Name: Izolacja zawartości rezerwuaru gruczołów żuchwowych od borneańskich eksplodujących mrówek (Formicidae) w celu analizy objętości za pomocą GC-MS i MetaboliteDetector (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Poznaj metodę izolacji zawartości gruczołów żuchwowych mrówek Colobopsis explodens z użyciem GC-MS i MetaboliteDetector. Protokół umożliwia profilowanie lotnych związków organicznych w badaniach ekologii chemicznej owadów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansowanie tego badania zostało uzyskane za pośrednictwem Wiedeńskiego Funduszu Nauki i Technologii (WWTF) LS13-048 do ISD. Specjalne podziękowania kierujemy do Diane W. Davidson (University of Utah; obecnie na emeryturze) za podzielenie się z nami swoją wiedzą na temat borneańskich mrówek COCY. Dziękujemy administracjom Centrum Badań Terenowych Kuala Belalong (KBFSC) i Universiti Brunei Darussalam (UBD) za zatwierdzenie projektu, a także Departamentowi Leśnictwa Brunei i Centrum Badań i Innowacji Brunei za pozwolenie na zbieranie mrówek oraz zatwierdzenie i wydanie pozwoleń na eksport. Specjalne podziękowania kierujemy do pracowników UBD i KBFSC, zwłaszcza Muhammada Salleha bin Abdullaha Bata, Teddy'ego Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rosli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei i Kushan Tennakoon za ułatwienie naszych badań.

