Name: Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
Description: Poznaj metodę elektroporacji do dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka pęcherza moczowego myszy in vivo. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie autochtonicznych modeli mysich chorób pęcherza bez ryzyka wektorów wirusowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy profesorowi Bin Chenowi, dr Yue Zhangowi i Kendy Hoangowi za pomoc w ustawieniu systemu elektroporacji. Praca ta była wspierana przez granty z Santa Cruz Cancer Benefit Group i NIH dla Z.A.W.

Wszystkie opisane tutaj procedury zostały wykonane zgodnie z wytycznymi i przepisami Instytucjonalnego Komitetu ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) Uniwersytetu Kalifornijskiego w Santa Cruz.
1. Przygotowanie plazmidu i narzędzi
<ol>
	<li>Dla każdego pęcherza moczowego do transfekcji przygotuj co najmniej 20 μl plazmidu DNA (1 μg/μl).</li>
	<li>Dodać 1 μl błękitu trypanowego do 20 μl roztworu plazmidu w probówce mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Odpipetować do dobrego wymieszania.</li>
	<li>Autoklaw wszystkie narzędzia chirurgiczne i wysterylizuj miejsce pracy 70% etanolem. Często spryskuj narzędzia chirurgiczne i rękawice 70% etanolem lub używaj sterylizatora z kulkami szklanymi podczas wykonywania poniższych czynności, aby utrzymać sterylne warunki.</li>
</ol>
2. Zwierzę znieczulające
<ol>
	<li>Użyj stołowego systemu anestezjologicznego, aby znieczulić zwierzę izofluranem. Włącz zbiornikO2 i ustaw przepływomierz tlenu na 1 l/min.</li>
	<li>Umieść dorosłą samicę myszy C57BL/6J w komorze indukcyjnej. Włącz i ustaw waporyzator izofluranu na 3% w celu indukcji. Mysz powinna być w znieczuleniu w ciągu 2 minut. Podać podskórnie buprenorfinę przeciwbólową (0,1 mg/kg) po wyjęciu myszy z komory indukcyjnej w celu prewencyjnego znieczulenia. 
	UWAGA: W tym protokole wykorzystywane są samice myszy, ponieważ są one łatwiejsze w obsłudze podczas cewnikowania cewki moczowej. Protokół działa również w przypadku samców myszy, ale podczas wykonywania kroku 3 należy zachować szczególną ostrożność.</li>
	<li>Nałóż maść okulistyczną na oczy zwierzęcia, aby zapobiec wysuszeniu. Połóż znieczuloną mysz przodem do góry na poduszce grzewczej, tak aby jej nos znajdował się w stożku nosowym. Przekręć przełącznik obwodu powietrza, aby izofluran mógł przejść przez stożek nosowy.</li>
	<li>Umocuj głowę i stożek nosowy taśmą klejącą. Dostosuj parownik izofluranu do 2% w celu konserwacji.</li>
	<li>Unieruchomić kończyny taśmą klejącą. Wykonaj testy szczypania palców u stóp, aby upewnić się, że zwierzę jest w głębokim znieczuleniu, a następnie ogol okolice brzucha.</li>
</ol>
3. Wyczerpanie moczu i płukanie pęcherza moczowego
<ol>
	<li>Nałóż lubrykant na cewnik (24G, długość 2,11 cm, średnica zewnętrzna 0,045 cm) i upewnij się, że jego zewnętrzna powierzchnia jest całkowicie pokryta.</li>
	<li>Włóż cewnik do otworu cewki moczowej i powoli dociśnij go, aż dotrze do pęcherza, po czym mocz powinien wypłynąć przez cewnik. Delikatnie uciskaj brzuch, aby pomóc w odprowadzaniu moczu.
	<ol>
		<li>Sprawdź, czy cewnik jest prawidłowo wprowadzony do pęcherza, obserwując automatyczny odpływ moczu. Unikaj przekłuwania cewki moczowej i ściany pęcherza, a w razie potrzeby nałóż smar wiele razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wylać mocz za pomocą pipety do zlewki na odpady.</li>
