Name: Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Poznaj metodę immunofluorescencji całych narządów z oczyszczaniem tkanek do automatycznej kwantyfikacji pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy. Technika zachowuje trójwymiarową strukturę organu i jest mniej pracochłonna niż tradycyjne preparaty.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Rebecce Williams i Johannie Dela Cruz z Cornell BRC Imaging oraz Andrew Recknagelowi za pomocne sugestie i pomoc techniczną. Prace te były wspierane przez National Institutes of Health w ramach grantu S10-OD018516 (dla Cornell's Imaging Facility), T32HD057854 dla J.C.B. i R01-GM45415 dla J.C.S.

Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt Uniwersytetu Cornell (IACUC) zatwierdził wszystkie opisane tutaj metody, zgodnie z protokołem 2004-0038 do JCS.
1. Przygotowanie instrumentów i pożywek hodowlanych
<ol>
	<li>Wytrzyj obszar roboczy do czysta 10% wybielaczem i pozwól, aby wybielacz pozostał na powierzchni roboczej przez co najmniej 5 minut. Po 5 minutach usuń nadmiar wybielacza czystymi ręcznikami papierowymi i 70% etanolem (EtOH). Dokładnie wyczyść mikroskop preparacyjny 70% EtOH. 
	UWAGA: Ważne jest, aby miejsce pracy było co najmniej częściowo sterylne, aby uniknąć zanieczyszczenia kultur narządów.</li>
	<li>Owiń czyste kleszczyki i nożyczki ręcznikiem papierowym zwilżonym 70% EtOH do czasu użycia. 
	UWAGA: Idealne narzędzia do preparowania mogą się różnić w zależności od wieku/wielkości jajnika. Najlepsze wyniki uzyskuje się przy użyciu jednej ostrej nożyczki do mikropreparacji, dwóch kleszczyków z cienką końcówką (numer 5 lub 55) i jednego mikronożyczki do cięcia tęczówki.</li>
	<li>W stożkowej probówce przygotować 50 ml pożywki do hodowli jajników i ogrzać w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Aby przygotować pożywkę do hodowli jajników4, uzupełnij 1x Minimal Essential Media (MEM) 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 25 mM (4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowym kwasem (HEPES), 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny, 0,25 μg/ml amfoterycyny B (np. 45 ml MEM, 5 ml inaktywowanego termicznie FBS, 1,25 ml HEPES, i 0,5 ml 100-krotnego zapasu penicyliny, streptomycyny i amfoterycyny B).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj płytki i wkładki przed posiewem jajników.
	<ol>
		<li>W kapturze do hodowli tkankowych dodać 1 ml pożywki do hodowli jajników na płytkę do hodowli tkankowej o średnicy 35 mm.</li>
		<li>Wstępnie namoczyć membranę wkładaną z pożywką hodowlaną. Dodaj wystarczającą ilość pożywki, zwykle około 0,55 ml na studzienkę, do 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek nośnikowych i umieść wkładkę do hodowli komórkowej w dołku. Upewnij się, że membrana wkładki styka się z nośnikiem.</li>
		<li>Przygotuj liczbę 35 mm płytek i studzienek z wkładkami do hodowli komórkowych zgodnie z oczekiwaną liczbą jajników w doświadczeniu. Umieścić płytki o średnicy 35 mm zawierające 1 ml pożywki hodowlanej i 24-dołkową płytkę nośną zawierającą pożywki hodowlane i wkładki w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i atmosferycznym O2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ułóż płytę grzejną obok lunety preparacyjnej i ustaw temperaturę na 37 °C. Utrzymuj temperaturę 37 °C, 5%CO2, a inkubator atmosferycznyO2 znajduje się w pobliżu pomieszczenia sekcyjnego.</li>
</ol>
2. Rozwarstwienie jajników i hodowla narządów
UWAGA: Jajniki mogą być preparowane w temperaturze pokojowej, o ile narażenie na nieidealną temperaturę jest minimalne.
<ol>
	<li>Poddaj eutanazji samice myszy w 5 dniu po urodzeniu, przez dekapitację, pojedynczo. 
	UWAGA: Eutanazja musi być przeprowadzona zgodnie z wytycznymi IACUC obowiązującymi w placówce, w której prowadzone są badania.</li>
	<li>Spryskaj zwierzę 70% EtOH. Umieść zwierzę na suchym ręczniku papierowym pod mikroskopem preparacyjnym. Umieścić 35-milimetrowe naczynie do hodowli tkankowych zawierające pożywkę do hodowli jajników w pobliżu mikroskopu preparacyjnego.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy lub nożyczek do mikropreparacji tęczówki wykonaj nacięcie przez skórę zwierzęcia i do jamy brzusznej, uważając, aby nie wciąć się w jelita. Wypchnij jelita z jamy brzusznej i zlokalizuj jajniki. Wyodrębnić jajniki i umieścić je w 35-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym pożywkę hodowlaną.</li>
	<li>Po wypreparowaniu jajników od zwierzęcia należy zwiększyć powiększenie mikroskopu preparacyjnego, aby lepiej uwidocznić jajniki i wszelkie przyczepione tkanki. Za pomocą czystych kleszczyków z cienką końcówką usuń całą tkankę niejajnikową, taką jak kaletka maziowa i tkanka tłuszczowa. Należy uważać, aby jajniki pozostały nienaruszone podczas usuwania przyczepionej tkanki niejajnikowej.</li>
	<li>Po wyizolowaniu jajników umieść parę w wstępnie nasączonych wkładkach do hodowli komórkowych na 24-dołkowej płytce nośnika (patrz kroki 1.4.2 i 1.4.3) i wyreguluj objętość pożywki, aby upewnić się, że jest wystarczająca do utrzymania wilgoci narządu (bez całkowitego zanurzania go). 
	Uwaga: Uważaj, aby nie zrobić w błonie wkładki do hodowli komórkowej podczas przenoszenia jajników.</li>
	<li>Umieść eksplantowane organy w inkubatorze o temperaturze 37 °C, 5% CO2 i atmosferycznymO2 .</li>
	<li>Powtarzać kroki 2.1-2.6, aż jajniki każdego zwierzęcia zostaną wypreparowane i umieszczone na wkładce do hodowli komórkowej 24-dołkowej płytki zawierającej pożywkę do hodowli jajników.</li>
	<li>Zmieniać pożywkę do hodowli jajników co 2 dni, używając podgrzanych podwielokrotności pożywki jajnikowej z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i przejść do części 3 protokołu w żądanym eksperymentalnym punkcie czasowym.</li>
</ol>
3. Utrwalenie tkanek
<ol>
	<li>W stożkowej probówce o pojemności 15 ml przygotuj 4% paraformaldehydu (PFA) w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) (np. Dodaj 2 ml 16% klasy mikroskopii elektronowej PFA do 6 ml 1x PBS). 
	Ostrzeżenie: PFA jest substancją niebezpieczną i należy się z nią obchodzić pod maską chemiczną.</li>
	<li>Utrwalić wyhodowane jajniki, bez wyjmowania tkanki z wkładki hodowlanej, pokrywając tkankę świeżo przygotowanym 4% roztworem PFA. Uszczelnić krawędzie płytki klejem do tworzyw sztucznych (aby uniknąć parowania) i umieścić próbki w temperaturze 4 °C na noc. 
	UWAGA: W celu ułatwienia obchodzenia się z jajnikami i integralności tkanek należy unikać przemieszczania jajników z wkładki do hodowli komórkowej przez cały czas trwania zabiegu. Wyhodowane jajniki przymocowane do powierzchni wkładki są korzystne w obsłudze bez uszkodzenia lub utraty narządu.</li>
	<li>Przepłukać tkankę 3x 70% EtOH i przejść do kroku 4.1 lub przechowywać ją w fiolkach scyntylacyjnych wypełnionych 70% EtOH w temperaturze 4 °C do czasu dalszego przetwarzania. 
	UWAGA: W przypadku stosowania tkanek z endogenną ekspresją białek fluorescencyjnych, przechowywanie próbek z 70% EtOH może znacznie zmniejszyć sygnał. Alternatywnie, tkanka może być przepłukana i przechowywana w PBS za pomocą 0,2% azydku sodu (NaN 3). NaN3 jest jednak wysoce toksyczny i stanowi poważne zagrożenie wdychania. Przygotować roztwór podstawowy w dygestorium i obchodzić się z nim, nosząc odpowiednie środki ochrony osobistej, takie jak fartuch laboratoryjny i rękawice nitrylowe.</li>
</ol>
4. Immunofluorescencja całego wierzchowca
<ol>
	<li>Umieścić utrwaloną tkankę w 1x PBS w RT na co najmniej 4 godziny przed etapem przepuszczalności 4.3.</li>