<ol><li>Morgan, E. D. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/284889224_Chemical_sorcery_for_sociality_Exocrine_secretions_of_ants_Hymenoptera_Formicidae">Chemical sorcery for sociality: exocrine secretions of ants (Hymenoptera: Formicidae).</a> Myrmecol News. 11, 79-90 (2008).</li>
<li>Betz, O. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBetz%2C+O+%22Biological+adhesive+systems%22">Biological adhesive systems</a>. , Springer. 111-152 (2010).</li>
<li>Laciny, A., Zettel, H., Druzhinina, I. <a target="_blank" href="https://dez.pensoft.net/articles.php?id=9435">Workers, soldiers, and gynes-morphometric characterization and description of the female castes of Camponotus singularis (Smith, 1858)(Hymenoptera, Formicidae).</a> Deutsche Entomologische Zeitschrift. 63, 183(2016).</li>
<li>Ward, P. S., Blaimer, B. B., Fisher, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+revised+phylogenetic+classification+of+the+ant+subfamily+Formicinae+%28Hymenoptera%3A+Formicidae%29%2C+with+resurrection+of+the+genera+Colobopsis+and+Dinomyrmex%5BTitle%5D)+AND+%22Zootaxa%22%5BJournal%5D)">A revised phylogenetic classification of the ant subfamily Formicinae (Hymenoptera: Formicidae), with resurrection of the genera Colobopsis and Dinomyrmex.</a> Zootaxa. 4072 (3), 343-357 (2016).</li>
<li>Davidson, D. W., Salim, K. A., Billen, J. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1463-6395.2011.00523.x">Histology of structures used in territorial combat by Borneo's 'exploding ants'.</a> Acta Zoologica. 93 (4), 487-491 (2012).</li>
<li>Davidson, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/236962932_An_Experimental_Study_of_Microbial_Nest_Associates_of_Borneo's_Exploding_Ants_Camponotus_Colobopsis_species">An experimental study of microbial nest associates of Borneo's exploding ants (Camponotus [Colobopsis] species).</a> Journal of Hymenoptera Research. 18 (2), 341-360 (2009).</li>
<li>Laciny, A., et al. Colobopsis explodens sp.n., model species for studies on "exploding ants" (Hymenoptera, Formicidae), with biological notes and first illustrations of males of the Colobopsis cylindrica group. ZooKeys. , (2018).</li>
<li>Maschwitz, U., Maschwitz, E. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF01039798">Platzende Arbeiterinnen: eine neue Art der Feindabwehr bei sozialen Hautflüglern.</a> Oecologia. 14 (3), 289-294 (1974).</li>
<li>Davidson, D. W., Lessard, J. P., Bernau, C. R., Cook, S. C. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1744-7429.2007.00304.x/abstract">The tropical ant mosaic in a primary Bornean rain forest.</a> Biotropica. 39 (4), 468-475 (2007).</li>
<li>Martin, S., Drijfhout, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+ant+cuticular+hydrocarbons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+ecology%22%5BJournal%5D)">A review of ant cuticular hydrocarbons.</a> Journal of chemical ecology. 35 (10), 1151(2009).</li>
<li>Pickett, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-1-4684-8062-7_29">Chromatography and isolation of insect hormones and pheromones</a>. , Springer. 299-309 (1990).</li>
<li>Tragust, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ants+disinfect+fungus-exposed+brood+by+oral+uptake+and+spread+of+their+poison%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Ants disinfect fungus-exposed brood by oral uptake and spread of their poison.</a> Current Biology. 23 (1), 76-82 (2013).</li>
<li>Menzel, F., Blüthgen, N., Schmitt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tropical+parabiotic+ants%3A+highly+unusual+cuticular+substances+and+low+interspecific+discrimination%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Zoology%22%5BJournal%5D)">Tropical parabiotic ants: highly unusual cuticular substances and low interspecific discrimination.</a> Frontiers in Zoology. 5 (1), 16(2008).</li>
<li>Hogan, C. T., Jones, T. H., Zhukova, M., Sosa-Calvo, J., Adams, R. M. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0305197817300649">Novel mandibular gland volatiles from Apterostigma ants.</a> Biochemical Systematics and Ecology. 72, 56-62 (2017).</li>
<li>Augusto, F., Valente, A. L. P. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993602006027">Applications of solid-phase microextraction to chemical analysis of live biological samples.</a> TrAC Trends in Analytical Chemistry. 21 (6), 428-438 (2002).</li>
<li>Davidson, D. W., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/298305559_Nutrition_of_Borneo's_'Exploding'_Ants_Hymenoptera_Formicidae_Colobopsis_A_Preliminary_Assessment">Nutrition of Borneo's 'exploding' ants (Hymenoptera: Formicidae: Colobopsis): a preliminary assessment.</a> Biotropica. 48 (4), 518-527 (2016).</li>
<li>Jones, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemistry+of+exploding+ants%2C+Camponotus+spp.%28cylindricus+complex%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+ecology%22%5BJournal%5D)">The chemistry of exploding ants, Camponotus spp.(cylindricus complex).</a> Journal of chemical ecology. 30 (8), 1479-1492 (2004).</li>
<li>Voegtle, H. L., Jones, T. H., Davidson, D. W., Snelling, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E-2-ethylhexenal%2C+E-2-ethyl-2-hexenol%2C+mellein%2C+and+4-hydroxymellein+in+Camponotus+species+from+Brunei%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+chemical+ecology%22%5BJournal%5D)">E-2-ethylhexenal, E-2-ethyl-2-hexenol, mellein, and 4-hydroxymellein in Camponotus species from Brunei.</a> Journal of chemical ecology. 34 (2), 215-219 (2008).</li>
<li>Hiller, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MetaboliteDetector%3A+comprehensive+analysis+tool+for+targeted+and+nontargeted+GC%2FMS+based+metabolome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">MetaboliteDetector: comprehensive analysis tool for targeted and nontargeted GC/MS based metabolome analysis.</a> Analytical chemistry. 81 (9), 3429-3439 (2009).</li>
<li>Sumner, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+minimum+reporting+standards+for+chemical+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolomics%22%5BJournal%5D)">Proposed minimum reporting standards for chemical analysis.</a> Metabolomics. 3 (3), 211-221 (2007).</li>
<li>Stein, S. Retention indices by NIST mass Spec data Center. NIST Chemistry Webbook, NIST Standard Reference Base. (69), (2010).</li>
<li>NIST Chemistry WebBook. NIST Standard Reference Database Number 69. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://webbook.nist.gov/chemistry/">http://webbook.nist.gov/chemistry/</a> (2018).</li>
<li>Cook, S. C., Davidson, D. W. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/j.1570-7458.2006.00374.x">Nutritional and functional biology of exudate-feeding ants.</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 118 (1), 1-10 (2006).</li>
<li>Abdalla, F. C., Cruz-Landim, C. d <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dufour+glands+in+the+hymenopterans+%28Apidae%2C+Formicidae%2C+Vespidae%29%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Revista+Brasileira+de+Biologia%22%5BJournal%5D)">Dufour glands in the hymenopterans (Apidae, Formicidae, Vespidae): a review.</a> Revista Brasileira de Biologia. 61 (1), 95-106 (2001).</li>
<li>Hiller, K. MetaboliteDetector. Documentation. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation">http://metabolitedetector.tu-bs.de/wiki/index.php/Documentation</a> (2010).</li>
<li>Nieke, C. MetaboliteDetector - Development Version. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf">http://md.tu-bs.de/system/files/Downloads/MD-Development-Version-Documentation.pdf</a> (2012).</li>
<li>Hiller, K., Koschnitzki, N. MetaboliteDetector. Download. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10">http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</a> (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszym manuskrypcie przedstawiamy kompletny protokół analizy objętości zawartości znalezionej w przerośniętych MGR C. explodens minor worker mrants. Ponieważ użyte tutaj mrówki mogą "eksplodować" i wyrzucać zawartość MGR w niekontrolowany sposób po dotknięciu kleszczami, zaleca się stosowanie "miękkiej" techniki zbierania, dostarczonej przez aspirator do owadów (ryc. 1). W przypadku niektórych gatunków mrówek, w tym mrówek COCY, może być konieczne ograniczenie maksymalnej liczby mrówek do pięciu osobników na fiolkę o pojemności 50 ml, ponieważ w przeciwnym razie może dojść do samozatrucia mrówek (np . przez nagromadzenie kwasu mrówkowego w przestrzeni nad głową). Do zamrażania mrówek na polu można użyć chłodnej torby wypchanej głęboko mrożonymi zimnymi okładami. Próbki należy szybko zamrozić i przechowywać w chłodnych warunkach (np . -20 °C, najlepiej w temperaturze -80 °C), ale nie zaleca się zabijania i przechowywania mrówek w ciekłym azocie, ponieważ przy tej metodzie zaobserwowano zwiększone uszkodzenie ich gruczołów.