	<li>Odpipetować 80 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do zewnętrznego końca cewnika, tak aby drugi koniec nadal znajdował się w pęcherzu moczowym. Ostrożnie przymocować strzykawkę o pojemności 1 ml do cewnika. Delikatnie wepchnąć strzykawkę, aby wstrzyknąć PBS do pęcherza moczowego. Pozostaw trochę PBS w cewniku, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w pęcherzu.</li>
	<li>Wyjąć strzykawkę. Poczekaj, aż PBS spłynie z pęcherza. Delikatnie naciśnij brzuch, aby ewakuować PBS.</li>
	<li>Wyrzucić PBS z cewnika za pomocą pipety do zlewki na odpady.</li>
	<li>Powtórz mycie PBS (kroki 3.4 - 3.6) jeszcze dwa razy. 
	UWAGA: Podczas tych etapów prania należy pracować delikatnie. Krew w cewniku lub niewydolność automatycznego odpływu płynu zwykle wskazuje na przekłucie cewki moczowej. Ważne jest również, aby unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza, ponieważ obniżą one wydajność elektroporacji.</li>
</ol>
4. Dostarczanie plazmidu
<ol>
	<li>Nałóż 70% etanol na brzuch myszy i za pomocą skalpela wykonaj pionowe nacięcie 1 cm, aby otworzyć skórę brzucha nad pęcherzem.</li>
	<li>Pobrać pipetę z co najmniej 20 μl plazmidu i roztworu błękitu trypanowego do zewnętrznego końca cewnika i podłączyć strzykawkę.</li>
	<li>Wstrzyknąć roztwór plazmidu do pęcherza moczowego. Jeśli pęcherz zmieni kolor na niebieski, wstrzyknięcie się powiedzie. Pozostaw trochę płynu w cewniku, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w pęcherzu.</li>
	<li>Chwyć zewnętrzny otwór cewki moczowej za pomocą pęsety, a następnie wyjmij cewnik i strzykawkę. Użyj sznurka, aby zacisnąć zewnętrzny otwór cewki moczowej. Zrób dwie pętle ze sznurka, a następnie zawiąż dwoma węzłami. 
	UWAGA: Zaciśnięcie cewki moczowej jest ważne dla zapobiegania cofaniu się płynu plazmidowego.</li>
	<li>Włącz generator elektroporacji o następujących parametrach: 33 V, czas pracy 50 ms i czas interwału 950 ms.</li>
	<li>Przytrzymaj pęcherz pęsetą i uszczypnij pęcherz dwiema elektrodami. Naciśnij pedał nożny, aby wykonać elektroporację. 
	UWAGA: Impulsy elektryczne są ustawione tak, aby pojawiały się 5 razy w krótkich odstępach czasu po każdym naciśnięciu pedału. Mysz może drgać w tym procesie. Naciśnięcie pedału nożnego więcej niż raz może zwiększyć wydajność podawania, ale zbyt wiele impulsów elektrycznych może uszkodzić integralność tkankową nabłonka dróg moczowych.
	<ol>
		<li>Unikaj kontaktu pęsety z elektrodami, ponieważ spowoduje to wytworzenie iskry.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Odzyskiwanie
<ol>
	<li>Zszyj otwór brzuszny i skórny sterylnym szwem chirurgicznym i klipsami. Nałóż jod na ranę.</li>
	<li>Usunąć zwierzę z układu izofluranu. Buprenorfinę należy podawać przeciwbólowo (0,1 mg/kg) podskórnie w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego.</li>
	<li>Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej i po pełnym wyzdrowieniu włóż je z powrotem do klatki domowej. Sprawdzaj zwierzę co najmniej raz dziennie pod kątem normalnej mobilności, zachowań związanych z piciem i karmieniem oraz braku oznak infekcji do czasu zagojenia się nacięcia, a następnie usuń klipsy. Podawaj kolejne wstrzyknięcia buprenorfiny przeciwbólowej, jeśli zwierzę wykazuje objawy bólowe, takie jak zmniejszona pielęgnacja, zwiększona agresywność i wokalizacja.</li>
</ol>

