Name: Charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj charakterystykę biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej i wizualnego klastrowania. Ta metoda umożliwia szybką analizę struktury społeczności mikroorganizmów oraz wykrywanie zanieczyszczeń takich jak mikroplastik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Prezentowana praca była wspierana przez SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) oraz Velux Research Grant (Amplebig). Chcielibyśmy podziękować Bettinie Wagner za pomoc w pracach eksperymentalnych.

1. Selekcja ekosystemu i pobieranie próbek biofilmu
<ol>
	<li>Wybierz interesujący Cię ekosystem wodny i znajdź miejsca, w których rosną biofilmy. Płytkie części strumienia o wolnym lub średnim przepływie wody i kamienistym korycie strumienia do przyczepiania biofilmu są odpowiednie17,18.</li>
	<li>Opcjonalnie: Jeśli w danym miejscu nie ma wystarczającej ilości powierzchni do przyczepienia biofilmu lub w celu zmniejszenia zmienności biofilmu w obrębie miejsca, należy umieścić w nim sztuczne podłoża do mocowania biofilmu (np. szkiełka szklane, płytki ceramiczne), upewniając się, że są one umieszczone w tym samym kierunku w stosunku do przepływu wody oraz na podobnej głębokości i natężeniu światła19.</li>
	<li>Aby określić warunki środowiskowe w miejscu pobierania próbek, należy użyć przenośnych przyrządów do pomiaru natężenia światła, temperatury wody, przewodności, tlenu i pH bezpośrednio nad powierzchnią, z której ma zostać pobrany biofilm. W trakcie pobierania próbek należy wykonywać powtarzające się pomiary (3–5) w celu obliczenia wartości średnich.</li>
	<li>Opcjonalnie: Pobrać próbki wody w celu określenia odpowiednich parametrów składu chemicznego wody (rozpuszczony węgiel organiczny (DOC), K+, Na+, Ca2+, Mg2+, Cl-, F-, SO42-, PO42-, NO32-, SiO44-).</li>
	<li>Używając rękawic ochronnych, zbierz porównywalne kamienie (pod względem wielkości, kształtu i rodzaju) z każdego miejsca (lub sztucznych podłoży). Kamienie powinny być wystawione na działanie podobnych warunków przepływu i światła18.</li>
	<li>Przefiltruj wystarczającą ilość wody strumieniowej z miejsca przez filtry 0,22 μm, aby była gotowa na wszystkie pobrane próbki (np. 15 ml na próbkę).</li>
	<li>Użyj miękkiej szczoteczki do zębów, aby usunąć biofilm z podłoża do kolby (szczotkuj do momentu usunięcia całego biofilmu) 15 ml przefiltrowanej wody ze strumienia20.</li>
	<li>Utrwal próbki w 0,01% paraformaldehydu i 0,1% aldehydu glutarowego21.</li>
</ol>
2. Wyznaczanie optymalnych parametrów cytometrii przepływowej (FC)
<ol>
	<li>Przenieś podpróbki do mikroskopu świetlnego (przy użyciu obiektywu 40X/0,75; w razie potrzeby użyj obiektywu 100 × 1,3 Oil) i zidentyfikuj gatunki obecne w próbkach22,23.</li>
	<li>Uporządkować zidentyfikowane pojedyncze gatunki z odpowiednich kolekcji kultur (np. Eksperymentalnej Kolekcji Fykologii i Kultur Glonów na Uniwersytecie w Getyndze [EPSAG] lub Kolekcji Kultur Glonów na Uniwersytecie w Kolonii [CCAC], jeśli prowadzony jest monitoring w ekosystemach Europy Środkowej).</li>
	<li>Hoduj pojedyncze gatunki w sposób ciągły w podobnych warunkach środowiskowych (np. światło, temperatura, pH) do środowiska, z którego pobrano próbki biofilmu. Zaleca się przebywanie w granicach 1 °C i 0,5 punktu pH od próbek środowiskowych.</li>
	<li>Aby odłączyć/rozproszyć komórki, umieść 15 ml próbek pojedynczych gatunków w probówkach wirówkowych i umieść probówki na środku łaźni wodnej i zanurz tak, aby powierzchnia cieczy próbki znajdowała się na tym samym poziomie co powierzchnia kąpieli. Sonikuj próbki przez 1 minutę przy 45 kHz24,25.</li>
	<li>Zapisać widma absorbancji i fluorescencji pojedynczych gatunków za pomocą czytnika płytkowego. Instrukcje można znaleźć w wybranym czytniku płytek. W tym przykładzie 96-dołkowe przezroczyste płytki z płaskiego dna z polistyromu załadowano próbką o objętości 200 μl i zmierzono absorbancję. (Używane ustawienia: (a) tryb skanowania fluorescencyjnego; długość fali emisji wielkość kroku 10 nm, liczba skanu emisyjnego 30, szerokość pasma 20 nm, wzmocnienie 100, 25 błysków, czas integracji 20 us lub (b) tryb skanowania absorpcji; 25 błysków, szerokość pasma 9 nm).</li>
	<li>Ustaw cytometr przepływowy z laserami, rozdzielaczami dichroicznymi i filtrami, które w połączeniu obejmują wszystkie te zakresy fluorescencyjne, w których różne gatunki mają określone właściwości. W przypadku strumieni z Europy Środkowej użyteczne wyniki daje laser o długości fali 405 nm, 488 nm i 638 nm.</li>
	<li>Dostosuj ustawienie napięcia fotopowielaczy (nie dotyczy wszystkich cytometrów przepływowych) oraz zakres mierzonych fluorescencji tak, aby obejmował co najmniej 99% wszystkich zdarzeń w próbkach.</li>
	<li>Alternatywnie, jeżeli dostępna jest wiedza na temat gatunków obecnych w biofilmach, należy rozpocząć od kroku 2.2. Jeśli znane są właściwości fluorescencyjne, zacznij od kroku 2.6.</li>
</ol>
3. Opcjonalnie: Przygotowanie referencyjnej bazy danych cytometrii przepływowej
UWAGA: FC nie pozwala na taksonomiczną identyfikację komórek obecnych w biofilmie. W interpretacji danych może pomóc referencyjna baza danych zawierająca pomiary FC pojedynczych gatunków, o których wiadomo, że są obecne w biofilmach, hodowanych w podobnych warunkach jak biofilmy.
<ol>
	<li>Odniesienie: pojedyncze gatunki
	<ol>
		<li>Korzystając ze zoptymalizowanych parametrów FC ustawionych w 2,5–7, zmierz właściwości optyczne i fluorescencyjne pojedynczych gatunków (utrwalonych w paraformaldehydzie i aldehydzie glutarowym i przefiltrowanych przez filtry o wielkości odpowiedniej dla cytometru przepływowego).</li>
		<li>Znormalizuj dane dotyczące pojedynczych gatunków w taki sam sposób, jak dane dotyczące biofilmów (patrz krok 6.1.2).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odniesienie: uszkodzone i rozkładające się komórki 
	Jednym z najważniejszych wskaźników zdrowia biofilmu jest frakcja uszkodzonych/umierających komórek obecnych w biofilmie. Aby określić ilościowo te komórki, można przygotować odniesienie do rozkładających się komórek.
	<ol>
		<li>Pobrać 1 ml podpróbek rozcieńczonych biofilmów i odwirować je w temperaturze pokojowej przy 8 000 x g przez 10 minut w wirówce stołowej. Zawiesić powstały osad w 1 ml 90% etanolu i przechowywać zawiesinę przez noc w temperaturze 4 °C. Powtórzyć następnego dnia.</li>
		<li>Korzystając ze zoptymalizowanych ustawień FC, zmierz właściwości optyczne i fluorescencyjne uszkodzonych i rozpadających się komórek (stałych i filtrowanych). </li>
	</ol>
	</li>
	<li>Indeks: microplastics 
	UWAGA: Jeśli jesteś zainteresowany monitorowaniem cząstek mikroplastiku w biofilmach, sprawdź, czy różnią się one wystarczająco od cząstek biotycznych właściwościami optycznymi i fluorescencyjnymi do identyfikacji.
	<ol>
		<li>Zawiesić cząsteczki mikroplastiku zgodnie z instrukcjami producenta mikroplastiku i zmierzyć ich właściwości optyczne i fluorescencyjne (przy użyciu parametrów FC z 2.7). </li>
		<li>Dodać cząsteczki mikrodrobiny plastiku do próbki biofilmu i pozostawić na noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Przefiltruj zawiesinę i zmierz tymi samymi parametrami FC, co powyżej.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Przygotowanie i przechowywanie próbek
