Name: Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 24 s
Description: Poznaj metodę poklatkowego obrazowania 3D fagocytozy w makrofagach myszy przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia wizualizację pochłaniania cząsteczek w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty HA 3271/4-1 i HA 3271/4-2 z DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft), oraz grant FF-2016-05 z EXC 1003 (Cluster of Excellence 1003), Cells in Motion (CiM), DFG.

<ol><li>Tauber, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metchnikoff+and+the+phagocytosis+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Metchnikoff and the phagocytosis theory.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 4, 897-901 (2003).</li>
<li>Kaplan, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+the+mode+of+phagocytosis+with+Fc+and+C3+receptors+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Differences in the mode of phagocytosis with Fc and C3 receptors in macrophages.</a> Scandinavian journal of immunology. 6, 797-807 (1977).</li>
<li>Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+cytochalasin+and+phalloidin+on+actin%5BTitle%5D)+AND+%22The+journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Effects of cytochalasin and phalloidin on actin.</a> The journal of cell biology. 105, 1473-1478 (1987).</li>
<li>Caron, E., Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+two+distinct+mechanisms+of+phagocytosis+controlled+by+different+Rho+GTPases%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Identification of two distinct mechanisms of phagocytosis controlled by different Rho GTPases.</a> Science. 282, 1717-1721 (1998).</li>
<li>Aderem, A., Underhill, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+phagocytosis+in+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+review+of+immunology%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of phagocytosis in macrophages.</a> Annual review of immunology. 17, 593-623 (1999).</li>
<li>Chimini, G., Chavrier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Rho+family+proteins+in+actin+dynamics+during+phagocytosis+and+engulfment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Function of Rho family proteins in actin dynamics during phagocytosis and engulfment.</a> Nature cell biology. 2, E191-E196 (2000).</li>
<li>Castellano, F., Chavrier, P., Caron, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11708890">Actin dynamics during phagocytosis.</a> Seminars in immunology. 13, 347-355 (2001).</li>
<li>Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+cups+into+phagosomes+and+macropinosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Molecular+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Shaping cups into phagosomes and macropinosomes.</a> Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 639-649 (2008).</li>
<li>Underhill, D. M., Goodridge, H. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22699831">Information processing during phagocytosis.</a> Nature reviews. Immunology. 12, 492-502 (2012).</li>
<li>Munthe-Kaas, A. C., Kaplan, G., Seljelid, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+internalization+of+opsonized+particles+by+rat+Kupffer+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+cell+research%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of internalization of opsonized particles by rat Kupffer cells in vitro.</a> Experimental cell research. , 201-212 (1976).</li>
<li>Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+membrane+structures+during+phagocytosis+and+chemotaxis+of+macrophages%3A+role+and+regulation+of+the+actin+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Immunological+reviews%22%5BJournal%5D)">Generation of membrane structures during phagocytosis and chemotaxis of macrophages: role and regulation of the actin cytoskeleton.</a> Immunological reviews. , 222-239 (2013).</li>
<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoscale+optomechanical+actuators+for+controlling+mechanotransduction+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Nanoscale optomechanical actuators for controlling mechanotransduction in living cells.</a> Nature. 13, 143-146 (2016).</li>
<li>Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia+using+gaseous+agents+in+laboratory+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+animals%22%5BJournal%5D)">Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents.</a> Laboratory animals. 50, 241-253 (2016).</li>
<li>McCarren, H. S., Moore, J. T., Kelz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+changes+in+volatile+general+anesthetic+sensitivity+of+mice+after+local+or+systemic+pharmacological+intervention%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Assessing changes in volatile general anesthetic sensitivity of mice after local or systemic pharmacological intervention.</a> Journal of visualized experiments. (80), e51079(2013).</li>
<li>Horsthemke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+roles+of+filopodial+dynamics+in+particle+capture+and+phagocytosis+and+phenotypes+of+Cdc42+and+Myo10+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion.</a> The Journal of biological chemistry. 292, 7258-7273 (2017).</li>
<li>Bzymek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+two-+and+three-dimensional+imaging+of+monocyte+motility+and+navigation+on+planar+surfaces+and+in+collagen+matrices%3A+Roles+of+Rho%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: Roles of Rho.</a> Scientific reports. 6, 25016(2016).</li>
<li>Poole, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+cell+antigens+on+band+3+and+glycophorin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+reviews%22%5BJournal%5D)">Red cell antigens on band 3 and glycophorin A.</a> Blood reviews. 14, 31-43 (2000).</li>
<li>Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Comprehensive+review+of+our+current+understanding+of+red+blood+cell+%28RBC%29+glycoproteins%5BTitle%5D)+AND+%22Membranes%22%5BJournal%5D)">A Comprehensive review of our current understanding of red blood cell (RBC) glycoproteins.</a> Membranes. 7, (2017).</li>
<li>Song, L., Hennink, E. J., Young, I. T., Tanke, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photobleaching+kinetics+of+fluorescein+in+quantitative+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journal%22%5BJournal%5D)">Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy.</a> Biophysical journal. 68, 2588-2600 (1995).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of immunological. 342, 71-77 (2009).</li>
<li>Boross, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FcRgamma-chain+ITAM+signaling+is+critically+required+for+cross-presentation+of+soluble+antibody-antigen+complexes+by+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunology%22%5BJournal%5D)">FcRgamma-chain ITAM signaling is critically required for cross-presentation of soluble antibody-antigen complexes by dendritic cells.</a> Journal of immunology. , Baltimore, Md. 5506-5514 (2014).</li>
<li>Ehrenstein, M. R., Notley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+importance+of+natural+IgM%3A+scavenger%2C+protector+and+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">The importance of natural IgM: scavenger, protector and regulator.</a> Nature reviews. Immunology. 10, 778-786 (2010).</li>
<li>Closse, C., Dachary-Prigent, J., Boisseau, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphatidylserine-related+adhesion+of+human+erythrocytes+to+vascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+haematology%22%5BJournal%5D)">Phosphatidylserine-related adhesion of human erythrocytes to vascular endothelium.</a> British journal of haematology. , 300-302 (1999).</li>
<li>Barth, N. D., Marwick, J. A., Vendrell, M., Rossi, A. G., Dransfield, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%26%2334%3Bphagocytic+synapse%26%2334%3B+and+clearance+of+apoptotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+immunology%22%5BJournal%5D)">The &#34;phagocytic synapse&#34; and clearance of apoptotic cells.</a> Frontiers in immunology. 8, 1708(2017).</li>