<ol><li>Sharpless, N. E., Depinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mighty+mouse%3A+genetically+engineered+mouse+models+in+cancer+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).</li>
<li>Heyer, J., Kwong, L. N., Lowe, S. W., Chin, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-germline+genetically+engineered+mouse+models+for+translational+cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Non-germline genetically engineered mouse models for translational cancer research.</a> Nat Rev Cancer. 10 (7), 470-480 (2010).</li>
<li>Maddalo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+engineering+of+oncogenic+chromosomal+rearrangements+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo engineering of oncogenic chromosomal rearrangements with the CRISPR/Cas9 system.</a> Nature. 516 (7531), 423-427 (2014).</li>
<li>Xue, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+direct+mutation+of+cancer+genes+in+the+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated direct mutation of cancer genes in the mouse liver.</a> Nature. , (2014).</li>
<li>Sanchez-Rivera, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+modelling+of+cooperating+genetic+events+in+cancer+through+somatic+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid modelling of cooperating genetic events in cancer through somatic genome editing.</a> Nature. 516 (7531), 428-431 (2014).</li>
<li>Romero, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keap1+loss+promotes+Kras-driven+lung+cancer+and+results+in+dependence+on+glutaminolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Keap1 loss promotes Kras-driven lung cancer and results in dependence on glutaminolysis.</a> Nat Med. 23 (11), 1362-1368 (2017).</li>
<li>Platt, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas9+knockin+mice+for+genome+editing+and+cancer+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling.</a> Cell. 159 (2), 440-455 (2014).</li>
<li>Yin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing+with+Cas9+in+adult+mice+corrects+a+disease+mutation+and+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.</a> Nat Biotechnol. 32 (6), 551-553 (2014).</li>
<li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dual+AAV+system+enables+the+Cas9-mediated+correction+of+a+metabolic+liver+disease+in+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A dual AAV system enables the Cas9-mediated correction of a metabolic liver disease in newborn mice.</a> Nat Biotechnol. 34 (3), 334-338 (2016).</li>
<li>Negrete, H. O., Lavelle, J. P., Berg, J., Lewis, S. A., Zeidel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+properties+of+the+intact+mammalian+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Permeability properties of the intact mammalian bladder epithelium.</a> Am J Physiol. 271 (4 Pt 2), F886-F894 (1996).</li>
<li>Lilly, J. D., Parsons, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bladder+surface+glycosaminoglycans+is+a+human+epithelial+permeability+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Gynecol+Obstet%22%5BJournal%5D)">Bladder surface glycosaminoglycans is a human epithelial permeability barrier.</a> Surg Gynecol Obstet. 171 (6), 493-496 (1990).</li>
<li>Ramesh, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+pretreatment+agents+to+enhance+adenovirus+infection+of+bladder+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium.</a> Mol Ther. 10 (4), 697-705 (2004).</li>
<li>Yamashita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syn3+provides+high+levels+of+intravesical+adenoviral-mediated+gene+transfer+for+gene+therapy+of+genetically+altered+urothelium+and+superficial+bladder+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Syn3 provides high levels of intravesical adenoviral-mediated gene transfer for gene therapy of genetically altered urothelium and superficial bladder cancer.</a> Cancer Gene Ther. 9 (8), 687-691 (2002).</li>
<li>Engler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethanol+improves+adenovirus-mediated+gene+transfer+and+expression+to+the+bladder+epithelium+of+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Urology%22%5BJournal%5D)">Ethanol improves adenovirus-mediated gene transfer and expression to the bladder epithelium of rodents.</a> Urology. 53 (5), 1049-1053 (1999).</li>
<li>Matsuda, T., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+and+RNA+interference+in+the+rodent+retina+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro.</a> P Natl Acad Sci USA. 101 (1), 16-22 (2004).</li>
<li>Yarmush, M. L., Golberg, A., Sersa, G., Kotnik, T., Miklavcic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation-based+technologies+for+medicine%3A+principles%2C+applications%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Electroporation-based technologies for medicine: principles, applications, and challenges.</a> Annu Rev Biomed Eng. 16, 295-320 (2014).</li>
<li>Saito, T., Nakatsuji, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+into+the+embryonic+mouse+brain+using+in+vivo+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation.</a> Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).</li>
<li>Boutin, C., Diestel, S., Desoeuvre, A., Tiveron, M. C., Cremer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+in+vivo+electroporation+of+the+postnatal+rodent+forebrain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient in vivo electroporation of the postnatal rodent forebrain.</a> PLoS One. 3 (4), e1883(2008).</li>
<li>Saito, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+in+the+embryonic+mouse+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation in the embryonic mouse central nervous system.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1552-1558 (2006).</li>
<li>Molotkov, D. A., Yukin, A. Y., Afzalov, R. A., Khiroug, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+delivery+to+postnatal+rat+brain+by+non-ventricular+plasmid+injection+and+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Gene delivery to postnatal rat brain by non-ventricular plasmid injection and electroporation.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li>
<li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239(2007).</li>
<li>Follenzi, A., Santambrogio, L., Annoni, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+to+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Immune responses to lentiviral vectors.</a> Curr Gene Ther. 7 (5), 306-315 (2007).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów.