Przedstawiona metodologia preparacji bez buforu i rozpuszczalnika jest odpowiednia do uzyskania woskopodobnej zawartości zbiornika gruczołu żuchwowego, a także innych gruczołów obecnych u zamrożonych mrówek robotnic. W przypadku analizy objętościowej zawartości MGR w C. explodens, głównymi aspektami, które należy wziąć pod uwagę podczas sekcji, są ciągłe chłodzenie mrówki (krok 2.1.4) i minimalizacja zanieczyszczeń krzyżowych próbek MG z innymi zawartościami/płynami gruczołowymi obecnymi w gastrze mrówki (krok 2.5, rysunek 4 i rysunek 15). Znaczna część zamrożonych mrówek może zostać uszkodzona, ponieważ mrówki "eksplodowały" podczas pobierania próbek lub zostały uszkodzone podczas transportu na suchym lodzie z miejsca pobierania próbek do laboratorium. Jeśli obszar gastra jest uszkodzony, mrówki te nie nadają się do dalszej analizy (ryc. 2C, D). Jeśli brakuje tylko czułków i nóg lub są one złamane, mrówki te mogą być nadal wykorzystywane do ekstrakcji zawartości MGR i dalszej analizy. Ponieważ zawartość MGR w schłodzonych mrówkach C. explodens ma konsystencję podobną do wosku, łatwo jest je wyizolować za pomocą igieł preparacyjnych (krok 2.5, rysunek 3E i rysunek 14). Należy zachować dodatkową ostrożność podczas obchodzenia się z lepką zawartością MGR. Może przyklejać się do wszystkiego, co ma z nim kontakt fizyczny, a także często przylega do kleszczy preparacyjnych, co zwiększa ryzyko zanieczyszczenia innych próbek. Konieczne jest jedynie dotknięcie zawartości MGR igłą do preparacji i natychmiastowe przeniesienie jej do szklanych fiolek używanych do ekstrakcji (kroki 2.5 i 2.6). Ponadto zaleca się czyszczenie sprzętu do preparacji mieszaniną MeOH/H2Opodczas przełączania między mrówkami lub typami gruczołów (krok 2.8).
Zawartość gruczołów innych gatunków mrówek może być obecna w stanie ciekłym nawet podczas chłodzenia zimnymi okładami. W takim przypadku cały dławik wraz z membraną może być najpierw odizolowany, a następnie przekłuty w celu uzyskania zawartości. Płynne wydzieliny można również uzyskać za pomocą cienkich pipet kapilarnych. Przy średniej długości ciała około 4-5 mm (bez czułków) robotnice C. explodens należą do mniejszych gatunków z grupy COCY. Ich często spuchnięty gaster ma około 2-2,5 mm długości i 1-1,5 mm szerokości. Robotnice dotychczas największego znanego gatunku z grupy COCY mogą osiągać wielkość około 8 mm długości ciała przy rozmiarze gaster około 3 mm długości i 2,5 mm szerokości. Ponieważ protokół jest dobrze przystosowany do preparowania i badania pojedynczych mrówek i ras tej wielkości różnych gatunków COCY, użyte tutaj narzędzia do preparacji i mikroskop mogą wymagać dostosowania do stosowania w przypadku mniejszych mrówek lub mniejszych narządów. Co więcej, konieczne może być również zwiększenie liczby mrówek w próbce analitycznej.
Podczas preparowania mrówki pod kątem zawartości MGR bardzo ważne jest, aby nie uszkodzić żadnych innych gruczołów ani jelit - których zawartość może spowodować zanieczyszczenie krzyżowe próbki (krok 2.5, rysunek 4 i rysunek 15). W optymalnym przypadku, po ekstrakcji zawartości MGR, DG oraz VG są w widoczny sposób utrzymywane w stanie nienaruszonym (ryc. 4). Zanieczyszczenia zawartością DG, która znajduje się pod MGR, są trudne do całkowitego uniknięcia. Przyczyną takiego stanu rzeczy może być również częściowe naruszenie integralności gruczołu podczas transportu na suchym lodzie z miejsca pobierania próbek do laboratorium. Możliwe jest również, że DG ulegną uszkodzeniu podczas pobierania próbek lub w procesie eksplozji, jak zauważyliśmy w przypadku MGR u wielu badanych mrówek. Ponieważ zawartość DG może być analizowana w taki sam sposób, jak zawartość MGR (sekcje 3 i 4), wyniki można porównać z danymi wynikowymi po analizie próbek zawartości MGR (sekcja 6). W przypadku ekstraktów zawierających MGR otrzymanych z mrówek C. explodens, związki zawarte również w DG zaczynają eluować późno w chromatogramie (ryc. 12). Aby zapobiec pomyleniu związków DG ze składnikami MGR, odpowiednie metabolity można wykluczyć z dalszej analizy. Z badań nad innymi gatunkami mrówek wiadomo, że DG mogą również zawierać (wysoko) lotne związki 1,24, które zazwyczaj eluują się na wczesnym etapie chromatogramu GC.
W poprzednich badaniach dotyczących składu chemicznego zawartości MGR w mrówkach COCY, analizowano całe mrówki lub ich całe gastry 16,17,18,23, podczas gdy tutaj samą zawartość MGR uzyskano poprzez rozbiór mrówek.
Analiza wypreparowanej zawartości MGR pozwala badaczom na przeprowadzenie szerokiego zakresu badań biochemicznych, w tym identyfikację zawartych w nim metabolitów. Z uwagi na to, że przeprowadzone badania koncentrowały się na identyfikacji składników lotnych zawartych w MGR C. explodens, do jego analizy wybrano GC-MS (sekcja 4). W tym celu ekstrakty najlepiej odmierzać natychmiast po przygotowaniu lub przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu analizy. Należy zauważyć, że (przedłużone) przechowywanie może powodować zmiany chemiczne ekstraktów (patrz uwagi po krokach 3.3 i 4.2). Ponieważ stężenie zawartości MGR może obejmować zakres kilku rzędów wielkości, może być konieczna analiza ekstraktów MGR przy różnych proporcjach podziału GC. Ponieważ dwa główne związki w ekstrakcie MRR z mrówek pobranym w celu zilustrowania protokołu powodowały przeciążenie kolumny, gdy zastosowano stosunek podziału 2:1, próbka ta została przeanalizowana po raz drugi przy wyższym stosunku podziału 50:1 (krok 4.3.1.2 i rysunek 5). Ustawienia parametrów GC-MS przedstawione w rozdziale 4 są odpowiednie dla danych generowanych za pomocą urządzeń GC-MS określonych w Tabeli materiałów. Obok kalibrantów RI (krok 4.1.1) należy również przeanalizować ślepą próbę rozpuszczalnika (krok 4.1.2) w celu rozpoznania niebiologicznych artefaktów i zanieczyszczeń podczas późniejszej analizy danych. W celu identyfikacji metabolitów ważne jest również zmierzenie autentycznych wzorców związków opatrzonych adnotacjami w tych samych warunkach GC-MS, jakie są stosowane do analizy ekstraktów próbek (kroki 5.4.7 i następne). Aby poprawić dokładność i wiarygodność danych końcowych, zaleca się analizowanie wszystkich kategorii próbek (ślepa próba rozpuszczalnika, kalibry RI, ekstrakty próbek i wzorce) w ramach tej samej sekwencji pomiarowej. Ponadto autentyczne wzorce powinny być analizowane w stężeniu porównywalnym do stężenia obserwowanego dla ekstraktów próbek. Pomaga to zwiększyć dokładność wartości RI i podobieństwo między próbką a standardowymi widmami masowymi, co ostatecznie doprowadzi do zwiększonej i bardziej znaczącej adnotacji/identyfikacji metabolitów. W tym celu normy mogą być wielokrotnie mierzone przy użyciu różnych współczynników podziału.
Do identyfikacji metabolitów wykorzystuje się zaawansowane oprogramowanie MetaboliteDetector do dekonwolucji widm oraz RI i porównywania widm z zaimplementowaną biblioteką NIST, a także z ustaloną biblioteką wewnętrzną (sekcja 5). Zaleca się uruchomienie MetaboliteDetector na 64 bitowym systemie operacyjnym opartym na systemie operacyjnym LINUX (np. KUBUNTU) i skopiowanie wygenerowanego *. CDF (krok 4.4) z przenośnego urządzenia do przechowywania danych na lokalny dysk twardy. MetaboliteDetector jest w stanie importować surowe dane GC-MS w formacie centroid lub profile netCDF. Oprogramowanie większości instrumentów GC-MS powinno być w stanie przekonwertować zarejestrowane surowe dane do tego formatu19. Przed rozpoczęciem analizy danych zdecydowanie zaleca się zapoznanie się z literaturą dostępną dla poprzednich wersji oprogramowania MetaboliteDetector w celu zapoznania się z funkcjami i graficznym interfejsem użytkownika 19,25,26.
Do kalibracji RI i późniejszego obliczania wartości RI pików związków obecnych w ekstraktach próbek stosuje się bibliotekę zawierającą RI i widma kalibrantów RI (w tym przypadku n-alkanów). Biblioteka taka może być albo tworzona przez samego siebie, albo może zostać pobrana już istniejąca ("CalibrationLibrary_Alkanes")27. Dostarczona domyślna biblioteka calibrant zawiera RI i widma dla n-alkanów w zakresie od C09 do C39, które zostały przeanalizowane zgodnie z opisem w sekcji 4. Udostępniona biblioteka umożliwia użytkownikom pracującym z detektorem metabolitów bezpośrednie rozpoczęcie procesu kalibracji swoich danych. W razie potrzeby biblioteka ta może być również rozszerzona o dodatkowe wpisy dla kolejnych alkanów. Na podstawie podobieństwa referencyjnych i eksperymentalnie wyprowadzonych RI oraz widm masowych (patrz krok 5.3 i podetapy, rysunek 7, rysunek 8, rysunek 9), można przeprowadzić adnotację lub identyfikację związków (krok 5.4 i podetapy, rysunek 11). Istotne jest również, aby po zautomatyzowanym przetwarzaniu danych za pomocą MetaboliteDetector, użytkownik ręcznie sprawdzał, czy piki są prawidłowo wybierane i dekonwolucje widma, sprawdzając widma masowe leżące pod "trójkątem" dla każdego przypuszczalnego związku będącego przedmiotem zainteresowania. Ponadto, w zależności od oprzyrządowania GC-MS i ustawień parametrów wykorzystywanych do generowania danych, konieczne mogą być adaptacje prezentowanych ustawień MetaboliteDetector. Oprogramowanie MetaboliteDetector jest w stanie wykonać o wiele więcej użytecznych operacji niż wyjaśniono w tym manuspekcie, np. wyświetlanie chromatogramów wyekstrahowanego prądu jonowego (EIC), eksport chromatogramów jako .csv, automatyczna kwantyfikacja partii związków i wiele innych.
Protokół przedstawiony w tym manuskrypcie może służyć jako sugestia dla eksperymentów przeprowadzanych przez innych badaczy koncentrujących się na izolacji gruczołów lub zawartości gruczołów od owadów, analizie lotylomu, a także identyfikacji metabolitów.

