Protokół pozyskiwania zwyrodnieniowego tenocytu od ludzi

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące biologii zwyrodnieniowych tenocytów u ludzi, ponieważ tylko kilka badań szczegółowo opisało izolację i hodowlę tenocytów zwyrodnieniowych u ludzi. Główną zaletą tej techniki jest to, że możemy uzyskać ludzki tenocyt zwyrodnieniowy bez dodatkowego urazu pacjenta, ponieważ tkanka zwyrodnieniowa jest pozyskiwana podczas standardowej operacji zapalenia nadkłykcia. Procedurę zademonstrują dr Soo-Hong Han, Minjung Baek i Hyung Kyung Kim z mojego poziomu trzeciego.

Aby uzyskać próbkę zwyrodnieniowej tkanki ścięgna, użyj skalpela chirurgicznego numer 15, aby wykonać od trzech do pięciu centymetrów nacięcia skóry tuż przed nadkłykciem bocznym i bliżej do poziomu stawu, aby odsłonić boczny łokieć i wizualnie zlokalizować prostownik nadgarstka promieniowego długiego w interfejsie rozcięgna prostownika. Użyj skalpela, aby wykonać nacięcie rozłupujące o głębokości od dwóch do trzech milimetrów między prostownikiem nadgarstka promieniowego długiego a rozcięgnem prostownika na styku. Po retrakcji przedniej prostownika nadgarstka promieniowego długiego zlokalizuj patologiczną tkankę zwyrodnieniową według jej charakterystycznego matowego szarawego koloru i typowo obrzękniętej i kruchej tkanki, a następnie użyj skalpela i mini ostrzy, aby ostrożnie, ale ostro, wyciąć całą tkankę zwyrodnieniową.

Po pobraniu całej tkanki zamknij ranę niewchłanialnym materiałem szwowym zgodnie ze standardowymi protokołami i ostrożnie usuń całą otaczającą tkankę z około jednego centymetra sześciennego próbki tkanki, umieszczając czystą tkankę ścięgna w 10 mililitrach PBS zaraz po jej przycięciu. Następnie umieść około połowy pobranej tkanki w neutralnej buforowanej 10% formalinie w chemicznym dygestorium na 12 godzin. Aby założyć kulturę tenocytów, przenieś drugą połowę pobranych próbek tkanek kontrolnych i zdegenerowanych do indywidualnych naczyń do kultur tkankowych zawierających świeży PBS i zmiel tkanki na jeden metr sześcienny lub mniejsze kawałki, strawij fragmenty tkanek w 30 mililitrach DMEM uzupełnionych 30 miligramami na mililitr kolagenazy po dwa na grupę tkanek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez jedną godzinę.

Pod koniec trawienia przefiltruj roztwory komórkowe przez indywidualne sitka komórkowe o wielkości 100 mikronów i dezaktywuj kolagenazę za pomocą jednego mililitra FBS na probówkę. Zebrać tenocyty przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w ilości trzykrotnie od 10 do piątej komórki na 10 mililitrów DMEM uzupełnione 10% FBS i 1% antybiotykiem, stężenie roztworu przeciwgrzybiczego. Następnie wysiewaj komórki w jednym 100-centymetrowym naczyniu hodowlanym na warunki i hoduj tenocyty w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez tydzień, zmieniając pożywkę hodowlaną co trzy dni, aż do osiągnięcia 80% konfluencji.

W przypadku analizy immunocytochemicznej przenieś dwa razy po 10 do piątej komórki w 200 mikrolitrach świeżej pożywki do każdej studzienki z jednego ośmiodołkowego szkiełka na grupę eksperymentalną i hoduj komórki do zbiegu przez 24 godziny. Następnego dnia przemyj komórki PBS, a następnie utrwal 500 mikrolitrami 4% formaldehydu na studzienkę i permeabilizację 0,5% trytonem X 100 w PBS przez 10 minut. Aby zablokować wszelkie niespecyficzne wiązania, inkubuj komórki z 1% albuminą surowicy bydlęcej i 0,05% Tween 20 w PBS, zgodnie z eksperymentalnie odpowiednimi potrzebami, a następnie inkubuj z oznaczonymi fluorescencyjnie przeciwciałami pierwszorzędowymi w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez noc, chroniąc je przed światłem.

