Name: In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-15T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Poznaj metodę elektrofizjologicznego pomiaru CMAP w kończynach przednich myszy. Technika umożliwia wczesne wykrywanie degeneracji aksonów i demielinizacji w modelach neurodegeneracyjnych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Badania te były wspierane przez KU Leuven ("Otwarcie Przyszłości" i C1), Fundusz Badań Naukowych Flandrii (FWO-Vlaanderen), Fundację Thierry'ego Latrana, Association Belge contre les Maladies neuro-Musculaires (ABMM), Stowarzyszenie Dystrofii Mięśniowej (MDA), Stowarzyszenie ALS oraz ALS Liga (Belgia). PVD jest starszym inspektorem śledczym FWO-Vlaanderen. RP był wspierany przez granty z Central Remedial Clinic (CRC) Ireland, a obecnie jest wspierany przez National University of Ireland (NUI) i FWO.

Wszystkie zwierzęta były utrzymywane w standardowych warunkach zgodnie z wytycznymi KU Leuven - Uniwersytetu w Leuven oraz powiązanymi z nimi wytycznymi europejskimi (Dyrektywa Unii Europejskiej 2010/63/EU w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych). Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostały zatwierdzone przez lokalną komisję etyczną KU Leuven.
1. Przygotowanie zwierząt i znieczulenie
<ol>
	<li>Wprowadź mysz w stan znieczulenia poprzez inhalację izofluranu w mieszaninie z tlenem. Do indukcji znieczulenia zastosuj 4% izofluranu, a do jego podtrzymania 2-3% przy przepływie tlenu wynoszącym 2,5 l/min. Dostosuj stężenie izofluranu podczas podtrzymywania znieczulenia w zależności od stanu myszy. t. j.małe i słabe myszy wymagają mniejszej ilości środków anestetycznych. Potwierdź prawidłowe znieczulenie np.wywierając lekki nacisk na podkładkę do chodzenia kończyn tylnych, aby sprawdzić brak odruchu wycofania z powodu bólu.</li>
	<li>Kontroluj temperaturę ciała myszy, korzystając z termostatycznej płyty grzewczej przy 37 °C aby zapobiec obniżeniu temperatury ciała podczas znieczulenia.</li>
	<li>Załóż myszy maskę nosową w celu utrzymania znieczulenia. Upewnij się, że zwierzę otrzymuje wystarczającą ilość tlenu, sprawdzając, czy maska nie blokuje dróg oddechowych oraz czy zwierzę oddycha miarowo.</li>
	<li>Podczas rejestracji należy monitorować, czy mysz jest w wystarczającym stopniu znieczulona, obserwując częstotliwość oddechów (około 1 Hz w znieczuleniu) oraz brak odruchu cofania po lekkim ucisku. W przypadku zbyt płytkiej znieczulenia należy ręcznie zwiększyć stężenie izofluranu.</li>
	<li>Po dokonaniu pomiarów pozostawić mysz na płycie grzewczej lub w cieple lampy podczerwonej do czasu odzyskania przez nią wystarczającej świadomości, aby mogła utrzymać pozycję grzbietową, przez około 2–5 min. Nie pozostawiać myszy bez nadzoru ani w towarzystwie innych myszy do czasu pełnego wybudzenia z narkozy.</li>
</ol>
2. Pomiar CMAP w kończynach tylnych i przednich
<img alt="Układ do elektrofizjologii gryzoni; schemat rozmieszczenia elektrod do pomiaru aktywności neuronalnej." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Rozmieszczenie elektrod do pomiarów CMAP. Pozycje elektrod przedstawiono dla kończyn tylnych (A) i przednich (B). Elektrody ponumerowano w następujący sposób: 1: anoda i 2: katoda (elektrody stymulujące), 3: aktywna elektroda rejestrująca, 4: elektroda referencyjna oraz 5: elektroda uziemiająca. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<ol>
	<li>Do pomiarów CMAP kończyn tylnych i przednich należy użyć elektrod igłowych 27 G. Zalecane miejsca rozmieszczenia elektrod przedstawiono na Rysunku 1.</li>
	<li>Elektrody na kończynie tylnej należy umieścić w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Umieścić mysz na podgrzewaczu w pozycji brzusznej. Wyprostować kończynę tylną w stawie kolanowym i przymocować łapę do powierzchni roboczej za pomocą taśmy klejącej (Rysunek 1A).</li>
		<li>Umieścić elektrody stymulujące podskórnie po obu stronach wyrostka kłykciowego z odległością około 2 cm między elektrodami (1 = anoda i 2 = katoda). Unieść skórę, aby wprowadzić igłę prostopadle przez skórę, i przesunąć około 5 mm igły pod skórę, nie przebijając leżących poniżej mięśni.</li>
