Immunofluorescencja całej góry i kwantyfikacja pęcherzyków w hodowanych jajnikach myszy

Ogólnym celem tej procedury jest uzyskanie obrazów hodowanych całych jajników, które są zgodne z automatyczną kwantyfikacją pęcherzyków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu, takie jak to, w jaki sposób różne warunki wpływają na sprawność jajników. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest mniej pracochłonna i zachowuje trójwymiarową architekturę organów.

Chociaż metoda ta została zoptymalizowana pod kątem hodowanych jajników myszy w piątym dniu po urodzeniu, można ją również zastosować do innych grup wiekowych i tkanek, takich jak gonady embrionalne lub jądra młodych myszy. Zacznij od czystej powierzchni roboczej. Przetrzyj dziesięcioprocentowym wybielaczem i pozwól wybielaczowi pozostać na powierzchni roboczej przez co najmniej pięć minut.

Po pięciu minutach usuń nadmiar wybielacza czystymi ręcznikami papierowymi i 70-procentowym etanolem. Dokładnie wyczyść mikroskop preparacyjny 70-procentowym etanolem i połóż suchy ręcznik papierowy na scenie. Owiń czyste kleszcze i nożyczki ręcznikiem papierowym zwilżonym 70-procentowym etanolem.

Następnie przygotuj 50 mililitrów pożywki do hodowli jajników w stożkowej probówce i ogrzej w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza. Po ogrzaniu pożywki przygotuj płytki i wkładki, dodając najpierw jeden mililitr pożywki do hodowli jajników do 35-milimetrowych płytek do hodowli tkankowych. Następnie dodaj około 0,55 mililitra pożywki do dołków 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej i umieść wkładkę w każdej studzience zawierającej pożywkę.

Upewnij się, że membrany stykają się z nośnikiem. Umieść 35-milimetrowe płytki i 24-dołkową płytkę nośną w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięcioprocentowym dwutlenku węgla i tlenu atmosferycznego. Następnie umieść płytę grzejną obok lunety sekcyjnej i ustaw temperaturę na 37 stopni Celsjusza.

Jeśli inkubator do hodowli tkankowej nie znajduje się w pobliżu obszaru rozwarstwienia, umieść jedną z 35-milimetrowych szalek do hodowli tkankowych zawierających pożywkę do hodowli jajników na gorącej płycie. Następnie rozpocznij sekcję od spryskania świeżo uśpionej kobiety 70-procentowym etanolem i umieść ją na suchym ręczniku papierowym pod mikroskopem preparacyjnym. Po wykonaniu nacięcia w jamie brzusznej należy wycisnąć jelita i zlokalizować jajniki.

Wyodrębnij jajniki i umieść je w pożywce hodowlanej w 35-milimetrowym naczyniu. Po wypreparowaniu jajników zwiększ powiększenie mikroskopu preparacyjnego, aby lepiej uwidocznić jajniki i wszelkie przyczepione tkanki. Za pomocą czystych kleszczyków z cienką końcówką usuń całą tkankę niejajnikową, taką jak kaletka i tkanka tłuszczowa, bez uszkadzania jajników.

Następnie umieść każdą parę jajników na wstępnie namoczonej wkładce do hodowli komórkowej i dostosuj objętość pożywki, aby upewnić się, że jest wystarczająca do utrzymania wilgoci w narządzie bez jego całkowitego zanurzania. Umieść eksplantowane organy w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, pięcioprocentowym dwutlenku węgla i tlenu atmosferycznego. W pożądanym eksperymentalnym punkcie czasowym usuń pożywkę do hodowli jajników z płytki i przymocuj wyhodowane jajniki do wkładki, pokrywając tkankę świeżo przygotowanym czteroprocentowym roztworem PFA.

Uszczelnij krawędzie płytki folią parafinową, aby uniknąć parowania, i umieść próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza na noc. Opłucz tkankę trzykrotnie 70-procentowym etanolem. Następnie przechowuj w fiolkach scyntylacyjnych wypełnionych 70-procentowym etanolem w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu dalszego przetwarzania.