Następnego ranka oznacz komórki odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi przez godzinę w temperaturze pokojowej chronionej przed światłem i umieść próbki w 0,5 mikrolitra odpowiedniego podłoża do montażu fluorescencyjnego na komorę. Następnie zobrazuj próbki pod mikroskopem fluorescencyjnym pod obiektywem 400 razy. W celu analizy patologicznej tkanki należy osadzić formalne i stałe próbki tkanek kontrolnych i zdegenerowanych ścięgien w czterech do pięciu mililitrach parafiny i uzyskać od czterech do pięciu mikronów z każdego bloku parafiny.

W przypadku hematoksyliny w eozynie lub barwienia H&E należy odparafinować próbki za pomocą trzech pięciominutowych zanurzeń w ksylenie, a następnie uwodnienia za pomocą stopniowanego zanurzenia w etanolu i dwuminutowego płukania wodą z kranu. Następnie oznacz próbki hematoksyliną przez pięć minut, a następnie ponownie przepłucz wodą przez dwie minuty. Zanurz wypłukane próbki w 1% kwasie solnym i 70% etanolu na trzy sekundy, a następnie przepłucz je wodą przez trzy minuty.

Zneutralizuj kwas, zanurzając go w 0,5% amoniaku przez 10 sekund, a następnie przemyj go wodą przez kolejne trzy minuty. Oznacz zneutralizowane próbki eozyną przez pięć minut i odwodnij próbki barwione H&E stopniowanymi zanurzeniami w etanolu. Po trzykrotnym zanurzeniu w ksylenie zamocować próbki za pomocą odpowiedniego podłoża montażowego i szkiełka przykrywkowego.

Aby przeprowadzić analizę immunohistochemiczną próbek tkanek, należy użyć zestawu do wykrywania rafinowanego polimeru wiążącego zgodnie z instrukcjami producenta z następującymi niewielkimi modyfikacjami. Po odparafinowaniu ksylenem, jak pokazano, zanurzyć próbki w roztworze do pobierania epitopów wiązań na 30 minut w temperaturze 100 stopni Celsjusza w celu pobrania antygenu, a następnie przeprowadzić pięciominutową inkubację w nadtlenku wodoru w celu stłumienia endogennej peroksydazy. Następnie oznacz skrawki przez piętnaście minut w temperaturze pokojowej podstawowymi przeciwciałami, które Cię interesują.

Pod koniec inkubacji oznaczyć próbki odpowiednim systemem sprzężonym z wtórnym przeciwciałem niezawierającym biotyny polimerowym łącznikiem peroksydazy chrzanowej przez 50 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zamontuj skrawki z szkiełkiem nakrywkowym w odpowiednim podłożu montażowym i zobrazuj próbki pod mikroskopem świetlnym w 400-krotnym powiększeniu. Analizy H&E ujawniają, że tkanka pobrana ze zwyrodniałego zapalenia nadkłykcia bocznego wykazuje zdezorganizowane wiązki kolagenu z utratą polarności i drobnymi, prostymi, silnie upakowanymi równoległymi strukturami włókien.

Rzeczywiście, wiązki kolagenu są dodatnie pod kątem barwienia Alcian Blue w zwyrodniałych skrawkach tkanki, co wskazuje na zwiększoną obecność proteoglikanów i glikozaminoglikanów w uszkodzonej tkance. Analiza immunohistochemiczna zdegenerowanych ścięgien wskazuje również na cytoplazmatyczną, ziarnistą dodatnią reakcję na czynnik wzrostu śródbłonka naczyniowego, której nie obserwuje się w kontrolnych, zdrowych próbkach tkanki ścięgna. Oba typy komórek próbek tkanek hodowlanych można potwierdzić jako tenocyty za pomocą immunofluorochemii, przy czym większość hodowanych komórek wykazuje ekspresję reprezentatywnych markerów tenocytów, takich jak białka irokeza i tenomoduliny, i wykazuje wydłużony wygląd.

Warto zauważyć, że zwyrodnieniowe tenocyty wykazują również wyższy wskaźnik proliferacji w kulturze w porównaniu z tenocytami zebranymi od zdrowych osób z grupy kontrolnej, a także wyższą ekspresję wielu genów, o których wiadomo, że są związane z rozwojem tendinopatii. Podsumowując, ten zweryfikowany protokół wykorzystujący tenocyty zwyrodnieniowe toruje drogę do przyszłych badań w biologii ścięgien i testowania nowych interwencji.