Name: Protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy z cukrzycą (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Poznaj protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy db/db z cukrzycą poprzez indukcję stresu oksydacyjnego i inhibicję enzymów antyoksydacyjnych. Model ten naśladuje ludzkie rany przewlekłe z biofilmem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy nie mają żadnych podziękowań.

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Po utworzeniu przewlekłych ran na myszach, model można wykorzystać do badania upośledzonych procesów gojenia się ran związanych z inicjacją przewlekłości. Model może być również wykorzystany do testowania skuteczności szerokiej gamy substancji chemicznych i leków, które mogą odwrócić przewlekły rozwój ran i upośledzone gojenie oraz prowadzić do zamykania i gojenia się ran. Można badać różne punkty czasowe po wystąpieniu przewlekłości : np. dni 1-5 po zranieniu w przypadku wczesnego początku przewlekłości i 20 dn...

Gojenie ran obejmuje złożone procesy komórkowe i molekularne, które są regulowane czasowo i przestrzennie, zorganizowane w sekwencyjne i nakładające się na siebie etapy, które obejmują wiele różnych typów komórek, w tym, ale nie ograniczając się do odpowiedzi immunologicznej i układu naczyniowego1. Natychmiast po tym, jak skóra dozna urazu, czynniki i komórki krwi gromadzą się w miejscu rany i inicjują kaskadę krzepnięcia, tworząc skrzep. Po osiągnięciu homeostazy naczynia krwionośne rozszerzają się, aby wpuścić do miejsca rany tlen, składniki odżywcze, enzymy, przeciwciała i czynniki chemotaktyczne, które chemoprzyciągają polimorfonukleocyty, aby oczyścić łożysko rany z obcych zanieczyszczeń i wydzielać enzymy proteolityczne2. Aktywowane płytki krwi wydzielają różne czynniki wzrostu, które stymulują keratynocyty na brzegu rany w celu ponownego nabłonkowania zranionego obszaru. Monocyty zrekrutowane do miejsca rany różnicują się w makrofagi, które fagocytozą bakterie i martwe neutrofile oraz wydzielają dodatkowe czynniki w celu utrzymania sygnałów proliferacyjnych i promigracyjnych keratynocytów. W fazie proliferacji, podczas gdy trwa reepitelializacja, nowa tkanka ziarninowa złożona z fibroblastów, monocytów/makrofagów, limfocytów i komórek śródbłonka kontynuuje proces odbudowy2. Angiogeneza jest stymulowana przez promowanie proliferacji i migracji komórek śródbłonka, co skutkuje rozwojem nowych naczyń. Nabłonek i przebudowa macierzy zewnątrzkomórkowej budują barierę przed środowiskiem. W miarę gojenia się rany i ziarniny tkanki przekształcającej się w bliznę, apoptoza eliminuje komórki zapalne, fibroblasty i komórki śródbłonka, nie powodując dodatkowych uszkodzeń tkanek. Wytrzymałość tkanki na rozciąganie jest zwiększana przez fibroblasty przebudowujące różne składniki macierzy zewnątrzkomórkowej, takie jak kolagen, dzięki czemu nowo powstała tkanka jest prawie tak mocna i elastyczna jak niezraniona skóra2.
Każde odchylenie od tego wysoce skoordynowanego postępu w kierunku zamykania ran prowadzi do upośledzenia i/lub przewlekłych ran3. Rany przewlekłe charakteryzują się zwiększonym stresem oksydacyjnym, przewlekłym stanem zapalnym, uszkodzoną mikrokrążeniem i nieprawidłową macierzą kolagenową w ranie4. Stres oksydacyjny, zwłaszcza w ranie, może opóźnić zamknięcie rany2,5. Kiedy w pierwszym etapie gojenia się ran faza zapalna staje się nieuregulowana, tkanka gospodarza ulega rozległym uszkodzeniom z powodu ciągłego napływu komórek zapalnych5, które uwalniają enzymy cytotoksyczne, wzrost wolnych rodników tlenowych i nieuregulowane mediatory stanu zapalnego, co prowadzi do śmierci komórki6,7.
W tym destrukcyjnym mikrośrodowisku, bakterie tworzące biofilm wykorzystują składniki odżywcze gospodarza i przyczyniają się do uszkodzenia tkanki gospodarza2. Te biofilmy są trudne do kontrolowania i usuwania, ponieważ uwodnione zewnątrzkomórkowe substancje polimerowe złożone z białek, DNA, RNA i polisacharydów pozwalają bakteriom znajdującym się w środku być tolerancyjnymi na konwencjonalne antybiotyki i unikać wrodzonej i adaptacyjnej odpowiedzi immunologicznej gospodarza2,8,9.
