Izolacja zawartości rezerwuaru gruczołów żuchwowych od borneańskich "eksplodujących mrówek" (Formicidae) w celu analizy objętości za pomocą GC-MS i MetaboliteDetector

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące metabolomiki owadów. Podejście oparte na profilowaniu metabolitów można wykorzystać do badania ekologii chemicznej mrówek poprzez wyjaśnienie roli substancji lotnych w interakcji z innymi organizmami. Główną zaletą prezentowanego przepływu pracy jest to, że składa się on z dwóch odrębnych części, które w zasadzie mogą być stosowane niezależnie.

Po pierwsze, fizyczna izolacja zbiornika gruczołu żuchwy i jego zawartości, a po drugie, nieukierunkowane profilowanie i identyfikacja lotnych składników organicznych w próbce biologicznej będącej przedmiotem zainteresowania. Procedurę zademonstruje Michaela Hoenigsberger, utalentowana doktorantka z mojego laboratorium. Przed sekcją mrówek, w dygestorium, wyczyść szklaną szalkę Petriego i narzędzia do preparowania za pomocą chusteczek papierowych i mieszaniny metanolu i wody jeden plus jeden objętościowo.

Przechowuj naczynie w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Następnie weź masę 1,5 mililitrowych fiolek z krótkim gwintem, w tym ich zakrętki, które zawierają silikonową przegrodę PTFE. Przechowywać fiolki na lodzie.

Następnie umieść zamrożony ciągliwy zimny okład w pudełku z pianki polistyrenowej. Następnie załaduj szalkę Petriego na wierzch zimnego opakowania i włóż do naczynia zamrożoną mrówkę. Teraz zbadaj mrówkę za pomocą mikroskopu stereoskopowego.

Sprawdź integralność jego komór gastralnych. Mrówka musi mieć nienaruszony obszar gasterowy. Nie używaj mrówek z płaskimi gastrem lub śladami stwardniałej zawartości zbiornika gruczołu żuchwowego na powierzchni ich ciała.

Teraz odizoluj zawartość zbiornika gruczołu żuchwowego od mrówki. Użyj kleszczy, aby chwycić propodium i ogonek, a następnie delikatnie rozsuń te segmenty ciała. Następnie chwyć gaster na tergicie czwartym za pomocą cienkich kleszczy.

Za pomocą kolejnej pary kleszczy chwyć tergit jeden i delikatnie usuń tergit, odrywając go. Powtórz ten proces, aby oderwać tergity dwa i trzy, tak aby część żołądkowa zbiorników gruczołu żuchwowego była w większości widoczna. Zbiorniki gruczołów żuchwowych są koloru żółtego u mrówek robotnic C.Explodens, ale kolor może wahać się od białego przez żółty do czerwonego u innych gatunków.

Następnie, za pomocą igły preparucyjnej, delikatnie usuń woskopodobną zawartość sparowanych zbiorników gruczołu żuchwowego, wydrapując je z komory gastralnej. Zawartość zbiornika gruczołu żuchwy należy usuwać tylko te części, które można odizolować bez wywierania nacisku na inne gruczoły i struktury ciała obecne w mięśniu mrówki. Nie jest konieczne zbieranie całej zawartości zbiornika gruczołu żuchwowego.

Teraz podnieś zawartość zbiornika gruczołu żuchwowego, delikatnie dotykając jej końcówką igły do preparacji, aż się do niej przyklei. Następnie przenieś zawartość gruczołu do zimnej fiolki z krótkim gwintem o pojemności 1,5 mililitra. Może być konieczne przesunięcie końcówki igły wzdłuż ścianki fiolki i rozsmarowanie zawartości gruczołu na ściance fiolki.

Przechowuj kolekcję pod przykryciem i na lodzie, dopóki nie będzie można jej przeanalizować. Pomiędzy sekcjami ponownie wyczyść narzędzia i naczynie mieszanką metanolu i wody. Aby uzyskać jedną próbkę analityczną, należy połączyć zawartość zbiornika gruczołu wielu mrówek.

W tym przypadku zawartość gruczołu pięciu mrówek robotnic C.explodens jest łączona. Do kontroli należy pobrać próbki składające się z gruczołu Dufoura, który przylega do zbiorników gruczołu żuchwowego. Przed ekstrakcją zawartości gruczołowej należy określić masę próbek analitycznych.

Następnie dodaj 14 części objętościowo lodowatego octanu etylu o wysokiej czystości do jednej części masowej tkanki. Wirować preparat przez pięć minut w schłodzonych warunkach. Następnie odwirować próbki przez 10 minut i zebrać supernatanty.

Oczekuje się, że z próbki pięciu mrówek pojawi się około 55 do 75 mikrolitrów supernatantu. Przenieść każdy supernatant do wstępnie schłodzonej fiolki z krótkim gwintem o pojemności 1,5 mililitra z mikrowkładką o pojemności 0,1 mililitra i szczelnie zamknąć fiolki za pomocą zakrętek zawierających otwory i czerwonej gumowej przegrody PTFE. Aby uzyskać pełną sekwencję pomiarową GCMS, przygotuj 1,5-mililitrową fiolkę z krótkim gwintem z mieszaniną kalibrującą wskaźnik retencji, wykonaną przez rozcieńczenie dostępnych w handlu roztworów wzorcowych alkanów w heksanie, do ośmiu miligramów na mililitr na związek.