Elektroporacja zwiększa przepuszczalność błony komórkowej i jest potężną technologią elektrotransferu genów16. Dostarczanie genów do żywych gryzoni za pomocą elektroporacji jest często stosowane w dziedzinach neurobiologii 17,18,19,20,21. Jego potencjalne zastosowania w wielu innych narządach nie zostały szeroko zbadane. Według naszej w...

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) odgrywają istotną rolę w poszerzaniu naszej wiedzy na temat rozwoju zwierząt, funkcji genów in vivo i mechanizmów progresji chorób1,2. GEMM linii zarodkowej są tradycyjnie rozwijane na dwa sposoby. Pierwszym z nich jest stworzenie transgenicznych myszy poprzez wstrzyknięcie plazmidu DNA do przedjądrza, a następnie przeszczepienie zygot samicom w rzekomej ciąży. Drugim jest wytwarzanie myszy typu knock-out/knock-in poprzez rekombinację homologiczną w embrionalnych komórkach macierzystych i rozwój chimer. Warunkowy nokaut genów w określonym typie tkanki lub komórki obejmuje hodowlę genetycznie zmodyfikowanych alleli z miejscami Cre i flox przez wiele pokoleń. Cały proces może być kosztowny i czasochłonny, zwłaszcza jeśli celem jest celowanie w wiele genów specyficznych dla tkanki. Ostatnio technologie edycji genów, takie jak zgrupowane, regularnie rozmieszczone krótkie powtórzenia palindromiczne (CRISPR), zostały zastosowane do kilku narządów myszy w celu wywołania specyficznych tkankowo zmian genetycznych w celu modelowania raka autochtonicznego3,4,5,6,7 lub popraw mutacje choroby in situ8,9. W tych badaniach dostarczanie wektorów gRNA było zwykle osiągane poprzez adenowirusowe lub lentiwirusowe zakażenie narządu lub hydrodynamiczne wstrzyknięcie żyły ogonowej. Względna łatwość dostarczania składników CRISPR do płuc i wątroby znacznie poprawiła wygodę i wydajność modelowania raka w tych narządach w porównaniu z tradycyjnymi modelami mysimi opartymi na Cre-Lox.
Nabłonek dróg moczowych jest miejscem, z którego pochodzi większość guzów pęcherza moczowego. Dostarczanie wektorów DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza moczowego w celu modelowania raka lub terapii genowej jest utrudnione przez warstwę glikozaminoglikanu na wierzchołkowej powierzchni nabłonka dróg moczowych, która działa jako bariera dla przylegania zakaźnych wirusów10,11. Zastosowano kilka środków do obróbki wstępnej, takich jak Syn3 i dodecyl-β-d-maltozyd, aby przełamać tę barierę i zwiększyć skuteczność infekcji adenowirusem12,13,14. Nie podano, czy wirusy związane z adenowirusami (AAV) mogą skutecznie infekować pęcherz moczowy. Ogólnie rzecz biorąc, pożądana byłaby metoda dostarczania nieoparta na wirusach. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę opracowaną w laboratorium w celu skutecznego dostarczania plazmidu DNA do nabłonka dróg moczowych myszy poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Ponieważ nasze podejście nie obejmuje chemicznej obróbki wstępnej warstwy glikozaminoglikanu ani produkcji wirusa, znacznie upraszcza dostarczanie plazmidów DNA do nabłonka moczowego pęcherza myszy i powinno ułatwić różne badania in vivo chorób pęcherza moczowego.

