Protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy z cukrzycą
25 września 2019
Z tym artykułem związana jest aktualizacja. Kliknij tutaj, aby zobaczyć aktualizację.
Przewlekłe rany powstają z ostrych ran na mysim modelu cukrzycowym poprzez wywołanie wysokiego poziomu stresu oksydacyjnego po pełnej grubości rany skórnej. Rana jest leczona inhibitorami katalazy i peroksydazy glutationowej, co powoduje upośledzenie gojenia i rozwoju biofilmu przez bakterie obecne w mikrobiomie skóry.
Ten mysi model może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie medycyny dotyczące przewlekłości ran. Główną zaletą tego modelu jest to, że rany przewlekłe u myszy naśladują wiele aspektów ran przewlekłych u ludzi. Aby rozpocząć, umieść mysz na czystej powierzchni i przytrzymaj ją w miejscu, ściskając podstawę ogona.
Następnie przygotuj maszynkę do strzyżenia włosów i bądź gotowa do szybkiego ich odciągnięcia, jeśli mysz wykona jakiekolwiek gwałtowne ruchy. Ogol cały grzbiet od szyi do ogona, w tym wokół ogona. Delikatnie przesuwaj ostrze w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów, aby uzyskać najbardziej efektywne strzyżenie.
Nie wciskaj maszynki do strzyżenia głęboko w skórę, ponieważ może to spowodować siniaki lub skaleczenia. Następnie przygotuj skórę do nałożenia balsamu do depilacji. Zwilż skórę ręcznikiem papierowym nasączonym wodą, aby zapobiec oparzeniom chemicznym.
Lekko dociśnij z wystarczającym naciskiem, aby zwilżyć ścięte włosy przy skórze. Następnie, gdy skóra jest mokra, wcieraj niewielką porcję balsamu do depilacji w ogolony obszar przez 15 do 20 sekund. Po nałożeniu pozwól balsamowi reagować ze skórą przez 20 do 45 sekund.
Przed spłukaniem balsamu delikatnie zetrzyj trochę balsamu w różnych miejscach, aby sprawdzić reakcję. Jeśli skóra jest różowa i bezwłosa, reakcja jest zakończona. Następnie chwyć mysz, aby ją zmyć.
Używając ręki niedominującej kciukiem, dociśnij podstawę ogona do dłoni i zamknij pozostałe palce. Następnie, trzymając nos myszy do góry i z dala od wody, pozwól, aby woda spływała po grzbiecie zwierzęcia. Następnie szybko, ale delikatnie, drugą ręką potrzyj grzbiet myszy, aby zmyć balsam.
Po usunięciu całego kremu do depilacji osusz skórę ręcznikiem papierowym. Ważne jest, aby nie nakładać balsamu na uszy, ogon ani w pobliżu twarzy. Jeśli tak się stanie, natychmiast wytrzyj balsam mokrym ręcznikiem, a następnie polej mysz wodą, aby zapobiec uszkodzeniu tych obszarów.
Jeśli po użyciu kremu zauważysz jakiekolwiek ciemne plamy, ponownie nałóż krem na te obszary. Ciemne plamy skóry będą rosły szybciej przez cały czas trwania eksperymentu. Dlatego w razie potrzeby przycinaj włosy na krótko co trzy do pięciu dni.
Dopuszczalna jest łatka lub dwie, które nie znajdują się nad miejscem zranienia, ale jeśli na grzbiecie myszy znajduje się więcej ciemnych plam, nie należy ich używać do modelu rany przewlekłej. Po usunięciu włosów trzymaj mysz samą przez co najmniej jeden dzień przed zranieniem, ponieważ skóra będzie zbyt wrażliwa od balsamu do depilacji. Na 30 minut przed zabiegiem wstrzyknąć myszu 120 mikrolitrów buprenorfiny dootrzewnowo w sterylnym PBS.
Wszystkie objętości w tej procedurze zakładają 60 gramową mysz. 20 minut przed zabiegiem wstrzyknij myszowi 480 mikrolitrów ATZ dootrzewnowo w sterylnym PBS. Podziel objętość po obu stronach brzucha.
Po podaniu ATZ umieść mysz w małym plastikowym pojemniku na ciepłej poduszce grzewczej, aż rozpocznie się operacja. Przykryj mały pojemnik ręcznikiem papierowym, aby powstrzymać ciepło. Mysz powinna się uspokoić, gdy się ogrzeje.
Po potwierdzeniu stanu znieczulenia przystąp do zranienia. Aby rozpocząć procedurę ranienia, spryskaj chusteczką chemiczną z 70% etanolem, aby wytrzeć grzbiet myszy w celu oczyszczenia miejsca rany i powierzchni skóry. Nie wycieraj nadmiernie, ponieważ istnieje ryzyko zabicia bakterii obecnych na skórze.
