Name: Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Poznaj metodę spektrofotometrycznego pomiaru transportu elektronów przez błonę plazmatyczną w komórkach C2C12 w czasie rzeczywistym. Ta technika umożliwia badanie mechanizmów biologii redoks i utrzymania równowagi redoks w komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Thomasowi Bellowi, Lyn Mattathil, Markowi Mannino i Neejowi Patelowi za ich wsparcie techniczne. Praca ta była wspierana przez Publiczną Służbę Zdrowia Stanów Zjednoczonych R15DK102122 przyznaną przez Narodowy Instytut Cukrzycy oraz Chorób Układu Pokarmowego i Nerek (NIDDK) dla Jonathana Fishera. Wyłączną odpowiedzialność za treść manuskryptu ponoszą autorzy i niekoniecznie reprezentuje ona oficjalne poglądy NIDDK lub National Institutes of Health.

UWAGA: Zobacz Rysunek 1, aby zobaczyć schematyczny przegląd kluczowych kroków.
1. Test redukcyjny WST-1
<ol>
	<li>Hoduj i różnicuj komórki przylegające do C2C12 przy użyciu standardowych procedur hodowli komórek7 na 96-dołkowej płytce z wykorzystaniem rzędów A-F.
	<ol>
		<li>Użyj pożywki różnicującej składającej się ze zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle's Medium (DMEM) uzupełnionej 2% surowicą końską, 100 U/ml penicyliny i 0,1 mg/ml streptomycyny. Inkubować komórki w temperaturze 37 °C z 5% CO2 .</li>
		<li>Monitorując udział askorbinianu w tPMET, należy uzupełnić pożywkę różnicującą kwasem askorbinowym o stężeniu 100 μM. Pozwól komórkom inkubować się w pożywce różnicowej przez ~ 24-48 godzin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj standardowe roztwory WST-1 i PMS.
	<ol>
		<li>Aby przygotować 10 mM zapasu WST-1, rozpuść 0,033 g WST-1 (masa formuły (FW): 651,34 g/mol) w 5 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Aby przygotować 5 mM zapasu PMS, rozpuść 0,0023 g PMS (FW: 306,34 g/mol) w 1,5 ml dejonizowanegoH2O(diH2O). Przechowywać w temperaturze -20 °C i chronić przed światłem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 0,0108 g glukozy dla końcowego stężenia 5 mM do 11,4 ml PBS lub buforowanej soli fizjologicznej HEPES (HBS; 20 mM soli sodowej HEPES, 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 2,5 mMMgSO4, 1 mM CaCl2). Dodać 480 μl 10 mM WST-1 dla końcowego stężenia 400 μM i 48 μL 5 mM PMS dla końcowego stężenia 20 μM.</li>
	<li>Monitorując udział askorbinianu w tPMET, należy podzielić roztwór na dwie podwielokrotności po 6 ml. Do jednej podwielokrotności dodać 6 μl diH2O, a do drugiej podwielokrotności dodać 6 μl 2 kU/ml AO, aby uzyskać końcowe stężenie 2 U/ml.</li>
	<li>Monitorując udział ponadtlenków w tPMET, należy podzielić roztwór na dwie podwielokrotności po 6 ml. Do jednej podwielokrotności dodać 55 μl 0,1 M buforu KPO4, a do drugiej podwielokrotności dodać 55 μl 6,5 kU/ml SOD dla końcowego stężenia 60 U/mL.</li>
	<li>Umyj komórki PBS. Odessać pożywkę i dodać 150 μl PBS. Następnie odessać PBS. 
	UWAGA: Test wykonuje się za pomocą platerowanych, dołączonych komórek. W związku z tym nie ma wirowania ani stosowania trypsyny w procesie mycia.</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu WST-1 (-) SOD lub (-) AO do kolumn 1-6 i dodać 100 μl roztworu WST-1 (+) SOD lub (+) AO do kolumn 7-12 w płytce 96-dołkowej. Użyć wierszy G i H jako kontrolnych tła (tj. do monitorowania zmian absorbancji w samym odczynniku w studzienkach bez komórek).</li>
	<li>Mierzyć wartości absorbancji za pomocą spektrofotometru co 10 minut przez 1 godzinę przy długości fali 438 nm.</li>
	<li>Po odczytaniu odessać pożywkę i umyć każdą studzienkę 150 μl PBS. Następnie odessać PBS.</li>
	<li>Obliczyć zmianę absorbancji dla każdej studzienki, odejmując początkową absorbancję dla studzienki od absorbancji w dowolnym punkcie czasowym dla tej studzienki. Skorygować tę zmianę o zmianę absorbancji (jeśli występuje) zaobserwowaną w studzienkach tła (tj. studzienkach z roztworem testowym, ale bez komórek).</li>
	<li>W celu analizy znormalizuj dane absorbancji do 60-minutowego pomiaru kontrolnego lub przepłucz studzienki PBS lub HBS, a następnie wykonaj test białka kwasu bicinchoninowego (BCA).</li>
	<li>Dodać 2 mg/ml wzorca albuminy surowicy bydlęcej (BSA) (zakres od 0,5-2 μl dla krzywej wzorcowej, w zależności od stopnia zbiegu komórek) do pustych studzienek (rzędy G i H), a następnie dodać odczynnik BCA do wszystkich studzienek.</li>
	<li>Określ ilościowo dane za pomocą nmol redukcji WST-1 na μg białka. Użyj 37 mM-1 cm-1 22 jako współczynnika ekstynkcji dla zredukowanego WST-1 przy 438 nm.</li>
</ol>
2. Test redukcji DPIP
<ol>
	<li>Hoduj i różnicuj przylegające komórki C2C12 zgodnie z tą samą procedurą, co w kroku 1.1.</li>
	<li>Przygotuj podstawowy roztwór DPIP 10 mM w następujący sposób. Rozpuścić 0,029 g DPIP (FW: 290,08 g/mol) w 10 ml diH2O. Potwierdzić stężenie DPIP, mierząc absorbancję przy 600 nm za pomocą spektrofotometru. Użyj 1 mM-1 cm-1 23 jako współczynnika ekstynkcji dla zmniejszonego DPIP przy 600 nm. Przechowywać w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Dodać 0,0108 g glukozy do 11,880 ml PBS, aby uzyskać końcowe stężenie 5 mM. Dodać 120 μl 10 mM DPIP, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM.</li>
	<li>Monitorując udział askorbinianu w tPMET, należy podzielić roztwór na dwie podwielokrotności po 6 ml. Do jednej podwielokrotności dodać 6 μl diH2O, a do drugiej podwielokrotności dodać 6 μl 2 kU/ml AO, aby uzyskać końcowe stężenie 2 U/ml.</li>
	<li>Monitorując udział ponadtlenków w tPMET, należy podzielić roztwór na dwie podwielokrotności po 6 ml. Do jednej podwielokrotności dodać 55 μl 0,1 M buforu KPO4, a do drugiej podwielokrotności dodać 55 μl 6,5 kU/ml SOD dla końcowego stężenia 60 U/mL.</li>
	<li>Odessać pożywkę i przepłukać komórki w 150 μl PBS. Odessać PBS i dodać 100 μl roztworu DPIP (-) SOD lub (-) AO do kolumn 1-6 i dodać 100 μl roztworu DPIP (+) SOD lub (+) AO do kolumn 7-12 w płytce 96-dołkowej. Użyj wierszy G i H jako kontrolnych tła (tj. do monitorowania zmian absorbancji w samym odczynniku w studzienkach bez komórek).</li>
	<li>Mierzyć absorbancję przy długości fali 600 nm za pomocą spektrofotometru co 10 minut przez 1 godzinę. Określić ilościowo zmianę absorbancji w stosunku do kontroli po 60 minutach, podobnie jak w krokach 1.9-1.13.</li>
</ol>
3. Określenie, czy akceptory zredukowanych elektronów są substratami dla AO czy SOD
<ol>
	<li>Do 5,436 ml PBS lub HBS dodać 240 μl 10 mM WST-1 dla końcowego stężenia 400 μM i 24 μL 5 mM PMS dla końcowego stężenia 20 μM.
	<ol>
		<li>W przypadku DPIP dodać 60 μl 10 mM DPIP, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM, do 5,940 ml PBS lub HBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 100 μl roztworu do każdej studzienki na płaskodennej 96-dołkowej płytce bez komórek i zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy 438 nm, dla WST-1, lub 600 nm, dla DPIP.</li>
	<li>Dodać 1 μl 10 mM askorbinianu do połowy studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 100 μM. Monitorować absorbancję, aż się ustabilizuje.</li>
	<li>Po ustabilizowaniu dodać 1 μl 200 U/ml AO dla końcowego stężenia 2 U/ml do każdej studzienki lub dodać 1 μl 6 kU/ml SOD dla końcowego stężenia 60 U/ml do każdego dołka i monitorować absorbancję przez 1 godzinę.</li>
</ol>

