Wykorzystanie implantacji komórkowej sterowanej tkankami pod kontrolą ultradźwięków do ustalenia biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów nowotworowych z przerzutami
25 maja 2018
Tutaj prezentujemy protokół wykorzystania wspomaganego ultradźwiękami wstrzykiwania komórek nerwiaka zarodkowego (NB) i mięsaka Ewinga (ES) (ustalone linie komórkowe i komórki nowotworowe pochodzące od pacjenta) w biologicznie istotnych miejscach do tworzenia wiarygodnych modeli przedklinicznych do badań nad rakiem.
Celem tej metody jest ustalenie biologicznie istotnych ksenoprzeszczepów ortotopowych nowotworów do badań przedklinicznych. Komórki nerwiaka zarodkowego pochodzące od pacjenta są wstrzykiwane do mysiego nadnercza pod kontrolą ultrasonograficzną bez otwartej operacji lub przedłużonej rekonwalescencji. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania w biologii nowotworów i badaniach translacyjnych, takich jak badania nad ewolucją guza, odpowiedziami terapeutycznymi w rodzimym mikrośrodowisku i przerzutami.
Taka wiedza znacznie poprawiłaby wiarygodność badań przedklinicznych i ułatwiłaby odkrywanie leków. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona uzyskiwana od pacjenta, kierowana tkankowo, wydajna i niezawodna w tworzeniu ortotopowego modelu ksenograficznego do badań nad terapią raka. Kluczowe etapy procedury zademonstrują Sahiti Chukkapalli, starszy technik i kierownik naszego laboratorium, wraz z Tiną Thomas, pracownikiem naukowym w naszym laboratorium.
Wygeneruj pojedynczą zawiesinę komórek rakowych pochodzącą od pacjenta z tkanki nowotworowej za pomocą zestawu do dysocjacji guza. Zacznij od przeniesienia około pół grama tkanki nowotworowej do 100-milimetrowej płytki do hodowli komórkowej zawierającej pięć mililitrów buforu RPMI uzupełnionego enzymem. Następnie użyj nożyczek i kleszczyków do tkanek, aby zmielić guz na małe kawałki o długości od dwóch do czterech milimetrów.
Odpipetować mieszaninę guza do probówki dysocjacyjnej i zamknąć probówkę. Odwróć rurkę, przymocuj do tulei dysocjatora tkanek i odwróć tkankę za pomocą odpowiedniego programu. Po dysocjacji inkubować zawiesinę komórek nowotworowych na obrotowym stojaku w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez godzinę.
Podczas inkubacji należy rozcierać zawiesinę komórkową co 15 minut. Po inkubacji przenieś zawiesinę komórek do nowej stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów i dodaj 10 mililitrów RPMI. Następnie odwirować zawiesinę komórkową o masie 314 g przez pięć minut.
Po odwirowaniu usunąć supernatant i zawiesić osad w pięciu mililitrach RPMI. Przepuść zawiesinę komórkową przez sitko o wielkości 40 mikronów i zbierz odcedzony roztwór do świeżej probówki o pojemności 50 mililitrów. Po umyciu sitka pięcioma mililitrami pożywki RPMI, odwiruj zawiesinę komórek o wadze 314 g przez pięć minut, aby zebrać osad.
Policz komórki za pomocą hemocytometru. Następnie zawiesić osad w RPMI, aby uzyskać końcowe stężenie cztery razy 10 do pięciu komórek na 10 mikrolitrów objętości. Przenieść pięć mikrolitrów tej zawiesiny komórkowej na wstrzyknięcie do świeżej probówki, a taką samą objętość matrycy błony podstawnej uzyskać 10 mikrolitrów roztworu komórkowego na każde wstrzyknięcie i umieścić go na lodzie.
Przenieś mysz na platformę obrazowania brzuchem do dołu. Dopasuj i zabezpiecz stożek nosowy, aby utrzymać znieczulenie izofluranem. Rozpocznij procedurę implantacji za pomocą balsamu do depilacji i golarki, aby zdepilować grzbiet i bok odpowiednio znieczulonej myszy NSG w wieku od sześciu do ośmiu tygodni z niedoborem odporności
.Nałóż maść optyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu. Następnie przyklej mysz taśmą na miejscu, aby zapobiec przypadkowym ruchom. Następnie użyj wizualizacji ultradźwiękowej, aby zidentyfikować mysią wątrobę, żyłę główną, śledzionę, lewą nerkę i sąsiednie lewe nadnercza.