<ol>
	<li>Po skonfigurowaniu FC i przygotowaniu referencyjnej bazy danych FC można przystąpić do oceny świeżych próbek biofilmu, pobranych zgodnie z krokami 1.1–7. Aby oderwać/rozproszyć biofilm, przenieść 15 ml próbek z kolb (patrz krok 1.7) do probówek wirówkowych.</li>
	<li>Umieść każdą probówkę na środku łaźni wodnej i zanurz tak, aby powierzchnia cieczy próbki znajdowała się na tym samym poziomie co powierzchnia kąpieli. Sonikować próbki przez 1 minutę przy 45 kHz.</li>
	<li>Utrwal próbki w 0,01% paraformaldehydu i 0,1% aldehydu glutarowego (zapas w wodzie nanoczystej). Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do analizy.</li>
	<li>Ważne: Połowę próbek należy wykorzystać do analizy metodą cytometrii przepływowej, a połowę przechowywać w magazynie ze względów bezpieczeństwa i do opcjonalnej walidacji za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją i/lub mikroskopii świetlnej (patrz punkt 6). 
	UWAGA: Przechowywane w lodówce utrwalone próbki biofilmu powinny zachować swoje właściwości optyczne i fluorescencyjne przez okres do trzech tygodni.</li>
</ol>
5. Przepuszczanie próbki przez FC
<ol>
	<li>Jeśli próbki były przechowywane w lodówce, należy je szybko poddać sonikacji lub kilkakrotnie odpipetować, aby oddzielić cząstki. Przed pomiarem przefiltrować podpróbki za pomocą filtrów 50 μm (wielkość filtra zależy od szerokości kapilary FC).</li>
	<li>Załaduj poszczególne próbki (1–2 ml, w zależności od zastosowanego cytometru przepływowego) do cytometru przepływowego i zmierz właściwości optyczne i fluorescencyjne każdej cząstki. Powtórzyć pomiar trzy razy dla każdej kontrpróby biologicznej (trzy kontrpróby techniczne).</li>
	<li>Wyeksportuj dane z FC w formacie .csv. </li>
</ol>
6. Przygotowanie danych i analiza korelacji
FC może analizować kilka parametrów (np. obszar sygnału, wysokość, szerokość) dla każdej mierzonej właściwości optycznej i zakresu fluorescencji. Przeprowadź analizę korelacji dla mierzonych zmiennych i zachowaj tylko te pomiary, które nie są silnie skorelowane. Zwykle usuwa to wszystkie parametry FC z wyjątkiem jednego (np. obszar sygnału), a także może usunąć wysoce skorelowane pomiary fluorescencyjne (zwykle pochodzące z tego samego lasera i sąsiednich filtrów).
<ol>
	<li>Uruchom CYT jako zestaw narzędzi w Matlabie:
	<ol>
		<li>Zaimportuj zredukowane dane FC w formacie .csv ze wszystkich próbek, które mają być analizowane, do oprogramowania CYT 16, w tym wszystkich kontrprób technicznych i biologicznych. (Kliknij +, Filtr plików *.csv, wybierz pliki do zaimportowania).</li>
		<li>Przekształć kanały fluorescencyjne wszystkich próbek za pomocą hiperbolicznej transformacji arcusine. Należy wybrać wartość kofaktora; 150 działa dla większości biofilmów fototroficznych i cytometrów przepływowych, ale optymalizacja może być konieczna w przypadku określonych konfiguracji eksperymentalnych i biofilmów heterotroficznych. (Kliknij prawym przyciskiem myszy/Przekształć/wprowadź kofaktor 150)</li>
		<li>W celu kontroli jakości należy porównać wzrokowo (w CYT) histogramy poszczególnych próbek oraz poszczególnych kanałów optycznych i fluorescencyjnych, aby upewnić się, że nie ma wartości odstających na technicznym i biologicznym poziomie replikacji. Wartości odstające objawią się znacznie przesuniętymi rozkładami fluorescencyjnymi/optycznymi między kontrpróbami. (Wybierz Dane, Wybierz Kanał, Wykres)
		<ol>
			<li>Alternatywnie: przeprowadzić analizę głównych składowych (PCA) na średnich wartościach rozkładów fluorescencyjnych i upewnić się, że kontrpróby techniczne i biologiczne grupują się razem.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Połącz kontrpróby techniczne w każdej kontrpróbie biologicznej i podpróbkuj kontrpróby biologiczne, tak aby każda z nich była reprezentowana przez tę samą liczbę cząstek (komórek, fragmentów komórek i cząstek abiotycznych) i tak, aby całkowita liczba cząstek analizowanych przez stochastyczne osadzanie sąsiadów Barnesa-Huta (bh-SNE) wynosiła około 150 000 (dla najlepszych wyników wizualizacji26). (Wybierz dane, kliknij prawym przyciskiem myszy, scal/podpróbkuj)</li>
		<li>Do porównania próbek ważne jest, aby wybrać tylko te próbki, które mają być porównane. Wybierz próbki i uruchom polecenie bh-SNE27. Po zakończeniu algorytmu pojawiają się nowe kanały o nazwach bh-SNE1 i bh-SNE2. Są to współrzędne SNE wszystkich analizowanych cząstek, które można wykorzystać do wizualizacji danych na wykresie punktowym (mapa viSNE). (Wybierz dane, Wybierz kanały, kliknij prawym przyciskiem myszy, bh-SNE, Tak znormalizowane dane)</li>
		<li>Na mapie viSNE cząstki są rozmieszczone zgodnie z podobieństwem i pogrupowane w wizualnie rozłączne klastry. Sprawdź właściwości optyczne/fluorescencyjne klastrów i oznacz i nazwij te, które są dobrze oddzielone i mają różne właściwości optyczne/fluorescencyjne, korzystając z narzędzi do rysowania dostępnych w CYT. (Wybierz kanał bh-SNE1, bh-SNE2)</li>
		<li>Opcjonalnie: Jeśli dostępna jest referencyjna baza danych pojedynczych gatunków drobnoustrojów (mierzonych przy użyciu tego samego ustawienia cytometrii przepływowej i hodowanych w podobnych warunkach!), wyeksportuj mapy viSNE do Matlaba i wyświetl referencyjną bazę danych na mapach. W ten sposób poszczególne klastry mogą być powiązane z poszczególnymi gatunkami/grupami taksonomicznymi (skrypty dostępne do pobrania na https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Sesja/Zapisz)</li>
		<li>Rozwiązywanie problemów: Jeśli analiza bh-SNE nie zwraca wizualnie rozłącznych klastrów, ale jeden duży, oznacza to, że w bh-SNE użyto zbyt wielu cząstek. Spróbuj ponownie z mniejszą liczbą cząstek na próbkę. Jeśli nie ma klastrów, ale raczej rzadkie pojedyncze punkty, zwiększ liczbę używanych cząstek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Opcjonalnie: Zamiast polegać na bh-SNE do grupowania, można zastosować inne metody grupowania (np. grupowanie hierarchiczne, oparte na centroidach lub gęstości) na znormalizowanych danych, a następnie nałożyć je na mapę viSNE (https://github.com/anzezupanic/FC_analysis).</li>
	<li>Po zidentyfikowaniu klastrów należy policzyć liczbę cząstek w każdym klastrze należących do każdej kontrpróby biologicznej w każdej próbce. Oceń różnice między próbkami, używając ANOVA i testu Tukeya z odpowiednią (np. Holmes) korektą dla wielokrotnego porównania.</li>
</ol>
7. Opcjonalnie: Walidacja interpretacji klastrów za pomocą sortowania komórek aktywowanego fluorescencją
<ol>
	<li>Po zidentyfikowaniu klastrów należy użyć sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS), aby w razie potrzeby oddzielić je od próbek, pod warunkiem, że FACS ma podobną (lub identyczną) konfigurację laserów i filtrów fluorescencyjnych.</li>
	<li>Dla każdej zidentyfikowanej gromady CYT dostarcza bramki optyczne i fluorescencyjne, które definiują klaster. Użyj tych bramek, aby posortować cząstki w każdym klastrze za pomocą FACS, a następnie zidentyfikuj posortowane komórki za pomocą mikroskopii świetlnej.</li>
</ol>