	<li>Przygotować roztwór przepuszczalny i roztwór blokujący.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór przepuszczalny zgodnie z opisem. Do 1x PBS dodać 0,2% alkoholu poliwinylowego (PVA), 0,1% roztworu borowodorku sodu (NaBH4) (z 12% wag. w 14 M roztworze wodorotlenku sodu (NaOH)) i 1,5% eteru tert-oktylofenylowego glikolu polietylenowego (niejonowy detergent powierzchniowo czynny). W stożkowej probówce o pojemności 50 ml dodaj 5 ml 10 PBS, 0,1 g PVA, 50 μl NaBH4 i 750 μl niejonowego detergentu powierzchniowo czynnego, a następnie dodaj ultraczystą wodę do 50 ml i dobrze mieszaj w temperaturze pokojowej, aż mieszanina całkowicie znajdzie się w roztworze.</li>
		<li>Przygotuj roztwór blokujący zgodnie z opisem. Do 1x PBS dodaj 0,1% niejonowego detergentu powierzchniowo czynnego, 0,15% 2,5M glicyny o pH 7,4, 10% normalnej surowicy koziej, 3% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), 0,2% NaN3, 100 jednostek/ml penicyliny, 100 μg/ml streptomycyny i 0,25 μg/ml amfoterycyny B. Przygotuj roztwór podstawowy 2,5 M glicyny, rozpuszczając 93,8 g glicyny w ultraczystej wodzie do 500 ml końcowej objętości (pH 7,4) i roztwór podstawowy 10% NaN3 przez rozpuszczenie 5 g w 50 ml ultraczystej wody; następnie w stożkowej probówce o pojemności 50 ml przygotować roztwór blokujący, dodając 5 ml 10x PBS, 50 μl niejonowego detergentu powierzchniowo czynnego, 750 μl roztworu podstawowego glicyny, 5 ml surowicy koziej, 1,5 g BSA, 1 ml roztworu podstawowego NaN3 i 0,5 ml 100x zapasu penicyliny, streptomycyna i amfoterycyna B . Dodać ultraczystą wodę do końcowej objętości 50 ml i przefiltrować strzykawką końcowy roztwór.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usuń i wyrzuć 1x PBS z fiolki, a następnie dodaj tyle roztworu przepuszczalnego, aby całkowicie zanurzyć jajniki. Umieścić próbkę w roztworze przepuszczalnym na wytrząsarce orbitalnej (np. nutatorze) w temperaturze pokojowej przez 4 godziny 
	UWAGA: Czas inkubacji może się różnić w zależności od grubości narządu.</li>
	<li>Zastąp roztwór przepuszczalny roztworem blokującym wystarczającym roztworem, aby całkowicie zanurzyć jajniki. Uszczelnić fiolkę plastikowym klejem i pozostawić tkankę do inkubacji przez co najmniej 12 godzin w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Przygotować rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych w roztworze blokującym zgodnie z kartą katalogową producenta. 
	UWAGA: Należy pamiętać, że nie wszystkie przeciwciała są kompatybilne ze środkiem czyszczącym. Średnia objętość potrzebna na próbkę wynosi około 750 μl.
	<ol>
		<li>Do oznaczania ilościowego oocytów należy użyć TAp63 (marker jądrowy oocytów) i MVH (cytoplazmatyczny marker komórek rozrodczych). 
		UWAGA: Przeciwciała użyte w obrazach immunofluorescencyjnych to mysie anty-p63 i królicze anty-MVH). Roztwór przeciwciała pierwotnego może być ponownie użyty 2 razy lub więcej, jeśli jest przechowywany w temperaturze 4 °C między protokołami barwienia i odpowiednio obchodzony, aby uniknąć rozwoju bakterii.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić wkładkę zawierającą tkankę w 24-dołkowej płytce i dodać około 750 μl roztworu przeciwciała pierwszorzędowego. Upewnij się, że jajniki są całkowicie zanurzone. Uszczelnij płytkę klejem do tworzywa sztucznego, aby zminimalizować parowanie i pozostaw tkankę do inkubacji przez 4 dni w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Przygotuj roztwór myjący.
	<ol>
		<li>Przygotować roztwór myjący zgodnie z opisem. Zrób 1x PBS, dodaj 0,2% PVA i 0,15% niejonowego detergentu powierzchniowo czynnego. W stożkowej probówce o pojemności 50 ml dodaj 5 ml 10x PBS, 0,1 g PVA, 75 μl niejonowego detergentu powierzchniowo czynnego i ultraczystą wodę do końcowej objętości 50 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć rozcieńczenie przeciwciał pierwotnych i dodać dużą ilość roztworu myjącego. Zawsze upewnij się, że zanurzyłeś jajniki. Pozwól jajnikom zanurzyć się w roztworze przez noc w temperaturze pokojowej na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Wymień roztwór płuczący i inkubuj na wytrząsarce orbitalnej przez 2 godziny lub dłużej.</li>
	<li>Powtórz krok 4.9 jeszcze jeden raz.</li>
	<li>Przygotować drugorzędowe rozcieńczenie przeciwciał w roztworze blokującym. 
	UWAGA: Stosowane przeciwciała drugorzędowe to barwnik fluorescencyjny anty-mysz 488 hodowany u kóz i barwnik fluorescencyjny anty-królik 594 hodowany u kóz. Patrz krok 4.5. dla średniej objętości potrzebnej na próbkę.</li>
	<li>Usunąć roztwór płuczący z jajników i dodać wtórny roztwór przeciwciał. Chroń próbki przed światłem (owiń płytkę folią aluminiową) i uszczelnij płytkę klejem z tworzywa sztucznego, aby zminimalizować parowanie. Próbki należy inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez 2 dni. 
	UWAGA: Kontynuuj ochronę próbek przed światłem za pomocą folii aluminiowej podczas wszystkich kolejnych etapów inkubacji.</li>
	<li>Usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała z próbek i dodać roztwór myjący. Inkubować na wytrząsarce orbitalnej przez 8 godzin 
	UWAGA: Jeśli pożądane jest barwienie 4,6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI), dodaj 50 ng/ml DAPI do pierwszego etapu płukania (~8 h inkubacji).</li>
	<li>Wymień roztwór myjący na pranie przez noc.</li>
	<li>Przygotowując roztwór czyszczący (patrz sekcja 5), należy zastąpić roztwór do przemywania na noc świeżym roztworem i przechowywać próbki w wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>
5. Oczyszczanie jajników i obrazowanie
<ol>
	<li>Przygotować roztwór czyszczący ScaleS(0).
	<ol>
		<li>Przygotuj roztwór czyszczący ScaleS(0)10, dodając odczynniki w podanej proporcji: 40% D-(-)sorbitolu (w/v), 10% glicerolu, 4,3 M mocznika i 20% dimetylosulfotlenku (DMSO), pH 8,1 (np. w stożkowej probówce o pojemności 50 ml dodać 2,5 ml glicerolu, 10 g sorbitolu, 5 ml DMSO i 12 ml 9 M mocznika o łącznej objętości 25 ml. Mieszać roztwór przez odwrócenie w temperaturze 50 °C przez 30 minut i odgazować przed użyciem.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Usunąć roztwór myjący i zanurzyć próbki w roztworze klarującym. Aby uzyskać lepsze wyniki, utrzymuj próbki na wytrząsarce orbitalnej.</li>
	<li>Roztwór czyszczący należy wymieniać 2 razy dziennie, aż tkanka stanie się przezroczysta (około 2 dni).</li>
	<li>Po oczyszczeniu tkanki przygotuj próbkę do obrazowania, ostrożnie usuwając membranę wkładki zawierającą wyhodowane jajniki za pomocą skalpela z cienką końcówką i umieszczając próbkę na szkiełku podstawowym.</li>
	<li>Przejdź do obrazowania próbek pod mikroskopem zdolnym do cięcia optycznego.</li>
</ol>
6. Kwantyfikacja oocytów
UWAGA: Istnieje wiele różnych programów komputerowych, które są w stanie określić ilościowo komórki. Poniżej opisano protokół kwantyfikacji oocytów przy użyciu niekomercyjnego pakietu do przetwarzania obrazu, FIJI-ImageJ14.
<ol>
	<li>Korzystając ze spłaszczonej projekcji maksymalnej intensywności serii obrazów Z-stack dla określonych markerów komórkowych będących przedmiotem zainteresowania (bez kanału DAPI), przekonwertuj obraz na czarno-biały obraz 8-bitowy w obszarze Typ w menu rozwijanym Obraz.</li>
	<li>W menu rozwijanym Obraz podświetl kartę Dostosuj, a następnie wybierz opcję Próg.</li>
	<li>Ręcznie dostosuj próg do poziomu, który najlepiej identyfikuje każdą pojedynczą komórkę jajową. Po określeniu poziomu kliknij przycisk Zastosuj, aby wygenerować czarno-biały obraz. Po zakończeniu określ ilościowo próbkę, wyznaczając ją za pomocą ikony owalu lub rysunku odręcznego. 
	UWAGA: FIJI-ImageJ ma różne opcje dostrajania obrazu, który zostanie użyty do ilościowego oznaczania cząstek. Na przykład w obszarze Proces | Zakładka binarna, istnieją różne opcje, które można wykorzystać, aby poprawić wykrywanie tego, co zostanie zliczone. W Rysunek 4, opcjami używanymi do lepszej indywidualizacji mieszków włosowych były Erode, następnie Fill holes i na końcu Watershed.</li>
	<li>W menu rozwijanym Analizuj wybierz opcję Analizuj cząstki. Ustaw parametry zgodnie z żądaną rozdzielczością.</li>
</ol>