Ogólnym celem przedstawionego tutaj przepływu pracy jest ogólne badanie składu chemicznego w wydzielinach owadów. Odbywa się to przede wszystkim w celu wyjaśnienia ekologicznych ról wydzieliny jako całości lub jej pojedynczych związków. Ponadto jesteśmy zainteresowani badaniem szlaków metabolicznych leżących u podstaw związków znajdujących się w odpowiednich wydzielinach. Szczególnie zawartość gruczołów mrówek (Hymenoptera, Formicidae) zyskała w ostatnich latach coraz większe zainteresowanie, ponieważ stanowi źródło dotychczas niezbadanych związków potencjalnie bioaktywnych (klejów, środków przeciwdrobnoustrojowych itp.)1,2. Drobne mrówki robotnice niektórych gatunków należących do grupy COCY3,4 mogą dostarczać takich związków zawartych w ich przerośniętych MGR, które rozciągają się od aparatu gębowego do gaster5,6. W przypadku zagrożenia ze strony domniemanych wrogów, pomniejsze robotnice C. explodens7 i niektóre pokrewne gatunki mogą wykorzystać zawartość MGR w nietypowy sposób: Poświęcają się, rozrywając ścianę gastralną, aby wyrzucić lepką zawartość MGR wybuchowo na przeciwnika, po czym domniemany wróg zostaje zatrzymany i może nawet zginąć5, 6,8,9. Celem opracowania i zastosowania przedstawionych w niniejszym artykule metod było pogłębienie wiedzy na temat składu chemicznego i charakteru wstępnie toksycznych składników tej wydzieliny mrówek.
W tym celu przedstawiamy protokół do sekcji mrówek robotnic C. eksplodujących, aby uzyskać gastralną część ich woskowej zawartości MGR, a następnie ekstrakcję rozpuszczalnikiem i analizę za pomocą GC-MS.
Analiza GC-MS jest jedną z dobrze znanych metod profilowania i identyfikacji lotnych metabolitów (volatilome) owadów. Typowe anality interesujące mrówki to węglowodory kutykularne10, semiochemicals11 i ogólnie związki o aktywności biologicznej12. Próbki można pobrać z całych zwierząt lub z części ciała i płynów wyizolowanych przez sekcję owada13,14. Techniki przygotowania próbek obejmują ekstrakcję zawartych w nich metabolitów za pomocą rozpuszczalników14 lub mikroekstrakcji do fazy stałej (HS-SPME)15.
Dla badań metabolomicznych ważne jest, aby próbki były szybko zamrażane bezpośrednio po pobraniu próbek, aby zminimalizować zmiany w składzie chemicznym i ilości związków. Mrówki użyte w tym badaniu zostały zabite przez szybkie zamrożenie na miejscu w chłodnej torbie wypełnionej głęboko zamrożonymi zimnymi okładami. Próbki były następnie przechowywane w zamrażarce o temperaturze -20 °C przy użyciu energii elektrycznej napędzanej generatorem, zanim zostały przetransportowane do laboratorium na suchym lodzie. Przedstawiona tutaj procedura preparacji daje możliwość wyizolowania zawartości MGR bez analizowania całej mrówki lub gastera jako całości, jak to miało miejsce wcześniej dla różnych gatunków COCY16,17,18. Co więcej, przedstawiony protokół umożliwia również bezpośredni dostęp i analizę otaczających gruczołów i tkanek, takich jak gruczoł jadowy (VG)5,8, gruczoł Dufoura (DG)8, lub jelita w innych badaniach biologicznych, lub w celu sprawdzenia, czy nie ma ewentualnych zanieczyszczeń krzyżowych wprowadzonych podczas obchodzenia się z mrówkami lub ich sekcji. Aby zminimalizować zmiany w składzie chemicznym zawartości MGR podczas preparacji, zarówno poprzez rozmrażanie próbek, jak i przy użyciu środków chemicznych, proces rozwarstwiania został zoptymalizowany tak, aby można go było przeprowadzić na zimnym opakowaniu (-20 °C), bez użycia dodatkowych, roztworów myjących lub rozpuszczalników. Próbki uzyskane tą metodą nadają się do udzielania odpowiedzi na pytania jakościowe i ilościowe.
Analiza danych w celu przypuszczalnej adnotacji i identyfikacji metabolitów odbywa się za pomocą oprogramowania open-source MetaboliteDetector19, które zostało opracowane do automatycznej analizy danych metabolomicznych opartych na GC-MS. Wykrywa pojedyncze piki jonowe obecne na chromatogramach, przeprowadza etap dekonwolucji i ekstrahuje zdekonwolucyjne widma masowe związków chemicznych zawartych w analizowanych próbkach. Przypuszczalna identyfikacja związków za pomocą MetaboliteDetector opiera się na wyznaczonym wskaźniku retencji (RI; RI Kovatsa może być obliczany automatycznie przez oprogramowanie), a także podobieństwie zdekonwoluowanych widm masowych. RI i współczynnik dopasowania spektralnego mogą być porównywane z istniejącymi bibliotekami referencyjnymi (które można zaimportować, jeśli są w powszechnym formacie NIST) lub z ustaloną biblioteką wewnętrzną. Jest to zgodne z wytycznymi dotyczącymi (przypuszczalnej) identyfikacji związków sugerowanymi np. przez Grupę Roboczą ds. Analizy Chemicznej (CAWG) Inicjatywy Standardów Metabolomicznych (MSI), gdzie co najmniej dwa niezależne i ortogonalne dane dotyczące autentycznego związku (w tym przypadku czas retencji (RT)/RI i widmo masowe) analizowane w identycznych warunkach eksperymentalnych są proponowane jako niezbędne do potwierdzenia identyfikacji metabolitów niebędących nowymi20.
Kompletny eksperyment jest przeprowadzany na zawartości MGR w modelu COCY gatunku C. explodens, ale etapy sekcji mogą być również dostosowane do izolacji innych gruczołów obecnych w mrówce. Ponadto, chociaż przedstawiamy protokół kompleksowej analizy objętości zawartości MGR, bardziej ogólne części przepływu pracy opisujące ekstrakcję, pomiar GC-MS i ocenę danych mogą być również wykorzystywane do analizy i (przypuszczalnej) identyfikacji lotnych metabolitów w ogóle.
Ponieważ eksperymenty opisane w tym manuskrypcie są przeprowadzane na owadach, nie jest wymagana etyczna zgoda. Prace terenowe, pobieranie próbek mrówek, a także ich wykorzystanie do publikacji są zgodne z wytycznymi regulującymi ten projekt przez Universiti Brunei Darussalam, Centrum Badań i Innowacji Brunei oraz Departament Leśnictwa Brunei, Brunei Darussalam.