Badanie ran przewlekłych jest kluczowe, ponieważ dotykają one ~6,5 miliona ludzi i kosztują ~40 miliardów dolarów rocznie w samych Stanach Zjednoczonych10. Pacjenci z cukrzycą mają zwiększone ryzyko rozwoju przewlekłych ran, które wymagają amputacji w celu powstrzymania rozprzestrzeniania się infekcji. U tych pacjentów ryzyko śmiertelności w ciągu 50 lat po amputacji jest przypisywane mechanizmowi patofizjologii cukrzycy11. Związek między układem odpornościowym gospodarza a mikrobiomem w gojeniu się ran jest istotnym tematem trwających badań, ponieważ konsekwencje ran przewlekłych, jeśli nie są leczone, obejmują amputację i śmierć12.
Chociaż włożono wiele wysiłku w zrozumienie, jak rozwijają się rany przewlekłe u ludzi, nadal nie jest jasne, jak i dlaczego powstają rany przewlekłe. Eksperymenty mające na celu zbadanie mechanizmów upośledzonego gojenia są trudne do przeprowadzenia u ludzi, a specjaliści zajmujący się gojeniem ran widzą tylko pacjentów z przewlekłymi ranami, które osiągnęły już przewlekłość przez tygodnie lub miesiące. W związku z tym specjaliści nie są w stanie zbadać, jakie procesy poszły nie tak, co doprowadziło do tego, że rana rozwinęła się w przewlekłą2. Brakuje modeli zwierzęcych, które oddawałyby złożoność ludzkich ran przewlekłych. Dopóki nie opracowaliśmy naszego modelu, nie istniał żaden model do badań nad ranami przewlekłymi.
Model ran przewlekłych został opracowany u myszy, które mają mutację w receptorze leptyny (db/db-/-)13. Te myszy są otyłe, chorują na cukrzycę i mają upośledzone gojenie, ale nie rozwijają przewlekłych ran14. Średni poziom glukozy we krwi wynosi około 200 mg/dl, ale może sięgać nawet 400 mg/dl15. Gdy wysoki poziom stresu oksydacyjnego (OS) w tkance rany zostanie wywołany natychmiast po zranieniu, rana staje się przewlekła16. Rany db/db-/- są uważane za przewlekłe przez 20 dni i pozostają otwarte przez 60 dni lub dłużej. Biofilm wytwarzany przez bakterie rozwija się od trzech dni po zranieniu; Dojrzały biofilm jest widoczny 20 dni po zranieniu i utrzymuje się do zamknięcia każdej z ran. Bakterie tworzące biofilm, które znajdujemy u tych myszy, znajdują się również w ludzkich przewlekłych ranach cukrzycowych.
Stres oksydacyjny jest wywoływany przez leczenie ran dwoma inhibitorami enzymów antyoksydacyjnych, katalazą i peroksydazą glutationową, dwoma enzymami o zdolności rozkładu nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru jest reaktywną formą tlenu i może powodować uszkodzenia komórek poprzez utlenianie białek, lipidów i DNA. Katalaza katalizuje rozkład nadtlenku wodoru na mniej szkodliwe substancje chemiczne, tlen i wodę. 3-amino-1,2,4-triazol (ATZ) hamuje katalazę poprzez specyficzne i kowalencyjne wiązanie się z aktywnym centrum enzymu, dezaktywując go17,18,19. ATZ został wykorzystany do badania skutków stresu oksydacyjnego zarówno in vitro, jak i in vivo poprzez hamowanie katalazy20,21,22,23,24. Peroksydaza glutationowa katalizuje redukcję nadtlenku wodoru poprzez przeciwutleniacz, glutation, i jest ważnym enzymem, który chroni komórkę przed stresem oksydacyjnym25. Kwas merkaptobursztynowy (MSA) hamuje peroksydazę glutationową poprzez wiązanie się z miejscem aktywnym selenocysteiny enzymu z tiolem, dezaktywując go26. MSA został wykorzystany do badania skutków stresu oksydacyjnego również in vitro i in vivo20,27,28.
Ten nowatorski model ran przewlekłych jest potężnym modelem do zbadania, ponieważ ma wiele cech obserwowanych w ludzkich przewlekłych ranach cukrzycowych, w tym przedłużony stan zapalny spowodowany zwiększonym OS i naturalne tworzenie biofilmu z mikrobiomu skóry. Rany mają upośledzoną interakcję skórno-naskórkową, nieprawidłowe odkładanie się macierzy, słabą angiogenezę i uszkodzone naczynienie. Przewlekłe rany rozwijają się zarówno u samców, jak i samic myszy, więc obie płcie mogą być wykorzystane do badania ran przewlekłych. W związku z tym model ran przewlekłych może znacząco przyczynić się do pogłębienia podstawowej wiedzy na temat tego, jak takie rany się zaczynają. Korzystanie z tego modelu ran przewlekłych może dostarczyć odpowiedzi na fundamentalne pytania dotyczące tego, w jaki sposób przewlekłość jest inicjowana/osiągana dzięki wkładowi fizjologii upośledzonego gojenia się ran i mikrobiomu gospodarza.

