Name: Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 21 s
Description: Poznaj metodę produkcji transgenicznych myszy za pomocą wektorów lentiwirusowych poprzez wstrzyknięcie do przestrzeni perywiteliny. Technika ta umożliwia szybkie badania in vivo z ponad 70% skutecznością integracji transgenu u noworodków.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Magali Dumont i Rolando Meloni za krytyczną lekturę manuskryptu oraz rdzeniom ICM iVector i Phenoparc za pomoc techniczną odpowiednio w produkcji wektorów lentiwirusowych i pomieszczeniach dla zwierząt. Prace te były wspierane przez Institut Hospitalo-Universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. otrzymała dofinansowanie dla Association de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) oraz wspólny grant JDRF / INSERM.

<ol><li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+engraftment+of+human+hematopoietic+cells+in+severe+combined+immunodeficient+%28SCID%29+mice+carrying+human+cytokine+transgenes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes.</a> Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).</li>
<li>Miyakawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+granulocyte-macrophage+colony+stimulating+factor+producing+transgenic+SCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice.</a> British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).</li>
<li>Hirabayashi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+on+the+integration+of+exogenous+DNA+into+mouse%2C+rat%2C+rabbit%2C+and+pig+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Animals%22%5BJournal%5D)">A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes.</a> Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).</li>
<li>Isola, L. M., Gordon, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+animals%3A+a+new+era+in+developmental+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine.</a> Biotechnology. 16, 3-20 (1991).</li>
<li>Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiply+attenuated+lentiviral+vector+achieves+efficient+gene+delivery+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo.</a> Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).</li>
<li>Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transmission+and+tissue-specific+expression+of+transgenes+delivered+by+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors.</a> Science. 295 (5556), 868-872 (2002).</li>
<li>Ewerling, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+laser-assisted+lentiviral+transgenesis+in+bovine%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine.</a> Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).</li>
<li>Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+embryos+and+mice+produced+from+low+titre+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Research%22%5BJournal%5D)">Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors.</a> Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).</li>
<li>Park, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors%3A+are+they+the+future+of+animal+transgenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Genomics%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis.</a> Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).</li>
<li>van Arensbergen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distal+intergenic+region+controls+pancreatic+endocrine+differentiation+by+acting+as+a+transcriptional+enhancer+and+as+a+polycomb+response+element%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element.</a> PLoS One. 12 (2), e0171508(2017).</li>
<li>Friedli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+enhancer+screen+using+lentivector+transgenesis+identifies+conserved+and+non-conserved+functional+elements+at+the+Olig1+and+Olig2+locus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus.</a> PLoS One. 5 (12), e15741(2010).</li>
<li>Sauvain, M. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+features+of+lentivirus+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Genotypic features of lentivirus transgenic mice.</a> Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).</li>
<li>Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+lentiviral-mediated+human+cytokine+transgenesis+on+the+NOD%2Fscid+background%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background.</a> Blood. 103 (2), 580-582 (2004).</li>
<li>Zennou, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+DNA+flap+stimulates+HIV+vector-mediated+cell+transduction+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain.</a> Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).</li>
<li>Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+self-inactivating+lentivirus+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Development of a self-inactivating lentivirus vector.</a> Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).</li>
<li>Yee, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+general+method+for+the+generation+of+high-titer%2C+pantropic+retroviral+vectors%3A+highly+efficient+infection+of+primary+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).</li>
<li>Castaing, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+restricted+gene+expression+in+beta+cells+by+lentivirus-mediated+gene+transfer+into+pancreatic+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells.</a> Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).</li>
<li>Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((neurogenin3+is+required+for+the+development+of+the+four+endocrine+cell+lineages+of+the+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).</li>
<li>Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+expression+of+retrovirus-mediated+gene+transfer+in+mouse+fibroblast+implants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).</li>
<li>Norrman, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+constitutive+promoters+in+human+ES+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells.</a> PLoS One. 5 (8), e12413(2010).</li>
<li>Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV%29+DNA+integration+in+acutely+infected+cells+as+determined+using+a+novel+assay+for+detection+of+integrated+HIV+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA.</a> Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).</li>
<li>Ohtsuka, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+multiple+transgenic+mouse+lines+using+an+improved+Pronuclear+Injection-based+Targeted+Transgenesis+%28i-PITT%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT).</a> BMC Genomics. 16, 274(2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+integrase-mediated+transgenesis+in+mice+via+pronuclear+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).</li>
<li>Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+highly+efficient+transgenesis+method+in+mice+with+the+Tol2+transposon+system+and+cytoplasmic+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection.</a> Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).</li>
<li>Garrels, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+injection+of+murine+zygotes+with+Sleeping+Beauty+transposon+plasmids+and+minicircles+results+in+the+efficient+generation+of+germline+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice.</a> Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).</li>
<li>Ding, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transposition+of+the+piggyBac+%28PB%29+transposon+in+mammalian+cells+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice.</a> Cell. 122 (3), 473-483 (2005).</li>
<li>Aida, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning-free+CRISPR%2FCas+system+facilitates+functional+cassette+knock-in+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice.</a> Genome Biology. 16, (2015).</li>
<li>Philippe, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+with+a+defective+integrase+allow+efficient+and+sustained+transgene+expression+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+USA%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do ujawnienia konfliktu interesów.