		<li>Podobnie umieścić podskórnie elektrodę rejestrującą (3), dopasowując ją do mięśnia brzuchatego łydki. Wprowadzić elektrodę referencyjną (4) podskórnie obok ścięgna Achillesa pod kątem 30 stopni, pozostawiając 2-5 mm igły pod skórą. Umieścić elektrodę uziemiającą (5) podskórnie z boku ciała myszy w sposób analogiczny do elektrod stymulujących, przy czym pozycja tej elektrody nie jest krytyczna dla pomiaru.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Elektrody na kończynach przednich należy umieścić w następujący sposób:
	<ol>
		<li>Umieścić mysz na podgrzewaczu w pozycji grzbietnej i za pomocą taśmy klejącej wyprostować obie kończyny przednie po bokach ciała (Rysunek 1B).</li>
		<li>Umieścić elektrody stymulujące (1 = anoda i 2 = katoda) podskórnie po obu stronach kończyny przedniej tak, aby odpowiadały przebiegowi splotu ramiennego. Unieść skórę, aby wprowadzić igłę prostopadle przez skórę, i przesunąć około 5 mm igły pod skórę, nie przebijając leżących poniżej mięśni.</li>
		<li>Umieścić elektrodę rejestrującą (3) podskórnie nad mięśniem dwugłowym ramienia, unosząc skórę. Umieścić elektrodę referencyjną (4) w poduszkach łapy na głębokości 3 mm pod kątem 30 stopni. Umieścić elektrodę uziemiającą (5) podskórnie z boku ciała myszy. 
		UWAGA: W tej konfiguracji elektrody znajdują się w bliskiej odległości od siebie. Należy zapobiegać ich wzajemnemu dotykaniu, ponieważ zniekształca to zapis.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Pozyskiwanie danych
<ol>
	<li>Rozpocznij stymulację, naciskając przycisk recurrent stimulus w jednostce sterującej, a następnie obróć pokrętło regulatora natężenia, aby zwiększyć bodziec. Stymuluj wszystkie aksony, stosując 1 impuls/s o czasie trwania bodźca 0,1 ms. Wybierz odpowiednią częstotliwość i czas trwania z menu rozwijanego w oprogramowaniu.</li>
	<li>Aby osiągnąć bodźce supramaksymalne (5-20 mA; w warunkach demielinizacji do 60 mA), stosuj bodźce o rosnącym natężeniu, obracając pokrętło regulatora natężenia, aż amplituda odpowiedzi CMAP przestanie rosnąć. Następnie zwiększ bodziec o kolejne 20%, aby upewnić się, że amplituda CMAP osiągnęła odpowiedź maksymalną. Zakończ stymulację, ponownie naciskając przycisk recurrent stimulus.</li>
	<li>Użyj narzędzia znacznikowania, aby wskazać następujące punkty w zapisie: początek bodźca, początek odpowiedzi, maksymalny szczyt dodatni oraz maksymalny szczyt ujemny (Rycina 2).</li>
	<li>Wyznacz latencję (w ms) jako opóźnienie od początku bodźca do początku odpowiedzi (Rycina 2). Za początek odpowiedzi uznaj najwcześniejszy punkt, w którym amplituda zaczyna rosnąć. Wykorzystaj latencję do oceny demielinizacji aksonów.</li>
	<li>Zmierz amplitudę (mV) od maksymalnego szczytu ujemnego do maksymalnego szczytu dodatniego (Rycina 2). Wykorzystaj wartość amplitudy do skorelowania liczby funkcjonalnych aksonów.</li>
</ol>
<img alt="Schemat przebiegów elektrofizjologicznych przedstawiający amplitudę i latencję, pomiar potencjału czynnościowego." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentacyjny obraz odpowiedzi CMAP. Schematyczna odpowiedź CMAP wskazująca punkty wykorzystywane do obliczania amplitudy i latencji (A). Latencję określa się jako opóźnienie od momentu stymulacji do początku odpowiedzi CMAP. Amplitudę szczyt-szczyt mierzy się od maksymalnego piku ujemnego do maksymalnego piku dodatniego fali dwufazowej. Reprezentacyjne zapisy ze zdrowego zwierzęcia nietransgenicznego (B) oraz zwierzęcia chorego z wydłużoną latencją i zmniejszoną amplitudą (C). <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>
<ol start="6">
	<li>Ponieważ dokładne rozmieszczenie elektrod może wpływać na wartość uzyskaną podczas rejestracji, należy ponownie umieścić elektrody i trzykrotnie zmierzyć ten sam nerw, stosując bodziec nadmaksymalny, aby upewnić się, że uzyskano największą odpowiedź. Należy wykorzystać średnią z tych pomiarów.</li>
</ol>