<ol><li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Revised+Protocol+for+In+Vitro+Development+of+Mouse+Oocytes+from+Primordial+Follicles+Dramatically+Improves+Their+Developmental+Competence%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Revised Protocol for In Vitro Development of Mouse Oocytes from Primordial Follicles Dramatically Improves Their Developmental Competence.</a> Biology of Reproduction. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li>
<li>Morgan, S., Campbell, L., Allison, V., Murray, A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+Co-Culture+of+Mouse+Ovaries+and+Ovarian+Follicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (97), (2015).</li>
<li>Livera, G., Rouiller-Fabre, V., Valla, J., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+retinoids+on+the+meiosis+in+the+fetal+rat+ovary+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Effects of retinoids on the meiosis in the fetal rat ovary in culture.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 165 (1), 225-231 (2000).</li>
<li>Livera, G., Petre-Lazar, B., Guerquin, M. -J., Trautmann, E., Coffigny, H., Habert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p63+null+mutation+protects+mouse+oocytes+from+radio-induced+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">p63 null mutation protects mouse oocytes from radio-induced apoptosis.</a> Reproduction. 135 (1), 3-12 (2008).</li>
<li>Tilly, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicle+counts+-+not+as+simple+as+1%2C+2%2C+3%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicle counts - not as simple as 1, 2, 3.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 1, 11(2003).</li>
<li>Bucci, T. J., Bolon, B., Warbritton, A. R., Chen, J. J., Heindel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+sampling+on+the+reproducibility+of+ovarian+follicle+counts+in+mouse+toxicity+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Influence of sampling on the reproducibility of ovarian follicle counts in mouse toxicity studies.</a> Reproductive Toxicology. 11 (5), 689-696 (1997).</li>
<li>Skodras, A., Marcelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-Generated+Ovaries+to+Assist+Follicle+Counting+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+ONE%22%5BJournal%5D)">Computer-Generated Ovaries to Assist Follicle Counting Experiments.</a> PLOS ONE. 10 (3), e0120242(2015).</li>
<li>Malki, S., Tharp, M. E., Bortvin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Whole-Mount+Approach+for+Accurate+Quantitative+and+Spatial+Assessment+of+Fetal+Oocyte+Dynamics+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">A Whole-Mount Approach for Accurate Quantitative and Spatial Assessment of Fetal Oocyte Dynamics in Mice.</a> Biology of Reproduction. 93 (5), (2015).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CLARITY+reveals+dynamics+of+ovarian+follicular+architecture+and+vasculature+in+three-dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">CLARITY reveals dynamics of ovarian follicular architecture and vasculature in three-dimensions.</a> Scientific Reports. 7, (2017).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ScaleS%3A+an+optical+clearing+palette+for+biological+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ScaleS: an optical clearing palette for biological imaging.</a> Nature Neuroscience. 18 (10), 1518-1529 (2015).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB%3A+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nature Neuroscience. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearT%3A+a+detergent-+and+solvent-free+clearing+method+for+neuronal+and+non-neuronal+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue.</a> Development. 140 (6), 1364-1368 (2013).</li>
<li>Rinaldi, V. D., Hsieh, K., Munroe, R., Bolcun-Filas, E. M., Schimenti, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Inhibition+of+the+DNA+Damage+Checkpoint+Prevents+Radiation-Induced+Oocyte+Death%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Inhibition of the DNA Damage Checkpoint Prevents Radiation-Induced Oocyte Death.</a> Genetics. , genetics.117.203455 (2017).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Obata, Y., Kono, T., Hatada, I. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/418497a">Oogenesis: Maturation of mouse fetal germ cells in vitro.</a> Nature. 418 (6897), 497(2002).</li>
<li>Faire, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Follicle+dynamics+and+global+organization+in+the+intact+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Follicle dynamics and global organization in the intact mouse ovary.</a> Developmental Biology. 403 (1), 69-79 (2015).</li>
<li>Byrne, C., Hardman, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Mount+Assays+for+Gene+Induction+and+Barrier+Formation+in+the+Developing+Epidermis%5BTitle%5D)+AND+%22Epidermal+Cells%22%5BJournal%5D)">Whole-Mount Assays for Gene Induction and Barrier Formation in the Developing Epidermis.</a> Epidermal Cells. , 127-136 (2005).</li>
<li>Lauter, G., Söll, I., Hauptmann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicolor+fluorescent+in+situ+hybridization+to+define+abutting+and+overlapping+gene+expression+in+the+embryonic+zebrafish+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Multicolor fluorescent in situ hybridization to define abutting and overlapping gene expression in the embryonic zebrafish brain.</a> Neural Development. 6, 10(2011).</li>
<li>Laronda, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioprosthetic+ovary+created+using+3D+printed+microporous+scaffolds+restores+ovarian+function+in+sterilized+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">A bioprosthetic ovary created using 3D printed microporous scaffolds restores ovarian function in sterilized mice.</a> Nature Communications. 8, ncomms15261 (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Badanie rozrodu ssaków wymaga użycia i ilościowego określenia wyspecjalizowanych komórek, które nie są rutynowo podatne na hodowlę komórkową. Jednak systemy hodowli ex vivo są skuteczne w utrzymaniu żywotności jajników i pęcherzykówjajnikowych 1,15. Podczas hodowli jajników tkanka wymaga większej powierzchni do wymiany składników odżywczych poprzez dyfuzję. Dlatego 5-dniowe jajniki myszy są idealne pod względem wielkości i kształtu do hodowli narządów. P...