<table><tbody><tr><td>Strzykawka BD 1mL TB</td><td>Fisher</td><td>148232E</td><td></td></tr><tr><td>Buprenorfina</td><td>Sigma</td><td>B9275-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Pęseta Dumont</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5005</td><td>Traktuj 70% etanolem przed użyciem chirurgicznym</td></tr><tr><td>ECM830 Elektroporator fal SQ</td><td>Aparat Harvarda</td><td>450052</td><td></td></tr><tr><td>Exel International Jednorazowe cewniki dożylne</td><td>Safelet Fisher Scientific</td><td>14-841-21</td><td>24G, długość 2,11 cm, średnica zewnętrzna 0,045 cm</td></tr><tr><td>Bardzo drobne mikronożyczki preparacyjne</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5135</td><td>Traktuj 70% etanolem przed użyciem chirurgicznym</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Vet one</td><td>501017</td><td></td></tr><tr><td>K& H Podgrzewana mata spoczynkowa dla małych zwierząt, 9 na 12 cali</td><td>Amazon</td><td>nie dotyczy</td><td>Przykryj matę grzewczą ręcznikami papierowymi</td></tr><tr><td>Maść okulistyczna</td><td>Fisher</td><td>NC0849514</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Life Technologies</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet 200 i mikro; L</td><td>USA Scientific</td><td>1111-0206</td><td></td></tr><tr><td>Końcówki do pipet, uniwersalne dopasowanie; 0,1 do 10 i mikro; L</td><td>Fisher</td><td>02707438(CS)</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P2</td><td>Gilson</td><td>F144561</td><td></td></tr><tr><td>PIPETMAN NEO P200N</td><td>Gilson</td><td>F144565</td><td></td></tr><tr><td>plazmid CAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>16664</td><td></td></tr><tr><td>Platynowa pęseta 5 mm</td><td>Aparat Harvard</td><td>450489</td><td>średnicy 5 mm</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Roboz Surgical Instr</td><td>RS-5880</td><td>Traktuj za pomocą 70% etanol przed użyciem chirurgicznym</td></tr><tr><td>Sznurek</td><td>Amazon</td><td>n/a</td><td>Mandala Crafts 150D 210D 0,8mm 1mm skórzane szwy do szycia płaska woskowana nić sznurek sznurek</td></tr><tr><td>Taśma, Scotch</td><td>Fisher</td><td>19047257</td><td></td></tr><tr><td>Therio-gel Weterynaryjny lubrykant</td><td>PBS Zdrowie zwierząt</td><td>353-736</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Blat stołu znieczulenie systemowe</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Vicryl fioletowy szew 18" FS-2 cięcie 5-0</td><td>Fisher</td><td>NC0578475</td><td></td></tr><tr><td>Walgreens Povidone Jod 10%</td><td>Walgreens</td><td>953982</td><td></td></tr><tr><td>Klips</td><td>do ran Fisher</td><td>018045</td><td></td></tr><tr><td>Aplikator do spinania ran</td><td>Fisher</td><td>01804</td><td></td></tr></tbody></table>

nowa metoda dostarczania plazmidowego dna do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

Novel Method of Plasmid DNA Delivery to Mouse Bladder Urothelium by Electroporation

Genetycznie modyfikowane modele myszy (GEMM) są niezwykle cenne w odkrywaniu nowych biologicznych spostrzeżeń na temat mechanizmów inicjacji i progresji ludzkich chorób, takich jak rak. Myszy transgeniczne i z warunkowym nokautem były często wykorzystywane do nadekspresji lub ablacji genów w określonych tkankach lub typach komórek in vivo. Jednak generowanie modeli myszy linii zarodkowej może być czasochłonne i kosztowne. Niedawne postępy w technologiach edycji genów i możliwość dostarczania plazmidów DNA przez infekcję wirusową umożliwiły szybkie wygenerowanie modeli autochtonicznego raka myszy niebędących linią zarodkową dla kilku narządów. Pęcherz moczowy jest narządem, do którego wektory wirusowe mają utrudniony dostęp ze względu na obecność warstwy glikozaminoglikanu pokrywającej nabłonek dróg moczowych. W tym miejscu opisujemy nowatorską metodę opracowaną w laboratorium w celu skutecznego dostarczania plazmidów DNA do nabłonka moczowego myszy in vivo. Poprzez dopęcherzowe wkraplanie plazmidu DNA pCAG-GFP i elektroporację chirurgicznie odsłoniętego pęcherza, pokazujemy, że plazmid DNA może być dostarczony specyficznie do komórek urotelialnych pęcherza moczowego w celu przejściowej ekspresji. Nasza metoda zapewnia szybki i wygodny sposób na nadekspresję i knockdown genów w pęcherzu myszy i może być stosowana do budowy GEMM raka pęcherza moczowego i innych chorób urologicznych.