<li>Sivagnanam, U., Palanirajan, S. K., Gummadi, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+human+phospholipid+scramblases+in+apoptosis%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+biophysica+acta%22%5BJournal%5D)">The role of human phospholipid scramblases in apoptosis: An overview.</a> Biochimica et biophysica acta. 1864, 2261-2271 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Zdecydowana większość testów fagocytozy, zwłaszcza testów punktu końcowego i testów wysokoprzepustowych, nie zapewnia wizualizacji tego, w jaki sposób cząstki są faktycznie wychwytywane, otaczane i spożywane. Pionierskie badania Munthe-Kaas i wsp.10 i Kaplan2 w latach siedemdziesiątych XX wieku sugerowali, że uderzająco różne reorganizacje cytoszkieletu były zaangażowane w fagocytozę cząstek opsonizowanych IgG w porównaniu z opsonizowanymi dopełniaczami (czerwone krwinki owiec). Tutaj opisujemy testy fagocytozy za pomocą mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem, która umożliwia obrazowanie pojedynczych zdarzeń fagocytarnych w czasie rzeczywistym w wysokiej rozdzielczości. Nasz modelowy fagocyt to makrofag otrzewnowy rezydujący u myszy, który można wyizolować przy minimalnej obsłudze, a jako cząsteczki używamy świeżo izolowanych ludzkich czerwonych krwinek. Jednak testy fagocytozy można zastosować do innych fagocytów, takich jak makrofagi lub neutrofile pochodzące ze szpiku kostnego myszy, linie komórkowe makrofagów myszy, makrofagi pochodzące z ludzkich monocytów lub neutrofile ludzkiej krwi obwodowej. W przypadku ludzkich fagocytów lub mysich neutrofili wymagane byłyby alternatywne przeciwciała znakowane fluorescencyjnie, takie jak znakowane fluorescencyjnie przeciwciała anty-CD14 (ludzkie monocyty/makrofagi)16 lub przeciwciała anty-Gr-1 (Ly-6G) (neutrofile mysie).
Nieopsonizowane ludzkie krwinki czerwone, podobnie jak tradycyjnie używane czerwone krwinki owcze, są obojętne w tym sensie, że komórki te nie są (lub przynajmniej bardzo rzadko) spożywane przez makrofagi otrzewnowej myszy. Zapewnia to, w przeciwieństwie do kulek polistyrenowych, niską aktywność tła. Ludzkie krwinki czerwone mogą być wygodnie opsonizowane immunoglobulinami przy użyciu mysich przeciwciał monoklonalnych IgG lub IgM przeciwko CD235a (glikoforynie A), specyficznemu markerowi ludzkich erytrocytów (czerwonych krwinek) i prekursorów erytroidalnych17,18. W testach równoległych można zastosować znakowane fluorescencyjnie przeciwciała drugorzędowe anty-mysie IgG lub IgM w celu potwierdzenia opsonizacji. Klasy przeciwciał IgG i IgM to hemaglutyniny, substancje (przeciwciała), które powodują aglutynację czerwonych krwinek. Aby uniknąć aglutynacji, przerywanie mieszamy zawiesinę komórkową podczas 8-minutowego okresu inkubacji z przeciwciałem anty-CD235a, a następnie dodajemy zmieszaną zawiesinę bezpośrednio do szkiełka kanałowego zawierającego makrofagi (szkiełko pokryte fibronektyną) bez etapu płukania. Etapy płukania polegają na sedymentacji czerwonych krwinek przez wirowanie, co silnie sprzyja aglutynacji. Przed opsonizacją ludzkich czerwonych krwinek oznaczamy błonę plazmatyczną lipofilową pomarańczowo-czerwoną sondą fluorescencyjną. Sonda ta jest jaskrawo fluorescencyjna na początku nagrań poklatkowych, ale sygnał stopniowo zanika, prawdopodobnie głównie z powodu fotowybielania19. Ponadto makrofagi i powłoka fibronektyny szkiełka mogą stać się słabo pomarańczowo-czerwone fluorescencyjne podczas nagrań. Problem ten jest prawdopodobnie spowodowany niewystarczającym myciem ludzkich czerwonych krwinek po oznakowaniu. Zamiast używać lipofilowego fluorescencyjnego markera błony plazmatycznej, ludzkie czerwone krwinki można znakować wrażliwą na pH pochodną rodaminy przy użyciu jej reaktywnego aminowego estru sukcynimidylu15,20. Ma to tę zaletę, że umożliwia wizualizację dojrzewania fagosomów, ponieważ intensywność fluorescencji wzrasta wraz ze spadkiem pH15,20, ale takie podejście ma tę wadę, że reaktywne preparaty estrowe są obecnie drogie i niestabilne po rozpuszczeniu w środowisku wodnym.
Ludzkie krwinki czerwone z opsonizacją IgG są spożywane za pośrednictwem FcγR, co można potwierdzić za pomocą makrofagów otrzewnowych wyizolowanych od myszy NOTAM21 lub Fcer1g-/- (nokaut Fcer1g). Makrofagi NOTAM wiążą ludzkie krwinki czerwone opsonizowane IgG, ale brakuje im sygnalizacji za pośrednictwem ITAM (immunoreceptor tyrozynowy oparty na motywie aktywacji), wymaganej do indukcji fagocytozy, podczas gdy makrofagi nokautujące Fcer1g nie wyrażają powierzchniowych FcγR. IgG- lub IgM-opsonizowane ludzkie krwinki czerwone mogą być dodatkowo opsonizowane C3b (który jest rozszczepiony do iC3b) poprzez inkubację komórek ze świeżo wyizolowaną surowicą od myszy o zerowym dopełniaczu C5 (surowica typu dzikiego powoduje hemolizę). Opsoniny IgG i IgM aktywują klasyczną kaskadę dopełniacza, co prowadzi do powstawania porów (kompleksów atakujących błony) i lizy komórek. U myszy pozbawionych dopełniacza C5 kaskada dopełniacza przechodzi do rozszczepienia dopełniacza C3, ale konwertazie C5 brakuje substratu wymaganego do katalizowania szlaku końcowego. Opracowaliśmy proste testy do pomiaru kinetyki kaskady dopełniacza. Krótko mówiąc, ludzkie czerwone krwinki mogą być znakowane za pomocą czerwonego fluorescencyjnego markera błony plazmatycznej i zielonego fluorescencyjnego, cytozolowego fluoroforu. Po utworzeniu kompleksu atakującego błonę, utworzonego przez składniki dopełniacza C5-C9, cytozolowy fluorofor jest szybko (w ciągu kilku sekund) tracony z cytozolu. Wizualizacja funkcji efektora końcowego (cytolizy) kaskady dopełniacza wykazała, że 4 minuty czasu inkubacji są wystarczające do opsonizacji C3b/iC3b ludzkich krwinek czerwonych. W testach równoległych powłokę C3b/iC3b ludzkich krwinek czerwonych można łatwo ocenić po zastosowaniu mieszaniny przeciwciał anty-mysich C3b i fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał drugorzędowych. W takim przypadku wymagany jest etap płukania w celu usunięcia niezwiązanych przeciwciał fluorescencyjnych. Chociaż etap płukania obejmuje sedymentację komórek przez wirowanie, co sprzyja aglutynacji, udaną opsonizację można łatwo ocenić za pomocą mikroskopii konfokalnej. Fagocytozę za pośrednictwem receptora dopełniacza można obrazować, stosując IgG-/iC3b-opsonizowane ludzkie krwinki czerwone do makrofagów NOTAM lub Fcer1g-/- lub wprowadzając opsonizowane ludzkie krwinki czerwone IgM-/iC3b do makrofagów typu dzikiego. Opsonizowane IgM komórki krwi nie są rozpoznawane przez FcγR zawierające ITAM (FcγRI, FcγRIII i FcγRIV) wymagane do fagocytozy cząstek IgG-opsonizowanych22.
Aby zobrazować zdarzenia fagocytarne, błonę plazmatyczną makrofagów można znakować zielonym fluorescencyjnym przeciwciałem anty-F4 / 80 sprzężonym z fluoroforem, które służy również jako specyficzny marker makrofagów myszy. Ludzkie krwinki czerwone mogą być przewodzone na czerwono fluorescencyjne przez inkubację z pomarańczowo-czerwonym fluorescencyjnym markerem błony plazmatycznej, jak omówiono powyżej. Ten lipofilowy marker błony plazmatycznej pozwala uniknąć potencjalnych mylących skutków etykiet opartych na przeciwciałach. Czerwone fluorescencyjne ludzkie krwinki czerwone, z opsonizacją lub bez, mogą być bezpośrednio pipetowane do kanału 100 μl szkiełka kanałowego i poklatkowego obrazu 3D za pomocą soczewki obiektywowej 60X/1,49 zanurzeniowej (lub podobnej) wykonanej przy użyciu linii laserowych odpowiednio 488 nm i 561 nm mikroskopu konfokalnego (lub podobnego) z wirującym dyskiem. Kuszące jest zoptymalizowanie systemu pod kątem obrazowania w wysokiej rozdzielczości, ale pozyskiwanie powtarzających się stosów Z w ciągu około 16 minut może spowodować znaczne fotowybielanie i fototoksyczność. Zdecydowaliśmy się na użycie binningu 2x2, aby promować dobry stosunek sygnału do szumu i umożliwić zmniejszenie intensywności wzbudzenia i/lub czasów ekspozycji, ale kosztem rozdzielczości optycznej. Ponadto, aby zmniejszyć fototoksyczność, do pożywki dodajemy pochłaniacz reaktywnych form tlenu. W przyszłych badaniach testy mogą zostać zmodyfikowane w celu zobrazowania fagocytozy apoptotycznych ludzkich krwinek czerwonych. Zastosowanie jonoforu Ca2 +, takiego jak A23187, może być wykorzystane do indukowania eksternalizacji fosfatydyloseryny23, sygnału "zjedz mnie" i cechy charakterystycznej wczesnej apoptozy24,25.