<ol><li>Kilberg, M. S., Christensen, H. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron-transferring+enzymes+in+the+plasma+membrane+of+the+Ehrlich+ascites+tumor+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Electron-transferring enzymes in the plasma membrane of the Ehrlich ascites tumor cell.</a> Biochemistry. 18 (8), 1525-1530 (1979).</li>
<li>Crane, F. L., Roberts, H., Linnane, A. W., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+ferricyanide+reduction+by+cells+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Transmembrane ferricyanide reduction by cells of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bioenerg Biomembr. 14 (3), 191-205 (1982).</li>
<li>Craig, T. A., Crane, F. L. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US8239207">Evidence for trans-plasma membrane electron transport system in plact cells.</a> Proc. Indiana Acad. Sci. 90, 150-155 (1981).</li>
<li>Mishra, R. K., Passow, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+intracellular+ATP+synthesis+by+extracellular+ferricyanide+in+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Membr+Biol%22%5BJournal%5D)">Induction of intracellular ATP synthesis by extracellular ferricyanide in human red blood cells.</a> J Membr Biol. 1 (1), 214-224 (1969).</li>
<li>Crane, F. L., Sun, I. L., Clark, M. G., Grenbing, C., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplasma-membrane+redox+systems+in+growth+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Transplasma-membrane redox systems in growth and development.</a> Biochim Biophys Acta. 811, 233-264 (1985).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01279296">Trans-plasma membrane electron transport: a cellular assay for NADH- and NADPH-oxidase based on extracellular, superoxide-mediated reduction of the sulfonated tetrazolium salt WST-1.</a> Protoplasma. 205 (1-4), 74-82 (1998).</li>
<li>Eccardt, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+and+ascorbate+efflux+by+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport and ascorbate efflux by skeletal muscle.</a> Antioxidants. 6 (4), 89(2017).</li>
<li>Sun, I. L., Navas, P., Crane, F. L., Morre, D. J., Low, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADH+diferric+transferrin+reductase+in+liver+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NADH diferric transferrin reductase in liver plasma membrane.</a> J Biol Chem. 262 (33), 15915-15921 (1987).</li>
<li>Larm, J. A., Vaillant, F., Linnane, A. W., Lawen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+the+plasma+membrane+oxidoreductase+as+a+prerequisite+for+the+viability+of+human+Namalwa+rho+0+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of the plasma membrane oxidoreductase as a prerequisite for the viability of human Namalwa rho 0 cells.</a> J Biol Chem. 269 (48), 30097-30100 (1994).</li>
<li>Inman, R. S., Coughlan, M. M., Wessling-Resnik, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+ferrireductase+activity+of+K562+cells+is+coupled+to+transferrin-independent+iron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular ferrireductase activity of K562 cells is coupled to transferrin-independent iron transport.</a> Biochemistry. 33, 11850-11857 (1994).</li>
<li>Castillo-Olivares, A., Esteban del Valle, A., Marquez, J., Nunez de Castro, I., Medina, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ehrlich+cell+plasma+membrane+redox+system+is+modulated+through+signal+transduction+pathways+involving+cGMP+and+Ca2%2B+as+second+messengers%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Ehrlich cell plasma membrane redox system is modulated through signal transduction pathways involving cGMP and Ca2+ as second messengers.</a> J Bioenerg Biomembr. 27 (6), 605-611 (1995).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Nunez de Castro, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+plasma+membrane+redox+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Multifunctional plasma membrane redox systems.</a> Bioessays. 19 (11), 977-984 (1997).</li>
<li>Medina, M. A., del Castillo-Olivares, A., Schweigerer, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membrane+redox+activity+correlates+with+N-myc+expression+in+neuroblastoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Plasma membrane redox activity correlates with N-myc expression in neuroblastoma cells.</a> FEBS Lett. 311 (2), 99-101 (1992).</li>
<li>Diaz-Gomez, C., Villalba, J. M., Perez-Vicente, R., Crane, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+Stabilization+Is+Stimulated+in+rho%280%29HL-60+Cells+by+CoQ10+Increase+at+the+Plasma+Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Ascorbate Stabilization Is Stimulated in rho(0)HL-60 Cells by CoQ10 Increase at the Plasma Membrane.</a> Biochem Biophys Res Commun. 234 (0), 79-81 (1997).</li>
<li>Navarro, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+ubiquinone+in+vitamin+E+and+selenium-deficient+plasma+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biofactors%22%5BJournal%5D)">Protective role of ubiquinone in vitamin E and selenium-deficient plasma membranes.</a> Biofactors. 9 (2-4), 163-170 (1999).</li>
<li>Herst, P. M., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+surface+oxygen+consumption%3A+a+major+contributor+to+cellular+oxygen+consumption+in+glycolytic+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Cell surface oxygen consumption: a major contributor to cellular oxygen consumption in glycolytic cancer cell lines.</a> Biochim Biophys Acta. 1767 (2), 170-177 (2007).</li>
<li>Baoutina, A., Dean, R. T., Jessup, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+induces+macrophage-mediated+low+density+lipoprotein+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport induces macrophage-mediated low density lipoprotein oxidation.</a> FASEB J. 15 (9), 1580-1582 (2001).</li>
<li>Furukawa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+oxidative+stress+in+obesity+and+its+impact+on+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome.</a> J Clin Invest. 114 (12), 1752-1761 (2004).</li>
<li>Del Principe, D., Avigliano, L., Savini, I., Catani, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trans-plasma+membrane+electron+transport+in+mammals%3A+functional+significance+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Trans-plasma membrane electron transport in mammals: functional significance in health and disease.</a> Antioxid Redox Signal. 14 (11), 2289-2318 (2011).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Capacity+Redox+Control+at+the+Plasma+Membrane+of+Mammalian+Cells+Trans-Membrane%2C+Cell+Surface%2C+and+Serum+NADH-Oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">High-Capacity Redox Control at the Plasma Membrane of Mammalian Cells Trans-Membrane, Cell Surface, and Serum NADH-Oxidases.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 2 (2), 231-242 (2000).</li>
<li>Ishiyama, M., Shiga, M., Sasamoto, K., Mizoguchi, M., He, P. G. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/cpb1958/41/6/41_6_1118/_article">A New Sulfonated Tetrazolium Salt That Produces a Highly Water-Soluble Formazan Dye.</a> Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 41 (6), 1118-1122 (1993).</li>
