Name: Wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Odkryj metodę wzbogacania bakterii oddychających anodą bez zasilania zewnętrznego. Technika ta umożliwia izolację trudnych do hodowli szczepów mikrobiologicznych z ekstremalnych środowisk.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Rogerowi Raiche i Davidowi McCrory'emu za umożliwienie nam dostępu do Cedrów i konsultacje w sprawie lokalizacji do długoterminowej inkubacji. Dziękujemy również ekipie terenowej Cedars w sezonie 2013-2014: Shino Suzuki, Shunichi Ishii, Greg Wanger, Grayson Chadwick, Bonita Lam i Matthew Schechter. Dodatkowe podziękowania dla Shino Suzuki i Gijsa Kuenena za wnikliwe badania i wsparcie w hodowli. Praca ta została sfinansowana w ramach grantu dla młodych naukowców A i B przyznanego przez Japońskie Towarzystwo Promocji Nauki (JSPS) KAKENHI o numerze grantu odpowiednio 17H04969 i 26810085 oraz Japońskiej Agencji Badań i Rozwoju Medycznego (17gm6010002h0002). Amerykańskie fundusze zapewnione przez Biuro Globalnych Badań Marynarki Wojennej USA (N62909-17-1-2038) oraz Center for Dark Energy Biosphere Investigations (C-DEBI) (OCE0939564) i NASA Astrobiology Institute - Life Underground (NAI-LU) (NNA13AA92A). Część tych prac została przeprowadzona w ramach Japońskiego Towarzystwa Promocji Nauk: krótkoterminowe stypendium podoktorskie dla Annette Rowe (PE15019) na Uniwersytecie Tokijskim w laboratorium Kazuhito Hashimoto.