Załaduj schłodzoną strzykawkę Hamiltona, wyposażoną w igłę o małym otworze, 10 mikrolitrami roztworu komórkowego. Następnie, pod kontrolą ultrasonograficzną, delikatnie wprowadzono schłodzony cewnik o rozmiarze 22 G przez skórę i mięsień grzbietowy, bezpośrednio do lewego nadnercza, aby zapewnić kanał do wstrzyknięcia komórkowego. Wyjąć igłę i pozostawić cewnik na miejscu.
Wizualizacja nadnercza podczas wprowadzania cewnika, wraz z igłą i jej trajektorią, jest niezbędna, aby zapewnić minimalne uszkodzenie otaczających struktur i narządów oraz zmniejszyć zachorowalność na myszy. Następnie przeprowadzić strzykawkę przez cewnik umieszczony w środku nadnerczy. Ponieważ strzykawka jest prowadzona przez cewnik, ważne jest, aby utrzymać stabilność cewnika i obserwować postęp igły.
Należy pamiętać, że sama igła wystaje około dwóch milimetrów poza zakończenie cewnika, a jej położenie jest łatwo widoczne w badaniu ultrasonograficznym. Wstrzyknąć komórki do docelowej tkanki nadnerczy. Pozostaw igłę na miejscu na jedną do dwóch minut, aby umożliwić zastygnięcie matrycy błony podstawnej.
Po zastygnięciu macierzy błony podstawnej powoli wyjmij igłę, a następnie usuń cewnik. Na koniec umieść mysz w klatce ratunkowej, aż odzyska wystarczającą przytomność, aby utrzymać leżącą mostek przed powrotem do klatki domowej. Obrazowanie ultrasonograficzne monitoruje progresję guza in vivo.
Ten obraz przedstawia obraz ultrasonograficzny nadnerczy, tydzień po wstrzyknięciu. W tym przypadku obrazowanie luminescencyjne myszy z nerwiakiem zarodkowym, której wstrzyknięto tydzień po wstrzyknięciu, pokazuje odczyty nie wskazujące na wszczepienie guza. Po dwóch tygodniach obrazowanie ultrasonograficzne pokazuje wszczepienie guza i progresję do obszaru około 40 milimetrów kwadratowych.
Bioluminescencja po dwóch tygodniach od wstrzyknięcia wykazała promieniowanie od 10 do siódmego, co sugeruje wychwyt komórek i wzrost guza korelujący z wynikami ultrasonografii. Obrazowanie ultrasonograficzne osiem tygodni po wstrzyknięciu wykazało ciągły wzrost guza z pomiarem powierzchni większym niż 100 milimetrów kwadratowych. Ponownie, bioluminescencja potwierdziła wyniki ultrasonografii ze zwiększonym poziomem promieniowania od 10 do 9.
Obrazowanie ultrasonograficzne 3D guza wykazało objętość większą niż 100 milimetrów sześciennych, co stanowi punkt odniesienia, który nasze laboratorium wykorzystuje do rozpoczynania przedklinicznych badań terapeutycznych. Wycięty guz grubo mierzony wielkości większej niż jeden centymetr, korelujący z pomiarami ultrasonograficznymi i sygnałami luminescencji. Pożywka ta pokazuje, jak skutecznie ustanowić ksenografy ortotopowe nadnerczy z komórkami nerwiaka zarodkowego pochodzącymi od pacjenta, wykorzystując wskazówki ultrasonograficzne.
Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż 12 minut na wstrzyknięcie, jeśli jest wykonywana prawidłowo.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół iniekcji komórek neuroblastoma oraz mięsaka Ewinga do modeli mysich pod kontrolą ultradźwięków. Technika ta ma na celu stworzenie wiarygodnych przedklinicznych modeli nowotworowych, które odzwierciedlają naturalne mikrośrodowisko guza.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Onkologia
- Badania przedkliniczne
Wstęp
- Komórki nowotworowe pochodzące od pacjentów stanowią bardziej dokładny model do badania raka.
- Ksenoprzeszczepy ortotopowe są niezbędne do zrozumienia zachowania guza w naturalnym środowisku.
- Naprowadzanie ultradźwiękowe umożliwia precyzyjną injekcję bez konieczności przeprowadzania inwazyjnej operacji.
- Metoda ta może zwiększyć wiarygodność badań przedklinicznych.
Cel badania
- Aby stworzyć biologicznie istotne modele nowotworów do celów badawczych.
- Aby badać ewolucję guza oraz odpowiedzi terapeutyczne.
- Aby ułatwić odkrywanie leków dzięki ulepszonym modelom przedklinicznym.
Zastosowane metody
- Wstrzykiwanie komórek neuroblastoma pod kontrolą USG.
- Iniekcja do nadnercza myszy.
- Wykorzystanie komórek nowotworowych pochodzących od pacjentów.
- Nieinwazyjna technika w celu zminimalizowania czasu rekonwalescencji.