<li>Berridge, M. V., Herst, P. M., Tan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetrazolium+dyes+as+tools+in+cell+biology%3A+New+insights+into+their+cellular+reduction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Annual+Review%22%5BJournal%5D)">Tetrazolium dyes as tools in cell biology: New insights into their cellular reduction.</a> Biotechnology Annual Review. 11, 127-152 (2005).</li>
<li>Gurtoo, H. L., Johns, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+interaction+of+the+electron+acceptor+2%2C6-dichlorophenolindophenol+with+bovine+milk+xanthine+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">On the interaction of the electron acceptor 2,6-dichlorophenolindophenol with bovine milk xanthine oxidase.</a> J Biol Chem. 246 (2), 286-293 (1971).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+trans-plasma+membrane+redox+pathways+reduce+cell-impermeable+dyes+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Rep%22%5BJournal%5D)">Distinct trans-plasma membrane redox pathways reduce cell-impermeable dyes in HeLa cells.</a> Redox Rep. 9 (6), 302-306 (2004).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+language+and+environment+for+statistical+computing%22">R: A language and environment for statistical computing</a>. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2013).</li>
<li>Peskin, A. V., Winterbourn, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microtiter+plate+assay+for+superoxide+dismutase+using+a+water-soluble+tetrazolium+salt+%28WST-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">A microtiter plate assay for superoxide dismutase using a water-soluble tetrazolium salt (WST-1).</a> Clinica Chimica Acta. 293 (1-2), 157-166 (2000).</li>
<li>Higaki, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+stimulates+skeletal+muscle+glucose+uptake+through+a+phosphatidylinositol+3-kinase-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress stimulates skeletal muscle glucose uptake through a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 294 (E889-E897), (2008).</li>
<li>Zuagg, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characteristics+and+some+chemical+propertiesof+N-methylphenazinium+methyl+sulfate+%28phenazine+methosulfate%29+and+pyocyanine+at+the+oxidation+level%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characteristics and some chemical propertiesof N-methylphenazinium methyl sulfate (phenazine methosulfate) and pyocyanine at the oxidation level.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3964-3970 (1964).</li>
<li>Dayan, J., Dawson, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate+specificity+of+ascorbate+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Substrate specificity of ascorbate oxidase.</a> Biochem Biophys Res Commun. 73 (2), 451-458 (1976).</li>
<li>Bellavite, P., della Bianca, V., Serra, M. C., Papini, E., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NADPH+oxidase+of+neurtrophils+forms+superoxide+anion+but+does+not+reduce+cytochrome+c+and+dichlorophenolindophenol%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS%22%5BJournal%5D)">NADPH oxidase of neurtrophils forms superoxide anion but does not reduce cytochrome c and dichlorophenolindophenol.</a> FEBS. 170 (1), 157-161 (1984).</li>
<li>Berridge, M. V., Tan, A. S., McCoy, K. D., Wang, R. <a target="_blank" href="https://scholar.google.com/scholar?hl=en&as_sdt=0,22&cluster=5895405450791166684">The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts.</a> Biochemica. 4, 15-20 (1996).</li>
<li>Tan, A. S., Berridge, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+produced+by+activated+neutrophils+efficiently+reduces+the+tetrazolium+salt%2C+WST-1+to+produce+a+soluble+formazan%3A+a+simple+colorimetric+assay+for+measuring+respiratory+burst+activation+and+for+screening+anti-inflammatory+agents%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Superoxide produced by activated neutrophils efficiently reduces the tetrazolium salt, WST-1 to produce a soluble formazan: a simple colorimetric assay for measuring respiratory burst activation and for screening anti-inflammatory agents.</a> J Immunol Methods. 238 (1-2), 59-68 (2000).</li>
<li>Phillips, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myricetin+induces+pancreatic+cancer+cell+death+via+the+induction+of+apoptosis+and+inhibition+of+the+phosphatidylinositol+3-kinase+%28PI3K%29+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Myricetin induces pancreatic cancer cell death via the induction of apoptosis and inhibition of the phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) signaling pathway.</a> Cancer Letters. 308 (2), 181-188 (2011).</li>
<li>Altundag, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quercetin-induced+cell+death+in+human+papillary+thyroid+cancer+%28B-CPAP%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thyroid+research%22%5BJournal%5D)">Quercetin-induced cell death in human papillary thyroid cancer (B-CPAP) cells.</a> Journal of thyroid research. 2016 (8), (2015).</li>
<li>Ukeda, H., Kawana, D., Maeda, S., Sawamura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+Assay+for+Superoxide+Dismutase+Based+on+the+Reduction+of+Highly+Water-soluble+Tetrazolium+Salts+by+Xanthine-Xanthine+Oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric Assay for Superoxide Dismutase Based on the Reduction of Highly Water-soluble Tetrazolium Salts by Xanthine-Xanthine Oxidase.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 63 (3), 485-488 (1999).</li>
<li>Halaka, F. G., Babcock, G. T., Dye, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties+of+5-methylphenazinium+methyl+sulfate.+Reaction+of+the+oxidized+form+with+NADH+and+of+the+reduced+form+with+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Properties of 5-methylphenazinium methyl sulfate. Reaction of the oxidized form with NADH and of the reduced form with oxygen.</a> J Biol Chem. 257 (3), 1458-1461 (1982).</li>
<li>Maghzal, G. J., Krause, K. H., Stocker, R., Jaquet, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+reactive+oxygen+species+derived+from+the+family+of+NOX+NADPH+oxidases%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Detection of reactive oxygen species derived from the family of NOX NADPH oxidases.</a> Free Radic Biol Med. 53 (10), 1903-1918 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Przedstawiliśmy dwie metody wykorzystania zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów, WST-1 i DPIP, w testach spektrofotometrycznych do monitorowania tPMET w miotubach C2C12. Dzięki wzrostowi linii komórkowych w standardowych procedurach hodowli i czytnikowi płytek spektrofotometru, możliwe jest monitorowanie tPMET za pomocą tych akceptorów elektronów w prostym teście mikropłytkowym. Redukcja WST-1 jest odtwarzalna od studni do studni w teście, ale występuje zmienność z dnia na dzień. Dzienny współczynnik zmienności (CV) ...