<ol><li>Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ecology+and+biogeochemistry+of+stream+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The ecology and biogeochemistry of stream biofilms.</a> Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).</li>
<li>Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. <a target="_blank" href="https://besjournals.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/1365-2664.12146">Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure.</a> J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).</li>
<li>Tlili, A., et al. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1111/fwb.12558">Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems.</a> Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).</li>
<li>Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mine+of+information%3A+Benthic+algal+communities+as+biomonitors+of+metal+contamination+from+abandoned+tailings%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings.</a> Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).</li>
<li>Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chronic+and+acute+pesticide+exposures+on+periphyton+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities.</a> Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).</li>
<li>Dorigo, U., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/240809842_Lotic_biofilm_community_structure_and_pesticide_tolerance_along_a_contamination_gradient_in_a_vineyard_area">Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area.</a> Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).</li>
<li>Pesce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+single+and+joint+toxic+effects+of+diuron+and+its+main+metabolites+on+natural+phototrophic+biofilms+using+a+pollution-induced+community+tolerance+%28PICT%29+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach.</a> Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).</li>
<li>Ricart, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+low+concentrations+of+the+phenylurea+herbicide+diuron+on+biofilm+algae+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria.</a> Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).</li>
<li>Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leaf-litter+leachate+concentration+promotes+heterotrophy+in+freshwater+biofilms%3A+Understanding+consequences+of+water+scarcity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Total+Environ%22%5BJournal%5D)">Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity.</a> Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).</li>
<li>Corcoll, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+DNA+extraction+methods+for+comprehensive+assessment+of+16S+rRNA+bacterial+diversity+in+marine+biofilms+using+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Fems+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing.</a> Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).</li>
<li>Welsh, A. K., McLean, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bacteria+in+mixed+biofilm+communities+using+denaturing+gradient+gel+electrophoresis+%28DGGE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE).</a> Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).</li>
<li>Ranjard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+bacterial+and+fungal+soil+communities+by+automated+ribosomal+intergenic+spacer+analysis+fingerprints%3A+Biological+and+methodological+variability%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environm+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability.</a> Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).</li>
<li>Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+extracellular+polymeric+substances+%28EPS%29+from+periphyton+using+liquid+chromatography-organic+carbon+detection-organic+nitrogen+detection+%28LC-OCD-OND%29%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+R%22%5BJournal%5D)">Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND).</a> Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).</li>
<li>Kroll, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mixed+messages+from+benthic+microbial+communities+exposed+to+nanoparticulate+and+ionic+silver%3A+3D+structure+picks+up+nano-specific+effects%2C+while+EPS+and+traditional+endpoints+indicate+a+concentration-dependent+impact+of+silver+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Sci+Pollut+R%22%5BJournal%5D)">Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions.</a> Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).</li>
<li>Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+combined+with+viSNE+for+the+analysis+of+microbial+biofilms+and+detection+of+microplastics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics.</a> Nat Commun. 7, 11587(2016).</li>
<li>Amir el, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((viSNE+enables+visualization+of+high+dimensional+single-cell+data+and+reveals+phenotypic+heterogeneity+of+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia.</a> Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).</li>
<li>Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. <a target="_blank" href="https://www.caister.com/hsp/abstracts/aquaticbiofilms/01.html">Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms.</a> Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).</li>
<li>Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. <a target="_blank" href="https://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1046/j.1365-2427.2003.01103.x">Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae.</a> Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).</li>
<li>Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micropollutant-induced+tolerance+of+in+situ+periphyton%3A+Establishing+causality+in+wastewater-impacted+streams%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams.</a> Water Res. 111, 185-194 (2017).</li>
<li>Robinson, C. T., Rushforth, S. R. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00026830">Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream.</a> Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).</li>
<li>Pomati, F., Nizzetto, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+triclosan-induced+ecological+and+trans-generational+effects+in+natural+phytoplankton+communities%3A+A+trait-based+field+method%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method.</a> Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).</li>
<li>Hulliger, J. <a target="_blank" href="https://www.bafu.admin.ch/bafu/de/home/themen/wasser/publikationen-studien/publikationen-wasser/methoden-untersuchung-beurteilung-fliessgewaesser.html">Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer</a>. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).</li>
<li>Tlili, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+spatio-temporal+changes+in+pollution-induced+community+tolerance+to+zinc+in+autotrophic+and+heterotrophic+biofilm+communities%5BTitle%5D)+AND+%22Ecotoxicology%22%5BJournal%5D)">In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities.</a> Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).</li>
<li>Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+sonication+on+bacteria+viability+in+wastewater+treatment+plants+evaluated+by+flow+cytometry+-+Fecal+indicators%2C+wastewater+and+activated+sludge%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge.</a> Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).</li>
<li>Buesing, N., Gessner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.int-res.com/abstracts/ame/v27/n1/p29-36/">Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms.</a> Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).</li>
<li>van der Maaten, L., Hinton, G. <a target="_blank" href="http://www.jmlr.org/papers/volume9/vandermaaten08a/vandermaaten08a.pdf">Visualizing Data using t-SNE.</a> J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).</li>
<li>van der Maaten, L. <a target="_blank" href="http://jmlr.org/papers/v15/vandermaaten14a.html">Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms.</a> J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Opisany powyżej protokół jest stosunkowo prosty do wdrożenia. Jednakże, chociaż wykazano, że przedstawione ustawienia domyślne są odpowiednie dla wszystkich dotychczas przebadanych biofilmów fototroficznych, konieczna jest optymalizacja (zgodnie z opisem w protokole), aby zmaksymalizować informacje uzyskane z metody. Rzeczywiście, właściwości optyczne i fluorescencyjne biofilmów mogą się różnić w zależności od warunków środowiskowych (pora roku, temperatura, skład chemiczny wody)1. Dlatego ważne j...