1. Budowa dwuelektrodowego systemu do inkubacji środowiskowej
<ol>
	<li>Przygotowanie materiału anody i obróbka elektrody z filcu węglowego (<klasa silna = "xfig">Rysunek 2).
	<ol>
		<li>Przytnij filc węglowy do równych wymiarów w zależności od pożądanego wzbogacenia biomasy. Namocz każdą elektrodę w 90% etanolu przez 30 minut, a następnie spłucz co najmniej 8 razy wodą dejonizowaną, sonikując przez 1 minutę po każdym płukaniu.</li>
		<li>Przemyć elektrody dwukrotnie w 1 M HCl, mieszając przez co najmniej 12 godzin przy każdym płukaniu.</li>
		<li>Suszyć elektrody w ciepłym (37 °C) piekarniku przez 6–12 godzin lub do momentu, gdy nie będzie płynu.</li>
		<li>Przymocuj elektrody do drutu tytanowego za pomocą grafitowej żywicy epoksydowej zgodnie z protokołem producenta na płycie z politetrafluoroetylenu (powierzchnia nieprzywierająca). 
		UWAGA: Użyliśmy drutu tytanowego ze względu na jego wysoką tolerancję na korozję tlenową.</li>
		<li>Piecz elektrodę w temperaturze 120 °C przez 6 godzin.</li>
		<li>Sprawdź rezystancję między drutem tytanowym a filcem węglowym za pomocą omomierza i potwierdź, że rezystancja między drutem a elektrodami filcowymi jest mniejsza niż 5 omów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektrografia platyny na elektrodzie filcowej węglowej w celu przygotowania materiału katodowego
	<ol>
		<li>Zanurz elektrody z filcu węglowego, przygotowane w kroku 1.1, w 2 M KOH na minimum 12 godzin w szklanym pojemniku.</li>
		<li>W celu czyszczenia elektrochemicznego należy umieścić elektrodę jako elektrodę roboczą (WE) w reaktorze trójelektrodowym, w którym znajduje się również elektroda referencyjna (RE) i przeciwelektroda (CE). Podłącz WE, RE i CE do potencjostatu za pomocą zacisków krokodylkowych. Potwierdź wszystkie połączenia omomierzem. 
		UWAGA: Użyliśmy elektrody Ag/AgCl (nasyconej KCl) i drutu platynowego odpowiednio jako RE i CE.</li>
		<li>Ustaw elektrodę na 1,0 V vs. Ag/AgCl przez 600 s w roztworze elektrolitu zawierającym 2 M KOH (używając wystarczającej ilości do zanurzenia całej elektrody). Wyjmij elektrodę z reaktora elektrochemicznego (który jest wykonany ze szkła). Przepłucz elektrodę w wodzie dejonizowanej co najmniej 8 razy, sonikując przez 1 minutę po każdym płukaniu. Suszyć elektrody w temperaturze 100 °C przez co najmniej 12 godzin.</li>
		<li>Aby przygotować roztwór do powlekania, dodać 100 g kwasu cytrynowego, 5 g siarczanu sodu i 2 g sześciowodnego heksachloroplatynianu diwodoru (IV) do 1 l 2 M kwasu siarkowego.</li>
		<li>Zważyć oczyszczone i wysuszone elektrody zgodnie z przygotowaniem w krokach 1.2.1–1.2.2, a następnie przykryć elektrodę roztworem galwanicznym, jak przygotowano w kroku 1.2.3. Sonikować elektrodę w roztworze galwanicznym trzy razy przez 30 s każda.</li>
		<li>Galwanizować elektrody, ustawiając potencjał elektrody na poziomie -0,2 V w stosunku do Ag/AgCl przez 460 s w roztworze galwanicznym. Przepłucz elektrody dwukrotnie w wodzie dejonizowanej i wyrzuć odpady platyny.</li>
		<li>Opłucz elektrody w wodzie dejonizowanej co najmniej 3 razy, sonikując przez 20 s po każdym płukaniu. Spłucz bez sonikacji jeszcze co najmniej trzy razy.</li>
		<li>Suszyć elektrody w temperaturze 100 °C przez co najmniej 12 godzin. Zważyć elektrodę w celu ilościowego określenia galwanicznej platyny na elektrodzie z filcu węglowego.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Budowa i instalacja systemu dwuelektrodowego
<ol>
	<li>Badanie miejsca instalacji dla każdej elektrody w środowisku naturalnym.
	<ol>
		<li>Określ stężenie tlenu za pomocą sondy tlenu rozpuszczonego (DO).</li>
		<li>Sprawdź profil głębokości DO w site. 
		UWAGA: Pożądane warunki środowiskowe dla anody to stałe nawodnienie i anoksja. W razie potrzeby usuń wpływ fotosyntezy tlenowej, osłaniając anodę przed światłem. Idealne warunki do umieszczenia katody to stałe uwodnienie, a wody w pobliżu powierzchni są tlenkowe. W razie potrzeby przymocuj pływaki, aby utrzymać kontakt powierzchniowy z katodą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa systemu inkubacji 2-elektrodowego typu ogniwa paliwowego
	<ol>
		<li>Połącz izolowany drut o żądanej długości i przewód z drutu tytanowego z elektrod (jedna anoda i jedna katoda pokryta platyną), skręcając dwie linie. Przykryj połączenia wodoodpornym woskiem i dodatkowo zabezpiecz za pomocą rurek termokurczliwych klasy morskiej.</li>
		<li>Połącz dwa przewody z katodą i anodą za pomocą rezystora o znanej rezystancji. 
		UWAGA: W przypadku systemów biologicznych niższe rezystory (od 10 do 1 000 Ω) skutkują bardziej spójną aktywnością biologiczną. W razie potrzeby rezystor o wysokiej rezystancji zapobiegnie aktywności biologicznej jako kontrola negatywna. Aby zapobiec korozji jakichkolwiek połączeń między rezystorem a wyprowadzeniami, zabezpieczyliśmy je rurkami termokurczliwymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Pomiar do rejestracji napięcia i temperatury w czasie.
	<ol>
		<li>Sprawdź napięcie między końcami rezystora, aby oszacować wytwarzanie prądu w wyniku reakcji ogniwa paliwowego.</li>
		<li>Zmierzyć różnicę napięcia w czasie za pomocą woltomierza rejestrującego dane z odpowiednimi połączeniami prowadzącymi do anody i katody (patrz protokół producenta). 
		UWAGA: Jednoczesne rejestrowanie danych o temperaturze jest opcjonalne, ale te informacje mogą pomóc powiązać zmiany prądu z fluktuacjami biotycznymi, a nie biologicznymi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ochrona rejestratora danych i połączeń elektrycznych
	<ol>
		<li>Użyj stacjonarnej i/lub plastikowej torby, aby chronić rejestrator i wszystkie połączenia elektryczne przed deszczem.</li>
		<li>Mocno przymocuj plastikową torbę i, aby chronić przed silnym wiatrem. Przykład jest pokazany w Rysunek 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pobieranie próbki elektrody ze środowiska naturalnego
<ol>
	<li>Aby zapobiec uszkodzeniu jakości próbki anody z powodu zanieczyszczenia tlenem, należy pobrać elektrodę w warunkach beztlenowych.</li>
	<li>Co najmniej 30 minut przed pobraniem próbki elektrody umieść probówkę w miejscu beztlenowym. Na przykład umieść probówkę i pokrywkę osobno na dnie stawu, aby butelka była w środku beztlenowa.</li>
	<li>Odetnij tytanowy ołów od elektrody za pomocą przecinaka do drutu, delikatnie zbierz próbkę elektrody do probówki i zamknij ją w strefie wody beztlenowej. Aby zachować świeżość próbki, należy ją przechowywać w temperaturze 4 °C natychmiast po pobraniu próbki. 
	UWAGA: Alternatywnie elektrody można przenieść bezpośrednio do medium beztlenowego (oczyszczonego N2). Użyliśmy podłoża Cedrs (opisanego przez Suzuki i wsp.11), który został zaprojektowany na podstawie geochemii wodnej zmierzonej na miejscu i zmodyfikowanej w celu zapewnienia wystarczającej ilości składników odżywczych do rozwoju mikroorganizmów. Pożywka ta została zmodyfikowana do różnych eksperymentów laboratoryjnych.</li>
</ol>
4. Potwierdzenie laboratoryjne dla bieżącej produkcji i analizy DNA
<ol>
	<li>Elektrochemiczne potwierdzenie aktualnej zdolności produkcyjnej konsorcjów mikrobiologicznych przyczepionych do elektrody.