Opisane tutaj wstrzyknięcie wektorów lentiwirusowych do zapłodnionych oocytów spowodowało wytworzenie transgenicznych zarodków, które dały ponad 70% transgenicznych zarodków w stosunku do całkowitej liczby pobranych zarodków. Wynik ten jest zgodny z wcześniejszymi raportami i ilustruje specyfikę procedury 2,7,10,11,12. Porównując wszystkie dane przedstawione w...

Pionierska praca Gordona i in. z 1980 roku pokazała, że po implantacji u myszy w pseudociąży, wstrzyknięcie plazmidowego DNA do męskich przedjądrzy zapłodnionych oocytów może spowodować produkcję transgenicznych zwierząt, które zintegrowały plazmidowe DNA1. Wykazanie, że można wyhodować transgeniczne ssaki, miało ogromny wpływ na światowe nauki przyrodnicze, otwierając drogę do nowych dziedzin badań zarówno w naukach podstawowych, jak i translacyjnych naukach biomedycznych. W ciągu ostatnich czterech dekad mikroiniekcja DNA stała się rutynową praktyką. Chociaż wyprodukowano ogromną liczbę myszy transgenicznych, standardowa metoda nie jest w pełni użyteczna dla wszystkich szczepów myszy i wymaga czasochłonnych krzyżówek wstecznych2,3. Jego zastosowanie do innych gatunków pozostaje wyzwaniem4, a ogólna wydajność integracji transgenu jest ograniczona do kilku procent urodzonych zwierząt5. Ponadto skuteczność integracji transgenu stanowi czynnik ograniczający, który wyjaśnia słabą ogólną wydajność wstrzykiwania projądrkowego DNA. Pod tym względem integracyjne wektory wirusowe są najbardziej wydajnymi narzędziami do transportu i integracji transgenów, a zatem mogą zapewnić nowe środki do znacznego zwiększenia wydajności integracji, przy czym jedynym ograniczeniem jest to, że rozmiar transgenu nie może przekraczać 10 kb6.
wektory lentiwirusowe pseudo-typowane białkiem otaczającym wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) są pantropicznymi i wysoce integracyjnymi narzędziami transferu genów i mogą być używane do transdukcji zapłodnionych oocytów7. Osłonka przejrzysta otaczająca oocyty stanowi naturalną barierę wirusową i musi zostać przekroczona, aby umożliwić transdukcję z wektorami lentiwirusowymi. Zwierzęta transgeniczne zostały wygenerowane przez transdukcję zapłodnionych oocytów po mikrowierceniu lub usunięciu osłony przejrzystej8,9. Jednak wstrzyknięcie poniżej osłonki przejrzystej w przestrzeni perywitelowej wydaje się być najprostszą metodą transdukcji zapłodnionych jaj, jak początkowo opisali Lois i współpracownicy7.
Wstrzykiwanie wektorów lentiwirusowych w periwitellinie pozwala na uzyskanie wysokich plonów w produkcji zwierząt transgenicznych, które stanowią ponad 70% urodzonych zwierząt. Taki plon jest ponad 10-krotnie wyższy niż najlepszy plon, jaki można osiągnąć przy użyciu standardowej iniekcji DNA z przedjądrza7,10,11. W tym kontekście, pojedyncza sesja zastrzyków wygeneruje co najmniej 50 transgenicznych założycieli (F0). Duża liczba założycieli jest zatem zgodna z fenotypowaniem efektu transgenu wykonywanym bezpośrednio na myszach F0 bez konieczności generowania transgenicznych linii myszy. Ta zaleta pozwala na szybkie badania przesiewowe efektu transgenu i jest specjalnie przystosowana do przeprowadzania badań in vivo nad przyrostem i utratą funkcji w ciągu kilku tygodni. Ponadto regulatorowe elementy DNA mogą być również szybko badane przesiewowo w celu mapowania wzmacniaczy i motywów DNA związanych czynnikami transkrypcyjnymi11,12. W przypadku wstrzyknięć projądrkowych transgeny zwykle integrują się jako wiele kopii w unikalnym locus. W przypadku wektorów lentiwirusowych integracja zachodzi w wielu loci jako pojedyncza kopia na locus10,13. W związku z tym mnogość zintegrowanych loci jest najprawdopodobniej związana z bardzo wysoką penetracją ekspresji obserwowaną u transgenicznych założycieli, co sprawia, że nowo wygenerowany model jest bardziej odporny.
Ważne, podczas korzystania z iniekcji projądrowej DNA, wizualizacja przedjądrzy podczas procedury jest absolutnie wymagana. To ograniczenie techniczne uniemożliwia wykorzystanie zapłodnionych oocytów pochodzących z wielu różnych szczepów myszy. W związku z tym wytworzenie modelu transgenicznego w określonym szczepie, dla którego przedjądrza są niewidoczne, wymaga produkcji zwierząt w szczepie permisywnym, po którym następuje co najmniej 10 kolejnych krzyżówek wstecznych w celu przeniesienia transgenu w pożądanym szczepie myszy. W przypadku iniekcji wektora lentiwirusowego przestrzeń okołowitelowa jest zawsze widoczna, a wstrzyknięcie nie wymaga bardzo specyficznych umiejętności. Na przykład, transgeniczne myszy NOD/SCID, które nie nadają się do wstrzyknięcia przedjądrza, uzyskano za pomocą iniekcji wektora wirusowego14.
Tutaj przedstawiono kompleksowy protokół umożliwiający prostą produkcję transgenicznych myszy za pomocą iniekcji wektorów lentiwirusowych w przestrzeni periwitelinowej zarodka w jednym stadium komórkowym. Ekspresja transgenu kontrolowana za pomocą wszechobecnych lub specyficznych dla komórki promotorów jest szczegółowo opisana.
W tym badaniu użyto szkieletu lentiwirusowego pTrip ΔU315. Wektor ten pozwala na wytwarzanie wadliwych wektorów lentiwirusowych z wadą replikacji, w których sekwencja U3 została częściowo usunięta w celu usunięcia aktywności promotora U3 i wygenerowania wektora samoinaktywującego (SIN)16. Stada wektorów lentiwirusowych wyprodukowano przez przejściową transfekcję komórek HEK-293T z plazmidem enkapsulacyjnym p8.91 (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G kodującym wirusa pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV) glikoproteina-G17 i wektor rekombinowany pTRIP ΔU3. Szczegółowa procedura produkcji jest podana jako metody uzupełniające.
Produkcja wektorów lentiwirusowych o wysokim mianie odbywa się w warunkach bezpieczeństwa biologicznego II poziomu (BSL-2). Dotyczy to większości transgenów, z wyjątkiem onkogenów, które muszą być wytwarzane w BSL-3. Dlatego produkcja w warunkach BSL-2 w większości przypadków jest wystarczająca. Ponadto dla większości krajowych agencji regulacyjnych zajmujących się organizmami modyfikowanymi genetycznie (GMO) stosowanie i produkcja są zwykle nierozłączne. Ograniczone ilości niekompetentnych do replikacji wektorów lentiwirusowych SIN (poniżej 2 μg białka kapsydu p24) mogą być stosowane w warunkach BSL-1 opisanych przez francuską agencję ds. GMO zgodnie z zaleceniami Unii Europejskiej.