Sukces modelu rany przewlekłej opiera się na warunkach niesterylnych. Myszy te nie są wolne od zarazków i są trzymane w konwencjonalnym wiwarium. Mikrobiom bakteryjny, który znajduje się na skórze, ma kluczowe znaczenie dla późniejszej inicjacji i rozwoju ran przewlekłych po leczeniu inhibitorami enzymów przeciwutleniających.
Teraz zastanów się, gdzie znajduje się rana. Najlepiej używać grzbietowej strony myszy wyśrodkowanej i z dala od ciemnych plam skóry. Teraz wykonaj procedurę zatruwania opatrunku w ciągu 30 do 45 sekund.
Najpierw delikatnie wciśnij siedmiomilimetrowy stempel do biopsji skóry w wybrane miejsce rany i przekręć go na tyle głęboko, aby pozostawić odcisk stempla. Następnie wytnij zarysowaną skórę, pociągając środek stempla pęsetą i przecinając wzdłuż konturu nożyczkami chirurgicznymi. Po zakończeniu mocno przykryj ranę połową kawałka przezroczystego opatrunku filmowego.
W ciągu 10 minut od zranienia nałóż 60 mikrolitrów podwielokrotności MSA w sterylnym PBS i nałóż miejscowo MSA na ranę. Później, sześć godzin po operacji, podaj kolejną dawkę buprenorfiny. W razie potrzeby można podać dodatkowe dawki.
Inicjacja rany przewlekłej następuje w czasie krótszym niż sześć godzin, a brzeg rany jest widocznie zmieniony pod wpływem stresu oksydacyjnego. Rana przewlekła to rana, która pozostaje otwarta, powiększona w porównaniu z raną początkową i zawiera biofilm. Po 20 dniach rana jest w pełni przewlekła.
Bakterie tworzące biofilm, które dominują w miejscu rany, obejmują Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae oraz różne gatunki Staphylococcus i Corynebacterium. Bakterie te znajdują się również w ludzkich przewlekłych ranach. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak tworzyć przewlekłe rany u myszy.
Po ustaleniu tych przewlekłych ran można je wykorzystać do zbadania wielu komórkowych mechanizmów molekularnych zaangażowanych w inicjację przewlekłości rany.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia szczegółowy protokół generowania ran przewlekłych u myszy db/db-/-, które ściśle naśladują charakterystykę ludzkich przewlekłych ran cukrzycowych. Model ten wykorzystuje indukcję stresu oksydacyjnego oraz hamowanie kluczowych enzymów antyoksydacyjnych w celu stworzenia ran, które pozostają otwarte, wykształcają biofilm i wykazują charakter przewlekły, stanowiąc tym samym wartościowe narzędzie do badania mechanizmów leżących u podstaw powstawania i utrzymywania się ran przewlekłych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Badania nad gojeniem ran
- Powikłania cukrzycy
- Modelowanie zwierzęce
Wstęp
- Przewlekłe rany są wynikiem rozregulowania komórkowych i molekularnych procesów gojenia.
- Dotykają one milionów ludzi i generują wysokie koszty leczenia.
- Istniejące modele mają ograniczenia w odtwarzaniu cech ludzkich ran przewlekłych.
- Tworzenie biofilmu i utrzymujące się otwarte rany są cechami charakterystycznymi dla przewlekłego przebiegu.
Cel badania
- Stworzenie powtarzalnego modelu mysiego, który dokładnie odzwierciedla przebieg przewlekłych ran cukrzycowych u ludzi.
- Umożliwienie badania mechanizmów komórkowych i molekularnych odpowiedzialnych za przewlekły charakter ran.
- Zapewnienie platformy do testowania interwencji terapeutycznych skierowanych przeciwko ranom przewlekłym.
Zastosowane metody
- Przygotowanie myszy db/db-/- poprzez golenie i depilację skóry grzbietu.
- Podanie buprenorfiny w celu zapewnienia analgezji oraz ATZ w celu zahamowania enzymów przeciwutleniających.
- Wykonanie pełnej grubości rany na grzbiecie przy użyciu 7 mm puncha do biopsji i wycięcia chirurgicznego.
- Miejscowe zastosowanie MSA (inhibitora) w celu wywołania stresu oksydacyjnego w miejscu rany.
- Utrzymanie warunków nisterylnych w celu zachowania naturalnego mikrobiomu skóry.
- Obserwacja i dokumentacja progresji rany, tworzenia się biofilmu oraz jej przewlekłości.
Główne wyniki
- Rany wykazują wysoki stres oksydacyjny oraz zmienione brzegi rany w ciągu kilku godzin.
- Naturalnie tworzy się biofilm, w którym obecne są bakterie takie jak gatunki Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Staphylococcus i Corynebacterium.
- Rany stają się w pełni przewlekłe w ciągu 20 dni i mogą pozostawać otwarte przez ponad 60 dni.
- Model odzwierciedla kluczowe cechy ludzkich przewlekłych ran cukrzycowych.
Wnioski
- Ten model mysi stanowi solidną platformę do badania patogenezy przewlekłych ran.
- Umożliwia on badanie współzależności między stresem oksydacyjnym, mikrobiomem a niepowodzeniem procesu gojenia ran.
- Protokół ten wspiera opracowywanie i testowanie nowych strategii terapeutycznych w leczeniu ran przewlekłych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Ten model myszy z cukrzycą wypełnia krytyczną lukę w przedklinicznych badaniach nad gojeniem ran, odtwarzając kluczowe cechy patofizjologiczne ludzkich przewlekłych ran cukrzycowych, w tym tworzenie biofilmu napędzane stresem oksydacyjnym oraz przedłużające się fenotypy braku gojenia. Umożliwia on mechanistyczną redukcję ryzyka w przypadku kandydatów terapeutycznych celujących w szlaki przewlekłości ran, co zwiększa wiarygodność predykcyjną w procesach walidacji celu i identyfikacji cząsteczek wiodących. Znaczenie tego modelu w kontekście rocznego obciążenia finansowego rzędu 40 mld USD w USA podkreśla jego strategiczną wartość dla selekcji projektów w programach dermatologicznych i medycyny regeneracyjnej.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie stresu oksydacyjnego oraz inhibicji enzymów przeciwutleniających jako mechanistycznych czynników prowadzących do przewlekłości ran.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system do walidacji celów zaangażowanych w regulację redoks oraz tworzenie biofilmu.
- Wartość naukowa: Wspiera testowanie hipotez dotyczących szlaków łączących cukrzycę, upośledzone gojenie i uporczywy stan zapalny.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Generuje mierzalne wskaźniki gojenia ran oraz obciążenie biofilmem jako zmienne zależne do przesiewania związków.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje indukcję rany poprzez miejscowe zastosowanie inhibitorów katalazy i peroksydazy glutationowej, umożliwiając przygotowanie do analizy.
- Wartość naukowa: Dostarcza istotnych w kontekście choroby wyników, w tym utrzymujących się otwartych ran, obciążenia mikrobiologicznego oraz histologicznych cech przewlekłości.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Odzwierciedla mikrobiologię ludzkich ran cukrzycowych, w tym Pseudomonas aeruginosa oraz gatunki Staphylococcus, co zwiększa trafność prognostyczną.
- Wartość operacyjna: Umożliwia długofalowe monitorowanie od rany ostrej do pełnej przewlekłości w 20 dniu, wspierając oceny skuteczności zależne od czasu.
- Wartość naukowa: Ułatwia odkrywanie biomarkerów związanych ze stresem oksydacyjnym, kolonizacją drobnoustrojową i odpowiedzią gospodarza w kontekście cukrzycy.
Integracja potoków i przepływów pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu po optymalizację związku wiodącego, w szczególności w przypadku metod ukierunkowanych na modulowanie stresu oksydacyjnego, przeżywalności drobnoustrojów lub interakcji gospodarz-patogen w ranach cukrzycowych.
- Biologia odkrywcza: Testowanie hipotez terapeutycznych dotyczących równowagi redoks i rozbijania biofilmu w mikrośrodowisku rany cukrzycowej.
- Przesiewanie: Umożliwia ocenę związków redukujących trwałość ran lub tworzenie biofilmu w warunkach cukrzycy.
- Analityka: Dostarcza ilościowe punkty końcowe, takie jak powierzchnia rany w czasie, ładunek mikrobiologiczny oraz markery stresu oksydacyjnego, służące do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań.
- Badania translacyjne: Łączy etap odkryć z walidacją przedkliniczną poprzez replikowanie ram czasowych przewlekłości ran ludzkich oraz profili mikrobiologicznych.
- Zastosowania w przedsiębiorstwie: Służy jako wielokrotnego użytku platforma dla wielu klas celów terapeutycznych, w tym inhibitorów enzymów, środków przeciwdrobnoustrojowych i immunomodulatorów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w szlakach gojenia ran poprzez modelowanie czynników odpowiedzialnych za przewlekłość charakterystyczną dla cukrzycy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji procesu zadawania ran, indukcji stresu oksydacyjnego oraz utrzymywaniu zwierząt w konwencjonalnych warunkach wiwaryjnych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez odfiltrowanie kandydatów o nieplauzabilnych mechanistycznie działaniach przed kosztownymi badaniami w późnych fazach.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację programów gojenia ran z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o skuteczność w klinicznie istotnym modelu cukrzycy.
Wskazówki dotyczące implementacji
- Doświadczenie w obsłudze myszy z cukrzycą, technikach zadawania ran oraz podawaniu środków miejscowych.
- Dostęp do sterylnego PBS, buprenorfiny, ATZ, inhibitorów katalazy i peroksydazy glutationowej, MSA oraz przezroczystych opatrunków foliowych.
- Standaryzacja wielkości rany, czasu indukcji stresu oksydacyjnego oraz oceny biofilmu pomiędzy operatorami.
- Uwzględnienie adaptacji dla różnych szczepów myszy lub modeli cukrzycy innych niż db/db.
- Ograniczenia obejmują zależność od niesterylnego mikrobiomu skóry oraz zmienność kinetyki tworzenia biofilmu.