Aby zbadać skład komórkowy i cechy morfologiczne jajników ssaków, naukowcy często polegają na eksperymentach in vivo, po których następuje immunohistologiczne barwienie jajników zatopionych w parafinie. Ostatnio jednak posiew całego narządu jajnika okazał się skuteczną alternatywą dla badania funkcji jajników1,2,3,4, ponieważ technikę tę można połączyć z lepszymi narzędziami do wizualizacji i kwantyfikacji. Tradycyjnie analiza morfologii jajników polega na odtworzeniu trójwymiarowej architektury jajnika na podstawie seryjnych wycinków zatopionych w parafinie, ale oprócz tego, że jest to pracochłonne i czasochłonne, seryjne cięcie tkanki zatopionej w parafinie nie gwarantuje prawidłowej rekonstrukcji narządu, a skrawki często giną lub są w tym procesie źle uporządkowane.
Oprócz wyzwań technicznych związanych z seryjnym cięciem, istnieją również różnice w metodach rutynowo używanych do ilościowego określania liczby pęcherzyków na jajnik5,6. Obecnie stosowana zmienność metodologiczna upośledza metaanalizę rezerwy jajnikowej w różnych badaniach5,7. Na przykład liczba pęcherzyków z różnych artykułów naukowych może różnić się 10-krotnie lub więcej między podobnymi wiekami rozwojowymi w obrębie określonego szczepu6. Te duże różnice w zgłaszanej kwantyfikacji pęcherzyków mogą prowadzić do nieporozumień i utrudniać porównania między badaniami. Eksperymentalnie, tradycyjne podejścia do kwantyfikacji pęcherzyków z odcinków szeregowych są wykonywane przez liczenie pęcherzyków o określonej liczbie odcinków (np. co piąty, dziesiąty lub inny odcinek). Zmienność liczby mieszków włosowych przy użyciu tego podejścia wynika nie tylko z okresowości, w jakiej zliczane są sekcje, ale także z różnic w grubości przekroju oraz doświadczenia technicznego w generowaniu odcinków szeregowych5,6. Oprócz zmienności, kolejną wadą tradycyjnego cięcia tkanek jest to, że cięcie małych jajników od młodych zwierząt jest szczególnie trudne i w dużym stopniu zależy od orientacji tkanki8.
Poniższy protokół opisuje rutynowo stosowaną technikę hodowli jajników1, ale znacznie poprawia tradycyjną kwantyfikację pęcherzyków, zastępując fizyczne cięcie oczyszczaniem tkanek i cięciem optycznym za pomocą mikroskopii konfokalnej8,9. Oczyszczanie za pomocą zanurzenia w tkance (bez konieczności perfuzji przezczaszkowej lub elektroforezy) w roztworze na bazie mocznika i sorbitolu (np. ScaleS(0)10) okazało się zgodne z barwieniem immunologicznym i pozwoliło na skrócenie czasu usuwania bez uszczerbku dla głębokości obrazowania. Inne raportowane metody (np. ScaleA28,10, SeeDB11, ClearT12 i ClearT212) są albo bardziej czasochłonne, albo nie pozwalają na dogłębną rozdzielczość optyczną próbki. Sekcja optyczna jest korzystna, ponieważ jest mniej pracochłonna i zachowuje trójwymiarową architekturę organów7,8. Kolejną zaletą tego podejścia jest to, że przygotowanie próbek nie wymaga kosztownych odczynników do oczyszczenia tkanki i może być przeprowadzone ze względną łatwością.
W szczególności, opisany protokół został zoptymalizowany dla hodowanych jajników myszy w piątym dniu po urodzeniu, ale został przeprowadzony na jajnikach od 0 do 10 dnia po urodzeniu. Metoda wykorzystuje system hodowli jajników, w którym tkanka w naturalny sposób przyczepia się do błony, na której jest hodowana, ułatwiając obsługę narządów i manipulację. Opisany system hodowli może być używany do utrzymywania eksplantowanych jajników przez okres do 10 dni i do oceny, w jaki sposób różne warunki eksperymentalne mogą zakłócać przeżywalność oocytów13. Opisana procedura kwantyfikacji jest wykonywana przy użyciu niekomercyjnego pakietu do przetwarzania obrazów FIJI-ImageJ14 i może być przeprowadzona na większości komputerów osobistych. Co więcej, obrazy wykorzystywane do kwantyfikacji mogą być szeroko dostępne dla społeczności naukowej, co pozwoli na przyszłą metaanalizę.