<table><tbody><tr><td>Rurka 50 ml, 115 x 28 mm, płaska/stożkowa podstawa PP</td><td>Sarstedt</td><td>62,559,001</td><td>patrz rysunek 1 w rękopisie</td></tr><tr><td>Rurki PVC</td><td>Rehau</td><td>290 4489</td><td>patrz rysunek 1 w rękopisie</td></tr><tr><td>Siatka, stal nierdzewna, rozmiar oczek 0,63 mm</td><td>Antstore</td><td>1000378</td><td>patrz rysunek 1 w rękopisie</td></tr><tr><td>Zamrażarka</td><td>Severin</td><td>KS 9890</td><td>&nbsp;-20 &deg; Skrzynka</td></tr> z <tr><td>pianki polistyrenowej C lub niższa, wymiary wewnętrzne 155 mm x 100 mm x 45 mm</td><td>Szalka Petriego Thorsten Koch</td><td>4260308590481</td><td></td></tr><tr><td>, szkło, 100 mm x 15 mm</td><td>Aldrich</td><td>BR455742</td><td></td></tr><tr><td>Opakowanie na zimno 150 mm x 100 mm</td><td>Elite Bags</td><td>1998</td><td>zamrażanie do -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Wiadro z kruszonym lodem</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 ml Fiolki z krótkim gwintem, 32 x 11,6 mm, przezroczyste szkło, 1. klasa hydrolityczna, szeroki otwór</td><td>La-Pha-Pack</td><td>11090500</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętki do 1,5 ml Fiolki z krótkim gwintem, zamknięte, Silikon biały/PTFE czerwona przegroda, 55&deg; Shore A, 1,0 mm</td><td>La-Pha-Pack</td><td>9151799</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Bresser</td><td>5806100</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, bardzo cienka końcówka zakrzywiona</td><td>Medizinische Instrumente May, Norman May</td><td>PI-0005B</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze, bardzo cienka końcówka</td><td>prosta niebieskaINOX</td><td>BL-3408</td><td></td></tr><tr><td>Igła do preparowania 140 mm, spiczasta, prosta</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1110301</td><td></td></tr><tr><td>Metanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Ha&euml; n</td><td>fisher scientific</td><td>15654740</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td></td><td></td><td></td>destylowana</tr><tr><td>Rotizell-Tissue-T&uuml; cher</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>0087.2</td><td></td></tr><tr><td>Ester etylowy kwasu octowego ROTISOLV &ge; 99,8 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>4442.1</td><td>zamrożenie do -20 stopni; C</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>neoLab</td><td>7-0092</td><td></td></tr><tr><td>0,1 ml mikrowkładki do 1,5 ml fiolki z krótkim gwintem, 31 x 6 mm, szkło bezbarwne, 1. klasa hydrolityczna, końcówka 15 mm&nbsp;</td><td>La-Pha-Pack</td><td>06090357</td><td></td></tr><tr><td>Zakrętki do fiolek z krótkim gwintem 1,5 ml, z otworem, przegroda RedRubber/PTFE,&nbsp; 45&deg; shore A, 1,0 mm</td><td>La-Pha-Pack</td><td>9151819</td><td></td></tr><tr><td>Alkanowy roztwór wzorcowy C8-C20</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>04070</td><td></td></tr><tr><td>Wzorcowy roztwór alkanów C21-C40</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>04071</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexane SupraSolv</td><td>Merck</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>GC-autosampler, np. MPS2XL-Twister</td><td>Gerstel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent Chromatograf gazowy 6890 N</td><td>Agilent Gooseneck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>splitless Liner</td><td>Restek</td><td>22406</td><td></td></tr><tr><td>Helium (5.0 - F50)</td><td>Messer</td><td>102532501</td><td></td></tr><tr><td>Kolumna kapilarna GC HP-5MS UI 30 m i razy; 0,25 mm i razy; 0,25 &mikro; m</td><td>Agilent</td><td>19091S-433UI</td><td></td></tr><tr><td>Selektywny detektor masy Agilent 5975B</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD ChemStation Oprogramowanie aplikacyjne&nbsp;</td><td>Oprogramowanie Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaboliteDetector (3.1.Lisa20170127Ra-Linux)</td><td>Hiller K</td><td></td><td>do pobrania z: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</td></tr><tr><td>Biblioteka kalibracji dla MetaboliteDetector</td><td>Hiller K</td><td></td><td>do pobrania z: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</td></tr><tr><td>MD Conversion Tool dla biblioteki</td><td>NIST Hiller K</td><td></td><td>do pobrania z: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</td></tr></tbody></table>