Biofilmy to dynamiczne konsorcja mikroorganizmów, które odgrywają kluczową rolę w ekosystemach słodkowodnych, począwszy od produkcji pierwotnej, obiegu składników odżywczych i oczyszczania wody, a skończywszy na wpływaniu na rozmieszczenie mikroorganizmów i ich różnorodność biologiczną w ekosystemie1. Kiedy biofilmy są wystawione na zmieniające się warunki środowiskowe lub czynniki stresogenne, takie jak chemikalia, ich struktura zbiorowiska szybko przesuwa się w kierunku bardziej tolerancyjnych gatunków2,3. Ich wysoka czułość sprawia, że biofilmy stają się atrakcyjnymi systemami modelowymi do monitorowania środowiska4, jednak żadna z obecnych metod nie jest idealnie dopasowana do śledzenia dynamiki społeczności biofilmu w szybki i łatwy sposób.
Powszechnie stosowany zestaw metod do charakteryzowania biofilmów składa się z pomiaru funkcjonalnych i strukturalnych punktów końcowych. Na poziomie całej społeczności aktywność fotosyntetyczna i oddechowa oraz aktywność enzymów zewnątrzkomórkowych dostarczają informacji o stanie funkcjonalnym biofilmu5,6,7,8,9. Przyrost biomasy jest używany jako wskaźnik ogólnego wzrostu biofilmu. Zmiany strukturalne są obecnie mierzone za pomocą tradycyjnej identyfikacji gatunków za pomocą mikroskopii świetlnej lub technik opartych na nukleotydach (np. elektroforeza żelowa z gradientem denaturacji (DGGE), zautomatyzowana analiza międzygenowej przekładki rybosomalnej (ARISA), metagenomika)10,11,12. Metody te dostarczają informacji, ale ich wykonanie jest czasochłonne, wymagają określonej wiedzy lub są nadal w fazie rozwoju. Wreszcie, nowe metody oceny zewnątrzkomórkowych substancji polimerowych (EPS)13,14 oraz architektura biofilmu1, choć czułe, są mało przepustowe i nie zostały jeszcze opracowane do celów monitorowania.
Jest oczywiste, że dla pełnej charakterystyki biofilmów słodkowodnych konieczne jest połączenie kilku różnych metod, które dają wgląd w funkcję, skład i architekturę biofilmu. Z drugiej strony do monitorowania środowiska potrzebna jest szybka i czuła metoda, która jest w stanie wykryć zmiany w biofilmie i umożliwić podstawową biologiczną interpretację zmian na poziomie funkcjonalnym i strukturalnym.
Opracowaliśmy nową metodę charakterystyki społeczności mikrobiologicznej komponentu fototroficznego biofilmów strumieniowych (peryfitonu), która jest wystarczająco szybka do celów monitorowania, a jednocześnie dostarcza wystarczających informacji o strukturze zbiorowiska biofilmu, aby umożliwić biologiczną interpretację15. Opiera się na jednokomórkowej cytometrii przepływowej (FC) próbek biofilmu i jest sprzężona z wizualizacją obliczeniową i dostarcza informacji na temat właściwości optycznych i fluorescencyjnych biofilmu na poziomie pojedynczej komórki.
Przebieg pracy po pobraniu próbek z biofilmu składa się z przygotowania próbki w formie sonikacji, utrwalenia i filtrowania próbek na podstawie wielkości, a następnie oceny próbki za pomocą cytometrii przepływowej. Uzyskane dane dostarczają informacji na temat kilku cech komórkowych w jednym pomiarze: wielkości cząstek, gęstości, zawartości pigmentu, zawartości abiotycznej (np. mikroplastiku) w biofilmie. Ten zestaw danych jest następnie analizowany za pomocą wizualizacji obliczeniowej przy użyciu wizualnego osadzania stochastycznego sąsiada (viSNE)16, co umożliwia szybką i łatwą interpretację danych. Chociaż konfiguracja i optymalizacja metody zajmuje kilka tygodni, po skonfigurowaniu zajmuje tylko kilka godzin od pobrania próbek biofilmu do interpretacji wyników.
Głównymi zaletami prezentowanej metody nad innymi są szybkość analizy i wysoka zawartość informacji. Co więcej, próbki mogą być przechowywane przez kilka tygodni po pobraniu bez utraty ich właściwości optycznych i fluorescencyjnych. Może to być bardzo przydatne, gdy wymagana jest charakterystyka dużej liczby próbek, takich jak badania dużych próbek lub programy biomonitoringu, ale może również dostarczyć znacznej ilości informacji w mniejszych badaniach eksploracyjnych.
Prezentowany protokół opiera się na analizie cytometrycznej przepływowej fototroficznych biofilmów (peryfitonów) zebranych z różnych miejsc strumienia. Wiele etapów protokołu, np. wybór miejsc odpowiednich do celów monitorowania, zależy od celów badania i dlatego nie można ich przepisać. Inne pozwalają na mniejszą swobodę i wymagają ścisłego przestrzegania protokołu, co zostało jasno określone w szczegółowym protokole poniżej.
Protokół rozpoczyna się od wyboru miejsc do monitorowania środowiska w oparciu o biofilm. Kolejnym krokiem jest ustawienie cytometru przepływowego (FC) w taki sposób, aby jego pomiary umożliwiały rozróżnienie różnych organizmów fototroficznych żyjących w biofilmach w monitorowanym środowisku. Odbywa się to poprzez pobranie próbek biofilmu z miejsc, zidentyfikowanie właściwości fluorescencyjnych różnych gatunków obecnych w biofilmie oraz ustawienie cytometru przepływowego z laserami i filtrami, które umożliwiają pomiar na odpowiednich długościach fal optycznych. Po ustawieniu FC można okresowo zbierać biofilmy z miejsc, właściwości optyczne i fluorescencyjne pojedynczych cząstek obecnych w biofilmie mierzyć za pomocą cytometrii przepływowej, a dane analizować za pomocą grupowania wizualnego. W celu lepszej interpretacji wyników możliwe jest zbudowanie referencyjnej bazy danych FC lokalnych gatunków żyjących w biofilmie i ich fenotypów oraz wykorzystanie bazy danych do identyfikacji różnych taksonomii w danych FC. Walidacja jest możliwa dzięki sortowaniu zidentyfikowanych klastrów pojedynczych komórek na podstawie fluorescencji za pomocą FACS oraz identyfikacji taksonomicznej obecnych gatunków opartej na mikroskopii. Schemat protokołu znajduje się w Rysunek 1.