<table><tbody><tr><td>Klasa B6. BKS(D)-Leprdb/J&nbsp;</td><td>Laboratorium Jacksona&nbsp;</td><td>00697</td><td>Dostępne homozygoty i heterozygoty&nbsp;</td></tr><tr><td>Nair Emulsja do depilacji z kojącym aloesem i lanoliną</td><td>Nair</td><td></td><td>chemiczny środek do depilacji</td></tr><tr><td>Buprenex (buprenorfina HCl)</td><td>Henry Stein Zdrowie zwierząt</td><td>059122</td><td>0,3 mg/ml, klasa 3</td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4-triazol (ATZ)</td><td>TCI</td><td>A0432</td><td></td></tr><tr><td>Kwas merkaptobursztynowy (MSA)</td><td>Aldrich</td><td>88460</td><td></td></tr><tr><td>Bufor fosforanowy (PBS)</td><td></td><td></td><td>sterylizowany w autoklawie</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>029405</td><td>NDC 11695-6776-2</td></tr><tr><td>Butla tlenu</td><td></td><td></td><td>musi być kompatybilna z systemem waporyzacji</td></tr><tr><td>Waporyzator izofluranowy</td><td>JA Baulch & Współpracownicy&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maszynka do strzyżenia włosów Wahl</td><td></td><td></td><td>Lithium Ion Pro</td></tr><tr><td>Acu Punch 7mm dziurki do biopsji skóry</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P750</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm&nbsp;</td><td>3M</td><td>Nr ref.: 1624W</td><td>Przezroczysty opatrunek foliowy (6 cm x 7 cm)</td></tr><tr><td>Poduszka grzewcza</td><td>Conair</td><td></td><td>Moist Dry Poduszka grzewcza</td></tr><tr><td>Strzykawki</td><td>insulinowe BD</td><td>329461</td><td>0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2")</td></tr><tr><td>70% etanolu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pęseta</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ostre nożyczki</td> <td>chirurgiczne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cienka metalowa szpatułka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rurka</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stożek</td><td></td><td></td><td></td>nosowy myszy</tr><tr><td>Rękawiczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>małe plastikowe pojemniki</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy z cukrzycą

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Przewlekłe rany powstają w wyniku wadliwej regulacji w jednym lub więcej złożonych procesach komórkowych i molekularnych związanych z prawidłowym gojeniem. Dotykają one ~6,5 mln ludzi i kosztują ~40 mld USD rocznie w samych Stanach Zjednoczonych. Chociaż włożono wiele wysiłku w zrozumienie, w jaki sposób rozwijają się rany przewlekłe u ludzi, podstawowe pytania pozostają bez odpowiedzi. Niedawno opracowaliśmy nowatorski mysi model przewlekłych ran cukrzycowych, które mają wiele cech charakterystycznych dla ludzkich ran przewlekłych. Używając myszy db/db-/-, możemy generować przewlekłe rany, wywołując wysoki poziom stresu oksydacyjnego (OS) w tkance rany natychmiast po zranieniu, stosując jednorazowe leczenie inhibitorami specyficznymi dla enzymów przeciwutleniających katalazy i peroksydazy glutationowej. Rany te mają wysoki poziom OS, naturalnie rozwijają biofilm, stają się w pełni przewlekłe w ciągu 20 dni po leczeniu i mogą pozostać otwarte dłużej niż 60 dni. Ten nowatorski model ma wiele cech przewlekłych ran cukrzycowych u ludzi, a zatem może znacząco przyczynić się do pogłębienia podstawowej wiedzy na temat tego, w jaki sposób rany stają się przewlekłe. Jest to duży przełom, ponieważ przewlekłe rany u ludzi powodują znaczny ból i niepokój u pacjentów, a w przypadku nierozwiązania skutkują amputacją. Co więcej, rany te są bardzo kosztowne i czasochłonne w leczeniu oraz prowadzą do znacznych strat w dochodach osobistych pacjentów. Postęp w tej dziedzinie badań dzięki zastosowaniu naszego modelu ran przewlekłych może znacznie poprawić opiekę zdrowotną dla milionów osób cierpiących na tę wyniszczającą chorobę. W tym protokole bardzo szczegółowo opisujemy procedurę, która ma na celu spowodowanie, że ostre rany staną się przewlekłe, co nie było wcześniej wykonywane.