izolacja zawartości rezerwuaru gruczołów żuchwowych od borneańskich "eksplodujących mrówek" (formicidae) w celu analizy objętości za pomocą gc-ms i metabolitedetector

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Celem tego manuskryptu jest przedstawienie protokołu opisującego analizę metabolomiczną borneańskich 'eksplodujących mrówek' należących do grupy Colobopsis cylindrica (COCY). W tym celu stosuje się model gatunku C. explodens. Mrówki należące do kasty drobnych robotnic posiadają charakterystyczne przerośnięte gruczoły żuchwy (MG). W walce terytorialnej wykorzystują lepką zawartość swoich powiększonych zbiorników gruczołów żuchwowych (MGR) do zabijania rywalizujących stawonogów w charakterystycznych samobójczych "eksplozjach" poprzez dobrowolne pęknięcie powłoki gastralnej (autotyza). Pokazujemy sekcję mrówek robotnic tego gatunku w celu wyizolowania części gastralnej woskopodobnej zawartości MGR, a także wymieniamy niezbędne kroki wymagane do ekstrakcji rozpuszczalnikiem zawartych w nich związków lotnych, a następnie analizę chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS) i przypuszczalną identyfikację metabolitów zawartych w ekstrakcie. Procedura preparacji jest wykonywana w chłodnych warunkach i bez użycia jakiegokolwiek roztworu buforowego do rozwarstwiania w celu zminimalizowania zmian w składzie chemicznym zawartości MGR. Po ekstrakcji lotnych metabolitów zawartych w tym roztworze na bazie rozpuszczalnika, przedstawiono etapy niezbędne do analizy próbek za pomocą iniekcji cieczy GC-MS. Na koniec przedstawiono przetwarzanie danych i przypuszczalną identyfikację metabolitów za pomocą oprogramowania open source MetaboliteDetector. Dzięki takiemu podejściu możliwe staje się profilowanie i identyfikacja lotnych metabolitów w MGR mrówek należących do grupy COCY za pomocą GC-MS i oprogramowania MetaboliteDetector.

Niepełnoletni robotnicy gatunku mrówek Colobopsis explodens są preparowani w celu wyizolowania woskowej zawartości przechowywanej w ich przerośniętych zbiornikach gruczołów żuchwowych w celu późniejszej ekstrakcji rozpuszczalnikiem i analizy za pomocą chromatografii gazowej i spektrometrii mas. Opisano również adnotację i identyfikację składników lotnych za pomocą oprogramowania open source MetaboliteDetector.