Dwadzieścia lat przed obserwacją przez Metchnikoffa fagocytarnych komórek mezenchymy u larw rozgwiazd, w 1882 roku, i późniejszym rozwinięciem jego teorii fagocytozy1, Ernest Haeckel opisał w 1862 roku pochłanianie nierozpuszczalnych cząsteczek barwnika przez komórki krwi Thetis fimbris (Tethys fimbria)), gatunek drapieżnego ślimaka morskiego (Ernest Haeckel. Die Radiolarien (Rhizopoda radiaria): Eine Monographie; Druck und Verlag von Georg Reimer, Berlin 1862). Wyraźnie opisał wypukłości błonowe otaczające cząsteczki, które następnie były pobierane do cytoplazmy i gromadzone wokół jądra komórkowego. Ponad 100 lat później pionierskie badania przeprowadzone przez Kaplana zasugerowały, że istnieją co najmniej dwa morfologicznie odrębne mechanizmy fagocytozy2. Kaplan wykazał za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, że makrofagi otrzewnowej myszy połykały czerwone krwinki owcze opsonizowane IgG za pomocą cienkich przedłużeń błony, które sięgały do góry i szczelnie otaczały cząstkę, początkowo powodując powstanie struktury przypominającej miseczkę. Tworzenie miseczek fagocytarnych wymagało polimeryzacji aktyny, ponieważ zostało zniesione przez przepuszczalną dla komórek toksynę grzybową cytochalazynę B, o której wiadomo, że blokuje dynamikę aktyny3. W przeciwieństwie do tego, czerwone krwinki owcze opsonizowane dopełniaczem wydawały się zatapiać bezpośrednio w makrofagach bez generowania rozszerzeń błony, chociaż na niektórych obrazach można zobaczyć zmarszczki błony w natychmiastowej pustce tonących cząstek. W przeciwieństwie do tworzenia miseczki fagocytarnej, zapadanie się za pośrednictwem receptora dopełniacza było niewrażliwe na leczenie cytochalazyną B2. W eksperymentach opisanych przez Kaplana opsonizację dopełniacza przeprowadzono przez inkubację krwinek czerwonych owiec znakowanych immunoglobuliną M (IgM) z surowicą myszy z niedoborem dopełniacza C5, która omija hemolizę przez końcowy kompleks dopełniacza C5 zależny od dopełniacza.
Dwa tryby fagocytozy, formowanie miseczki fagocytarnej i zapadanie się, zidentyfikowane przez Kaplana, stały się utrwaloną opinią w branży4,5,6,7,8,9. Jednak obrazy o ultrawysokiej rozdzielczości użyte w oryginalnym badaniu przez Kaplan2, a także w podobnym badaniu przeprowadzonym przez Munthe-Kaas i wsp.10, udostępniaj tylko migawki zdarzeń fagocytarnych. W niedawnym przeglądzie Rougerie i wsp.11 podkreślił, że różnice morfologiczne między fagocytozą za pośrednictwem FcγR i CR pozostają do wyjaśnienia, a ponadto zaobserwowano zmarszczki błony podczas wychwytu cząstek za pośrednictwem receptora dopełniacza2. Obrazowanie na żywych komórkach pojedynczych fagocytarnych zdarzeń rozciągających się od wychwytywania cząstek do internalizacji, w połączeniu z genetycznie zmodyfikowanymi modelami myszy, może znacznie poprawić nasze zrozumienie, w jaki sposób fagocyty wychwytują i połykają cząsteczki. Jednym z podejść może być zastosowanie szybkiej mikroskopii sił atomowych (AFM), która umożliwia obrazowanie topograficzne żywych komórek w ultrawysokiej rozdzielczości (10–20 nm). Ostatnio opracowano szybki system AFM12, który nadaje się do szybkiego obrazowania powierzchni komórek przy niskim poziomie szumów. Technika ta ma tę zaletę, że parametry topograficzne i mechaniczne żywych komórek o wysokiej rozdzielczości mogą być mierzone w krótkich odstępach czasu (sekundach), w przeciwieństwie do skaningowej mikroskopii elektronowej, która wymaga utrwalenia i wysuszenia komórek w punkcie krytycznym. Innym podejściem jest poklatkowa mikroskopia konfokalna 3D, która jest powszechnie dostępna, chociaż fototoksyczność i bielenie są czynnikami ograniczającymi podczas nagrań. Podejście to jest bardzo wszechstronne i umożliwia sekcję optyczną o wysokiej rozdzielczości przestrzennej oraz zapewnia niezwykłą elastyczność w znakowaniu za pomocą oszałamiającej gamy sond fluorescencyjnych, w tym genetycznie kodowanych białek fluorescencyjnych. Tutaj opisujemy testy fagocytozy za pomocą poklatkowej mikroskopii konfokalnej z wirującym dyskiem, która pozwala na wysoką rozdzielczość czasoprzestrzenną określonych zdarzeń fagocytarnych, w których pośredniczy receptor.