Rysunek 5 przedstawia przykład rany bez zastosowania inhibitorów, która zmierza do zamknięcia, oraz rany z zastosowaniem inhibitorów, która przekształca się w ranę przewlekłą. Przezroczysty opatrunek pozostawiono na ranie przewlekłej, aby umożliwić obserwację biofilmu oraz gromadzenia się płynu.
Inicjacja rany przewlekłej następuje w czasie krótszym niż 6 godzin, a brzegi rany ulegają widocznym zmia...

Z tym artykułem związana jest aktualizacja. <a href="https://app.jove.com/v/67395">Kliknij tutaj, aby zobaczyć aktualizację.</a>
Przewlekłe rany powstają z ostrych ran na mysim modelu cukrzycowym poprzez wywołanie wysokiego poziomu stresu oksydacyjnego po pełnej grubości rany skórnej. Rana jest leczona inhibitorami katalazy i peroksydazy glutationowej, co powoduje upośledzenie gojenia i rozwoju biofilmu przez bakterie obecne w mikrobiomie skóry.

Protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy z cukrzycą

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Ten mysi model może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie medycyny dotyczące przewlekłości ran. Główną zaletą tego modelu jest to, że rany przewlekłe u myszy naśladują wiele aspektów ran przewlekłych u ludzi. Aby rozpocząć, umieść mysz na czystej powierzchni i przytrzymaj ją w miejscu, ściskając podstawę ogona.Następnie przygotuj maszynkę do strzyżenia włosów i bądź gotowa do szybkiego ich odciągnięcia, jeśli mysz wykona jakiekolwiek gwałtowne ruchy. Ogol cały grzbiet od szyi do ogona, w tym wokół ogona. Delikatnie przesuwaj ostrze w kierunku przeciwnym do kierunku wzrostu włosów, aby uzyskać najbardziej efektywne strzyżenie.Nie wciskaj maszynki do strzyżenia głęboko w skórę, ponieważ może to spowodować siniaki lub skaleczenia. Następnie przygotuj skórę do nałożenia balsamu do depilacji. Zwilż skórę ręcznikiem papierowym nasączonym wodą, aby zapobiec oparzeniom chemicznym.Lekko dociśnij z wystarczającym naciskiem, aby zwilżyć ścięte włosy przy skórze. Następnie, gdy skóra jest mokra, wcieraj niewielką porcję balsamu do depilacji w ogolony obszar przez 15 do 20 sekund. Po nałożeniu pozwól balsamowi reagować ze skórą przez 20 do 45 sekund.Przed spłukaniem balsamu delikatnie zetr

protocol-to-create-chronic-wounds-in-diabetic-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Opracowaliśmy małoinwazyjną technikę tworzenia modelu niedokrwiennej rany ucha u królika poprzez przerwanie tętnicy centralnej, nerwu oraz czaszkowego pęczka naczyniowo-nerwowego. Następnie wykonuje się tunel podskórny, przecinając wszystkie tkanki podskórne. Procedura ta powoduje minimalne uszkodzenie skóry i może być bezpiecznie stosowana u zwierząt z cukrzycą.

Uproszczona technika wytwarzania modelu rany niedokrwiennej

Mysi model gojenia się ran skórnych, który może być używany do oceny związków terapeutycznych w warunkach fizjologicznych i patofizjologicznych.