Izolacja zawartości rezerwuaru gruczołów żuchwowych od borneańskich "eksplodujących mrówek" (Formicidae) w celu analizy objętości za pomocą GC-MS i MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolomiki owadów. Podejście oparte na profilowaniu metabolitów można wykorzystać do badania ekologii chemicznej mrówek poprzez wyjaśnienie roli substancji lotnych w interakcji z innymi organizmami. Główną zaletą prezentowanego przepływu pracy jest to, że składa się on z dwóch odrębnych części, które w zasadzie mogą być stosowane niezależnie.Po pierwsze, fizyczna izolacja zbiornika gruczołu żuchwy i jego zawartości, a po drugie, nieukierunkowane profilowanie i identyfikacja lotnych składników organicznych w próbce biologicznej będącej przedmiotem zainteresowania. Procedurę zademonstruje Michaela Hoenigsberger, utalentowana doktorantka z mojego laboratorium. Przed sekcją mrówek, w dygestorium, wyczyść szklaną szalkę Petriego i narzędzia do preparowania za pomocą chusteczek papierowych i mieszaniny metanolu i wody jeden plus jeden objętościowo.Przechowuj naczynie w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie weź masę 1,5 mililitrowych fiolek z krótkim gwintem, w tym ich zakrętki, które zawierają silikonową przegrodę PTFE. Przechowywać fiolki na lodzie.Następnie umieść zamrożony ciągliwy zimny okład w pudełku z pianki polistyrenowej. Następnie załaduj szalkę Petriego na wierzch zimnego opakowania i włóż do naczynia zamrożoną mrówkę. Teraz zbadaj mrówkę za pomocą mikroskopu stereoskopowego.Sprawdź integralność jego komór gastralnych. Mrówka musi mieć nienaruszony obszar gasterowy. Nie używaj mrówek z płaskimi gastrem lub śladami stwardniałej zawartości zbiornika gruczołu żuchwowego na powierzchni ich ciała.Teraz odizoluj zawartość zbiornika gruczołu żuchwowego od mrówki. Użyj kleszczy, aby chwycić propodium i ogonek, a następnie delikatnie rozsuń te segmenty ciała. Następnie chwyć gaster na tergicie czwartym za pomocą cienkich kleszczy.Za pomocą kolejnej pary kleszczy chwyć tergit jeden i delikatnie usuń tergit, odrywając go. Powtórz ten proces, aby oderwać tergity dwa i trzy, tak aby część żołądkowa zbiorników gruczołu żuchwowego była w większości widoczna. Zbiorniki gruczołów żuchwowych są koloru żółtego u mrówek robotnic C.Explodens, ale kolor może wahać się od białego przez żółty do czerwonego u innych gatunków.Następnie, za pomocą igły preparucyjnej, delikatnie usuń woskopodobną zawartość sparowanych zbiorników gruczołu żuchwowego, wydrapując je z komory gastralnej. Zawartość zbiornika gruczołu żuchwy należy usuwać tylko te części, które można odizolować bez wywierania nacisku na inne gruczoły i struktury ciała obecne w mięśniu mrówki. Nie jest konieczne zbieranie całej zawartości zbiornika gruczołu żuchwowego.Teraz podnieś zawartość zbiornika gruczołu żuchwowego, delikatnie dotykając jej końcówką igły do preparacji, aż się do niej przyklei. Następnie przenieś zawartość gruczołu do zimnej fiolki z krótkim gwintem o pojemności 1,5 mililitra. Może być konieczne przesunięcie końcówki igły wzdłuż ścianki fiolki i rozsmarowanie zawartości gruczołu na ściance fiolki.Przechowuj kolekcję pod przykryciem i na lodzie, dopóki nie będzie można jej przeanalizować. Pomiędzy sekcjami ponownie wyczyść narzędzia i naczynie mieszanką metanolu i wody. Aby uzyskać jedną próbkę analityczną, należy połączyć zawartość zbiornika gruczołu wielu mrówek.W tym przypadku zawartość gruczołu pięciu mrówek robotnic C.explodens jest łączona. Do kontroli należy pobrać próbki składające się z gruczołu Dufoura, który przylega do zbiorników gruczołu żuchwowego. Przed ekstrakcją zawartości gruczołowej należy określić masę próbek analitycznych.Następnie dodaj 14 części objętościowo lodowatego octanu etylu o wysokiej czystości do jednej części masowej tkanki. Wirować preparat przez pięć minut w schłodzonych warunkach. Następnie odwirować próbki przez 10 minut i zebrać supernatanty.Oczekuje się, że z próbki pięciu mrówek pojawi się około 55 do 75 mikrolitrów supernatantu. Przenieść każdy supernatant do wstępnie schłodzonej fiolki z krótkim gwintem o pojemności 1,5 mililitra z mikrowkładką o pojemności 0,1 mililitra i szczelnie zamknąć fiolki za pomocą zakrętek zawierających otwory i czerwonej gumowej przegrody PTFE. Aby uzyskać pełną sekwencję pomiarową GCMS, przygotuj 1,5-mililitrową fiolkę z krótkim gwintem z mieszaniną kalibrującą wskaźnik retencji, wykonaną przez rozcieńczenie dostępnych w handlu roztworów wzorcowych alkanów w heksanie, do ośmiu miligramów na mililitr na związek.Następnie należy przygotować kolejną fiolkę z czystym octanem etylu, która posłuży jako ślepa próba rozpuszczalnika. Na schłodzoną tacę autosamplera chromatografu gazowego załaduj najpierw ślepą próbę rozpuszczalnika, następnie mieszaninę kalibru o wskaźniku retencji, trzecią ekstrakt zawartości gruczołu żuchwy, a po czwarte, ekstrakt zawartości gruczołu Dufoura. Umieścić próbki z tacką na lodzie w celu transportu do chromatografu gazowego.Włóż tackę do chłodzonego automatycznego podajnika próbek Dla każdej próbki wstrzyknąć jeden mikrolitr płynu do specyfikacji masowej GC w celu separacji chromatograficznej na kolumnie odpowiedniej dla związków docelowych. Takich jak kolumna interfejsu użytkownika HP-5MS.Następnie należy ustawić odpowiednie parametry GC. Na przykład użyj helu w gazie nośnym o stałym przepływie kolumny wynoszącym jeden mililitr na minutę. Użyj rampy temperatury piekarnika, zaczynając od 40 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie rampy od 10 stopni Celsjusza na minutę do 330 stopni Celsjusza.Po czym następuje siedmiominutowe wstrzymanie. Przy tych parametrach ustaw temperaturę na wlocie na 270 stopni Celsjusza. Teraz, jeśli to konieczne, dostosuj współczynniki podziału dla specyfikacji masy GC.iniekcji, tak aby zapewniały odpowiednie kształty pików i intensywność dla interesujących związków. Ustaw temperaturę pomocniczą na 350 stopni Celsjusza. Dla specyfikacji masy.Użyj następujących parametrów. Temperatura źródła MS wynosi 230 stopni Celsjusza, temperatura poczwórna MS wynosi 150 stopni Celsjusza, zakres skanowania od niskiej masy 30 do dużej masy 500, co daje szybkość skanowania około trzech skanów na sekundę. oraz opóźnienie rozpuszczalnika wynoszące 4,1 minuty dla ślepej próby rozpuszczalnika i próbek doświadczalnych lub opóźnienie rozpuszczalnika wynoszące 6,1 minuty dla mieszaniny kalibru o wskaźniku retencji.Po zakończeniu pomiarów otwórz oprogramowanie do analizy danych GCMS i wyeksportuj dane jako plik projektu AIA na przenośne urządzenie pamięci masowej, aby ułatwić transfer danych do komputera z 64-bitowym systemem operacyjnym opartym na systemie Linux. Aby przeanalizować dane, postępuj zgodnie z opisem tekstowym protokołu dotyczącym użycia oprogramowania detektora metabolitów. W terenie mrówki zbierano i zamrażano w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwa dni, a następnie przechowywano w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu ich analizy.Zawartość zbiornika gruczołu żuchwowego od pięciu mrówek robotnic C.explodens zebrano i zmierzono za pomocą GCMS. Analiza danych ujawniła dziesiątki przypuszczalnych związków zawartości gruczołów. Dwa dominujące metabolity w ekstrakcie z zawartości zbiornika gruczołu żuchwowego powodowały przeciążenie kolumny.Dlatego ta sama próbka została ponownie przeanalizowana przy wyższym stosunku podziału 50 do jednego. Zanieczyszczenie krzyżowe zawartości rezerwuaru gruczołu żuchwowego przez skład gruczołu Dufoura zbadano poprzez pobranie próbek gruczołu Dufoura do zbadania. Takie zanieczyszczenia wykazywały późny czas retencji, zaczynający się od około 29 minut.Wykryte przypuszczalne metabolity zawarte w rezerwuarze gruczołu żuchwy zidentyfikowano na podstawie kombinacji podobieństwa widma i wskaźnika retencji do biblioteki wewnętrznej. W ten sposób udało się potwierdzić tożsamość około 10% wykrytych metabolitów, z których część jest wymieniona jako związki od jednego do pięciu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować, ekstrahować i oznaczać, pojedynczo metabolity, wybierając pomiar MS.Po opanowaniu, izolacja, ekstrakcja rozpuszczalnikiem i akwizycja danych tej samej próbki mogą być wykonane w ciągu około dwóch godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. W zależności od złożoności profilu lotnych związków organicznych, czas potrzebny na ocenę danych będzie się różnił. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby próbka była stale chłodzona, od pobrania do analizy.Ponadto przed sekcją należy sprawdzić, czy gaster mrówki jest fizycznie nienaruszony. Procedura ta może być również połączona z porównawczą lub bezwzględną kwantyfikacją metabolitów, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak skład metaboliczny i różne warunki środowiskowe lub bezwzględne ilości składnika w puszkach. Dogodnie, etapy ekstrakcji, pomiaru i oceny danych tego protokołu mogą być również stosowane do wielu systemów biologicznych, takich jak inne owady, mikroorganizmy lub rośliny.