Barwienie należy rozpocząć od usunięcia 70% etanolu z fiolek i przemycia utrwalonej tkanki PBS w temperaturze pokojowej z potrząsaniem przez co najmniej cztery godziny. Po usunięciu PBS dodaj tyle roztworu do przepuszczalności, aby całkowicie zanurzyć jajniki. Umieścić na wytrząsarce orbitalnej i inkubować w temperaturze pokojowej przez cztery godziny.

Zastąp roztwór przepuszczalny roztworem blokującym wystarczającym roztworem, aby całkowicie zanurzyć jajniki. Następnie inkubować szczelnie zamknięte fiolki w temperaturze pokojowej przez co najmniej 12 godzin na wytrząsarce orbitalnej. Po zablokowaniu umieść wkładki w 24-dołkowej płytce i dodaj około 750 mikrolitrów roztworu przeciwciał pierwotnych, upewniając się, że jajniki są całkowicie zanurzone.

Następnie umieść szczelnie zapieczętowaną płytkę na wytrząsarce orbitalnej i inkubuj przez cztery dni w temperaturze pokojowej. Po czterech dniach usuń przeciwciało pierwotne i dodaj dużą ilość roztworu myjącego. Umyj jajniki przez noc.

Następnego dnia zastąp świeżym roztworem do płukania i inkubuj na wytrząsarce orbitalnej przez dwie godziny lub dłużej. Po umyciu dodaj wtórny roztwór przeciwciał. Chronić próbki przed światłem i inkubować na wytrząsarce orbitalnej w temperaturze pokojowej przez dwa dni.

Po dwóch dniach usunąć drugorzędowy roztwór przeciwciała z próbek i dodać roztwór myjący. Zacznij od przygotowania roztworu czyszczącego ScaleS0. Wymieszaj roztwór przez odwrócenie i inkubuj w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Odgazuj roztwór czyszczący ScaleS0. Następnie usuń roztwór myjący z jajników wybarwionych immunologicznie. Dodaj roztwór czyszczący.

Przykryj płytkę folią aluminiową i włóż ją z powrotem do wytrząsarki orbitalnej. Niezwykle ważne jest, aby uzbroić się w cierpliwość podczas etapów barwienia i czyszczenia. Gdy tkanka stanie się przezroczysta, użyj skalpela z cienką końcówką, aby ostrożnie usunąć błony wprowadzające zawierające hodowane jajniki.

Umieścić próbkę na szkiełku podstawowym i delikatnie przykryć próbkę szkiełkiem nakrywkowym. Następnie przystąp do obrazowania próbek pod mikroskopem zdolnym do cięcia optycznego. To zdjęcie przedstawia jajnik w piątej dobie po porodzie, który nie został oczyszczony.

W tym przypadku jajnik jest pokazany godzinę po dodaniu roztworu czyszczącego. Jajnik zacznie stawać się przezroczysty w ciągu kilku minut od zanurzenia w roztworze klarującym. Możliwe jest optyczne cięcie hodowanych jajników bez oczyszczania, ale komórki znajdujące się głęboko w tkance mają sygnał, który jest trudny do odróżnienia od tła, co utrudnia prawidłową kwantyfikację oocytów.

W przeciwieństwie do tego, ten reprezentatywny obraz przedstawia oczyszczoną próbkę, w której możliwa jest kwantyfikacja oocytów w całym narządzie. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że przeciwciała muszą dyfundować przez tkankę; W związku z tym grubsze tkanki będą wymagały dłuższego czasu inkubacji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować, barwić i obrazować całe jajniki.

Tekst opisuje użycie darmowego oprogramowania Fiji ImageJ, które może być używane do prostej oceny ilościowej mieszków włosowych. Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem i azydkiem sodu może być niebezpieczna, a podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak stosowanie dygestoriów i środków ochrony osobistej.