<ol><li>Brown, R. H., Al-Chalabi, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28700839">Amyotrophic Lateral Sclerosis.</a> N Engl J Med. 377 (2), 162-172 (2017).</li>
<li>Prior, R., Van Helleputte, L., Benoy, V., Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+axonal+transport%3A+A+common+pathological+mechanism+in+inherited+and+acquired+peripheral+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Defective axonal transport: A common pathological mechanism in inherited and acquired peripheral neuropathies.</a> Neurobiol Dis. , 300-320 (2017).</li>
<li>de Carvalho, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrodiagnostic+criteria+for+diagnosis+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Electrodiagnostic criteria for diagnosis of ALS.</a> Clin Neurophysiol. 119 (3), 497-503 (2008).</li>
<li>Krajewski, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurological+dysfunction+and+axonal+degeneration+in+Charcot-Marie-Tooth+disease+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Neurological dysfunction and axonal degeneration in Charcot-Marie-Tooth disease type 1A.</a> Brain. 123 (Pt 7), 1516-1527 (2000).</li>
<li>Raynor, E. M., Ross, M. H., Shefner, J. M., Preston, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+between+axonal+and+demyelinating+neuropathies%3A+identical+segments+recorded+from+proximal+and+distal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Differentiation between axonal and demyelinating neuropathies: identical segments recorded from proximal and distal muscles.</a> Muscle Nerve. 18 (4), 402-408 (1995).</li>
<li>Zielasek, J., Martini, R., Toyka, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+abnormalities+in+P0-deficient+mice+resemble+human+hereditary+neuropathies+linked+to+P0+gene+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Functional abnormalities in P0-deficient mice resemble human hereditary neuropathies linked to P0 gene mutations.</a> Muscle Nerve. 19 (8), 946-952 (1996).</li>
<li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Motor+Unit+Number+Estimation+%28MUNE%29+Measuring+Compound+Muscle+Action+Potential+%28CMAP%29+in+Mouse+Hindlimb+Muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Motor Unit Number Estimation (MUNE) Measuring Compound Muscle Action Potential (CMAP) in Mouse Hindlimb Muscles.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Schulz, A., Walther, C., Morrison, H., Bauer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+measurements+on+mouse+sciatic+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological measurements on mouse sciatic nerves.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Gurney, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+degeneration+in+mice+that+express+a+human+Cu%2CZn+superoxide+dismutase+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation.</a> Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).</li>
<li>Mitchell, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+human+wild-type+FUS+causes+progressive+motor+neuron+degeneration+in+an+age-+and+dose-dependent+fashion%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Overexpression of human wild-type FUS causes progressive motor neuron degeneration in an age- and dose-dependent fashion.</a> Acta Neuropathol. 125 (2), 273-288 (2013).</li>
<li>Robertson, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+a+new+pmp22+transgenic+mouse+line+with+other+mouse+models+and+human+patients+with+CMT1A%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Comparison of a new pmp22 transgenic mouse line with other mouse models and human patients with CMT1A.</a> J Anat. 200 (4), 377-390 (2002).</li>
<li>Huxley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+varying+levels+of+PMP22+expression+and+the+degree+of+demyelination+and+reduction+in+nerve+conduction+velocity+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Correlation between varying levels of PMP22 expression and the degree of demyelination and reduction in nerve conduction velocity in transgenic mice.</a> Hum Mol Genet. 7 (3), 449-458 (1998).</li>