isolation-mandibular-gland-reservoir-contents-from-bornean-exploding

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Przedstawiono metodę szybkiego przesiewania substancji lotnych roślin żywicielskich poprzez pomiar odpowiedzi elektrofizjologicznej czułków dorosłych osobników omacnicy brzoskwiniowej (Amyelois transitella) na pojedyncze składniki oraz mieszaniny za pomocą analizy elektroantenograficznej.

Bioassay elektroantenograficzny jako narzędzie przesiewowe dla lotnych substancji rośliny żywicielskiej

Bodźce węchowe pośredniczą w wielu różnych zachowaniach owadów i często stanowią złożone mieszaniny składające się z dziesiątek lub setek lotnych związków. Wykorzystując chromatografię gazową z wielokanałowym zapisem w płacie antenalnym owada, opisujemy metodę identyfikacji związków biologicznie czynnych.

Identyfikacja lotnych substancji zapachowych przy użyciu chromatografii gazowej z wielokanałowym zapisem (GCMR) w płacie antenalnym owada

Gruczoły roślinne to wyspecjalizowane struktury odpowiedzialne za biosyntezę i wydzielanie wielu związków biorących udział w interakcjach ze środowiskiem biotycznym. Aby umożliwić badania nad ich cechami molekularnymi i biochemicznymi, opracowano technikę mechanicznego mikroprzygotowania w celu wyizolowania pojedynczych gruczołów aktywnych metabolicznie, w tym przypadku z mięsożernej rośliny Nepenthes.

Izolacja żywotnych gruczołów wielokomórkowych z tkanki rośliny mięsożernej, Dzbanecznik

Ten protokół opisuje, jak przygotować larwy Drosophila do analizy metabolomicznej opartej na GC-MS.

Przygotowanie próbek larw Drosophila do metabolomiki opartej na chromatografii gazowej i spektrometrii mas (GC-MS)

Zaoferowaliśmy mangustom placebo doustne przynęty przeciwko wściekliźnie z kwasem etylowym lub metylowym jofenoksynowym jako biomarkerem i zweryfikowaliśmy wykorzystanie przynęty za pomocą nowatorskiej metody chromatografii cieczowej z tandemową spektrometrią mas (LC-MS/MS).

Analiza analogów kwasu jofenoksynowego w małych surowicach mangusty indyjskiej (Herpestes auropunctatus) do stosowania jako doustny marker biologiczny szczepienia przeciwko wściekliźnie

Opracowaliśmy skuteczną metodologię pobierania próbek i analizy sygnałów zapachowych, aby zrozumieć, jak mogą być one wykorzystywane w komunikacji zwierząt. W szczególności stosujemy mikroekstrakcję do fazy stałej w połączeniu z chromatografią gazową ze spektrometrią mas do analizy lotnych składników zapachów zwierzęcych i oznaczeń zapachowych.

Pobieranie próbek i analiza sygnałów zapachowych zwierząt

Ten protokół obejmuje szczegółową analizę składu peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas w połączeniu z zaawansowanym oprogramowaniem do ekstrakcji cech i analizy bioinformatycznej.

Półilościowa analiza peptydoglikanu za pomocą chromatografii cieczowej, spektrometrii mas i bioinformatyki

Ten protokół opisuje ekstrakcję lotnych związków organicznych z próbki biologicznej za pomocą metody ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżniowo, chromatografię gazową sprzężoną ze spektrometrią mas przy użyciu szyny Entech Sample Preparation Rail, oraz analizę danych. Opisano również hodowlę próbek biologicznych i sondowanie izotopów stabilnych.

Wychwytywanie aktywnie wytwarzanych mikrobiologicznych lotnych związków organicznych z próbek związanych z człowiekiem za pomocą ekstrakcji sorbentem wspomaganym próżnią

Tutaj prezentujemy ekstrakcję i przygotowanie polarnych i półpolarnych metabolitów z holobiontu koralowca, a także wydzielonych tkanek gospodarza koralowców i frakcji komórek Symbiodiniaceae, do analizy metodą chromatografii gazowej i spektrometrii mas.

Ukierunkowana metabolomika próbek koralowców twardych oparta na chromatografii gazowej i spektrometrii mas

Protokół opisuje infekcję in vivo i in vitro nicieniami sosnówki Pinus pinaster oraz ich analizę lotną za pomocą chromatografii gazowej (GC) i GC sprzężonej ze spektrometrią mas (GC-MS).

Zakażenie sosen in vivo i in vitro nicieniem sosnowym Bursaphelenchus xylophilus i izolacja indukowanych substancji lotnych

Proponujemy zoptymalizowany protokół skaningowej mikroskopii elektronowej do wizualizacji wysoce heterogenicznych i delikatnych próbek zawierających biomasę roślinną i grzybową, wraz z mikrobiotą i biofilmem. Protokół ten pozwala na opisanie wymiarów przestrzennych organizacji mikrobioty.

Mikrobiota ogrodów mrówek attine: wizualizacja krajobrazu mikrobiologicznego za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Poznaj metodę izolacji zawartości gruczołów żuchwowych mrówek Colobopsis explodens z użyciem GC-MS i MetaboliteDetector. Protokół umożliwia profilowanie lotnych związków organicznych w badaniach ekologii chemicznej owadów.

Izolacja zawartości rezerwuaru gruczołów żuchwowych od borneańskich eksplodujących mrówek (Formicidae) w celu analizy objętości za pomocą GC-MS i MetaboliteDetector (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja zawartości rezerwuaru gruczołów żuchwowych od borneańskich "eksplodujących mrówek" (Formicidae) w celu analizy objętości za pomocą GC-MS i MetaboliteDetector

Przeglądaj więcej filmów