<table><tbody><tr><td>Cewnik plastikowy 24 G</td><td>B Braun Mesungen AG, Niemcy</td><td>4254503-01</td><td>Używany do płukania otrzewnej</td></tr><tr><td>Hank' s buforowany roztwór soli bez Ca2+ i Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14170120</td><td>Stosowany do płukania otrzewnowego</td></tr><tr><td>14 mL polipropylenowe probówki okrągłodenne</td><td>BD Falcon</td><td>352059</td><td>Służy do pobierania komórek otrzewnej</td></tr><tr><td>RPMI 1640 pożywka zawierająca 20 mM Hepes</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7388</td><td>Pożywka bazowa do testów</td></tr><tr><td>Bydło inaktywowane termicznie surowica</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10082139</td><td>Stosowana jako suplement do pożywki RPMI 1640</td></tr><tr><td>100x penicylina/streptomycyna</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Stosowana jako suplement do pożywki RPMI 1640</td></tr><tr><td>Pokryta fibronektyną &micro;-Slide&nbsp; I komory</td><td>Ibidi, Martinsried, Niemcy</td><td>80102</td><td>Szkiełka kanałowe używane do testów</td></tr><tr><td>&mikro;-Stojak na szkiełka (anodowane aluminium)</td><td>Ibidi, Martinsried, Niemcy</td><td>80003</td><td>Autoklawowalny stojak do układania w stosy do prowadnic kanałowych</td></tr><tr><td>RPMI 1640 zawierający wodorowęglan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>Pożywka do hodowli nocnej</td></tr><tr><td>N-(2-merkaptopropionylo)glicyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6635</td><td>Wymiatacz reaktywnych form tlenu</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężone przeciwciało monoklonalne (klon BM8) przeciw mysim F4/80 szczurzemu (IgG2a)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MF48020</td><td>Mysi marker makrofagowy i etykieta błony plazmatycznej</td></tr><tr><td>CellMask Orange</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td>Czerwona fluorescencyjna plama błony plazmatycznej</td></tr><tr><td>Ester sukcynimidylowy pHrodo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36600</td><td>Aminowo-reaktywny ester sukcynimidylowy mysiego pHrodo</td></tr><tr><td>(IgG2b) monoklonalnego (klon HIR2) anty-ludzkiego CD235a&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MA1-20893</td><td>Służy do opsonizacji ludzkich czerwonych krwinek za pomocą IgG</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594-sprzężone&nbsp; kozie przeciwciało anty-mysie (wtórne) IgG</td><td>Abcam</td><td>Ab150116</td><td>Służy do potwierdzania opsonizacji ludzkich czerwonych krwinek za pomocą mysiego przeciwciała IgG</td></tr><tr><td>Rat anty-mysie C3b/iC3b/C3c</td><td>Hycult Biotech</td><td>HM1065</td><td>Służy do potwierdzania opsonizacji C3b/iC3b ludzkich czerwonych krwinek</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488-sprzężone kozie przeciwciało anty-szczurze IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11006</td><td>Stosowane jako przeciwciało wtórne w celu potwierdzenia opsonizacji C3b/iC3b</td></tr><tr><td>Calceina/AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C3100MP</td><td>Służy do ładowania ludzkich krwinek czerwonych za pomocą</td></tr><tr><td>systemu obrazowania żywych komórek Calcein UltraVIEW Vox 3D&nbsp;</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Niemcy</td><td></td><td>System mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem</td></tr><tr><td>Mikroskop odwrotny Nikon Eclipse Ti</td><td>Nikon, Japonia</td><td></td><td>Mikroskop odwrócony</td></tr><tr><td>Skaner krążków CSU-X1</td><td>Yokogawa Electric Corporation, Japonia</td><td></td><td>Jednostka wirującego dysku Nipkow</td></tr><tr><td>14-bitowa Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) Aparat chłodzony ogniwem</td><td>Hamamatsu Photonics Inc., Japonia</td><td></td><td>Kamera EM-CCD systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem&nbsp;</td></tr><tr><td>Laser na ciele stałym 488 nm, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Niemcy</td><td></td><td>Laser (488 nm) źródło systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem</td></tr><tr><td>Laser na ciele stałym 561 nm, 50 mW</td><td>Perkin Elmer, Rodgau, Niemcy</td><td></td><td>Laser (561 nm) źródło systemu mikroskopu konfokalnego z wirującym dyskiem</td></tr></tbody></table>