<table><tbody><tr><td>Multimetr</td><td>WTW</td><td>MultiLine 3620 IDS</td><td>Do pomiaru temperatury, pH, tlenu rozpuszczonego</td></tr><tr><td>Myjka ultradźwiękowa</td><td>VWR International</td><td>97043-986</td><td>Wymiary zbiornika: 15*14*10 cm</td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy</td><td>Beckman Coulter</td><td>Gallios</td><td>Lasery: 405, 488 i 638 nm. Pasma filtrów w tabeli uzupełniającej 11. Sgier et, Nat Comm, 2016.&nbsp;</td></tr><tr><td>Czytnik płytek</td><td>Tecan</td><td>Infinite M200</td><td>służy do wyboru odpowiednich ustawień</td></tr><tr><td>sortownika FC Cell</td><td>Beckman Coulter</td><td>MoFlo Astrios</td><td>Ustawienia w tabeli uzupełniającej 12. Sgier et, Nat Comm, 2016.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 135</td><td>obiektyw Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75</td></tr><tr><td>OPROGRAMOWANIE Matlab</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>MathWorks</td><td>R2013a</td><td>oprogramowanie do obliczeń numerycznych</td></tr><tr><td>CYT</td><td>Dana Pe'er Lab</td><td>Version 1.1</td><td>bezpłatne interaktywne narzędzie do wizualizacji do analizy danych cytometrycznych</td></tr></tbody></table>

charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Biofilmy to dynamiczne konsorcja mikroorganizmów, które odgrywają kluczową rolę w ekosystemach słodkowodnych. Zmieniając strukturę zbiorowisk, biofilmy szybko reagują na zmiany środowiskowe i mogą być wykorzystywane jako wskaźniki jakości wody. Obecnie ocena biofilmu opiera się głównie na integracyjnych i funkcjonalnych punktach końcowych, takich jak aktywność fotosyntetyczna lub oddechowa, które nie dostarczają informacji na temat struktury zbiorowiska biofilmu. Cytometria przepływowa i wizualizacja obliczeniowa stanowią alternatywną, czułą i łatwą w użyciu metodę oceny składu zbiorowiska, w szczególności części fotoautotroficznej biofilmów słodkowodnych. Wymaga jedynie podstawowego przygotowania próbki, po czym cała próbka jest przepuszczana przez cytometr przepływowy. Informacje optyczne i fluorescencyjne z pojedynczej komórki są wykorzystywane do wizualizacji obliczeniowej i interpretacji biologicznej. Jej główne zalety w porównaniu z innymi metodami to szybkość analizy i wysoki poziom zawartości informacji. Cytometria przepływowa dostarcza informacji na temat kilku cech komórkowych i biofilmu w jednym pomiarze: wielkości cząstek, gęstości, zawartości pigmentu, zawartości abiotycznej w biofilmie i zgrubnych informacji taksonomicznych. Nie dostarcza jednak informacji na temat składu biofilmu na poziomie gatunku. Dostrzegamy duży potencjał w wykorzystaniu tej metody do monitorowania ekosystemów wodnych oraz jako wstępnego etapu oceny biofilmu, który dostarcza informacji na temat dalszych szczegółowych badań za pomocą uzupełniających i bardziej szczegółowych metod.