Następnie należy przygotować kolejną fiolkę z czystym octanem etylu, która posłuży jako ślepa próba rozpuszczalnika. Na schłodzoną tacę autosamplera chromatografu gazowego załaduj najpierw ślepą próbę rozpuszczalnika, następnie mieszaninę kalibru o wskaźniku retencji, trzecią ekstrakt zawartości gruczołu żuchwy, a po czwarte, ekstrakt zawartości gruczołu Dufoura. Umieścić próbki z tacką na lodzie w celu transportu do chromatografu gazowego.

Włóż tackę do chłodzonego automatycznego podajnika próbek Dla każdej próbki wstrzyknąć jeden mikrolitr płynu do specyfikacji masowej GC w celu separacji chromatograficznej na kolumnie odpowiedniej dla związków docelowych. Takich jak kolumna interfejsu użytkownika HP-5MS.

Następnie należy ustawić odpowiednie parametry GC. Na przykład użyj helu w gazie nośnym o stałym przepływie kolumny wynoszącym jeden mililitr na minutę. Użyj rampy temperatury piekarnika, zaczynając od 40 stopni Celsjusza przez dwie minuty, a następnie rampy od 10 stopni Celsjusza na minutę do 330 stopni Celsjusza.

Po czym następuje siedmiominutowe wstrzymanie. Przy tych parametrach ustaw temperaturę na wlocie na 270 stopni Celsjusza. Teraz, jeśli to konieczne, dostosuj współczynniki podziału dla specyfikacji masy GC.

iniekcji, tak aby zapewniały odpowiednie kształty pików i intensywność dla interesujących związków. Ustaw temperaturę pomocniczą na 350 stopni Celsjusza. Dla specyfikacji masy.

Użyj następujących parametrów. Temperatura źródła MS wynosi 230 stopni Celsjusza, temperatura poczwórna MS wynosi 150 stopni Celsjusza, zakres skanowania od niskiej masy 30 do dużej masy 500, co daje szybkość skanowania około trzech skanów na sekundę. oraz opóźnienie rozpuszczalnika wynoszące 4,1 minuty dla ślepej próby rozpuszczalnika i próbek doświadczalnych lub opóźnienie rozpuszczalnika wynoszące 6,1 minuty dla mieszaniny kalibru o wskaźniku retencji.

Po zakończeniu pomiarów otwórz oprogramowanie do analizy danych GCMS i wyeksportuj dane jako plik projektu AIA na przenośne urządzenie pamięci masowej, aby ułatwić transfer danych do komputera z 64-bitowym systemem operacyjnym opartym na systemie Linux. Aby przeanalizować dane, postępuj zgodnie z opisem tekstowym protokołu dotyczącym użycia oprogramowania detektora metabolitów. W terenie mrówki zbierano i zamrażano w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza przez dwa dni, a następnie przechowywano w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu ich analizy.

Zawartość zbiornika gruczołu żuchwowego od pięciu mrówek robotnic C.explodens zebrano i zmierzono za pomocą GCMS. Analiza danych ujawniła dziesiątki przypuszczalnych związków zawartości gruczołów. Dwa dominujące metabolity w ekstrakcie z zawartości zbiornika gruczołu żuchwowego powodowały przeciążenie kolumny.

Dlatego ta sama próbka została ponownie przeanalizowana przy wyższym stosunku podziału 50 do jednego. Zanieczyszczenie krzyżowe zawartości rezerwuaru gruczołu żuchwowego przez skład gruczołu Dufoura zbadano poprzez pobranie próbek gruczołu Dufoura do zbadania. Takie zanieczyszczenia wykazywały późny czas retencji, zaczynający się od około 29 minut.

Wykryte przypuszczalne metabolity zawarte w rezerwuarze gruczołu żuchwy zidentyfikowano na podstawie kombinacji podobieństwa widma i wskaźnika retencji do biblioteki wewnętrznej. W ten sposób udało się potwierdzić tożsamość około 10% wykrytych metabolitów, z których część jest wymieniona jako związki od jednego do pięciu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować, ekstrahować i oznaczać, pojedynczo metabolity, wybierając pomiar MS.

Po opanowaniu, izolacja, ekstrakcja rozpuszczalnikiem i akwizycja danych tej samej próbki mogą być wykonane w ciągu około dwóch godzin, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. W zależności od złożoności profilu lotnych związków organicznych, czas potrzebny na ocenę danych będzie się różnił. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, aby próbka była stale chłodzona, od pobrania do analizy.

Ponadto przed sekcją należy sprawdzić, czy gaster mrówki jest fizycznie nienaruszony. Procedura ta może być również połączona z porównawczą lub bezwzględną kwantyfikacją metabolitów, w celu udzielenia odpowiedzi na dodatkowe pytania, takie jak skład metaboliczny i różne warunki środowiskowe lub bezwzględne ilości składnika w puszkach. Dogodnie, etapy ekstrakcji, pomiaru i oceny danych tego protokołu mogą być również stosowane do wielu systemów biologicznych, takich jak inne owady, mikroorganizmy lub rośliny.