td>Parker</td><td></td><td>Żel ultradźwiękowy</td></tr> <tr><td>Histology</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>DAKO</td><td>M3601</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Hydroksylaza tyrozyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2928</td><td>Przeciwciało pierwotne</td></tr><tr><td>Przeciwciało wtórne HRP-polimerowe</td><td>Pipety Biocare</td><td>BRR4056KG</td><td></td></tr><tr><td>Miscelleneous</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipety</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-676-10H</td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Probówki do mikrowirówek</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td>Pipeta 3120000062</tr><tr><td>P200</td> Końcówki do pipet <td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>P1000</td> Końcówki do pipet <td>Fisher Scientific</td><td>21-375E</td><td></td></tr><tr><td>P200</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-375D</td><td></td></tr> Przenośna pomoc do pipet Cyfrowa waga do ważenia zwierząt <tr><td></td><td>Drummond</td><td>4-000-101</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Suwmiarki KentScientific</td><td>SCL-1015</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>06-664-16</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowe płytki z niskim mocowaniem</td><td>Corning</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Naczynia poddane kulturom tkankowym</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB012924</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr></tbody></table>

wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Przedkliniczne testy terapii przeciwnowotworowych opierają się na odpowiednich modelach ksenoprzeszczepów, które naśladują wrodzone tendencje raka. Zaletami standardowych podskórnych modeli bocznych są łatwość zabiegu oraz możliwość monitorowania progresji i odpowiedzi guza bez inwazyjnego obrazowania. Takie modele są często niespójne w translacyjnych badaniach klinicznych i mają ograniczone biologicznie istotne cechy oraz niską skłonność do wytwarzania przerzutów, ponieważ brakuje rodzimego mikrośrodowiska. Dla porównania, wykazano, że ortotopowe modele ksenoprzeszczepów w natywnych miejscach guza naśladują mikrośrodowisko guza i replikują ważne cechy choroby, takie jak odległe rozprzestrzenianie się przerzutów. Modele te często wymagają żmudnych zabiegów chirurgicznych z wydłużonym czasem znieczulenia i okresami rekonwalescencji. Aby temu zaradzić, naukowcy zajmujący się nowotworami wykorzystali ostatnio techniki iniekcji pod kontrolą ultradźwięków w celu stworzenia modeli ksenoprzeszczepów nowotworowych do eksperymentów przedklinicznych, co pozwala na szybkie i niezawodne ustanowienie mysich modeli ukierunkowanych na tkanki. Wizualizacja ultrasonograficzna zapewnia również nieinwazyjną metodę podłużnej oceny wszczepienia i wzrostu guza. W tym miejscu opisujemy metodę wstrzykiwania komórek nowotworowych pod kontrolą USG, z wykorzystaniem nadnerczy w przypadku NB i podkapsułki nerkowej w przypadku ES. To minimalnie inwazyjne podejście pozwala przezwyciężyć żmudną otwartą chirurgię implantacji komórek rakowych w specyficznych dla tkanki miejscach wzrostu i przerzutów oraz skraca chorobliwe okresy rekonwalescencji. Opisujemy wykorzystanie zarówno ustalonych linii komórkowych, jak i linii komórkowych pochodzących od pacjenta do iniekcji ortotopowej. Dostępne są gotowe zestawy komercyjne do dysocjacji guza i znakowania komórek lucyferazy. Wstrzykiwanie zawiesiny komórkowej za pomocą wskazówek obrazowych zapewnia minimalnie inwazyjną i powtarzalną platformę do tworzenia modeli przedklinicznych. Metoda ta jest wykorzystywana do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych dla innych nowotworów, takich jak pęcherz moczowy, wątroba i trzustka, co ilustruje jej niewykorzystany potencjał w wielu modelach nowotworowych.