	<ol>
		<li>Zbuduj reaktor elektrochemiczny14,15 z próbkowaną elektrodą, drutem platynowym i elektrodą Ag/AgCl (nasyconą KCl) odpowiednio WE, CE i RE w komorze beztlenowej. Napełnij reaktor elektrochemiczny pożywką cedrową zawierającą rozpuszczalne donory elektronów węglowodanów.</li>
		<li>Ustaw potencjał elektrody na poziomie +0,2 V w stosunku do Ag/AgCl i zmierz produkcję prądu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja DNA z próbki elektrody za pomocą zestawu mikrobiologicznego DNA (patrz tabela materiałów).
	<ol>
		<li>Wyczyść wnętrze beztlenowego schowka rękawicowego 70% etanolem i umieść wysterylizowane naczynie na folii aluminiowej. 
		UWAGA: Komora beztlenowa utrzymuje stężenie tlenu poniżej 1 ppm, utrzymując atmosferę wodoru na poziomie około ~2-3% w celu wychwytywania tlenu w obecności katalizatora palladowego.</li>
		<li>Otwórz reaktor elektrochemiczny w schowku rękawicowym, umieść elektrodę próbki na naczyniu i przyciąć do rozmiaru pasującego do rurki używanej w zestawie DNA. Postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nealson, K. H., Saffarini, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+and+manganese+in+anaerobic+respiration%3A+environmental+significance%2C+physiology%2C+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Iron and manganese in anaerobic respiration: environmental significance, physiology, and regulation.</a> Annual Reviews of Microbiology. 48, 311-343 (1994).</li>
<li>Lovley, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bug+juice%3A+harvesting+electricity+with+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Bug juice: harvesting electricity with microorganisms.</a> Nature Reviews Microbiology. 4 (7), 497-508 (2006).</li>
<li>Rabaey, K., Rozendal, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+electrosynthesis+-+revisiting+the+electrical+route+for+microbial+production%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Microbial electrosynthesis - revisiting the electrical route for microbial production.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (10), 706-716 (2010).</li>
<li>Lovley, D. R., Coates, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioremediation+of+metal+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Bioremediation of metal contamination.</a> Current Opinion in Biotechnology. 8 (3), 285-289 (1997).</li>
<li>Dinh, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+corrosion+by+novel+anaerobic+microorganisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms.</a> Nature. 427 (6977), 829-832 (2004).</li>
<li>Myers, C. R., Nealson, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+manganese+reduction+and+growth+with+manganese+oxide+as+the+sole+electron+acceptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial manganese reduction and growth with manganese oxide as the sole electron acceptor.</a> Science. 240 (4857), 1319-1321 (1988).</li>
<li>Lovley, D. R., Phillips, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+mode+of+microbial+energy+metabolism%3A+organic+carbon+oxidation+coupled+to+dissimilatory+reduction+of+iron+or+manganese%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Novel mode of microbial energy metabolism: organic carbon oxidation coupled to dissimilatory reduction of iron or manganese.</a> Applied and Environmental Microbiology. 54 (6), 1472-1480 (1988).</li>
<li>Arnold, R. G., DiChristina, T. J., Hoffmann, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+dissolution+of+Fe%28III%29+oxides+by+Pseudomonas+sp+200%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Reductive dissolution of Fe(III) oxides by Pseudomonas sp 200.</a> Biotechnology and Bioengineering. 32 (9), 1081-1096 (1988).</li>
<li>Rowe, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+electrochemical+enrichment+and+isolation+of+a+magnetite-reducing+bacterium+from+a+high+pH+serpentinizing+spring%5BTitle%5D)+AND+%22Environmentakl+Microbiology%22%5BJournal%5D)">In situ electrochemical enrichment and isolation of a magnetite-reducing bacterium from a high pH serpentinizing spring.</a> Environmentakl Microbiology. 19 (6), 2272-2285 (2017).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+diversity+in+The+Cedars%2C+an+ultrabasic%2C+ultrareducing%2C+and+low+salinity+serpentinizing+ecosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Microbial diversity in The Cedars, an ultrabasic, ultrareducing, and low salinity serpentinizing ecosystem.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 110 (38), 15336-15341 (2013).</li>
<li>Suzuki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+genomic+features+of+highly+alkaliphilic+hydrogen-utilizing+Betaproteobacteria+from+a+continental+serpentinizing+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Physiological and genomic features of highly alkaliphilic hydrogen-utilizing Betaproteobacteria from a continental serpentinizing site.</a> Nature Communications. 5, 3900(2014).</li>
<li>McCollom, T. M., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703716300941">Temperature trends for reaction rates, hydrogen generation, and partitioning of iron during experimental serpentinization of olivine.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 181, 175-200 (2016).</li>
<li>Morrill, P. L., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0016703713000768">Geochemistry and geobiology of a present-day serpentinization site in California: The Cedars.</a> Geochimica et Cosmochimica Acta. 109, 222-240 (2013).</li>
<li>Okamoto, A., Nakamura, R., Hashimoto, K. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0013468611004543">In-vivo identification of direct electron transfer from Shewanella oneidensis MR-1 to electrodes via outer-membrane OmcA-MtrCAB protein complexes.</a> Electrochimica Acta. 56 (16), 5526-5531 (2011).</li>
<li>Okamoto, A., Hashimoto, K., Nakamura, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOkamoto%2C+A+%22Spectroelectrochemical+Investigation+on+Biological+Electron+Transfer+Associated+with+Anode+Performance+in+Microbial+Fuel+Cells%22">Spectroelectrochemical Investigation on Biological Electron Transfer Associated with Anode Performance in Microbial Fuel Cells</a>. , InTech. 207-222 (2012).</li>
<li>Deng, X., Nakamura, R., Hashimoto, K., Okamoto, A. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/electrochemistry/83/7/83_15-E00044/_article">Electron from an Extracellular Electrode by Desulfovibrio ferrophilus Strain IS5 Without Using Hydrogen as an Electron Carrier.</a> Electrochemistry. 83 (7), 529-531 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W opisywanym badaniu pokazano wzbogacenie konsorcjum mikrobiologicznego, związane z produkcją prądu in situ . Obserwowane wzorce prądu potwierdzają aktywność mikrobiologiczną w tym systemie w krótkich i długich skalach czasowych. Kluczowym krokiem w budowie funkcjonalnego systemu dwuelektrodowego (typu ogniwa paliwowego) jest zidentyfikowanie i wykorzystanie miejsca o stabilnym poziomie wody i stężeniu tlenu w środowisku. Katoda jest wystawiona na działanie tlenu na granicy faz powietrze-woda, podczas gdy anoda ...