<table><tbody><tr><td>Nożyczki do mikro preparacji 4,5", proste, ostre końcówki</td><td>Roboz</td><td>RS-5912</td><td>Nożyczki do mikropreparowania</td></tr><tr><td>Kleszcze jubilerskie 4-3/8", styl 5</td><td>Integra Miltex</td><td>17-305X</td><td>Kleszczyki z cienką końcówką</td></tr><tr><td>Nożyczki Micro Iris 4", proste, ostre końcówki</td><td>Integra Miltex</td><td>18-1618</td><td>Nożyczki do mikro preparowania tęczówki lub nożyczki sprężynowe do mikro preparowania</td></tr><tr><td>1X Minimal Essential Media (MEM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>Serium bydlęce</td> płodu <td>Corning</td><td>35011CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1M)</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>antybiotykowo-przeciwgrzybicze (100X)</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>stosowany w kroku 1.3.1</td></tr><tr><td>Naczynie poddane hodowli tkankowej 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>Nunc&handel; 24-dołkowa płytka nośna do wkładów do hodowli komórkowych</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>141006</td><td>Wielkość porów: 8&mu; m</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA)</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td>16% roztwór</td></tr><tr><td>1X Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Mikser nutatorów GyroTwister&trade;</td><td>Trójwymiarowa wytrząsarka</td> <td>Labnet</td><td>S1000-A-B</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>VWR</td><td>103219-578</td><td></td></tr><tr><td>Białko surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>VWR</td><td>97061-416</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu (NaN3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002-25G</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór borowodorku sodu (NaBH4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>452904-25ML</td><td>Użyj roztworu, a nie w postaci tabletek lub proszku&nbsp;</td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy (PVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8136-250G</td><td>Rozpuszczalny w zimnej wodzie</td></tr><tr><td>Triton&trade; X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93443-100ML</td><td>eter tert-oktylofenylowy glikolu polietylenowego</td></tr><tr><td>Filtry strzykawkowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>725-2520</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawki 25mm 10mL</td><td>BD</td><td>309695</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało anty-p63 (4A4)</td><td>Biocare Medical</td><td>CM 163A</td><td>Rozcieńczenie 1:500</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-MVH królika</td><td>Abcam</td><td>ab13840</td><td>Rozcieńczenie 1:600</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; kozia anty-mysz 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11032</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor&reg; koza anty-królik 488</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-11034</td><td>Rozcieńczenie 1:1000</td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)&nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>D-(-)sorbitol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>240850-100G</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Mocznik</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dimetylosulfotlenek (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-5X10ML</td><td></td></tr><tr><td>FIJI-ImageJ</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazu</td></tr><tr><td>Jednorazowe plastikowe pipety transferowe</td><td>VWR</td><td>414044-034</td><td></td></tr></tbody></table>

immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Badania w dziedzinie biologii rozrodu ssaków często obejmują ocenę ogólnego stanu zdrowia jajników i jąder. W szczególności u kobiet sprawność jajników jest często oceniana poprzez wizualizację i ilościowe określenie pęcherzyków i oocytów. Ponieważ jajnik jest nieprzezroczystą trójwymiarową tkanką, tradycyjne podejścia wymagają pracochłonnego krojenia tkanki na liczne szeregowe odcinki w celu wizualizacji komórek w całym narządzie. Ponadto, ponieważ kwantyfikacja tą metodą zazwyczaj wiąże się z oceną tylko podzbioru odcinków oddzielonych przybliżoną średnicą oocytu, jest ona podatna na niedokładności. Tutaj opisano protokół, który zamiast tego wykorzystuje oczyszczanie tkanek całego narządu i barwienie immunofluorescencyjne jajników myszy w celu wizualizacji pęcherzyków i oocytów. W porównaniu z bardziej tradycyjnymi podejściami, protokół ten jest korzystny dla wizualizacji komórek w jajniku z wielu powodów: 1) jajnik pozostaje nienaruszony przez cały okres przygotowywania i przetwarzania próbki; 2) małe jajniki, które są trudne do przekrojenia, można z łatwością zbadać; 3) kwantyfikacja komórkowa jest łatwiejsza i dokładniejsza; oraz 4) cały narząd przedstawiony na obrazie.