Zdolność oczyszczonych błon plazmatycznych do redukcji akceptorów elektronów doprowadziła do wniosku, że błona plazmatyczna ma wrodzoną zdolność redoks1. Wcześniej obserwowany u grzybów, roślin i zwierząt, tPMET jest procesem wspólnym dla wielu organizmów2,3,4,5. W szczególności proces ten wykazano w Saccharomyces cerevisiae, komórkach marchwi, erytrocytach, limfocytach, kostniakomięsaku, czerniaku, makrofagach, mięśniach szkieletowych i neutrofilach2,3,4,5,6,7. W procesie, który transportuje elektrony przez błonę plazmatyczną w celu redukcji zewnątrzkomórkowych utleniaczy, tPMET bierze udział w wielu funkcjach komórkowych, w tym: wzrost komórek5,8, żywotność komórki9, metabolizm żelaza10, sygnalizacja komórkowa11,12,13 oraz ochrona przed reaktywnymi formami tlenu12,14,15. Ze względu na udział tPMET w wielu funkcjach komórkowych, przypuszcza się, że brak równowagi tPMET przyczynia się do rozwoju niektórych poważnych schorzeń, w tym raka16, choroby układu krążenia17 i zespół metaboliczny18.
Istnieje wiele sposobów monitorowania transferu elektronów przez błonę plazmatyczną, ale najczęściej używaną techniką jest ocena redukcji zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów za pomocą testów kolorymetrycznych. Powszechnie stosowanymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów są sole tetrazoliowe, DPIP, FeCN i żelazochrom c19,20. Najczęściej stosowaną solą tetrazolową jest sól drugiej generacji znana jako WST-119. Związek ten jest łatwiejszy do wykorzystania w testach kolorymetrycznych w porównaniu z solami tetrazolowymi pierwszej generacji ze względu na dwie grupy sulfonianów, które zwiększają jego rozpuszczalność w wodzie21. WST-1, w połączeniu z pośrednim akceptorem elektronów 1-metoksy-fenazynosiarczanem (mPMS), ulega redukcji w dwóch zdarzeniach przeniesienia pojedynczego elektronu. Ta redukcja zmienia słabo zabarwioną, utlenioną formę WST-1 na bardziej intensywną, żółtą formazan20,22. WST-1 ma wysoki współczynnik ekstynkcji molowej wynoszący 37 x 103 M-1 cm-1, co prowadzi do wysokiej czułości testu21,22. DPIP jest również wykorzystywany jako zewnątrzkomórkowy akceptor elektronów do monitorowania tPMET. Wykazano, że DPIP może być redukowany zewnątrzkomórkowo przez tPMET bez pomocy pośrednich akceptorów elektronów23,24. Ze względu na brak pośrednich akceptorów elektronów, DPIP może bezpośrednio odbierać elektrony z błony plazmatycznej, w przeciwieństwie do WST-124. Podobnie jak w przypadku DPIP, wykazano, że FeCN jest redukowany zewnątrzkomórkowo do żelazocyjanku przez tPMET bez pomocy pośrednich akceptorów elektronów19,24. W przeciwieństwie do WST-1 i DPIP, FeCN ma niski współczynnik ekstynkcji molowej, co prowadzi do niższej czułości testu9. Innym powszechnie stosowanym zewnątrzkomórkowym akceptorem elektronów do monitorowania tPMET jest żelazorytochrom c. Podobnie jak w przypadku WST-1, redukcja żelazorytochromu c zwiększa się przy użyciu pośredniego akceptora elektronów, mPMS22. Jednak w przeciwieństwie do WST-1, metoda ferrycytochromu c jest mniej czuła ze względu na wysokie tło i niski współczynnik ekstynkcji molowej22.
Tutaj prezentujemy metodę analizy tPMET w czasie rzeczywistym za pomocą testów spektrofotometrycznych. W metodzie wykorzystano zewnątrzkomórkowe akceptory elektronów WST-1 i DPIP, ponieważ oba mają wysoki współczynnik ekstynkcji molowej, a jednocześnie są tańsze w porównaniu z innymi powszechnie stosowanymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów, takimi jak ferrycytochrom c. Użyliśmy metosiarczanu fenazyny (PMS) zamiast mPMS, mają one podobny skład chemiczny, a PMS jest znacznie tańszy. mPMS jest stabilny fotochemicznie, co jest ważną cechą zestawu komercyjnego, który wymaga długiego okresu przydatności do spożycia. Jednak sprawiamy, że PMS jest świeży dla każdego testu, więc stabilność nie powinna być problemem. Przedstawiamy również metodę oceny możliwych oddziaływań enzymatycznych (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 1) między zewnątrzkomórkowym akceptorem elektronów a enzymami, które można wykorzystać do dalszego scharakteryzowania procesu tPMET. W szczególności enzymy AO i SOD mogą być używane do określania, która część tPMET jest spowodowana transportem askorbinianu lub zewnątrzkomórkowym uwalnianiem ponadtlenku, dwiema powszechnymi metodami transportu elektronów przez błonę plazmatyczną.