Zastosowując przedstawioną tutaj procedurę (Rysunek 1), przeanalizowano próbki pobrane z kilku stanowisk lokalnego strumienia w Szwajcarii. Na każdym stanowisku pobrano trzy kamienie o podobnej wielkości (10–12 cm), a następnie z ich powierzchni szczotkowano biofilmy. Próbki poddano sonikacji, utrwaleniu, filtracji, a następnie analizie metodą cytometrii przepływowej. Konfiguracja cytometru przepływowego oraz wykorzystana baza referencyjna były zgodne z opise...

Cytometria przepływowa w połączeniu z wizualnym grupowaniem oferuje łatwą w użyciu i szybką metodę badania biofilmów wodnych. Może być stosowany do charakteryzowania biofilmu, wykrywania zmian w strukturze zbiorowiska biofilmu oraz wykrywania cząstek abiotycznych osadzonych w biofilmie.

Charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu nauk o środowisku, takie jak wpływ zanieczyszczeń chemicznych czy zmiany klimatu na ekosystemy wodne. Główną zaletą tej techniki jest to, że wszystkie poszczególne kroki są proste i szybkie do wykonania. Chociaż procedura koncentruje się na charakterystyce biofilmów autotroficznych, może być również stosowana do charakteryzowania biofilmów heterotroficznych i wykrywania zanieczyszczeń cząsteczkowych, takich jak mikroplastiki.Na początek wybierz miejsce pobierania próbek wodnych, w którym rośnie biofilm, są to zazwyczaj płytkie części strumieni, które mają powolny lub pośredni przepływ wody i kamieniste koryta strumieni. Jeśli miejsce nie ma wystarczającej powierzchni do przyczepienia biofilmu, możesz użyć sztucznych podłoży, na których mogą rosnąć biofilmy. Zmierzyć warunki środowiskowe w miejscu pobierania próbek za pomocą przenośnych przyrządów do pomiaru przewodności, pH, temperatury wody i natężenia światła tuż nad powierzchnią biofilmu, z którego ma być pobrana próbka.Używając rękawic ochronnych, zbieraj kamienie o podobnym rozmiarze, kształcie i rodzaju z każdego miejsca. Kamienie należy zbierać z obszarów, które

characterization-of-aquatic-biofilms-with-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Environment

Środowisko

Protokół opisujący zastosowanie systemu komórek przepływowych do hodowli i analizy biofilmów mikrobiologicznych w konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej (CLSM).