<table><tbody><tr><td>PMSG 50UI</td><td>Sigma</td><td>G4527</td><td></td></tr><tr><td>hCG 5000UI</td><td>Sigma</td><td>CG5-1VL</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>7982</td><td></td></tr><tr><td>100 mm szalka Petriego</td><td>Hotsher</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>4 dołki Miska Nunc</td><td>Dutsher</td><td>56469</td><td>Miska IVF</td></tr><tr><td>M2 średnia</td><td>Sigma</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>M16 średnia</td><td>Sigma</td><td>M7292</td><td></td></tr><tr><td>0,22 &mikro; m Filtr strzykawkowy</td><td>Dutsher</td><td>146611</td><td></td></tr><tr><td>Enzym hialuronidazy 30mg</td><td>Sigma</td><td>H4272</td><td>testowany na zarodkach myszy</td></tr><tr><td>Serynge insulinowy</td><td>VWR</td><td>613-3867</td><td>Terumo Myjector</td></tr><tr><td>Kleszcze zakrzywione</td><td>Moria</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki zakrzywione</td><td>Moria</td><td>MC26</td><td></td></tr><tr><td>Zestawy probówek aspiratora do kalibrowanych pipet mikrokapilarnych</td><td>Sigma</td><td>A5177-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Kapilary ze szkła borokrzemianowego</td><td>Aparat Harvarda</td><td>GC 100-10</td><td></td></tr><tr><td>Poziomy ściągacz do mikropipet</td><td>Narishige</td><td>PN-30</td><td></td></tr><tr><td>Microforge</td><td>Narishige</td><td>MF-900</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Nikon</td><td>Transferman NK2 5188</td><td>Wymagane</td></tr> <tr><td>jest oświetlenie kontrastowe modulacji HoffmanaMikromanipulator</td><td>Eppendorf</td><td>Celltram air</td><td></td></tr><tr><td>Kontroler pipety trzymającej</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td></td></tr><tr><td>Olej mineralny</td><td>Sigma</td><td>M8410</td><td>badany na zarodkach myszy</td></tr><tr><td>Mikrowstrzykiwacz</td><td>Eppendorf</td><td>Femtojet</td><td>Może być używany do wstrzykiwania DNA lub wektorów wirusowych</td></tr><tr><td>Dumont # 5 kleszcze</td><td>Moria</td><td>MC 40</td><td></td></tr><tr><td>vannas mikronożyczki</td><td>Moria</td><td>9600</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>centravet</td><td>ISO005</td><td>ISO-VET 100% 250ml</td></tr><tr><td>ocrygel</td><td>centravet</td><td>OCR002</td><td></td></tr><tr><td>Povidone jodure</td><td>centravet</td><td>VET001</td><td>vetedine 120ml</td></tr><tr><td>Buprenorphine</td><td>centravet</td><td>BUP002</td><td>Buprecare 0,3Mg/ml 10ml</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T5941</td><td>Trizma chlorowodorek</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma 436143</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>białkowaza w proszku</td></tr><tr><td>K</td><td>Sigma</td><td>P2308&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw oneTaq</td><td>NEB</td><td>M0480L</td><td></td></tr><tr><td>Startery</td><td>Eurogentec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasek 8 probówek PCR</td><td>4titude</td><td>4ti-0781</td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowy termocykler</td><td>Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>Veriti</td></tr><tr><td>Genomic DNA mini kit</td><td>invitrogen</td><td>K1820-02</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Master mix</td><td>Roche</td><td>4887352001</td><td>SYBR Green&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytka wielodołkowa 384</td><td></td><td>Przyrząd do</td> qPCR 5217555001 <td></td>Roche</tr><tr><td>384 dołkowy</td><td>Roche</td><td>5015243001</td><td>LightCycler 480</td></tr></tbody></table>

produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders

Od prawie 40 lat iniekcja projądrowego DNA stanowi standardową metodę generowania transgenicznych myszy z losową integracją transgenów. Taka rutynowa procedura jest szeroko stosowana na całym świecie, a jej głównym ograniczeniem jest słaba skuteczność integracji transgenów, co skutkuje niską wydajnością zwierząt założycielskich. Tylko kilka procent zwierząt urodzonych po implantacji zapłodnionych oocytów, którym wstrzyknięto implant, zintegrowało transgen. W przeciwieństwie do tego, wektory lentiwirusowe są potężnymi narzędziami do integracyjnego transferu genów, a ich zastosowanie do transdukcji zapłodnionych oocytów pozwala na wysoce wydajną produkcję założycielskich myszy transgenicznych ze średnią wydajnością powyżej 70%. Co więcej, każdy szczep myszy może być wykorzystany do produkcji transgenicznego zwierzęcia, a penetracja ekspresji transgenu jest niezwykle wysoka, ponad 80% w przypadku transgenezy za pośrednictwem lentiwirusa w porównaniu z mikroiniekcją DNA. Wielkość fragmentu DNA, który może być przenoszony przez wektor lentiwirusowy, jest ograniczona do 10 kb i stanowi główne ograniczenie tej metody. Stosując prostą i łatwą do wykonania procedurę iniekcji pod osłonką przejrzystą zapłodnionych oocytów, podczas jednej sesji mikroiniekcji można wyprodukować ponad 50 zwierząt założycielskich. Taka metoda jest wysoce przystosowana do przeprowadzania, bezpośrednio u zwierząt założycielskich, badań nad szybkim przyrostem i utratą funkcji lub do badań przesiewowych regionów genomowego DNA pod kątem ich zdolności do kontrolowania i regulowania ekspresji genów in vivo.

Zwierzęta transgeniczne wygenerowano zgodnie z przedstawionym tutaj protokołem. Zilustrowano reprezentatywne wyniki zarówno dla powszechnej, jak i specyficznej dla typu komórek ekspresji transgenu.
Konstytutywna ekspresja transgenów
Promotory powszechne są podstawowymi narzędziami badawczymi służącymi do trwałej i wydajnej ekspresji transgenów. Promoto...

Tutaj prezentujemy protokół promujący integrację transgenów i produkcję założycielskich myszy transgenicznych z wysoką skutecznością poprzez proste wstrzyknięcie wektora lentiwirusowego w przestrzeń okołobrewą zapłodnionego oocytu.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

For almost 40 years, pronuclear DNA injection represents the standard method to generate transgenic mice with random integration of transgenes. Such a ...