<table><tbody><tr><td>Kolekcja kultur typu amerykańskiego C2C12 mioblastów</td><td>&nbsp;</td><td>CRL-1772</td><td></td></tr><tr><td>Zmodyfikowany orzeł Dulbecco średnio - niski poziom glukozy</td><td>Sigma</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Plex kompleks surowicy zwierzęcej</td><td>Gemini Bio-Products&nbsp;</td><td>100-602</td><td></td></tr><tr><td>penicylina-streptomycyna</td><td>Sigma</td><td>516106</td><td></td></tr><tr><td>surowica konia</td><td>Gibco Technologies</td><td>16050-130</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>trypsyna-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4049</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia hodowlane 15 cm</td><td>TPP</td><td>93150</td><td></td></tr><tr><td>96 dołków płytki hodowlane</td><td>TPP</td><td>92096</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa 2-(4-jodofenylo)-3-(4-nitrofenylo)-5-(2,4-disulfofenylo)-2H-tetrazolium (WST-1)</td><td>Accela ChemBio&nbsp; Inc</td><td>SY016315</td><td></td></tr><tr><td>metosiarczan fenazyny&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Kwas L-askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>oksydaza askorbinianowa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A0157</td><td></td></tr><tr><td>dysmutaza ponadtlenkowa&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S5395</td><td></td></tr><tr><td>Sól sodowa 2,6-dichloroindofenolu&nbsp;</td><td>ICN Biomedicals</td><td>215011825</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-glukoza</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sól sodowa</td><td>Sigma</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP366</td><td></td></tr><tr><td>siarczan magnezu siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>M5921</td><td></td></tr><tr><td>dwuwodny chlorek wapnia</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>fosforan potasu</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>BP363</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania białek Pierce BCA</td> Spektrofotometr <td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Powerwave X-I</td><td>Wycofane z produkcji Biotek Insturment</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr Spectronic Genesys 5</td><td>Thermo Scientific</td><td>336001</td><td></td></tr><tr><td>Mikropłytka PureGrade 96-dołkowa, z dnem F, przezroczysta, nieobrobiona, niesterylna</td><td>MidSci</td><td>781602</td><td></td></tr><tr><td>Czterowodny chlorek żelaza (II)</td><td>Sigma</td><td>220299</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan żelaza (II) siedmiowodny</td><td>Sigma</td><td>215422</td><td></td></tr><tr><td>hipoksantyna</td><td>Sigma</td><td>H9636</td><td></td></tr><tr><td>oksydaza ksantynowa</td><td>Sigma</td><td>X4500</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R Studio</td><td>Rstudio</td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/</td></tr> <tr><td>KC4</td><td>Biotek Insturments</td><td>wycofane&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki c2c12