Wykazano, że kilka mikrobów redukujących minerały wykorzystuje minerały fazy stałej jako końcowe akceptory elektronów, poprzez procesy zewnątrzkomórkowego transportu elektronów (EET), które przewodzą elektrony na zewnątrz komórki za pośrednictwem enzymów redoks1. EET ma kluczowe znaczenie nie tylko dla procesów mikroorganizmowo-mineralnych, ale także dla stosowanych technologii energetycznych i środowiskowych, takich jak mikrobiologiczne ogniwa paliwowe2, electrode synthesis3 i bioremediation4. Nowe bakterie zdolne do EET są bardzo poszukiwane i zostały szeroko przebadane z perspektywy podstawowej lub stosowanej5. Mamy jednak ograniczony wgląd w ekologiczne lub biogeochemiczne znaczenie tych bakterii. Większość drobnoustrojów zdolnych do EET została wyizolowana po wzbogaceniu z fermentacji wodnej, osadowej lub beztlenowej przy użyciu stałych akceptorów elektronów, takich jak MnO2, Fe2O3 lub elektrod w laboratorium6,7,8. Jednak metody te często prowadzą do powstania podobnych konsorcjów i potencjalnie pomijają bardziej wrażliwe taksony, które mogą dominować w systemach o niskiej energii lub niskiej biomasie, co wpływa na zdolność tych drobnoustrojów do przystosowania się do środowiska laboratoryjnego lub hodowli aksenicznej9. Zwykle w środowiskach o niskiej biomasie duże ilości wody z danego miejsca są filtrowane w celu skoncentrowania komórek bakteryjnych. Jednak bakterie zdolne do EET często wykazują metabolizm beztlenowy, a zatem narażenie na tlen może dodatkowo hamować lub uniemożliwiać ich rozmnażanie. Alternatywne metody koncentracji komórek na miejscu bez wystawiania ich na działanie tlenu mogą ułatwić izolację bakterii zdolnych do EET. W tym miejscu przedstawiamy szczegóły konfiguracji techniki elektrochemicznej na miejscu w celu wzbogacania mikroorganizmów zdolnych do EET przez długi czas bez konieczności korzystania z zewnętrznego źródła zasilania.
Korzystając z naszych eksperymentów z elektrokultywacją z wysoce alkalicznego źródła w Północnej Kalifornii, Cedars10, opisujemy tę technikę elektrochemiczną na miejscu. Na geochemię źródeł w The Cedars wpływa serpentynizacja pod powierzchnią. Źródła są wysoce redukcyjne, a stężenia tlenu poniżej granicy wykrywalności pod interfejsem powietrze-woda podkreślają potencjał produkcji energii mikrobiologicznej za pośrednictwem EET w tym funkcjonalnie beztlenowym środowisku11. Nie ma jednak dowodów na poparcie zdolności do EET mikrobów z cedrów (ani w 16S rRNA, ani w analizie metagenomicznej). Mimo że środowisko to zostało scharakteryzowane jako ograniczone akceptory elektronów, potencjał wykorzystania nierozpuszczalnych minerałów jako końcowych akceptorów elektronów, w tym minerałów takich jak minerały obnażające żelazo, które powstają w wyniku serpentynizacji (tj. magnetyt), nie został dokładnie zbadany12. W związku z tym rozmieściliśmy nasz system elektrochemiczny w Campsite Spring, źródle o wysokim pH w Cedars, aby wzbogacić mikroorganizmy zdolne do EET (Rysunek1)13.