Niniejszy protokół obejmuje 6 głównych etapów następujących po wycięciu jajników, zgodnie z opisem na Rysunku 1. Rysunek 2, Rysunek 3, Rysunek 4 uwydatniają najbardziej nowatorskie cechy tego protokołu, do których należą optymalizacja utrudniania przejrzystości tkanek (clearingu) dla jajników oraz ilościowe oznaczenie oo...

Tutaj prezentujemy protokół do ilościowego oznaczania pęcherzyków w hodowanych jajnikach młodych myszy bez seryjnego cięcia. Stosując immunofluorescencję całego narządu i oczyszczanie tkanek, cięcie fizyczne zastępuje się cięciem optycznym. Ta metoda przygotowania i wizualizacji próbek utrzymuje integralność narządów i ułatwia automatyczną ocenę ilościową określonych komórek.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie obrazów hodowanych całych jajników, które są zgodne z automatyczną kwantyfikacją pęcherzyków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu, takie jak to, w jaki sposób różne warunki wpływają na sprawność jajników. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest mniej pracochłonna i zachowuje trójwymiarową architekturę organów.Chociaż metoda ta została zoptymalizowana pod kątem hodowanych jajników myszy w piątym dniu po urodzeniu, można ją również zastosować do innych grup wiekowych i tkanek, takich jak gonady embrionalne lub jądra młodych myszy. Zacznij od czystej powierzchni roboczej. Przetrzyj dziesięcioprocentowym wybielaczem i pozwól wybielaczowi pozostać na powierzchni roboczej przez co najmniej pięć minut.Po pięciu minutach usuń nadmiar wybielacza czystymi ręcznikami papierowymi i 70-procentowym etanolem. Dokładnie wyczyść mikroskop preparacyjny 70-procentowym etanolem i połóż suchy ręcznik papierowy na scenie. Owiń czyste kleszcze i nożyczki ręcznikiem papierowym zwilżonym 70-procentowym etanolem.Następnie przygotuj 50 mililitrów pożywki do hodowli jajników w stożkowej probówce i ogrzej w łaźni wod