Measuring Trans-Plasma Membrane Electron Transport by C2C12 Myotubes

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) odgrywa rolę w ochronie komórek przed wewnątrzkomórkowym stresem redukcyjnym, jak również w ochronie przed uszkodzeniem przez zewnątrzkomórkowe utleniacze. Ten proces transportu elektronów z reduktorów wewnątrzkomórkowych do utleniaczy zewnątrzkomórkowych nie jest dobrze zdefiniowany. W tym artykule przedstawiono testy spektrofotometryczne za pomocą miotub C2C12 do monitorowania tPMET z wykorzystaniem zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów: rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolu-1 (WST-1) i 2,6-dichlorofenolindofenolu (DPIP lub DCIP). Dzięki redukcji tych akceptorów elektronów jesteśmy w stanie monitorować ten proces w analizie w czasie rzeczywistym. Po dodaniu do testów enzymów, takich jak oksydaza askorbinianowa (AO) i dysmutaza ponadtlenkowa (SOD), możemy określić, która część tPMET jest spowodowana odpowiednio eksportem askorbinianu lub produkcją ponadtlenków. Podczas gdy wykazano, że WST-1 daje stabilne wyniki przy niskim tle, DPIP był w stanie ponownie utlenić się po dodaniu AO i SOD, co wykazano za pomocą analizy spektrofotometrycznej. Metoda ta demonstruje wielodołkowy, szybki test spektrofotometryczny w czasie rzeczywistym, który ma przewagę nad innymi metodami stosowanymi do monitorowania tPMET, takimi jak redukcja żelazocyjanku (FeCN) i żelazorytochromu c.

Analizy statystyczne przeprowadzono przy użyciu testu ANOVA z powtarzanymi pomiarami w oprogramowaniu statystycznym RStudio25. Wielkości prób podano w legendach do rycin.
W celu monitorowania tPMET wykorzystano miotuby C2C12 wraz z pozakomórkowymi akceptorami elektronów, WST-1 i DPIP. AO zastosowano w celu określenia, jaka część redukcji WST-1 i DPIP wynikała z odpływu askorbinianu, natomiast SOD wykorzys...

Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

Trans-plasma membrane electron transport (tPMET) plays a role in protection of cells from intracellular reductive stress as well as protection from damage ...