Mysi model gojenia się ran

Komórki macierzyste pochodzące z tkanki tłuszczowej (ASC) są łatwo izolowane i zbierane z tłuszczu normalnych szczurów. Arkusze ASC mogą być tworzone przy użyciu inżynierii arkuszy komórkowych i mogą być przeszczepiane do tłustych szczurów z cukrzycą Zuckera, wykazujących defekty skóry na całej grubości z odsłoniętą kością, a następnie pokryte dwuwarstwą sztucznej skóry.

Tworzenie i przeszczepianie arkusza komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) w modelu gojenia się ran cukrzycowych

Tutaj opisujemy nowy model myszy z cukrzycą, wykorzystujący bezwłose myszy do nieinwazyjnego monitorowania w czasie rzeczywistym infekcji ran biofilmu bioluminescencyjnych Pseudomonas aeruginosa. Metodę tę można zaadaptować do oceny infekcji innymi gatunkami bakterii i mikroorganizmami modyfikowanymi genetycznie, w tym biofilmami wielogatunkowymi, oraz do testowania skuteczności strategii zwalczania biofilmu.

Przejdźmy na jasną stronę mocy: monitorowanie in vivo zakażeń biofilmem Pseudomonas aeruginosa w ranach przewlekłych w modelu myszy bezwłosej z cukrzycą

Przygotowane rusztowanie DOX-CL spełniało warunki idealnego opatrunku DW pod względem wytrzymałości mechanicznej, porowatości, absorpcji wody, szybkości degradacji, przedłużonego uwalniania, właściwości przeciwbakteryjnych, biokompatybilności i przeciwzapalnych, które są uważane za niezbędne do odzyskania uszkodzonej tkanki w DW.

Rusztowanie kompozytowe z kolagenem i chitozanem naładowane doksycykliną do przyspieszonego gojenia się ran cukrzycowych

Model ran cukrzycowych wywołanych streptozotocyną u samców szczurów SD jest obecnie najczęściej używanym modelem do badania gojenia się ran w cukrzycy typu I. Niniejszy protokół opisuje metody użyte do skonstruowania tego modelu. Przedstawiono również potencjalne wyzwania i omówiono je, a także zbadano progresję i charakterystykę angiogenną ran cukrzycowych.

Protokół konstruowania modelu rany szczurzej cukrzycy typu 1

Przedstawiono uproszczony protokół do tworzenia modelu gojenia ran oparzeniowych u myszy za pomocą cyfrowego urządzenia grzewczego. Przypominające szachownicę miejsca eksperymentalne utworzone na skórze ułatwiają dalszą analizę funkcjonalną w teście gojenia się ran.

Szachownica gojącego rany po oparzeniach model myszy oparty na cyfrowym urządzeniu grzewczym

Rany stanowią globalne wyzwanie zdrowotne. W ramach tego badania opracowano standaryzowaną kabinę fotograficzną wykorzystującą planimetrię cyfrową w celu zminimalizowania zmienności pomiaru rany. Monitorowanie ran u myszy przez 14 dni wykazało początkowy wzrost powierzchni i obwodu rany, po którym następowało stopniowe zamykanie. Metodologia ta może pomóc w ocenie kinetyki zamykania ran w modelach przedklinicznych.

Planimetria cyfrowa do oceny kinetyki zamykania ran w modelu mysim

Niniejszy artykuł opisuje protokół hipertermii całego ciała u myszy, który może stymulować stany przypominające gorączkę przez okres od 12 do 24 hr.

Protokół długotrwałej hipertermii całego ciała u myszy

Opisujemy tworzenie wątrobowych neo-wysepek u myszy z cukrzycą indukowaną STZ (streptozotocyną) poprzez transfer genów Neurogenin3 (Ngn3) i Betacellulin (Btc) z wykorzystaniem zależnego od helpera wektora adenowirusowego (HDAd) oraz odwrócenie hiperglikemii. Nasza metoda wykorzystuje zależne od helpera wektory adenowirusowe, które charakteryzują się wysoką wydajnością transdukcji in vivo oraz długotrwałą ekspresją genów.

Tworzenie neo-wysepek w wątrobie myszy z cukrzycą za pomocą transferu genów za pośrednictwem adenowirusowego wektora zależnego od pomocnika

Poznaj protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy db/db z cukrzycą poprzez indukcję stresu oksydacyjnego i inhibicję enzymów antyoksydacyjnych. Model ten naśladuje ludzkie rany przewlekłe z biofilmem.

Protokół tworzenia przewlekłych ran u myszy z cukrzycą

Przeglądaj więcej filmów