whole-mount-immunofluorescence-follicle-quantification-cultured-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten protokół opisuje pierwotną hodowlę/kokulturę tkanki jajnikowej myszy, używając jajników od noworodków myszy i indywidualnych pęcherzyków jajnikowych od myszy przed okresem dojrzewania. Techniki hodowli wspomagają rozwój w wysoce fizjologiczny sposób, umożliwiając badanie wpływu czynników zewnętrznych na jajnik oraz interakcji między pęcherzykami jajnikowymi.

Hodowla i kokultura jajników myszy i pęcherzyków jajnikowych

Hodowle tkanek jajnikowych mogą być używane jako modele rozwoju pęcherzyków, owulacji i atrezji pęcherzyków oraz wskazują mechanizmy regulacyjne dynamicznych procesów jajnikowych.

Posiew tkanki jajnikowej w celu wizualizacji zjawisk w jajniku myszy

Tutaj opisujemy, porównujemy i kontrastujemy dwie różne techniki dokładnego liczenia pęcherzyków w stałych tkankach jajnika myszy.

Dokładne liczenie pęcherzyków w jajnikach dorosłych myszy

Tutaj prezentujemy zoptymalizowany protokół obrazowania całych jajników do analiz ilościowych i jakościowych przy użyciu barwienia immunologicznego z całą mocą, mikroskopii wielofotonowej oraz wizualizacji i analizy 3D. Protokół ten umożliwia wysokowydajne, niezawodne i powtarzalne przetwarzanie, które ma zastosowanie w toksykologii, diagnostyce klinicznej i testach genomowych funkcji jajników.

Immunofluorescencja, oczyszczanie i mikroskopia wielofotonowa całego jajnika do ilościowej analizy 3D rozwijającej się rezerwy jajnikowej u myszy

Opisany tutaj protokół szczegółowo opisuje indukcję programu hemogennego w mysich fibroblastach embrionalnych poprzez nadekspresję minimalnego zestawu czynników transkrypcyjnych. Technologia ta może zostać przełożona na system ludzki, aby zapewnić platformy do przyszłych badań nad hematopoezą, chorobami hematologicznymi i przeszczepem krwiotwórczych komórek macierzystych.

Przeprogramowanie fibroblastów embrionalnych myszy za pomocą czynników transkrypcyjnych w celu wywołania programu hemogennego

Prezentujemy metodę izolacji i hodowli mysiego kanału Wolffa (WD). Demonstrujemy również szczegółową procedurę barwienia immunologicznego całej góry hodowanych/świeżo wyizolowanych WD z fluorescencyjnie znakowanymi przeciwciałami. Razem techniki te umożliwiają badanie rozwoju, zwijania i różnicowania WD.

Hodowla narządów i barwienie immunofluorescencyjne całego wierzchowca mysich przewodów Wolffa

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

W tym protokole opisujemy techniki prawidłowego preparowania kwiatów i krzemionek Arabidopsis, niektóre podstawowe techniki oczyszczania oraz wybrane procedury barwienia dla obserwacji struktur rozrodczych na całej powierzchni.

Całościowe oczyszczanie i barwienie organów kwiatowych Arabidopsis i krzemianek

Tutaj opisujemy protokół immunofluorescencji całego wierzchowca i ilościowej analizy objętościowej zarodków myszy we wczesnym stadium rozwoju. Przedstawiamy tę technikę jako potężne podejście do jakościowej i ilościowej oceny struktur serca podczas rozwoju i sugerujemy, że może być ona szeroko adaptowalna do innych układów narządów.

Ilościowa analiza immunofluorescencyjna całego mocowania populacji progenitorów serca w zarodkach myszy

Jajnik Drosophila jest doskonałym modelem do badania rozwoju nisz komórek macierzystych. Chociaż metody preparowania jajników larwalnych i dorosłych zostały opublikowane, sekcje jajników poczwarki wymagają różnych technik, które nie zostały szczegółowo opublikowane. Tutaj przedstawiamy protokół preparowania, barwienia i montowania jajników poczwarki.

Rozwarstwienie i barwienie jajników poczwarki Drosophila

Poznaj metodę immunofluorescencji całych narządów z oczyszczaniem tkanek do automatycznej kwantyfikacji pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy. Technika zachowuje trójwymiarową strukturę organu i jest mniej pracochłonna niż tradycyjne preparaty.

Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Przeglądaj więcej filmów