Ogólnym celem tej procedury jest monitorowanie procesu transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną w czasie rzeczywistym za pomocą testów spektrofotometrycznych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii radox dotyczące mechanizmu transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną i sposobu utrzymywania środowiska redoks w komórce. Główną zaletą tej techniki jest to, że test jest szybkim testem spektrofotometrycznym w czasie rzeczywistym, wielodołkowym.Na początek umieść komórki przylegające C2C-12 dwa razy 10 do 4 komórek na centymetr kwadratowy w rzędach od A do F płytki 96-dołkowej, a następnie przykryj komórki pożywką wzrostową. Inkubuj komórki w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla. Po 24 godzinach w hodowli odessać pożywkę wzrostową, przemyć 150 mikrolitrami PBS, zastąpić pożywką różnicującą i inkubować komórki przez dodatkowe 24 do 48 godzin.Następnie przygotuj standardowe roztwory WST-1 i PMS. Przygotować 10-milimolowy roztwór podstawowy WST-1, rozpuszczając 033 gramy WST-1 w pięciu mililitrach PBS. Następnie zwiruj roztwór.Następnie przygotuj roztwór podstawowy PMS, rozpuszczając 0023 gramy PMS w 1,5 mililitra zjonizowanej wody. Wiruj roztwór. Aby przygotować roztwór roboczy, dodaj glukozę do PBS, aby uzyskać 11,4 mililitra pięciomilimolowego roztworu glukozy.Do tego roztworu dodać 480 mikrolitrów roztworu podstawowego WST-1 dla końcowego stężenia 400 mikromolowych WST-1 i 48 mikrolitrów roztworu podstawowego PMS dla końcowego stężenia 20 mikromolowych PMS. Wiruj roztwory do mieszania. Następnie podziel roztwór na dwie sześciomililitrowe porcje.W zależności od testu należy dodać odpowiednie składniki opisane tutaj. Mając teraz przygotowane roztwory, odessać pożywki różnicujące z komórek i przemyć je raz 150 mikrolitrami PBS. Usunąć PBS i dodać 100 mikrolitrów z podwielokrotności jeden do kolumn od pierwszej do szóstej.I dodaj 100 mikrolitrów z podwielokrotności drugiej do kolumn od siódmej do dwunastej płytki 96-dołkowej. Umieść 96-dołkową płytkę w czytniku płytek i mierz wartości absorbancji co 10 minut przez godzinę przy 438 nanometrach. Po końcowym odczycie odessać pożywkę i umyć każdą studzienkę 150 mikrolitrami PBS.Następnie odessać PBS. Na potrzeby analizy należy obliczyć zmianę absorbancji dla każdej studzienki, odejmując początkową absorbancję dla studzienki od absorbancji w dowolnym późniejszym punkcie czasowym dla tej samej studzienki. Skorygować tę zmianę w oparciu o zmianę absorbancji zaobserwowaną w studzienkach tła.Po skorygowaniu tła znormalizuj dane absorbancji do 60-minutowych pomiarów kontrolnych. Alternatywnie, znormalizuj zawartość białka w każdym dołku za pomocą standardowego testu białka BCA. Na koniec określ ilościowo dane, aby uzyskać ilość redukcji WST-1 o mikrogram białka.Aby rozpocząć test redukcji DPIP, należy wyhodować i zróżnicować komórki adhezyjne C2C-12, jak pokazano w teście redukcji WST-1. Następnie przygotuj roztwór podstawowy zawierający 10 milimolowy DPIP, rozpuszczając 029 gramów DPIP w 10 mililitrach zjonizowanej wody. Następnie zwiruj roztwór.Potwierdzić stężenie, mierząc absorbancję roztworu przy 600 nanometrach za pomocą spektrofotometru. Aby przygotować roztwór roboczy, dodaj 120 mikrolitrów 10-milimolowego roztworu podstawowego DPIP do 11,88 mililitra pięciomilimolowego roztworu glukozy i PBS, aby uzyskać końcowe stężenie robocze DPIP 100 mikromolowych. Następnie zwiruj roztwór.Następnie podziel roztwór na dwie podwielokrotności po sześć mililitrów. W zależności od testu należy dodać odpowiednie składniki opisane tutaj. Mając teraz przygotowane roztwory, odessać pożywki różnicujące z komórek i przemyć je raz 150 mikrolitrami PBS.Usunąć PBS i dodać 100 mikrolitrów z podwielokrotności pierwszej do kolumn od pierwszej do szóstej i 100 mikrolitrów z podwielokrotności drugiej do kolumn od siódmej do dwunastej płytki 96-dołkowej. Umieścić 96-dołkową płytkę w czytniku płytek i mierzyć wartości absorbancji co 10 minut przez godzinę przy 600 nanometrach i analizować uzyskane wartości zgodnie z opisem w analizie testu redukcji WST-1. Na początek przygotuj dwa rozwiązania.Najpierw przygotuj sześć mililitrów 400 mikromolowych WST-1 i 20 mikromolowych PMS w PBS. Następnie przygotuj sześć mililitrów 100 mikromolowego roztworu DPIP i PBS. Przygotować pierwszą 96-dołkową płytkę, dodając 100 mikrolitrów roztworu WST-1/PMS do rzędów od A do D na płaskiej płytce dennej przy braku komórek i zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy 438 nanometrach.Następnie przygotować drugą 96-dołkową płytkę, dodając 100 mikrolitrów roztworu DPIP do rzędów od A do D na płaskiej płytce dennej pod nieobecność komórek i zmierzyć absorbancję w spektrofotometrze przy 600 nanometrach. Następnie dodaj jeden mikrolitr 10-milimolowego askorbinianu do połowy studzienek, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mikromolowych. Monitorować absorbancję w płytce, aż się ustabilizuje.Następnie powtórz z DPIP. Po ustabilizowaniu określ, czy wytworzone akceptory elektronów są substratami. W przypadku oksydazy askorbinianowej dla dysmutacji ponadtlenkowych, dodając oksydazę askorbinianową lub dysmutacje supertlenków do każdego dołka i monitorując zmianę absorbancji przez jedną godzinę.Aby monitorować transport elektronów przez błonę transplazmatyczną, oksydazę askorbinianową użyto do zablokowania efektów redukcji za pośrednictwem askorbinianu, a dysmutazy ponadtlenkowej użyto do zablokowania redukcji za pośrednictwem ponadtlenku, aby określić, która część redukcji WST-1 była spowodowana każdym składnikiem. Po dodaniu oksydazy askorbinianowej redukcja WST-1 została stłumiona o około 30%, co wskazuje, że około 30% transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną było spowodowane eksportem askorbinianu. Po dodaniu dysmutazy ponadtlenkowej redukcja WST-1 została stłumiona o około 70%, co wskazuje, że około 70% transportu elektronów w błonie transplazmatycznej było spowodowane zewnątrzkomórkowym uwalnianiem ponadtlenku.Aby ustalić, czy obniżony DPIP jest substratem dla oksydazy askorbinianowej lub dysmutazy supertlenkowej, poziomy DPIP obniżono za pomocą kwasu askorbinowego. Po 20 minutach dodano oksydazę askorbinianową i monitorowano absorbancję. Odzysk pokazuje, że obniżony DPIP jest substratem dla oksydazy askorbinianowej.Po dodaniu dysmutazy ponadtlenkowej DPIP również uległ reoksydacji, choć w wolniejszym tempie; w związku z tym zredukowany DPIP jest substratem dla tych enzymów, a nie odpowiednim zewnątrzkomórkowym akceptorem elektronów do wykorzystania z tymi enzymami. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dwóch godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby wszystkie odczynniki były świeże każdego dnia.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią redoks do zbadania transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną w różnych typach komórek. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć transport elektronów w błonie transplazmatycznej za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów, a także jak określić, czy akceptor elektronów może być substratem dla enzymów wykorzystywanych w teście.

measuring-trans-plasma-membrane-electron-transport-by-c2c12-myotubes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Regulowana endocytoza kontroluje poziomy ekspresji na powierzchni komórki dla większości białek błonowych. W niniejszym opracowaniu wykorzystujemy redukowalne, nieprzenikające przez błonę odczynniki do biotinylacji, aby zmierzyć tempo endocytozy transportera dopaminy (DAT), który jest politopeowym białkiem błonowym. Metoda ta umożliwia prostą procedurę pomiaru tempa endocytozy większości białek błony plazmatycznej.