Metoda ta umożliwia szybkie badania przesiewowe in vivo u myszy pod kątem wpływu transgenu i jest specjalnie przystosowana do przeprowadzania badań nad zyskiem lub utratą funkcji, a także nad odpowiedzią i mapowaniem motywów DNA. Główną zaletą tej techniki jest to, że predykcja wykorzystania zwierząt transgenicznych wynosi ponad 70% noworodków i może być zastosowana do dowolnych szczepów myszy, w tym zwierząt transgenicznych. Po eutanazji myszy zbierz jajowody.Aby rozpocząć operację, za pomocą nożyczek należy wykonać duże poziome nacięcie w jamie brzusznej. Następnie zlokalizuj jajowód między macicą a jajnikiem. Następnie użyj zakrzywionych kleszczy, aby usunąć mezometrium i błonę z wystającymi naczyniami krwionośnymi.Następnie oddziel jajowód od jajnika i wypreparuj jajowód z jajnika. Następnie pociągnij za jajowód i odetnij od macicy. Przenieś wszystkie zebrane jajowody na podłoże M2 w temperaturze pokojowej.Podczas obchodzenia się z jajowodami należy uważać, aby nie dotykać spuchniętej bańki wypełnionej zapłodnionymi jajami. Następnie dodaj 100 mikrolitrową kroplę roztworu roboczego hialuronidazy do 10-centymetrowego naczynia. Następnie przenieś do niego dwa jajowody, aby usunąć komórki wzgórka z jaj.Pod mikroskopem stereoskopowym użyj pary strzykawek insulinowych, aby zabezpieczyć jajowód, jednocześnie rozrywając bańkę i rozpraszając zapłodnione jaja. Następnie użyj przygotowanej szklanej pipety z rurką i ustnikiem, aby zassać wszystkie jaja. Za pomocą tego narzędzia przenieś je między sześć kropli pożywki M2, aby zmyć otaczające komórki wzgórka.Następnie przenieś umyte jajka do 10-milimetrowej studzienki, na czterodołkowej płytce, wypełnionej podgrzanym M16. Następnie przenieś naczynie do nawilżonego inkubatora o temperaturze 37 stopni Celsjusza. W trakcie przygotowań odwirować przygotowaną zawiesinę wektora lentiwirusowego o masie 160 g przez dwie minuty, aby osadzać resztki często obecne w bulionie lentiwirusowym.W komorze bezpieczeństwa klasy drugiej przenieść supernatanty do nowej probówki o pojemności 0,5 mililitra. Następnie załadować jeden mikrolitr supernatantu do pipety iniekcyjnej. Następnie przymocuj pipetę iniekcyjną do mikromanipulatora po prawej stronie.I przymocuj pipetę przytrzymującą do mikromanipulatora po lewej stronie. Teraz dozuj osiem mikrolitrów pożywki M2 na środku szkiełka depresyjnego. I przykryj lekkim olejem parafinowym, aby uniknąć parowania.Następnie umieść 20 jaj w płytkich miejscach w kropli, nie tworząc bąbelków. Następnie upewnij się, że końcówka pipety iniekcyjnej jest otwarta. Jeśli nie, postukaj pipetą iniekcyjną pipetą przytrzymującą, aby ją otworzyć.Następnie należy ustawić mikrowtryskiwacz na 20-sekundowe wstrzyknięcia. Teraz za pomocą pipety podtrzymującej i ręcznego nacisku odessaj zapłodnioną komórkę jajową, która zawiera dwa przedjądrza i dwa ciała polarne. Następnie, za pomocą pipety iniekcyjnej, wstrzyknąć przestrzeń okołojajową komórki jajowej.Nie dotykaj błony plazmatycznej. Dostosuj ciśnienie tak, aby przestrzeń okołowitelinowa była wypełniona roztworem. Ciśnienie nie powinno przekraczać 600 hektopaskalów.Natychmiast po wstrzyknięciu 20 jaj przenieść partię do kąpieli z podgrzanym podłożem M16. I wysiaduj je przez co najmniej 30 minut przed wszczepieniem. 