poklatkowe obrazowanie 3d fagocytozy przez makrofagi myszy

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Fagocytoza odgrywa kluczową rolę w obronie gospodarza, jak również w rozwoju i utrzymaniu tkanek, i polega na szybkich, zapośredniczonych przez receptory rearanżacjach cytoszkieletu aktynowego w celu wychwytywania, otaczania i pochłaniania dużych cząstek. Chociaż zidentyfikowano receptory fagocytarne, dalsze szlaki sygnałowe i efektory, takie jak GTPazy Rho, dynamiczne przebudowywanie cytoszkieletu określonych zdarzeń fagocytarnych za pośrednictwem receptorów pozostaje niejasne. Czterdzieści lat temu za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej zidentyfikowano dwa odrębne mechanizmy fagocytozy, których przykładem jest fagocytoza za pośrednictwem receptora Fcγ (FcγR) i receptora dopełniacza (CR). Wiązanie cząstek opsonizowanych immunoglobuliną G (IgG) z FcγR powoduje wysunięcie cienkich przedłużeń błony, które początkowo tworzą tak zwaną miseczkę fagocytarną wokół cząstki, zanim zostanie ona całkowicie zamknięta i wycofana do komórki. W przeciwieństwie do tego, opsonizowane cząstki dopełniacza wydają się zatapiać w fagocytach po związaniu się z receptorami dopełniacza. Te dwa tryby fagocytozy, tworzenie miseczek fagocytarnych i zapadanie się, stały się dobrze ugruntowane w literaturze. Jednak różnice między tymi dwoma trybami zostały zatarte przez doniesienia, że fagocytoza za pośrednictwem receptora dopełniacza może indukować różne wypukłości błony. Ze względu na dostępność technik obrazowania o wysokiej rozdzielczości wymagane są testy fagocytozy, które umożliwiają wizualizację 3D (trójwymiarową) w czasie rzeczywistym tego, w jaki sposób określone receptory fagocytarne pośredniczą w wychwytywaniu poszczególnych cząstek. Częściej stosowane podejścia do badania fagocytozy, takie jak testy punktu końcowego, tracą możliwość zrozumienia, co dzieje się na granicy cząstek i fagocytów. Tutaj opisujemy testy fagocytarne, wykorzystujące poklatkową mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem, które umożliwiają obrazowanie 3D pojedynczych zdarzeń fagocytarnych. Ponadto opisujemy testy, aby jednoznacznie zobrazować fagocytozę za pośrednictwem receptora Fcγ lub receptora dopełniacza.