<table><tbody><tr><td>Arkusz filcu węglowego</td><td>nie</td><td>dotyczy</td><td>dotyczy Używany do anody i katody</td></tr><tr><td>Drut tytanowy</td><td>Nilaco Cooporation</td><td>TI-451485</td><td>Używany do budowy systemu ogniw paliwowych</td></tr><tr><td>Grafitowa żywica epoksydowa</td><td>Electrolytica lnc.</td><td>nie dotyczy</td><td>Służy do podłączenia elektrod i drutu Ti</td></tr><tr><td>Suszarka</td><td>Yamato</td><td>DY300</td><td>upiecz elektrodę do zestalić przewodzący grafit epoksydowy</td></tr><tr><td>Cyfrowy multimetr</td><td>Fluke</td><td>616-1454</td><td>do sprawdzania wartości omowej rezystancji</td></tr><tr><td>Sonda tlenu rozpuszczonego</td><td>Sper Science</td><td>#&nbsp; 850045</td><td>do sprawdzenia stężenia tlenu w środowiska</td></tr><tr><td>Rezystor</td><td>Sodial</td><td></td><td>Służy do budowy systemu ogniw paliwowych </td></tr><tr><td>Przewód przewodzący</td><td>Pico</td><td>81141s</td><td>Służy do budowy ogniw paliwowych system</td></tr><tr><td>Woltomierz i rejestrator danych</td><td>T& D corporation</td><td>VR-71</td><td>Służy do rejestracji danych</td></tr><tr><td>Wodoru Heksachloroplatynian(IV) Heksahydrat</td><td>wako</td><td>18497-13-7</td><td>Używany do elektropolacji</td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy</td><td>Wako</td><td>038-06925</td><td>Używany do elektropolacji</td></tr><tr><td>Kwas siarkowy</td><td>Wako</td><td>192-04696</td><td>Używany do elektropolacji</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Wako</td><td>083-01095</td><td>Używany do mycia elektrod</td></tr><tr><td>Szklany cylinder</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Wykonany na zamówienie, używany jako reaktor elektrochemiczny</td></tr><tr><td>Pokrywa i podstawa z PTFE</td><td>N/A</td> N<td>/A</td><td>Wykonany na zamówienie, używany jako pokrywa i fundament reaktora elektrochemicznego</td></tr><tr><td>Kauczuk butylowy</td><td>NIE</td><td>DOTYCZY</td><td>Wykonany na zamówienie, wkładany między każdy element reaktora elektrochemicznego</td></tr><tr><td>Septa</td><td>GL Science</td><td>3007-16101</td><td>Używany jako port iniekcyjny reaktora elektrodowego</td></tr> z <tr><td>tlenku indu i cyny (ITO)</td><td>GEOMATEC</td><td>No.0001</td><td>Używany jako elektroda robocza, 5&Omega;/</td></tr><tr><td>sq Ag/AgCl KCl elektroda nasycona</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HX-R5</td><td>Używany jako elektroda odniesienia, &Phi; Drut platynowy 0,30 mm</td></tr><tr><td></td><td>Nilaco Cooporation</td><td>PT-351325</td><td>Używany jako przeciwelektroda</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Wako</td><td>191-01305</td><td>Używany do Cedrs Media (CMS)</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Wako</td><td>030-00385</td><td>Używany do CMS</td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Wako</td><td>011-03015</td><td>Używany do CMS</td></tr><tr><td>MgCl2&nbsp; i byka; 6H2O</td><td>Wako</td><td>135-00165</td><td>Używany do CMS</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Wako</td><td>198-13765</td><td>Używany do CMS</td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td>Wako</td><td>194-03355</td><td>Używany do CMS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Wako</td><td>164-04295</td><td>Używany do CMS</td></tr><tr><td>CABS</td><td>SANTA CRUZ</td><td>SC-285279</td><td>Używany do</td></tr><tr><td>inkubatora</td> CMS <td>TOKYO RIKAKIKAI CO. LTD.</td><td>LTI-601SD</td><td>Używany do autoklawu do uprawy wstępnej</td></tr><tr><td></td><td>TOMY SEIKO CO. LTD.</td><td>LSX-500</td><td>Służy do sterylizacji reaktora elektrochemicznego i pożywki</td></tr><tr><td>Czysta ławka</td><td>SANYO</td><td>MCV-91BNF</td><td>Służy do zapobiegania zanieczyszczeniu reaktora elektrochemicznego i pożywki innymi drobnoustrojami</td></tr><tr><td>Separator wirówkowy</td><td>Eppendorf</td><td>5430R</td><td>Prędkość obrotowa do 6000 i razy; g jest wymagane</td></tr><tr><td>: Generator azotu</td> gazowego, <td>Puequ CO., LTD.</td><td>PNTN-2</td><td>Butla z azotem może być również używana zamiast generatora gazu</td></tr><tr><td>Spektrometr UV-vis</td><td>SHIMADZU</td><td>UV-1800</td><td>Służy do optymalizacji gęstości komórek</td></tr><tr><td>Potencjostat</td><td>BioLogic</td><td>VMP3</td><td>Służy do tworzenia biofilmu i eksperymentów z kinetycznymi efektami izotopowymi</td></tr><tr><td>Cyrkulator wody termalnej</td><td>AS ONE</td><td>TR-1A</td><td>Służy do utrzymywania temperatury reaktora elektrochemicznego</td></tr><tr><td>Klatka Faradaya</td><td>HOKUTO DENKO</td><td>HS-201S</td><td>Służy do eksperymentów elektrochemicznych</td></tr><tr><td>Komora beztlenowa</td><td>COY</td><td>TypeB (Vinyl)</td> <td>DO przeprowadzania eksperymentów w warunkach beztlenowych</td></tr><tr><td>Ultraclean Zestaw do ekstrakcji DNA</td><td>MoBio</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu

Self-standing Electrochemical Set-up to Enrich Anode-respiring Bacteria On-site

Oddychanie beztlenowe połączone z transportem elektronów do nierozpuszczalnych minerałów (określane jako zewnątrzkomórkowy transport elektronów [EET]) jest uważane za kluczowe dla produkcji i trwałości energii mikrobiologicznej w wielu środowiskach podpowierzchniowych, zwłaszcza tych pozbawionych rozpuszczalnych końcowych akceptorów elektronów. Podczas gdy mikroorganizmy zdolne do EET zostały z powodzeniem wyizolowane z różnych środowisk, różnorodność bakterii zdolnych do EET jest nadal słabo poznana, zwłaszcza w trudnych do pobrania, niskoenergetycznych lub ekstremalnych środowiskach, takich jak wiele ekosystemów podpowierzchniowych. W tym miejscu opisujemy system elektrochemiczny do wzbogacania bakterii zdolnych do EET przy użyciu anody jako końcowego akceptora elektronów układu oddechowego. Anoda ta jest połączona z katodą zdolną do katalizowania abiotycznej redukcji tlenu. W porównaniu z metodami elektrokultywacji, które wykorzystują potencjostat do ustawiania potencjału elektrody, system dwuelektrodowy nie wymaga zewnętrznego źródła zasilania. Przedstawiamy przykład naszego wzbogacania na miejscu wykorzystywanego w alkalicznym stawie w Cedars, lądowym miejscu serpentynizacji w Północnej Kalifornii. Wcześniejsze próby hodowli bakterii redukujących minerały zakończyły się niepowodzeniem, co prawdopodobnie wynika z niskiego charakteru biomasy tego miejsca i/lub niskiej względnej obfitości mikroorganizmów redukujących metale. Przed wdrożeniem naszego wzbogacania dwuelektrodowego zmierzyliśmy pionowy profil stężenia tlenu rozpuszczonego. Pozwoliło nam to umieścić anodę z filcu węglowego i katodę z filcu węglowego pokrytą galwanizacją platynową na głębokościach, które wspierałyby odpowiednio procesy beztlenowe i tlenowe. Po inkubacji na miejscu dodatkowo wzbogaciliśmy elektrodę anodową w laboratorium i potwierdziliśmy odrębną społeczność mikrobiologiczną w porównaniu ze społecznościami przyczepionymi do powierzchni lub biofilmami, które zwykle obserwuje się w cedrach. To wzbogacenie doprowadziło następnie do wyizolowania pierwszego elektrogenicznego mikroba z cedrów. Ta metoda wzbogacania mikrobiologicznego na miejscu może znacznie poprawić izolację bakterii zdolnych do EET z siedlisk o niskiej biomasie lub trudnych do pobrania próbek.

Prąd został pomyślnie mierzony przez okres około 3 miesięcy przy użyciu rejestratora danych napięciowych, jak pokazano na Rysunku 3. Wybrano ten czas, ponieważ był to najdłuższy okres stabilnej inkubacji wiosennej, ze względu na intensywne deszcze jesiennych wpływające na wiosnę. Krótszy okres mógłby być wystarczający, choć dłuższy mógłby zapewnić silniejsze wzbogacenie biomasy. Po zakończeniu inkubacji elektrochemicznej potwierdzono połączenie układu dwuelek...

Techniki wzbogacania mikroorganizmów na miejscu lub hodowli in situ mogą ułatwić izolację trudnych do hodowli taksonów mikroorganizmów, zwłaszcza z ekstremalnych środowisk o niskiej biomasie lub geochemicznie. W tym miejscu opisujemy układ elektrochemiczny bez użycia zewnętrznego źródła zasilania w celu wzbogacenia szczepów drobnoustrojów, które są zdolne do zewnątrzkomórkowego transportu elektronów (EET).

Wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu

Anaerobic respiration coupled with electron transport to insoluble minerals (referred to as extracellular electron transport [EET]) is thought to be ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrobiologii środowiskowej dotyczące wszechobecności mikroorganizmów zdolnych do EET, zwłaszcza w warunkach o niskiej biomasie lub ekstremalnych warunkach geochemicznych. Główną zaletą naszego wzbogacania mikrobiologii na miejscu jest to, że nie wymaga ono źródła zasilania, co ułatwia wielomiesięczny okres izolacji w celu schwytania trudnych do hodowli taksonów. Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowicjuszami w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ wytwarzanie systemu elektrochemicznego składa się z wielu etapów, które wymagają precyzyjnego wdrożenia.Aby skonstruować system inkubacji elektrod typu II ogniwa paliwowego, należy skręcić izolowany drut o odpowiedniej długości eksperymentalnej wraz z ołowiem drutu tytanowego z elektrod i pokryć połączenia wodoodpornym woskiem. Następnie dodatkowo zabezpiecz rurkami termokurczliwymi klasy morskiej i połącz dwa przewody z katodą i anodą za pomocą rezystora o znanej rezystancji. Aby zmierzyć napięcie rejestrujące temperaturę w czasie, sprawdź napięcie między końcami rezystora, aby umożliwić oszacowanie produkcji prądu w wyniku reakcji ogniwa paliwowego.I użyj woltomierza rejestrującego dane z odpowiednim złączem prowadzącym do anody i katody, aby zmierzyć różnicę napięcia w czasie, zgodnie ze specyfikacjami producenta. Aby chronić rejestrator danych i połączenia elektryczne, umieść plastikową torbę wokół rejestratora i wszystkich połączeń elektrycznych oraz mocno zabezpiecz torbę i, aby chronić materiały przed silnym wiatrem. Aby pobrać próbkę elektrody ze środowiska naturalnego, co najmniej 30 minut przed pobraniem umieść niezakorkowaną szklaną probówkę i pokrywkę probówki w miejscu beztlenowym.Po umieszczeniu butelki w miejscu zbiórki upewnij się, że wszystkie pęcherzyki powietrza zostały usunięte z wnętrza butelki. Pod koniec okresu uprawy za pomocą przecinaka do drutu odciąć tytanowy ołów od elektrody. I delikatnie zbierz próbkę elektrody do probówki.Zakryj probówkę w strefie wody beztlenowej i natychmiast przechowuj próbkę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby potwierdzić aktualną produkcję, użyj pobranej elektrody, drutu platynowego i elektrody srebrno-chlorkowej do budowy reaktora elektrochemicznego w komorze beztlenowej. Wypełnij ogniwo elektrochemiczne pożywką cedrową uzupełnioną rozpuszczalnymi donorami elektronów węglowodanów.Ustaw potencjał elektrody na dodatnim 0,2 V w porównaniu z elektrodą referencyjną nasyconą srebrem/chlorkiem srebra, chlorkiem potasu. Następnie zmierz produkcję prądu i wyjmij elektrodę z ogniwa elektrody w celu analizy rybosomalnego RNA 16S. Podczas analizy bieżącej produkcji należy unikać zanieczyszczenia próbki bakteriami z laboratorium, zwłaszcza w komorze rękawic beztlenowych.Za pomocą rejestratora danych napięcia, jak pokazano, produkcja prądu była z powodzeniem mierzona przez około trzy miesiące. W tym systemie dwuelektrodowym zwykle obserwuje się wysoki prąd. Widoczna jest tutaj rezystancja 1,000 omów w porównaniu z rezystancją 100 kiloomów kontroli ujemnej.W tym reprezentatywnym eksperymencie zaobserwowano stopniowy wzrost produkcji prądu w pierwszym miesiącu w naszym zakładzie w Cedars, co sugeruje wzrost, akumulację lub akomodację drobnoustrojów na powierzchni elektrody, po czym nastąpiła stabilna produkcja prądu przez następne dwa miesiące. Co ciekawe, obecna produkcja zwykle oscyluje w cyklu około 24-godzinnym przez cały okres wzbogacania elektrochemicznego. W obrębie obserwowanych społeczności mikrobiologicznych można zaobserwować wyraźne różnice w nadrzędnej strukturze między typami elektrodowymi i niezwiązanymi z elektrodami.Na przykład w tym eksperymencie społeczność mikroorganizmów związanych z elektrodami została znacznie wzbogacona o bakterie z linii niehodowlanych, a także z linii Firmicute Bacillus. W tym badaniu zaobserwowano również zmianę składu proteobakterii, w którym beta proteobakterie dominowały zarówno w próbkach środowiskowych związanych z kalcytem, jak i planktonem, a z drugiej strony proteobakterie gamma dominowały w próbkach związanych z elektrodami. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że czynniki środowiskowe mogą mieć wpływ na bieżącą produkcję na miejscu.Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się mikrobiologią środowiskową do izolowania bakterii zdolnych do EET z różnych środowisk. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przeprowadzić wzbogacanie na miejscu bakterii zdolnych do EET bez potrzeby korzystania ze źródła zasilania.

self-standing-electrochemical-set-up-to-enrich-anode-respiring

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Zacznij od kultury wzbogacającej glebę pochodzącej z terenów podmokłych, zawierającej zbiorowiska bakterii.Kultura wykazuje aktywność Feammox, utlenianie amonu sprzężone z redukcją żelaza, co wskazuje na wzbogacenie bakterii zdolnej do tego procesu metabolicznego.Seryjnie rozcieńczyć kulturę za pomocą pożywki.Rozcieńczone próbki rozprowadzić na badanych płytkach agarowych uzupełnionych żelazem i amonem.Używaj płytek kontrolnych, które nie zawierają żelaza lub amonu lub zawierają żelazo z węglem...