Aby zademonstrować skuteczność dostarczania genów do urothelium pęcherza moczowego, do elektroporacji wykorzystaliśmy plazmid pCAG-GFP15. Przez cewkę moczową wstrzyknięto 20 µL plazmidu i roztworu błękitu trypanowego, a następnie podano 5 impulsów elektrycznych. Po 48 h wycięto pęcherz myszy i za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu stereoskopowego zaobserwowano obszary fluorescencji GFP, podczas gdy pęcherz w grupie kontrolnej, który nie został poddany elektroporac...

Opisujemy nowatorską metodę dostarczania plazmidu DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Oferuje szybki i wygodny sposób generowania autochtonicznych mysich modeli chorób pęcherza moczowego.

Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

Genetically engineered mouse models (GEMMs) are extremely valuable in revealing novel biological insights into the initiation and progression mechanisms ...

Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie plazmidów DNA do nabłonka dróg moczowych żywych myszy in vivo w celu nadekspresji genów lub edycji genomu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka pęcherza moczowego, takie jak to, w jaki sposób różne mutacje genetyczne sprzyjają progresji raka pęcherza moczowego? Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia szybki i wygodny sposób dostarczania genów do pęcherza moczowego bez obaw o bezpieczeństwo i barier technicznych związanych z wektorami wirusowymi.Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, aby spróbować użyć wszelkich zmodyfikowanych wirusów powiązanych z dostarczaniem DNA, co nie działało dobrze na pęcherzu. Implikacje tej techniki mogą również rozciągać się na terapię genową, ponieważ elektroporacja może zapewnić skuteczne dostarczanie plazmidów DNA do komórek urotelialnych. Procedurę zademonstrują Ofir Stefanson i Yueli Liu z mojego laboratorium.Aby rozpocząć tę procedurę, należy autoklawować wszystkie narzędzia chirurgiczne i wysterylizować miejsce pracy 70% etanolem. Podczas wykonywania kolejnych zabiegów należy często spryskiwać narzędzia chirurgiczne i rękawice 70% etanolem, aby utrzymać sterylne warunki. Na początek znieczul mysz i ogol obszar operacyjny.Aby usunąć mocz, nałóż lubrykant na cewnik i upewnij się, że jego zewnętrzna powierzchnia jest całkowicie pokryta. Następnie włóż cewnik do otworu cewki moczowej myszy i powoli dociśnij go, aż dotrze do pęcherza. Delikatnie uciskaj brzuch, aby pomóc w odprowadzaniu moczu.Następnie wyrzuć mocz za pomocą pipety do zlewki na odpady, a następnie odpipetuj 80 mikrolitrów PBS do zewnętrznego końca cewnika, tak aby drugi koniec nadal znajdował się w pęcherzu. Następnie ostrożnie przymocuj jednomilimetrową strzykawkę do cewnika. Delikatnie wepchnąć strzykawkę, aby wstrzyknąć PBS do pęcherza.Pozostaw trochę PBS w cewniku, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w pęcherzu. Następnie należy wyjąć strzykawkę i poczekać, aż PBS spłynie z pęcherza. Delikatnie nacisnąć brzuch, aby usunąć PBS, a następnie wyrzucić PBS z cewnika za pomocą pipety do zlewki na odpady.Powtórz mycie PBS jeszcze dwa razy. Dla każdego pęcherza do transfekcji przygotuj co najmniej 20 mikrolitrów plazmidu DNA w ilości jednego mikrograma na mikrolitr. Następnie dodaj jeden mikrolitr błękitu trypanowego do 20 mikrolitrów roztworu plazmidu i 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki i pipety, aby dobrze wymieszać.Aby dostarczyć plazmid, nałóż 70% etanol na brzuch. Wykonaj pionowe nacięcie o długości jednego centymetra, aby otworzyć skórę brzucha nad pęcherzem. Następnie przetnij warstwę mięśni, aby odsłonić pęcherz.Odpipetować co najmniej 20 mikrolitrów plazmidu i roztworu błękitu trypanowego