Schematyczny rysunek płytki kanałowej użytej do obrazowania fagocytozy za pomocą konfokalnej mikroskopii spinning-disk w trybie time-lapse przedstawiono na Rysunku 1. Ludzkie erytrocyty (hRBCs) są barwione czerwonym fluorescencyjnym markerem błony plazmatycznej CellMask Orange, natomiast izolowane mysie makrofagi otrzewnowe (Ms) są znakowane zielonym fluorescencyjnym przeciwciałem anty-F4/80 sprzężonym z Alexa Fluor 488 (Rysunek 2), które służy zarówno jako specyficzny marker makrofagów mysich, jak i znacznik błony plazmatycznej. Ludzkie erytrocyty można opsonizować mysim IgG (mIgG) lub mysim IgM (mIgM) poprzez inkubację komórek z przeciwciałem anty-CD235a IgG (lub IgM) (CD235a, znane również jako glikoforyna A, jest białkiem specyficznie eksprymowanym na ludzkich erytrocytach). Obrazowanie 3D w trybie time-lapse zielonych fluorescencyjnych makrofagów w obecności czerwonych fluorescencyjnych ludzkich erytrocytów umożliwia wizualizację pojedynczych zdarzeń fagocytozy cząstek (Rysunek 2). Wnikliwa obserwacja pojedynczych zdarzeń fagocytycznych pozwala na szczegółowe opisanie procesu wychwytu i wchłaniania cząstek. Na przykład można zaobserwować wychwyt ludzkiego erytrocyta opsonizowanego mIgG przez filopodium makrofaga, czyli cienką, palcowatą wypustkę (Rysunek 3A; patrz również Horsthemke et al.15). Ponadto można zaobserwować ściskanie ludzkiego erytrocyta podczas formowania się pucharka fagocytowego (Rysunek 3A). Po wprowadzeniu świeżego surowicy mysiej, ludzkie erytrocyty opsonizowane mIgG lub mIgM uruchamiają klasyczną kaskadę dopełniacza, która kończy się powstaniem hemolitycznego kompleksu atakującego błonę. Kinetykę hemolizy zależnej od dopełniacza można zmierzyć poprzez obrazowanie komórek podwójnie barwionych CellMask Orange i kalceiną. Zielona fluorescencyjna cytosolowa kalceina jest szybko uwalniana z komórek podczas hemolizy (Rysunek 3B).
<img alt="Schemat podciągania kapilarnego w różnych konfiguracjach, pasek papieru, wznoszenie się cieczy, ilustracja procesu." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1: Obsługa szkiełek z kanałami powleczonymi fibronektyną. (A) Szkiełko z kanałem składa się z dwóch zbiorników połączonych kanałem o wymiarach 50 mm x 5 mm x 0,4 mm. Szkiełka z kanałami są wstępnie napełniane poprzez naniesienie 1-2 mL medium do jednego z dwóch zbiorników i przechylenie szkiełka. (B) Przed inkubacją na zbiornikach można umieścić zakrętki. Zakrętki mogą być wygodnie wykorzystane do wypompowania niepożądanych pęcherzyków powietrza przed zasianiem kanału komórkami. (C) Wolny od pęcherzyków powietrza kanał o pojemności 100 µL można napełnić, pipetując medium bezpośrednio do wlotu kanału. Krok ten jest stosowany na przykład w celu zasiania makrofagów w szkiełku lub dodania przeciwciała anty-F4/80 sprzężonego z gfluorophorem (zielonym fluorophorem), który służy jako znacznik błony oraz marker makrofagów mysich. (D) Po wpipetowaniu cząstek, takich jak opsonizowane ludzkie erytrocyty, do kanału zasianego makrofagami zabarwionymi fluorescencyjnie, szkiełko można umieścić na stole mikroskopu odwróconego i przeprowadzić mikroskopię konfokalną z dyskiem obrotowym w trybie time-lapse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Interakcja makrofagów z RBC; schemat i mikroskopia fluorescencyjna, obrazowanie 3D fagocytozy." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2: Obrazowanie 3D fagocytozy w czasie (time-lapse). (A) Schemat przedstawiający opsonizację ludzkich erytrocytów (hRBCs) z barwioną błoną plazmatyczną (czerwona fluorescencja) za pomocą mysiej (m) przeciwciała immunoglobulin G anty-CD235a (mIgG) oraz prezentację znakowanych hRBCs mysim makrofagom (Ms), znakowanym (zielona fluorescencja) przeciwciałem anty-F4/80 sprzężonym z zielonym fluorophorem. (B) Obrazy time-lapse (rzuty XZ), uzyskane za pomocą konfokalnej mikroskopii dyskowej, pokazujące tworzenie się pucharów fagocytarnych i pochłanianie opsonizowanych mIgG hRBCs. Pasek skali = 10 µm. (C) Rekonstrukcje 3D pokazujące makrofagi pochłaniające opsonizowane mIgG hRBCs. Odpowiadające im rzuty XZ (dla 3 punktów czasowych) przedstawiono w B. Odstępy siatki wynoszą 5,07 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Mikroskopia time-lapse, CellMask Orange, AF488-F4/80, proces fagocytozy makrofagów." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57566/57566fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Chwytanie cząsteczki przez filopodium. Obrazy time-lapse, uzyskane za pomocą konfokalnej mikroskopii dyskowej, przedstawiające makrofag mysi chwytający opsonizowany immunoglobuliną G mysią (mIgG) ludzki erytrocyt (hRBC) za pomocą filopodium (strzałki w górnym panelu), czyli wypustki przypominającej palec. Należy zauważyć, że erytrocyt traci swoje kremnacje wczesnym etapie formowania się pucharka fagocytarnego. Ponadto pucharzek fagocytarny zdaje się ściskać otoczony erytrocyt (wskazano strzałkami w dolnym panelu). Pasek skali = 10 µm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57566/57566fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.</a>