16 godzin po kryciu normalnych samic z samcami z wazektomią sprawdź, czy nie ma zatyczek kopulacyjnych.Użyj tych samic do implantacji. Następnie należy wykonać pipety implantacyjne o średnicy wewnętrznej około 150 mikronów. I z polerowanymi płomieniowo końcówkami o długości około czterech do pięciu milimetrów.Załaduj pipetę z badanym zarodkiem, lekkim olejem parafinowym tuż nad punktem ramienia. Następnie odessać mały pęcherzyk powietrza i dalej załadować pipetę medium M2. Następnie odessaj drugi pęcherzyk powietrza.Teraz wciągnij zarodki do pipety jeden po drugim, minimalizując objętość pożywki między zarodkami. Zakończ, odsysając bardzo małą kroplę olejku parafinowego o szerokości zaledwie jednego zarodka. Przygotowanie pipety do implantacji jest kluczowe i wymaga dużo praktyki.Jaja w pipecie muszą być wyrównane praktycznie bez pożywki między nimi. Następnie, po znieczuleniu myszy i potwierdzeniu znieczulenia szczyptą palca u nogi, zgolić dwa, dwa centymetrowe paski włosów wzdłuż rdzenia kręgowego na poziomie ostatniego żebra. Teraz umieść mysz na poduszce grzewczej na sterylnym polu i ułóż ją, pozostawiając okno na odsłoniętą skórę.Następnie zdezynfekuj odsłoniętą skórę naprzemiennie peelingami z jodoprowidonu i 70 procent etanolu. W celu implantacji należy najpierw wykonać jednocentymetrowe nacięcie poprzeczne, a następnie przesunąć skórę na boki, aż pomarańczowy jajnik będzie widoczny przez ścianę ciała. Następnie wykonaj pięciomilimetrowe nacięcie cienkimi nożyczkami i podnieś poduszeczkę tłuszczową za pomocą atraumatycznego zacisku buldoga.Po uchwyceniu podkładki wyciągnij jajnik, jajowód i górną część macicy. Następnie zlokalizuj bańkę i wykonaj hemisekcję nożyczkami vannas na segmencie jajowodu, który łączy jajnik z bańką. Następnie należy wprowadzić pipetę do transferu zarodków i wysunąć komórki jajowe.Zatrzymanie się na pierwszym pęcherzyku powietrza po uwolnieniu jaj. Przygotuj wymagane materiały, aby powtórzyć procedurę na drugim jajowodzie. A po zakończeniu zamknij skórę klipsami do ran.Natychmiast po zamknięciu skóry dootrzewnowo wstrzyknąć środek przeciwbólowy i umieścić zwierzę w komorze rekonwalescencji z elementem grzejnym o temperaturze 39 stopni Celsjusza. Monitoruj, aż zostanie w pełni obudzony. Zwierzęta transgeniczne zostały wygenerowane przy użyciu prezentowanej metody.Wektory lentiwirusowe o wysokim mianie wyprodukowano przy użyciu 2,3-kilogramowego wzmacniacza zasady dla Neurogeniny-3 do napędzania eGFP. Lub jako kontrola, fragment chromosomu szóstego do napędzania eGFP. Integracja z embrionami przebiegła dość pomyślnie.Z zarodków pączek trzustki został wycięty i wybarwiony immunologicznie w celu znalezienia zlokalizowanej ekspresji eGFP. Ponad 90 procent wektorów, ze wzmacniaczem Neurogenin-3, wyrażało eGFP w komórkach eksprymujących Neurog3. Jednak żaden ze zintegrowanych wektorów kontrolnych nie wykazywał ekspresji eGFP w pączku trzustkowym.Miejsca integracji transgenu oceniano za pomocą ilościowej reakcji PCR, wykorzystując gen CDX2 jako kontrolę. Średnia liczba miejsc integracji wynosiła około 20 przy użyciu konstruktu Neurogenina-3 lub 10 przy użyciu konstruktu kontrolnego. Co ciekawe, miano transdukcji wirusa użyte dla konstruktu Neurogeniny-3 było około dwukrotnie większe niż wektor kontrolny.Sugerowanie związku między mianem transdukcji a liczbą integracji. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak generować dużą liczbę założycielskich zarodków transgenicznych za pomocą iniekcji wektorów lentiwirusowych z dużą skutecznością periviteliny. Po opanowaniu tej techniki można wyprodukować do 50 zwierząt założycielskich w ciągu jednego dnia od mikroiniekcji, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak wstrzyknięcie miana projądrkowego DNA, w celu ustalenia transgenicznych linii myszy. Nie zapominaj, że praca z wektorami lentiwirusowymi podlega autoryzacji lokalnego komitetu GMO. Wektory te mogą być bardzo niebezpieczne i zawsze należy zachować środki ostrożności podczas wykonywania tej procedury.