Główne wyniki
- Skuteczne wytworzenie ksenoprzeszczepów ortotopowych.
- Wykazana wydajność i niezawodność metody.
- Uzyskanie wiedzy na temat zachowania guza w naturalnym mikrośrodowisku.
- Ułatwienie dalszych badań nad odpowiedziami terapeutycznymi i przerzutowaniem.
Wnioski
- Metoda wstrzykiwania pod kontrolą USG jest skuteczna w badaniach nad nowotworami.
- Modele pochodzące od pacjentów zwiększają istotność badań przedklinicznych.
- Technika ta może znacząco wspomóc wysiłki w zakresie odkrywania leków.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Tworzenie biologicznie istotnych ksenograftów przerzutowych z wykorzystaniem tkankowo ukierunkowanej implantacji komórkowej pod kontrolą ultradźwięków pozwala na wypełnienie krytycznej luki w przedklinicznych modelach onkologicznych poprzez dokładne odtworzenie mikrośrodowiska guza oraz zachowania przerzutowego. To małoinwazyjne podejście zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad odpowiedzią terapeutyczną i przerzutami, co wspiera decyzje dotyczące portfela projektów w odkrywaniu leków onkologicznych w oparciu o analizę ryzyka. Powtarzalność i zgodność translacyjna tej metody sprawiają, że stanowi ona strategiczny zasób dla przedsiębiorczych procesów B+R dążących do minimalizacji ryzyka wczesnych etapów rozwoju produktów onkologicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych w natywnym mikrośrodowisku guza.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez modelowanie rozprzestrzeniania się przerzutów i ewolucji nowotworu.
- Zwiększa pewność prognostyczną w wyborze kandydatów i priorytetyzacji portfela badań.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Ułatwia przygotowanie zwalidowanych, ortotopowych modeli ksenoprzeszczepów do późniejszych testów skuteczności.
- Zapewnia powtarzalne, ilościowe odczyty wzrostu guza i przerzutów za pomocą obrazowania ultrasonograficznego oraz bioluminescencyjnego.
- Umożliwia skalowalne, małoinwazyjne tworzenie modeli do oceny związków.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Uspójnia modele przedkliniczne z biologią ludzkich chorób dzięki zastosowaniu komórek pochodzących od pacjentów oraz implantacji tkankowo specyficznej.
- Zapewnia ciągłość procesu od etapu odkrycia po walidację przedkliniczną, umożliwiając podłużną ocenę progresji nowotworu i odpowiedzi terapeutycznej.
- Zmniejsza ryzyko translacyjne poprzez modelowanie klinicznie istotnych mechanizmów przerzutowania.
Integracja potoków i przepływów pracy
Ta metoda ksenoprzeszczepu pod kontrolą ultradźwięków integruje się z continuum odkryć w onkologii – od wczesnej walidacji celu po przedkliniczne badania skuteczności – umożliwiając tworzenie solidnych modeli do identyfikacji wiodących związków oraz badań translacyjnych.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez i redukcję ryzyka mechanistycznego poprzez modelowanie wzrostu guza w natywnym kontekście tkankowym.
- Przesiewanie: Zapewnia zestandaryzowane, reprodukowalne modele z ilościowymi wynikami obrazowania do przesiewania związków.
- Analityka: Dostarcza podłużnych pomiarów wielkości guza i bioluminescencji w celu porównania warunków terapeutycznych.
- Badania translacyjne: Łączy fazę odkrywczą z fazą przedkliniczną, umożliwiając tworzenie systemów modelowych pochodzących od pacjentów i istotnych dla danej choroby.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje platformę adaptowalną do wielu typów nowotworów i źródeł komórek, co zapewnia szeroką użyteczność w badaniach i rozwoju (B+R).
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w modelach onkologicznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje i usprawnia ustanawianie modeli przy minimalnej zachorowalności zwierząt i szybkiej rekonwalescencji.
- Wartość strategiczna: Poprawia jakość decyzji go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez zwiększenie relewantności modelu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój aktywów onkologicznych w oparciu o dane spójne translacyjnie.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w obrazowaniu ultrasonograficznym oraz technikach chirurgicznych u małych zwierząt.
- Wymaga dostępu do platform obrazowania, zestawów do dysocjacji komórek oraz infrastruktury do analizy bioluminescencji.
- Wymaga standaryzacji międzyzespołowej w celu zapewnienia powtarzalności i porównywalności danych.
- Możliwość adaptacji do różnych typów nowotworów oraz linii komórkowych, zarówno ustalonych, jak i pochodzących od pacjentów.
- Ograniczony koniecznością specjalistycznego szkolenia oraz posiadania sprzętu obrazującego w celu precyzyjnej implantacji i monitorowania.