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię konfokalną z wirującym dyskiem do obrazowania pojedynczych zdarzeń fagocytarnych przez makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki fagocytarne.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Ogólnym celem tego eseju jest przygotowanie makrofagów i opsonizowanych czerwonych krwinek do wizualizacji fagocytozy za pomocą trójwymiarowej mikroskopii poklatkowej. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie immunologii, takie jak to, w jaki sposób fagocyty wychwytują i połykają cząstki. Technika ta pozwala na wizualizację wychwytu cząstek w czasie rzeczywistym, w przeciwieństwie do bardziej tradycyjnych testów punktu końcowego, które pozwalają jedynie na ocenę, czy cząstka została połknięta, ale nie w jaki sposób.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć problemy, dopóki nie przyzwyczają się do procedur izolacji komórek. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę z zalet wykorzystania tej mikroskopii konfokalnej do obrazowania poklatkowego 3D fagocytozy. Aby wyizolować makrofagi otrzewnowe, umieść plastikowy cewnik o rozmiarze 24 w otrzewnej trzy- lub czteromiesięcznej myszy i użyj plastikowej pięciomililitrowej strzykawki, aby dwukrotnie przepłukać jamę 4,5 mililitra lodowatego HBSS bez wapnia i magnezu na płukanie.Przenoszenie zasysanej zawiesiny do 14-mililitrowej rury z okrągłym dnem z polipropylenu w miarę jej zbierania. Po pobraniu obu próbek odwirować aspirat i ponownie zawiesić komórki otrzewnej w jednym mililitrze całkowicie wolnego od wodorowęglanów podłoża RPMI 1640, aby uzyskać stężenie około sześć razy 10 do szóstych komórek na mililitr. Następnie, aby wstępnie napełnić szkiełka, dodaj jeden mililitr kompletnego podłoża uzupełnionego HEPES do jednego zbiornika szkiełka kanałowego pokrytego fibronektyną i przechyl szkiełko, aby umożliwić zassanie pożywki z dolnego zbiornika.Aby usunąć niechciane pęcherzyki powietrza, dodaj od jednego do dwóch mililitrów świeżej pożywki do jednego z dwóch zbiorników i szczelnie załóż korek zbiornika. Następnie zastosuj rytmiczny nacisk kciuka na nasadkę, aby wypompować powietrze ze zjeżdżalni, przechylając suwak w razie potrzeby. Gdy całe powietrze zostanie usunięte, przechyl suwak w kierunku niezakorkowanego zbiornika zawierającego medium i zdejmij korek, aby uniknąć zasysania powietrza z powrotem do kanału.Teraz odpipetuj roztwór komórkowy kilka razy, aby zmniejszyć zbrylanie się i dodaj 100 mikrolitrów komórek do jednego kanału szkiełka na dwugodzinną inkubację w wilgotnej komorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza przy braku dwutlenku węgla. Pod koniec inkubacji zastąpić pożywkę zawierającą HEPES na każdym szkiełku kompletną pożywką uzupełnioną wodorowęglanem, jak to właśnie pokazano. Następnie umieść komórki w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza z 5% dwutlenkiem węgla do hodowli przez noc.Następnego ranka przenieś jeden mililitr świeżo pobranej zdrowej krwi dawcy do dwumililitrowej probówki wirówkowej z polipropylenu o okrągłym dnie. Następnie odwirować próbkę. Usunąć osocze i kożuchy zawierające supernatant.I ostrożnie przenieś 100 mikrolitrów osadzonych czerwonych krwinek do dwumililitrowej probówki mirkowirówki zawierającej 100 mikrolitrów kompletnej pożywki uzupełnionej HEPES. Oznaczyć probówkę w stosunku 1:1 i przenieść cztery mikrolitry rozcieńczonych czerwonych krwinek do nowej dwumililitrowej probówki do mikrowirówki zawierającej dwa mililitry kompletnej pożywki uzupełnionej HEPES. Następnie oznacz tę probówkę jako 4:2000 i umieść obie rozcieńczone probówki z próbkami czerwonych krwinek na lodzie.Aby oznaczyć makrofagi otrzewnowe, zastąp pożywkę wodorowęglanową w każdym szkiełku kanałowym kompletnymi pożywkami uzupełnionymi HEPES. Następnie przechyl szkiełko, aby umożliwić dodanie 100 mikrolitrów fluorescencyjnie znakowanego mysiego przeciwciała specyficznego dla makrofagów, które jest przedmiotem zainteresowania, do otworu kanału 100 mikrolitrów szkiełka. Zassać pożywkę, która wpływa do znajdującego się za nią zbiornika, i inkubować komórki przez 20 minut w wilgotnej komorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza przy braku dwutlenku węgla.Podczas znakowania komórek otrzewnej delikatnie wymieszaj próbkę czerwonych krwinek w proporcji 4:2000 i przenieś 400 mikrolitrów komórek do nowej dwumililitrowej probówki do mikrowirówki, w podgrzewanym aluminiowym bloku wewnątrz okapu z przepływem laminarnym przez około pięć do ośmiu minut. Gdy komórki ogrzeją się do 37 stopni Celsjusza, wymieszaj z komórkami 0,4 mikrolitra odpowiedniego czerwonego fluorescencyjnego barwnika błony plazmatycznej. Następnie umieść ogniwa z powrotem w bloku grzewczym.Po pięciu minutach umyj komórki, dodając 1,6 mililitra świeżej pożywki uzupełnionej HEPES i odwirowania. Obróć probówkę, aby zidentyfikować osad czerwonych krwinek. Używając jednej do 1,5 mililitrowej końcówki pipety, ostrożnie usuń supernatant w dwóch objętościach, nie naruszając osadu i wymieszaj 2000 mikrolitrów świeżej pożywki uzupełnionej HEPES z komórkami.Odwirować i ponownie zawiesić osad w 400 mikrolitrach pożywki. Następnie oznacz probówkę PMS dla barwienia błony plazmatycznej. Pod koniec 20-minutowej inkubacji znakowania komórek otrzewnej przemyć szkiełko jednym mililitrem świeżej, kompletnej pożywki uzupełnionej HEPES.Aby opsonizować czerwone krwinki, dodaj jeden mikrolitr mysiego przeciwciała monoklonalnego IGG2B przeciwko ludzkiemu CD235A do probówki z próbką PMS. Po ośmiu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza z mieszaniem raz na minutę przenieś 100 mikrolitrów barwionych błoną plazmatyczną IGG opsonizowanych ludzkich czerwonych krwinek do szkiełka kanałowego zawierającego makrofagi otrzewnowe. Jak tylko ludzkie czerwone krwinki zostaną dodane, zamontuj szkiełko na mikroskopie konfokalnym z wirującym dyskiem.Z inkubatorem stage ustawionym na 37 stopni Celsjusza i natychmiast rozpocznij obrazowanie komórek. Obrazowanie 3D w czasie zielonych makrofagów fluorescencyjnych prezentowanych z czerwonymi fluorescencyjnymi ludzkimi krwinkami czerwonymi umożliwia wizualizację zdarzeń fagocytarnych z pojedynczymi cząsteczkami. Na przykład można zaobserwować schwytanie mysiej ludzkiej krwinki czerwonej opsonizowanej IGG przez filopodium makrofagów.A także ściskanie ludzkiej czerwonej krwinki podczas tworzenia kubka fagocytarnego. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować makrofagi otrzewnowe rezydujące u myszy, komórki znakowane fluorescencyjnie i opsonizowane cząstki.