lentiviral-mediated-production-transgenic-mice-simple-highly

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Generowanie linii indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych (iPSC) prowadzi do powstania linii o różnym potencjale rozwojowym, nawet jeśli przechodzą one standardowe testy na pluripotencję. W niniejszym materiale opisujemy protokół otrzymywania myszy pochodzących w całości z iPSC, co definiuje linie iPSC jako posiadające pełną pluripotencję1.

Generowanie myszy pochodzących z indukowanych pluripotentnych komórek macierzystych

Ten film opisuje wstrzyknięcie projądrkowe wektorów lentiwirusowych do przestrzeni okołokomórkowej zapłodnionego zarodka myszy. Lentiwirus zawiera transgen, który jest włączany do genomu zapłodnionego zarodka, ostatecznie dając początek transgenicznym myszom.

Wstrzyknięcie periviteliny opartej na wektorze lentiwirusowym: metoda transdukcji interesującego genu do zapłodnionych jednokomórkowych oocytów myszy

Ten film demonstruje znakowanie wirusowe i przeszczepianie komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju (MGE) do badań in vivo. Przedstawiono w nim etapy związane z transdukcją komórek MGE za pomocą reportera wirusa, przeszczepianiem tych transdukowanych komórek do kory młodego myszy i umożliwianiem ekspresji reporterowej w określonych podtypach interneuronów.

Znakowanie wirusowe i przeszczepianie komórek wyniosłości przyśrodkowej zwoju przyśrodkowego do badań in vivo

MikroRNA odgrywają znaczącą rolę w strukturze i funkcjonowaniu mózgu. Tutaj opisujemy metodę wymuszania nadmiernej ekspresji miRNA w hipokampie za pomocą stereotaktycznego wstrzykiwania zmodyfikowanego lentiwirusa wykazującego ekspresję miRNA. Podejście to może służyć jako stosunkowo szybki sposób oceny skutków in vivo nadmiernej ekspresji miRNA w określonych regionach mózgu.