Izolacja reduktorów żelaza utleniających amonu z kultury wzbogacania gleby pochodzącej z terenów podmokłych 

Źródło: Okamoto, A. i inni. Samostojąca elektrochemiczna konfiguracja wzbogacająca bakterie oddychające anodem na miejscu. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje zastosowanie elektrochemicznego systemu na miejscu do wzbogacania bakterii oddychających anodą (ARB) z naturalnych rezerwuarów. Gradient redoks ustanawia się, umieszczając anodę w głębokiej wodzie wolnej od tlenu, a katodę w bogatej w tlen wodzie powierzchniowej. ARB tworzą biofilmy i przekazują elektrony do anody, która płynie do...

Wzbogacenie bakterii oddychających anodami za pomocą systemu elektrochemicznego na miejscu

Źródło: Tokunou, Y . i in., Elektrochemiczne wykrywanie efektu izotopu kinetycznego deuteru na transport elektronów zewnątrzkomórkowych w Shewanella oneidensis MR-1. J. Vis. Exp. (2018)Ten film demonstruje montaż i działanie modelu reaktora elektrochemicznego zaprojektowanego do symulacji powstawania biofilmu na powierzchniach elektrod. Kontrolowana stymulacja elektrochemiczna sprzyja przyczepności mikroorganizmów, prowadząc do stopniowego powstawania bakteryjnego monowarstwowego biofilmu.

Opracowywanie bakteryjnego monowarstwowego biofilmu z użyciem reaktora elektrochemicznego

Pokazano chronoamperometryczny wzrost anodowych elektroaktywnych biofilmów mikrobiologicznych w reaktorze z zasilaniem przy użyciu układu trzech elektrod, kontrolowanego przez potencjostat. Zewnątrzkomórkowy transfer elektronów charakteryzuje się za pomocą woltamperometrii cyklicznej w obecności donora elektronów i pod nieobecność donora elektronów. Pokazano analizę danych fundamentalnych.

Elektroaktywne biofilmy mikrobiologiczne pochodzące ze ścieków: wzrost, utrzymanie i podstawowa charakterystyka

Pokazujemy ekstrakcję amoniaku ze strumienia bogatego w amoniak za pomocą systemu elektrochemicznego i bioelektrochemicznego. Omówiono konfigurację reaktora, jego działanie i analizę danych.

Elektrochemicznie i bioelektrochemicznie indukowany odzysk amonu

Przedstawiono protokół pomiaru przewodnictwa elektrycznego żywych biofilmów mikrobiologicznych w fizjologicznie istotnych warunkach.

Charakterystyka transportu elektronów przez żywe biofilmy

Tutaj prezentujemy protokół eksperymentów elektrochemicznych na całych komórkach, aby zbadać wpływ transportu protonów na szybkość pozakomórkowego transportu elektronów przez kompleks cytochromów błony zewnętrznej w Shewanella oneidensis MR-1.

Elektrochemiczne wykrywanie wpływu kinetycznego izotopu deuteru na zewnątrzkomórkowy transport elektronów w Shewanella oneidensis MR-1

Tutaj prezentujemy protokół charakteryzujący pozakomórkowy transfer elektronów za pośrednictwem (EET) u bakterii kwasu mlekowego za pomocą trzyelektrodowego, dwukomorowego systemu bioelektrochemicznego. Ilustrujemy tę metodę za pomocą Lactiplantibacillus plantarum i mediatora redoks kwasu 1,4-dihydroksy-2-naftoesowego i podajemy dokładny opis technik elektrochemicznych stosowanych do oceny EET, w którym pośredniczy.

Charakterystyka pośredniczonego zewnątrzkomórkowego transferu elektronów u bakterii kwasu mlekowego za pomocą trójelektrodowego, dwukomorowego układu bioelektrochemicznego

Ten protokół szczegółowo opisuje montaż układów mini-bioreaktorów, które mają być wykorzystane do hodowli złożonego przepływu złożonych zbiorowisk kałowych w warunkach beztlenowych. Omówiono również metody montażu, inokulacji i pobierania próbek z reaktorów do dalszej analizy.

Montaż bioreaktora do ciągłej hodowli złożonych zbiorowisk kałowych

Choroba kory buka jest inicjowana przez działania żywieniowe owadów łuskowych, które tworzą punkty wejścia grzyba w korze. Drzewa, które są odporne na owada łuskowego, są również odporne na choroby. Tutaj prezentujemy opracowany przez nas protokół do badania poszczególnych drzew bukowych pod kątem odporności na łuski.

Technika przesiewania buka amerykańskiego pod kątem odporności na owada łuskowatego (Cryptococcus fagisuga Lind.)

Odkryj metodę wzbogacania bakterii oddychających anodą bez zasilania zewnętrznego. Technika ta umożliwia izolację trudnych do hodowli szczepów mikrobiologicznych z ekstremalnych środowisk.

Wolnostojący zestaw elektrochemiczny do wzbogacania bakterii oddychających anodą na miejscu

Przeglądaj więcej filmów