time-lapse-3d-imaging-of-phagocytosis-by-mouse-macrophages

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Ten film demonstruje test do monitorowania niezależnych zdarzeń fagocytozy krwinek czerwonych (RBC) za pośrednictwem makrofagów. Mysie immunoglobuliny G (IgG) opsonizowane ludzkie erytrocyty są inkubowane z mysimi makrofagami i obserwowane pod mikroskopem konfokalnym. Erytrocyty są pochłaniane przez makrofagi poprzez tworzenie miseczki fagocytarnej i ukierunkowane na degradację lizosomalną.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym fagocytozy makrofagów krwinek czerwonych z opsonizowanymi IgG

Ten film demonstruje technikę mikroskopii TIRF (total internal reflection fluorescence) o wysokiej rozdzielczości do wizualizacji w czasie rzeczywistym powstawania i zamykania fagosomów podczas fagocytozy za pośrednictwem makrofagów opsonizowanych IgG-opsonizowanych czerwonych krwinek (RBC) przyczepionych do powierzchni naczynia o szklanym dnie. Makrofagi rozciągają pseudopodia wokół erytrocytów i pochłaniają je wewnątrz fagosomów, odrywając je od powierzchni szkła.

Wizualizacja powstawania i zamykania fagosomów oparta na mikroskopii TIRF

Opisujemy metody wideomikroskopii żywych komórek fagocytozy Candida albicans za pomocą makrofagów.  Metody te umożliwiają specyficzną dla danego etapu analizę migracji, rozpoznawania, pochłaniania i dojrzewania fagosomów oraz ujawniają nowe aspekty fagocytozy.

Mikroskopia wideo żywych komórek fagocytozy patogenów grzybowych

Phagocytic cells play a major role in the innate immune system by removing and eliminating invading microorganisms in their phagosomes. Phagosome ...

Badanie biogenezy fagolizosomów w żywych makrofagach

Tutaj prezentujemy protokół ilościowego oznaczania fagocytozy cząstek fluorescencyjnych za pomocą przylegającej linii komórkowej makrofagów przy użyciu metody fluorometrycznej. Metoda ta ułatwia wysokoprzepustową kwantyfikację internalizacji cząstek, a także wynikającą z niej polimeryzację aktyny.

Wysokoprzepustowa technika fluorometryczna do oceny fagocytozy makrofagów i polimeryzacji aktyny

Opisujemy eksperymentalny układ do wizualizacji z bezprecedensową wysoką rozdzielczością tworzenia i zamykania fagosomów w trzech wymiarach u żywych makrofagów, przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem. Umożliwia monitorowanie podstawy miseczki fagocytarnej, rozciągających się pseudopodów, a także dokładnego miejsca rozszczepienia fagosomu.

"Test zamykania fagosomu" do wizualizacji powstawania fagosomów w trzech wymiarach przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej z całkowitym wewnętrznym odbiciem (TIRFM)

Aktywność fagocytarna makrofagów przeciwko komórkom rakowym, w szczególności komórkom raka sutka myszy 4T1, została zobrazowana w tym badaniu. Stworzono model kokultury żywych komórek i obserwowano go za pomocą kombinacji fluorescencyjnej i różnicowej interferencyjnej mikroskopii kontrastowej. Ocena ta została zobrazowana za pomocą oprogramowania do obrazowania w celu opracowania wielopunktowego filmu poklatkowego.

Poklatkowe obrazowanie 2D aktywności fagocytarnej w komórkach raka sutka myszy M1 Macrophage-4T1 w kokulturach

Tutaj opisujemy metody wykorzystujące mikroskopię poklatkową z kontrastem fazowym do obrazowania makrofagów otrzewnowych rezydujących myszy w chemotaktycznym gradiencie dopełniacza C5a. Protokoły można rozszerzyć na inne komórki odpornościowe.

Obrazowanie poklatkowe chemotaksji makrofagów myszy

Prezentowany tutaj jest protokół do ilościowego określania i tworzenia dynamicznych obrazów regulacji makrofagów (MΦ) za pośrednictwem mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) fagocytozy nieopsonizowanych cząsteczek drożdży (zymosan), które są sprzężone z cząsteczką fluorescencyjną wrażliwą na pH.

Mezenchymalne komórki macierzyste regulują fagocytozę makrofagów; Kwantyfikacja i obrazowanie

Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania żywych komórek w technice time-lapse w celu wizualizacji zależnej od przeciwciał fagocytozy komórek raka piersi potrójnie ujemnego znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym, z wykorzystaniem makrofagów pochodzących z monocytów krwi obwodowej oraz mikroskopu zautomatyzowanego.

Obrazowanie time-lapse fagocytozy komórek trzykrotnie ujemnego raka piersi znakowanych zielonym białkiem fluorescencyjnym przez makrofagi indukowaną przeciwciałami

Poznaj metodę poklatkowego obrazowania 3D fagocytozy w makrofagach myszy przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Technika ta umożliwia wizualizację pochłaniania cząsteczek w czasie rzeczywistym.

Poklatkowe obrazowanie 3D fagocytozy przez makrofagi myszy

Przeglądaj więcej filmów