do zewnętrznego końca cewnika i odłączyć go od strzykawki. Następnie wstrzyknąć roztwór plazmidu do pęcherza moczowego. Jeśli pęcherz zmieni kolor na niebieski, wstrzyknięcie się powiedzie.Pozostaw trochę płynu w cewniku, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w pęcherzu. Następnie chwyć zewnętrzny otwór cewki moczowej i wyjmij cewnik i strzykawkę. Użyj sznurka, aby zacisnąć zewnętrzny otwór cewki moczowej.Zrób dwie pętle ze sznurkiem, a następnie zawiąż dwoma węzłami. Jest to kluczowy krok, który wymaga współpracy dwóch osób. Upewnij się, że węzły są napięte, aby plazmidy nie wyciekły.Teraz włącz generator elektroporacji. Ściśnij pęcherz dwiema elektrodami i naciśnij pedał nożny, aby wykonać elektroporację. Aby utrzymać pęcherz podparty, można uszczypnąć tylną część nacięcia brzucha pęsetą.Unikaj kontaktu pęsety z elektrodami, ponieważ może to spowodować powstanie iskry. Po wykonaniu tej czynności zszyj jamę brzuszną i otwór skóry sterylnym, chirurgicznym szwem. Usuń sznurek i przyłóż klipsy.Nałóż jod na ranę, a następnie usuń zwierzę z układu izofluranu. Buprenorfinę należy podawać przeciwbólowo podskórnie w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej i po pełnym wyzdrowieniu włóż je z powrotem do klatki domowej.Sprawdzaj zwierzę co najmniej raz dziennie pod kątem normalnej mobilności, zachowań związanych z piciem i karmieniem oraz braku oznak infekcji do czasu zagojenia się nacięcia. Następnie, tydzień później, usuń klipsy. Podawaj kolejne zastrzyki przeciwbólowego buprenorfiny, jeśli zwierzę wykazuje objawy bólowe, takie jak zmniejszona pielęgnacja, zwiększona agresywność i wokalizacja.Aby zademonstrować skuteczne dostarczanie genu do nabłonka moczowego pęcherza moczowego, wstrzyknięto 20 mikrolitrów plazmidu pCAG-GFP i roztworu błękitu trypanowego przez cewkę moczową i podano pięć impulsów elektrycznych. Pokazano tutaj udaną elektroporację, która zmieniła kolor pęcherza na zielony po 48 godzinach, podczas gdy pęcherz kontroli negatywnej, który nie został poddany elektroporacji, nie wykazał sygnału GFP. Barwienie immunofluorescencyjne wyciętych tkanek pęcherza moczowego przeprowadzono za pomocą przeciwciał CK5, CK18 i GFP.Zaobserwowano, że sygnał GFP jest obecny w komórkach parasolowych, pośrednich i podstawnych, ale nie w warstwie mięśniowej, co wskazuje na dobrą specyficzność dostarczania plazmidu do nabłonka dróg moczowych. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się rakiem pęcherza moczowego do budowy nowych autochtonicznych modeli myszy w celu zbadania mechanizmów progresji choroby.

novel-method-plasmid-dna-delivery-to-mouse-bladder-urothelium

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Opisano metodę transferu genów do rozwijającego się mózgu myszy z wykorzystaniem unikalnej metody chirurgicznej oraz specjalnego kształtu elektrod. Ta wyjątkowa technika umożliwia czasową i przestrzenną transfekcję plazmidowego DNA, co pomoże wielu neuronaukowcom w badaniu rozwoju mózgu.

Elektroporacja myszy in utero: kontrolowana spatiotemporalna transfekcja genów

W tym filmie opisujemy procedurę opartą na cewniku, która ma na celu opróżnienie i przepłukanie pęcherza moczowego modelu myszy. Tak przygotowana mysz może być następnie wykorzystana do dalszych procedur eksperymentalnych.

Wyczerpanie moczu i płukanie pęcherza moczowego w modelu mysim: procedura oparta na cewniku do opróżniania i mycia mysiego pęcherza moczowego

Ten film demonstruje dostarczanie plazmidu DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza myszy za pomocą kombinacji cewnikowania cewki moczowej i technik elektroporacji. Opisana procedura pozwala na wygenerowanie modeli raka pęcherza moczowego u myszy.

Dostarczanie plazmidów DNA do nabłonka dróg moczowych pęcherza myszy: procedura oparta na elektroporacji mająca na celu skuteczne dostarczanie plazmidów DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy w celu wygenerowania modeli modyfikowanych genetycznie

Ten film demonstruje dostarczanie plazmidowego DNA do komórek neuronalnych móżdżku mysich zarodków za pomocą elektroporacji in utero. Metoda ta jest przydatna do zrozumienia funkcji genów in vivo w prawidłowym rozwoju mózgu oraz zmian w ekspresji genów komórek neuronalnych podczas progresji guza.

Dostarczanie genów oparte na elektroporacji in utero: technika wstrzykiwania plazmidowego DNA do embrionalnych komórek móżdżku mysich zarodków

Ten film demonstruje technikę elektroporacji, która wprowadza plazmidowe DNA kodujące białka fluorescencyjne do prekursorów pierwotnych komórek ziarnistych móżdżku myszy.

Dostarczanie genów in vitro za pośrednictwem elektroporacji: technika impulsów elektrycznych do wprowadzania fluorescencyjnych plazmidów kodujących białko reporterowe do hodowanych komórek

Implantacja komórek nowotworowych do narządu pochodzenia może służyć jako użyteczny model przedkliniczny do oceny nowych terapii. Komórki raka pęcherza moczowego MB49 mogą być hodowane w pęcherzu moczowym po wkropleniu dopęcherzowym. Protokół ten demonstruje cewnikowanie pęcherza myszy w celu implantacji guza i dostarczenia adenowirusa.

Ortotopowy model raka pęcherza moczowego do badań nad dostarczaniem genów

Ten artykuł opisuje mikroiniekcję i elektroporację jąder myszy in vivo jako technikę transfekcji komórek jąder myszy w celu zbadania unikalnych procesów spermatogenezy. Prezentowany protokół obejmuje etapy przygotowania kapilar szklanych, mikroiniekcji przez przewód odprowadzający oraz transfekcji za pomocą elektroporacji.

In vivo (in vivo) Mikroiniekcja i elektroporacja jąder myszy

Ten protokół opisuje proces generowania i charakterystyki mysich organoidów urotelialnych zawierających delecje w interesujących genach. Metody obejmują pobieranie mysich komórek urotelialnych, transdukcję ex vivo z adenowirusem napędzającym ekspresję Cre za pomocą promotora CMV oraz charakterystykę in vitro i in vivo.

Ex vivo Organoidalny model delecji genów za pośrednictwem adenowirusa-cre w mysich komórkach urotelialnych

Elektroporacja plazmidowego DNA w mięśniach szkieletowych jest realną metodą modulowania ekspresji genów bez naruszania kurczliwości mięśni u myszy.

Elektroporacja plazmidowego DNA do mięśni szkieletowych myszy

Opisano metody generowania dużych ilości rekombinowanych adenowirusów, które następnie mogą być użyte do transdukcji rodzimego nabłonka dróg moczowych gryzoni, co pozwala na ekspresję transgenów lub regulację w dół produktów genów endogennych.

Ekspresja transgenów w natywnym nabłonku dróg moczowych pęcherza moczowego za pomocą transdukcji za pośrednictwem adenowirusa

Artykuł przedstawia łatwą i powtarzalną metodę transcetralnej elektroporacji wapnia z wykorzystaniem nowo opracowanej elektrody endoskopowej kompatybilnej ze standardowym sprzętem urologicznym. Badanie to stanowi istotny krok naprzód w kierunku zastosowania elektroporacji w transuretre i toruje drogę do rozszerzenia innowacyjnego i minimalnie inwazyjnego leczenia guzów moczowych.

Integracja elektroporacji w praktyce urologicznej: projektowanie i ocena nowej elektrody transurethralnej

Poznaj metodę elektroporacji do dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka pęcherza moczowego myszy in vivo. Technika ta umożliwia szybkie tworzenie autochtonicznych modeli mysich chorób pęcherza bez ryzyka wektorów wirusowych.

Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji

Przeglądaj więcej filmów