Stereotaktyczne wstrzyknięcie lentiwirusów eksprymujących mikroRNA do regionu CA1 hipokampa myszy i ocena wyniku behawioralnego

Tutaj opisujemy procedurę opartą na wykorzystaniu cząsteczek lentiwirusowych do długoterminowej modyfikacji genetycznej nerwowych komórek macierzystych i/lub ich sąsiadujących komórek wyściółkowych w dorosłej komorowo-podkomorowej niszy neurogennej, która pozwala na oddzielną analizę autonomicznych i nieautonomicznych, zależnych od niszy efektów na neuronalne komórki macierzyste.

Stabilna i wydajna modyfikacja genetyczna komórek dorosłej myszy V-SVZ do analizy autonomicznych i nieautonomicznych efektów neuronalnych komórek macierzystych

Mikroiniekcja mysich oocytów jest powszechnie stosowana zarówno do klasycznej transgenezy (tj. losowej integracji transgenów), jak i do celowania genów za pośrednictwem CRISPR. W protokole tym dokonano przeglądu najnowszych osiągnięć w dziedzinie mikroiniekcji, ze szczególnym naciskiem na kontrolę jakości i strategie genotypowania.

Generowanie genetycznie zmodyfikowanych myszy poprzez mikroiniekcję oocytów

Jaja zapłodnione myszami i zarodki we wczesnym stadium są chronione przez osłonkę przejrzystą, matrycę glikoproteinową, która tworzy barierę przed dostarczaniem genów. W artykule opisano protokół perforacji zony za pomocą lasera w celu transdukcji komórek embrionalnych za pomocą wektorów lentiwirusowych i stworzenia myszy transgenicznych.

Wspomagane laserowo dostarczanie genów lentiwirusowych do zapłodnionych jaj myszy

Ten protokół przedstawia kroki potrzebne do wygenerowania modelowego systemu, w którym transkrypcja interesującego nas endogennego genu może być warunkowo kontrolowana u żywych zwierząt lub komórek za pomocą ulepszonych systemów represora lac i/lub aktywatora tet.

Zastosowanie in vivo systemu REMOTE-control do manipulacji endogenną ekspresją genów

Opisane są protokoły wysoce efektywnej edycji genomu mysich hematopoetycznych komórek macierzystych i progenitorowych (HSPC) przez system CRISPR/Cas9 w celu szybkiego rozwoju mysich systemów modelowych z modyfikacjami genów specyficznymi dla układu krwiotwórczego.

Edycja genomu za pośrednictwem lentiwirusowego CRISPR/Cas9 w celu badania komórek krwiotwórczych w modelach chorobowych

Ten artykuł ma na celu przedstawienie metodologii transgenezy lentiwirusowej w zarodkach szczurów przy użyciu wielokrotnych wstrzyknięć zawiesiny wirusa do przestrzeni zygoty periviteliny. Samice szczurów, które są kojarzone płodnym szczepem samców o innym dominującym kolorze futra, są wykorzystywane do generowania pseudociężarnych matek zastępczych.

Wytwarzanie transgenicznych szczurów przy użyciu podejścia wektora lentiwirusowego

Tutaj prezentowany jest protokół produkcji zawiesiny HEK293 oparty na komórkach AAV, co skutkuje zmniejszeniem czasu i pracy potrzebnej do produkcji wektorów przy użyciu komponentów, które są dostępne do celów badawczych od komercyjnych dostawców.

Produkcja wysokowydajnych partii wektorów związanych z adeno przy użyciu komórek zawiesinowych HEK293

Poznaj metodę produkcji transgenicznych myszy za pomocą wektorów lentiwirusowych poprzez wstrzyknięcie do przestrzeni perywiteliny. Technika ta umożliwia szybkie badania in vivo z ponad 70% skutecznością integracji transgenu u noworodków.

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli (Wideo) | JoVE Journal

Produkcja transgenicznych myszy za pośrednictwem lentiwirusa: prosta i wysoce skuteczna metoda bezpośredniego badania założycieli

Przeglądaj więcej filmów