Biofilm Pseudomonas aeruginosa i Saccharomyces cerevisiae w komórkach przepływowych

Biofilmy mikrobiologiczne są zazwyczaj tworzone przez odrębne subpopulacje wyspecjalizowanych komórek. Analiza pojedynczych komórek w tych subpopulacjach wymaga zastosowania reporterów fluorescencyjnych. W niniejszym protokole opisujemy metodę wizualizacji i monitorowania kilku subpopulacji w biofilmach B. subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej oraz cytometrii przepływowej.

Analiza pojedynczych komórek biofilmu Bacillus subtilis przy użyciu mikroskopii fluorescencyjnej i cytometrii przepływowej

Źródło: Chapman, I. J. i wsp., Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) przy użyciu cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp. (2016)Ten film przedstawia metodę rozróżniania żywych i martwych komórek Microcystis aeruginosa poprzez połączenie znakowania sondą fluorescencyjną z analizą autofluorescencji fikocyjaniny i sygnałem sondy za pomocą cytometrii przepływowej.

Analiza żywotności Microcystis aeruginosa za pomocą cytometrii przepływowej

Przedstawiono protokół jednoczesnej kwantyfikacji i porównania trzech składników komórkowych i zewnątrzkomórkowych w biofilmach. Metodologia obejmuje wykorzystanie konfokalnej laserowej mikroskopii skaningowej, oprogramowania do analizy strukturalnej i wizualizacji biofilmu oraz oprogramowania do analizy statystycznej.

Jednoczesna kwantyfikacja komórkowych i zewnątrzkomórkowych składników biofilmów

Tutaj prezentujemy kompleksowy protokół do oceny dostępności organicznych i nieorganicznych składników odżywczych oraz obfitości i struktury społeczności mikroorganizmów i wirusów w odległych środowiskach morskich.

Odkrywanie niewidzialnych graczy w oceanie - przewodnik terenowy po chemii wody i mikrobiologii morskiej

Biofilmy mają złożone interakcje z otaczającym je środowiskiem. Aby kompleksowo zbadać interakcje biofilm - środowisko, przedstawiamy tutaj szereg metod tworzenia heterogenicznego środowiska chemicznego do rozwoju biofilmu, ilościowego określania lokalnej prędkości przepływu oraz analizy transportu masowego w koloniach biofilmu i wokół nich.

Metody charakteryzowania współrozwoju biofilmu i heterogeniczności siedlisk

Populacje mikroorganizmów zawierają znaczną heterogeniczność komórek, która może dyktować ogólne zachowanie. Analiza sondy molekularnej za pomocą cytometrii przepływowej może określić stany fizjologiczne komórek, jednak jej zastosowanie różni się w zależności od gatunku. Badanie to zapewnia protokół do dokładnego określenia śmiertelności komórek w populacji cyjanobakterii, bez niedoceniania lub rejestrowania wyników fałszywie dodatnich.

Optymalizacja sondy molekularnej w celu określenia śmiertelności komórek w organizmie fotosyntetyzującym (Microcystis aeruginosa) za pomocą cytometrii przepływowej

Ten protokół opisuje nową metodę hodowli i jakościowej analizy biofilmów bakteryjnych na strzępkach grzybów za pomocą mikroskopii konfokalnej i elektronowej.

Nowa metoda jakościowej wieloskalowej analizy biofilmów bakteryjnych na koloniach grzybów nitkowatych z wykorzystaniem mikroskopii konfokalnej i elektronowej

Analiza cytometryczna przepływu okazała się przydatna do badania czystych kultur i monitorowania dynamiki społeczności mikroorganizmów. Przedstawiamy trzy kompleksowe przepływy pracy, od próbkowania po analizę danych, dla czystych kultur i złożonych społeczności, odpowiednio w przezroczystym podłożu, jak i w trudnych matrycach.

Charakterystyka dynamiki mikrobiomu – przepływy pracy oparte na cytometrii przepływowej od czystych kultur do naturalnych społeczności

Opisujemy montaż, działanie i czyszczenie urządzenia przepływowego zaprojektowanego do obrazowania tworzenia się biofilmu grzybów w czasie rzeczywistym podczas przepływu. Dostarczamy również i omawiamy algorytmy ilościowe, które można zastosować na pozyskanych obrazach.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym i kwantyfikacja rozwoju biofilmu grzybów przy użyciu dwufazowego systemu przepływu recyrkulacyjnego

Ten protokół opisuje ilościowe podejście do pomiaru autoagregacji drobnoustrojów za pomocą obrazowej cytometrii przepływowej.

Obrazowa cytometria przepływowa do badania autoagregacji drobnoustrojów

Poznaj charakterystykę biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej i wizualnego klastrowania. Ta metoda umożliwia szybką analizę struktury społeczności mikroorganizmów oraz wykrywanie zanieczyszczeń takich jak mikroplastik.

Charakterystyka biofilmów wodnych za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów