Nowa metoda dostarczania plazmidowego DNA do nabłonka moczowego myszy za pomocą elektroporacji
3 maja 2018
Opisujemy nowatorską metodę dostarczania plazmidu DNA do komórek urotelialnych pęcherza myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Oferuje szybki i wygodny sposób generowania autochtonicznych mysich modeli chorób pęcherza moczowego.
Ogólnym celem tej metody jest dostarczenie plazmidów DNA do nabłonka dróg moczowych żywych myszy in vivo w celu nadekspresji genów lub edycji genomu. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie raka pęcherza moczowego, takie jak to, w jaki sposób różne mutacje genetyczne sprzyjają progresji raka pęcherza moczowego? Główną zaletą tej techniki jest to, że zapewnia szybki i wygodny sposób dostarczania genów do pęcherza moczowego bez obaw o bezpieczeństwo i barier technicznych związanych z wektorami wirusowymi.
Po raz pierwszy wpadłem na pomysł tej metody, aby spróbować użyć wszelkich zmodyfikowanych wirusów powiązanych z dostarczaniem DNA, co nie działało dobrze na pęcherzu. Implikacje tej techniki mogą również rozciągać się na terapię genową, ponieważ elektroporacja może zapewnić skuteczne dostarczanie plazmidów DNA do komórek urotelialnych. Procedurę zademonstrują Ofir Stefanson i Yueli Liu z mojego laboratorium.
Aby rozpocząć tę procedurę, należy autoklawować wszystkie narzędzia chirurgiczne i wysterylizować miejsce pracy 70% etanolem. Podczas wykonywania kolejnych zabiegów należy często spryskiwać narzędzia chirurgiczne i rękawice 70% etanolem, aby utrzymać sterylne warunki. Na początek znieczul mysz i ogol obszar operacyjny.
Aby usunąć mocz, nałóż lubrykant na cewnik i upewnij się, że jego zewnętrzna powierzchnia jest całkowicie pokryta. Następnie włóż cewnik do otworu cewki moczowej myszy i powoli dociśnij go, aż dotrze do pęcherza. Delikatnie uciskaj brzuch, aby pomóc w odprowadzaniu moczu.
Następnie wyrzuć mocz za pomocą pipety do zlewki na odpady, a następnie odpipetuj 80 mikrolitrów PBS do zewnętrznego końca cewnika, tak aby drugi koniec nadal znajdował się w pęcherzu. Następnie ostrożnie przymocuj jednomilimetrową strzykawkę do cewnika. Delikatnie wepchnąć strzykawkę, aby wstrzyknąć PBS do pęcherza.
Pozostaw trochę PBS w cewniku, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w pęcherzu. Następnie należy wyjąć strzykawkę i poczekać, aż PBS spłynie z pęcherza. Delikatnie nacisnąć brzuch, aby usunąć PBS, a następnie wyrzucić PBS z cewnika za pomocą pipety do zlewki na odpady.
Powtórz mycie PBS jeszcze dwa razy. Dla każdego pęcherza do transfekcji przygotuj co najmniej 20 mikrolitrów plazmidu DNA w ilości jednego mikrograma na mikrolitr. Następnie dodaj jeden mikrolitr błękitu trypanowego do 20 mikrolitrów roztworu plazmidu i 1,5 mililitrowej probówki mikrowirówki i pipety, aby dobrze wymieszać.
Aby dostarczyć plazmid, nałóż 70% etanol na brzuch. Wykonaj pionowe nacięcie o długości jednego centymetra, aby otworzyć skórę brzucha nad pęcherzem. Następnie przetnij warstwę mięśni, aby odsłonić pęcherz.
Odpipetować co najmniej 20 mikrolitrów plazmidu i roztworu błękitu trypanowego do zewnętrznego końca cewnika i odłączyć go od strzykawki. Następnie wstrzyknąć roztwór plazmidu do pęcherza moczowego. Jeśli pęcherz zmieni kolor na niebieski, wstrzyknięcie się powiedzie.
Pozostaw trochę płynu w cewniku, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza w pęcherzu. Następnie chwyć zewnętrzny otwór cewki moczowej i wyjmij cewnik i strzykawkę. Użyj sznurka, aby zacisnąć zewnętrzny otwór cewki moczowej.
Zrób dwie pętle ze sznurkiem, a następnie zawiąż dwoma węzłami. Jest to kluczowy krok, który wymaga współpracy dwóch osób. Upewnij się, że węzły są napięte, aby plazmidy nie wyciekły.
Teraz włącz generator elektroporacji. Ściśnij pęcherz dwiema elektrodami i naciśnij pedał nożny, aby wykonać elektroporację. Aby utrzymać pęcherz podparty, można uszczypnąć tylną część nacięcia brzucha pęsetą.
Unikaj kontaktu pęsety z elektrodami, ponieważ może to spowodować powstanie iskry. Po wykonaniu tej czynności zszyj jamę brzuszną i otwór skóry sterylnym, chirurgicznym szwem. Usuń sznurek i przyłóż klipsy.
Nałóż jod na ranę, a następnie usuń zwierzę z układu izofluranu. Buprenorfinę należy podawać przeciwbólowo podskórnie w celu złagodzenia bólu pooperacyjnego. Trzymaj zwierzę na poduszce grzewczej i po pełnym wyzdrowieniu włóż je z powrotem do klatki domowej.
Sprawdzaj zwierzę co najmniej raz dziennie pod kątem normalnej mobilności, zachowań związanych z piciem i karmieniem oraz braku oznak infekcji do czasu zagojenia się nacięcia. Następnie, tydzień później, usuń klipsy. Podawaj kolejne zastrzyki przeciwbólowego buprenorfiny, jeśli zwierzę wykazuje objawy bólowe, takie jak zmniejszona pielęgnacja, zwiększona agresywność i wokalizacja.
Aby zademonstrować skuteczne dostarczanie genu do nabłonka moczowego pęcherza moczowego, wstrzyknięto 20 mikrolitrów plazmidu pCAG-GFP i roztworu błękitu trypanowego przez cewkę moczową i podano pięć impulsów elektrycznych. Pokazano tutaj udaną elektroporację, która zmieniła kolor pęcherza na zielony po 48 godzinach, podczas gdy pęcherz kontroli negatywnej, który nie został poddany elektroporacji, nie wykazał sygnału GFP. Barwienie immunofluorescencyjne wyciętych tkanek pęcherza moczowego przeprowadzono za pomocą przeciwciał CK5, CK18 i GFP.
Zaobserwowano, że sygnał GFP jest obecny w komórkach parasolowych, pośrednich i podstawnych, ale nie w warstwie mięśniowej, co wskazuje na dobrą specyficzność dostarczania plazmidu do nabłonka dróg moczowych. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w 15 minut, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu, technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się rakiem pęcherza moczowego do budowy nowych autochtonicznych modeli myszy w celu zbadania mechanizmów progresji choroby.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje nową metodę dostarczania plazmidów DNA do komórek urothelium pęcherza moczowego myszy in vivo poprzez cewnikowanie cewki moczowej i elektroporację. Technika ta stanowi szybki i wygodny sposób tworzenia autochtonicznych modeli mysich chorób pęcherza moczowego.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Badania nad rakiem pęcherza moczowego
- Techniki elektroporacji
Wstęp
- Metoda ma na celu wprowadzenie plazmidów DNA do urothelium pęcherza moczowego u żywych myszy.
- Odpowiada ona na kluczowe pytania dotyczące progresji raka pęcherza moczowego.
- Tradycyjne wektory wirusowe budzą obawy w kwestii bezpieczeństwa i stwarzają bariery techniczne.
- Niniejsza metoda stanowi alternatywę dla dostarczania genów.
Cel badania
- W celu ułatwienia nadekspresji genów lub edycji genomu w komórkach pęcherza moczowego.
- W celu zbadania wpływu mutacji genetycznych na raka pęcherza moczowego.
- W celu poprawy wydajności metod dostarczania DNA.
Zastosowane metody
- Cewnikowanie cewki moczowej w celu dostarczenia plazmidu.
- Elektroporacja w celu zwiększenia poboru DNA.
- Zastosowanie in vivo w modelach mysich.
- Demonstracja przeprowadzona przez Ofira Stefansona i Yueli Liu.
Główne wyniki
- Skuteczne wprowadzenie plazmidów DNA do komórek urothelium.
- Szybka i wydajna metoda w porównaniu z wektorami wirusowymi.
- Potencjalne zastosowania w terapii genowej i badaniach nad nowotworami.
- Wykazana wykonalność w modelach żywych myszy.
Wnioski
- Metoda ta stanowi nowatorskie podejście do dostarczania genów do pęcherza moczowego.
- Ma ona znaczenie dla badania chorób i nowotworów pęcherza moczowego.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres jej zastosowań w terapii genowej.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda rozwiązuje kluczowy problem w badaniach nad rakiem pęcherza moczowego, umożliwiając szybkie, niewirusowe dostarczanie genów do urothelium in vivo. Wspiera ona walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez umożliwienie przejściowej nadekspresji lub wyciszenia genów kandydackich w systemie istotnym dla danej choroby. Podejście to przyspiesza generowanie modeli przedklinicznych, redukując czas i koszty w porównaniu z modelami linii zarodkowej, przy jednoczesnym zachowaniu istotności fizjologicznej dla badań translacyjnych.
Strategiczne Zastosowania w Badań i Rozwoju Biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia weryfikację hipotez terapeutycznych poprzez dostarczanie plazmidów do komórek urothelium pęcherza moczowego w celu funkcjonalnej modulacji genów.
- Wartość operacyjna: Stanowi szybką i wygodną alternatywę dla wektorów wirusowych, pozwalając uniknąć ograniczeń związanych z bezpieczeństwem biologicznym oraz opóźnień w produkcji.
- Wartość predykcyjna: Wspiera screening fenotypowy w kontekście tkanki natywnej, zwiększając pewność wyboru celów w szlakach sygnałowych raka pęcherza moczowego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje powtarzalne, mierzalne odczyty (np. ekspresję GFP) w celu oceny wydajności transfekcji oraz poziomów ekspresji genów.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje dostarczanie plazmidów poprzez kateteryzację i elektroporację, co umożliwia spójne przesiewy związków lub perturbacji genetycznych.
- Skalowalność: Ułatwia przygotowanie zwalidowanych modeli pęcherza do późniejszych analiz odpowiedzi na leki lub testów biomarkerów.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Tworzy autochtoniczne modele mysie, które odzwierciedlają mechanizmy inicjacji i progresji raka pęcherza moczowego.
- Wartość operacyjna: Umożliwia indukowalną modulację genów u dorosłych myszy, zapewniając kontrolę czasową w badaniach przedklinicznych.
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez testowanie efektów genetycznych w klinicznie istotnym układzie narządowym.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od etapu odkryć do badań przedklinicznych, umożliwiając szybką iterację od hipotezy dotyczącej celu do walidacji in vivo w tkance pęcherza moczowego.
- Biologia odkrywcza: Wspomaga wyjaśnianie szlaków sygnałowych i potwierdzanie celów poprzez bezpośrednią dostarczanie genów do przedziałów urotelialnych.
- Screening: Dostarcza ilościowych wyników fluorescencyjnych lub immunohistochemicznych służących do oceny wydajności transfekcji i modulacji genów.
- Analityka: Zapewnia mierzalne punkty końcowe (np. intensywność sygnału GFP, specyficzność typu komórek) w celu porównania warunków eksperymentalnych.
- Badania translacyjne: Umożliwia przedkliniczne modelowanie fenotypów raka pęcherza moczowego z wykorzystaniem genetycznie zmodyfikowanego urotelium.
- Ponowne wykorzystanie w organizacji: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do dostarczania genów dla wielu celów i badań w ramach analizy chorób urologicznych.
Wpływ operacyjny i organizacyjny
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez zmniejszenie zależności od sztucznych systemów nadekspresji.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność dzięki zestandaryzowanym parametrom chirurgicznym i elektroporacyjnym.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez przyspieszenie generowania modeli i zmniejszenie liczby niepowodzeń wynikających z błędnego wyboru celu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację celów w raku pęcherza moczowego z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o funkcjonalne dane in vivo.
Uwagi dotyczące implementacji
- Wymaga doświadczenia w zakresie mysich technik chirurgicznych, kaniulacji oraz elektroporacji.
- Zależne od sterylnych narzędzi chirurgicznych, generatora do elektroporacji oraz odpowiednich elektrod.
- Wymaga standaryzacji między zespołami w celu zapewnienia spójności objętości plazmidu, parametrów impulsu oraz ekspozycji pęcherza.
- Rozważania dotyczące adaptacji obejmują wielkość plazmidu, wybór promotora oraz tempo wymiany urothelium, co wpływa na czas trwania ekspresji.
- Ograniczenia praktyczne obejmują przejściową ekspresję (szczyt po 48 godzinach) oraz trudności techniczne w zachowaniu integralności pęcherza podczas procedur.