Zgodnie z przedstawionymi procedurami, implantacja komórek NB do nadnercza pod kontrolą ultradźwięków została przeprowadzona w specjalistycznym pomieszczeniu zabiegowym wyposażonym w podgrzewany stół operacyjny. W celu monitorowania aktywności serca myszy zastosowano elektrody na kończyny przednie i tylne (Rysunek 1A). Zwierzę pozostawało pod narkozą izofluranem podawanym drogą wziewną przez maskę nosową. Za pomocą wysokorozdzielczej sondy USG zidentyfikowano...

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

Celem tej metody jest ustalenie biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów ortotopowych nowotworów do badań przedklinicznych. Komórki nerwiaka zarodkowego pochodzące od pacjenta są wstrzykiwane do mysiego nadnercza pod kontrolą ultrasonograficzną bez otwartej operacji lub przedłużonej rekonwalescencji. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii nowotworów i badaniach translacyjnych, takich jak badania nad ewolucją guza, odpowiedziami terapeutycznymi w rodzimym mikrośrodowisku i przerzutami.Taka wiedza znacznie poprawiłaby wiarygodność badań przedklinicznych i ułatwiłaby odkrywanie leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona uzyskiwana od pacjenta, kierowana tkankowo, wydajna i niezawodna w tworzeniu ortotopowego modelu ksenograficznego do badań nad terapią raka. Kluczowe etapy procedury zademonstrują Sahiti Chukkapalli, starszy technik i kierownik naszego laboratorium, wraz z Tiną Thomas, pracownikiem naukowym w naszym laboratorium.Wygeneruj pojedynczą zawiesinę komórek rakowych pochodzącą od pacjenta z tkanki nowotworowej za pomocą zestawu do dysocjacji guza. Zacznij od przeniesienia około pół grama tkanki nowotworowej do 100-milimetrowej

utilization-ultrasound-guided-tissue-directed-cellular-implantation

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

W tym filmie komórki czerniaka pochodzenia ludzkiego są wszczepiane podskórnie w obszar boczny myszy z obniżoną odpornością. Model PDX umożliwia przedkliniczne badanie komórek czerniaka, które lepiej oddaje niejednorodność guza i agresywność czerniaka obserwowane w warunkach in vivo.

Modelowanie ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjenta: technika generowania mysich modeli czerniaka

Sprawdzona technika szczepienia pierwotnych inwazyjnych ksenoprzeszczepów raka ortotopowego pęcherza moczowego wymaga laparotomii i mobilizacji pęcherza. Procedura ta powoduje znaczną zachorowalność u myszy, jest technicznie trudna i czasochłonna. W związku z tym opracowaliśmy wysoce precyzyjne, przezskórne podejście wykorzystujące kontrolę ultrasonograficzną.

Małoinwazyjne założenie mysich ortotopowych ksenoprzeszczepów pęcherza moczowego

Ten protokół opisuje generowanie modeli ortotopowych ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów poprzez dopęcherzowe wkraplanie komórek raka urotelialnego o wysokim stopniu złośliwości lub dodoodbytnicze wstrzykiwanie komórek raka jelita grubego do myszy z nieotyłym cukrzycą/ciężkim złożonym niedoborem odporności (NOD/SCID) w celu pierwotnego wzrostu guza i spontanicznych przerzutów pod wpływem komórek zrębu węzłów chłonnych, co naśladuje postęp ludzkich chorób przerzutowych.

Ortotopowe modele ksenoprzeszczepów pobrane od pacjentów dla ludzkiego raka urotelialnokomórkowego i raka jelita grubego, wzrostu guza i spontanicznych przerzutów

Ortotopowe modele myszy z przerzutowym czerniakiem błony naczyniowej oka ludzkiej wątroby zostały stworzone przy użyciu technik chirurgicznej implantacji ortotopowej z technikami wstrzykiwania kawałków guza pochodzących od pacjenta i igieł z hodowanymi ludzkimi liniami komórkowymi czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej.