Pomiar szybkości endocytozy białek błony plazmatycznej za pomocą odwracalnego znakowania biotyną

Przedstawiono opis metody profilowania funkcji mitochondriów w komórkach. Wygenerowany profil mitochondrialny dostarcza czterech parametrów funkcji mitochondriów, które można zmierzyć w jednym eksperymentcie: podstawowego tempa oddychania, oddychania związanego z syntezą ATP, przecieku protonów oraz wydolności rezerwowej.

Eksperyment profilu bioenergetycznego z wykorzystaniem komórek mioblastów C2C12

Zakres wlotu Ca2+ zależnego od zapasów (SOCE) można monitorować przy użyciu fluorescencyjnych wskaźników Ca2+. Wygaszanie tych wskaźników przez Mn2+ pozwala na badanie SOCE w hodowlach komórkowych i włóknach mięśni szkieletowych. Opisano również technikę umożliwiającą rozdzielczość przestrzenną i czasową SOCE poprzez obrazowanie konfokalne mechanicznie odskórkowanych włókien mięśniowych.

Pomiar wewnątrzkomórkowego napływu wapnia sterowanego zapasami w żywych komórkach z wykorzystaniem fluorescencji: od hodowlanych komórek nowotworowych po włókna mięśni szkieletowych

W niniejszym opracowaniu przedstawiono protokół spektrofluorometryczny do pomiaru otwarcia mitochondrialnego poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy. Analiza obejmuje jednoczesny pomiar gospodarki Ca2+ w mitochondriach, potencjału błony mitochondrialnej oraz objętości mitochondriów. Opisano również procedurę pozyskiwania wysokiej jakości funkcjonalnych mitochondriów serca.

Wieloparametryczny pomiar otwierania poru przejścia przepuszczalności w izolowanych mitochondriach serca myszy

Mięśnie szkieletowe są niezbędne do poruszania się i są głównym magazynem białka w organizmie. Pomiary zdrowia mięśni w obrębie C. Opisano elegans. Potencjalne zmiany w strukturze i funkcji mięśni ocenia się za pomocą zlokalizowanego GFP i barwników kationowych.

Metody oceny subkomórkowych kompartmentów mięśniowych u C. elegans

Opisano metody biopsji mięśnia obszernego bocznego, przygotowania oczyszczonych mitochondriów i profilowania respirometrycznego. Wykorzystanie małej objętości mięśniowej sprawia, że technika ta nadaje się do zastosowań w badaniach klinicznych.

Przygotowanie i ocena respirometryczna mitochondriów wyizolowanych z tkanki mięśni szkieletowych uzyskana metodą przezskórnej biopsji igłowej

Przedstawione metody dostarczają instrukcji krok po kroku do wykonania zbioru testów respirometrycznych opartych na mikropłytkach przy użyciu izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy. Testy te są w stanie zmierzyć mechanistyczne zmiany/adaptacje w mitochondrialnym zużyciu tlenu w powszechnie używanym modelu zwierzęcym.

Wykorzystanie izolowanych mitochondriów z minimalnych ilości mięśni szkieletowych myszy do wysokoprzepustowych pomiarów oddechowych na mikropłytkach

Tutaj prezentujemy protokół do badania molekularnego mechanizmu translokacji protonów przez błony lipidowe pojedynczych liposomów, używając cytochromu bo3 jako przykładu. Łącząc elektrochemię i mikroskopię fluorescencyjną, zmiany pH w świetle pojedynczych pęcherzyków, zawierających jeden lub wiele enzymów, mogą być wykrywane i analizowane indywidualnie.

Pomiary pojedynczych liposomów do badania enzymów błonowych pompujących protony przy użyciu elektrochemii i mikroskopii fluorescencyjnej

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Mitochondria są kluczowymi organellami metabolicznymi, które wykazują wysoki poziom plastyczności fenotypowej w mięśniach szkieletowych. Import białek z cytozolu jest krytycznym szlakiem biogenezy organelli, niezbędnym do ekspansji retikulum i utrzymania funkcji mitochondriów.  Dlatego import białka służy jako barometr zdrowia komórek.

Pomiar zdolności importowej białek z mitochondriów mięśni szkieletowych

Ten protokół opisuje test porównawczy, wykorzystujący aktywność kompleksu mitochondrialnego CI+CIII i CII+CIII w obecności lub braku Na+, w celu zbadania istnienia częściowo segmentowanych funkcjonalnych pul CoQ.

Wrażliwość wewnętrznej błony mitochondrialnej na Na+ ujawnia częściowo segmentowane funkcjonalne pule CoQ

Poznaj metodę spektrofotometrycznego pomiaru transportu elektronów przez błonę plazmatyczną w komórkach C2C12 w czasie rzeczywistym. Ta technika umożliwia badanie mechanizmów biologii redoks i utrzymania równowagi redoks w komórkach.

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

Przeglądaj więcej filmów