Generowanie ortotopowej platformy ksenoprzeszczepu ludzkiego czerniaka błony naczyniowej gałki ocznej wątroby u myszy z niedoborem odporności

Opisujemy protokół implantacji pod kontrolą ultrasonograficzną linii komórkowych rdzeniakoraka przewodowego trzustki pochodzących od myszy bezpośrednio do natywnego miejsca guza. Takie podejście spowodowało guzy trzustki wykrywalne za pomocą skanowania ultrasonograficznego w ciągu 2-4 tygodni od wstrzyknięcia i znacznie zmniejszyło odsetek wysiewu komórek nowotworowych na ścianie otrzewnej w porównaniu z chirurgiczną implantacją ortotopową.

Ortotopowa implantacja mysiego gruczolakoraka przewodowego trzustki pod kontrolą USG

Tutaj prezentujemy protokół do testowania skuteczności terapii celowanych, wybranych na podstawie składu genomowego guza. Protokół opisuje identyfikację i walidację strukturalnych rearanżacji DNA, wszczepianie guzów pacjentów myszom oraz testowanie odpowiedzi na odpowiednie leki.

Testowanie terapii celowanych w nowotworach z wykorzystaniem analizy zmian strukturalnych DNA i ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów

Modele przerzutów do kości nie rozwijają przerzutów równomiernie ani ze 100% częstością. Bezpośrednie wstrzyknięcie do komórek nowotworowych kości może spowodować embolizację płuc. Przedstawiamy naszą technikę modelowania pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z wykorzystaniem implantacji przeszczepu guza litego do kości, prowadzącej do powtarzalnego wszczepienia i wzrostu.

Modelowanie pierwotnych guzów kości i przerzutów do kości z implantacją przeszczepu guza litego do kości

Modele PDX z przerzutami do ośrodkowego układu nerwowego reprezentują fenotypowe i molekularne cechy ludzkich przerzutów, co czyni je doskonałymi modelami do badań przedklinicznych. Poniżej opisano, jak ustalić modele PDX i drogi inokulacji, które najlepiej wykorzystać w badaniach przedklinicznych.

Opracowanie i wykorzystanie modeli ksenoprzeszczepów do ośrodkowego układu nerwowego pochodzących od pacjentów

Przedstawiamy protokół generowania minimalnie inwazyjnego modelu ortotopowego raka trzustki poprzez wstrzykiwanie ludzkich komórek raka trzustki pod kontrolą ultradźwięków i późniejsze monitorowanie wzrostu guza in vivo za pomocą obrazowania ultradźwiękowego.

Wytwarzanie ortotopowego ksenoprzeszczepu komórek raka trzustki za pomocą iniekcji pod kontrolą ultradźwięków

Ten protokół opisuje skuteczną, niechirurgiczną metodę ortotopowego wszczepiania ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi u myszy. Technika ta polega na enzymatycznej dysocjacji guza, a następnie bezpośrednim wstrzyknięciu do poduszek tłuszczowych sutka, co umożliwia implantację o wysokiej przepustowości. Kompleksowa walidacja zapewnia wierność modelu, ułatwiając rygorystyczne badania nad różnymi podtypami raka piersi.

Wysokoprzepustowa dysocjacja i ortotopowa implantacja ksenoprzeszczepów pochodzących od pacjentów z rakiem piersi

Celem tego protokołu jest dostarczenie badaczom wysoce powtarzalnej techniki implantacji czaszkowych.

Steryotatyczna wewnątrzczaszkowa implantacja linii komórek xenotransplantatu pochodzenia pacjenckiego z glioblastomu u myszy

Poznaj metodę implantacji komórek neuroblastoma sterowaną ultradźwiękami do gruczołu nadnerczowego myszy. Technika ta umożliwia tworzenie biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów ortotopowych bez otwartej chirurgii, poprawiając wiarygodność badań przedklinicznych i wspierając odkrywanie nowych leków przeciwnowotworowych.

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami

Przeglądaj więcej filmów