<li>Turner, B. J., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenics%2C+toxicity+and+therapeutics+in+rodent+models+of+mutant+SOD1-mediated+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transgenics, toxicity and therapeutics in rodent models of mutant SOD1-mediated familial ALS.</a> Prog Neurobiol. 85 (1), 94-134 (2008).</li>
<li>Manganelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nerve+conduction+velocity+in+CMT1A%3A+what+else+can+we+tell%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Neurol%22%5BJournal%5D)">Nerve conduction velocity in CMT1A: what else can we tell.</a> Eur J Neurol. 23 (10), 1566-1571 (2016).</li>
<li>Cornett, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+Variability+of+Childhood+Charcot-Marie-Tooth+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22JAMA+Neurol%22%5BJournal%5D)">Phenotypic Variability of Childhood Charcot-Marie-Tooth Disease.</a> JAMA Neurol. 73 (6), 645-651 (2016).</li>
<li>Jacobson, W. C., Gabel, R. H., Brand, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+vs.+fine-wire+electrode+ensemble-averaged+signals+during+gait%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electromyogr+Kinesiol%22%5BJournal%5D)">Surface vs. fine-wire electrode ensemble-averaged signals during gait.</a> J Electromyogr Kinesiol. 5 (1), 37-44 (1995).</li>
<li>Parker, V., Warman Chardon, J., Mills, J., Goldsmith, C., Bourque, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramaximal+Stimulus+Intensity+as+a+Diagnostic+Tool+in+Chronic+Demyelinating+Neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+J%22%5BJournal%5D)">Supramaximal Stimulus Intensity as a Diagnostic Tool in Chronic Demyelinating Neuropathy.</a> Neurosci J. 2016, 6796270(2016).</li>
<li>Benoy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+Improved+HDAC6+Inhibitors+as+Pharmacological+Therapy+for+Axonal+Charcot-Marie-Tooth+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Development of Improved HDAC6 Inhibitors as Pharmacological Therapy for Axonal Charcot-Marie-Tooth Disease.</a> Neurotherapeutics. 14 (2), 417-428 (2017).</li>
<li>Xia, R. H., Yosef, N., Ubogu, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dorsal+caudal+tail+and+sciatic+motor+nerve+conduction+studies+in+adult+mice%3A+technical+aspects+and+normative+data%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+Nerve%22%5BJournal%5D)">Dorsal caudal tail and sciatic motor nerve conduction studies in adult mice: technical aspects and normative data.</a> Muscle Nerve. 41 (6), 850-856 (2010).</li>
<li>Srivastava, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutant+HSPB1+overexpression+in+neurons+is+sufficient+to+cause+age-related+motor+neuronopathy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Mutant HSPB1 overexpression in neurons is sufficient to cause age-related motor neuronopathy in mice.</a> Neurobiol Dis. 47 (2), 163-173 (2012).</li>
<li>Arnold, W. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+Biomarkers+in+Spinal+Muscular+Atrophy%3A+Preclinical+Proof+of+Concept%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Clin+Transl+Neurol%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological Biomarkers in Spinal Muscular Atrophy: Preclinical Proof of Concept.</a> Ann Clin Transl Neurol. 1 (1), 34-44 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Czułe metody rejestracji są niezbędne do oceny postępu choroby, a zwłaszcza skuteczności terapii w zwierzęcych modelach zaburzeń neuronalnych. Oznaczanie CMAP jest minimalnie inwazyjną techniką elektrofizjologiczną, która jest rutynowo stosowana w klinikach i w warunkach eksperymentalnych do oceny przewodnictwa nerwowego w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych i neuropatycznych 3,18. W tym miejscu opisujemy nowatorskie zastosowanie do rejestracji CMAP u myszy w celu pomiaru przewodnictwa nerwowego w nerwie splotu ramiennego kończyny przedniej. Przedstawiona metoda pozwala na bardziej wszechstronną i szczegółową ocenę podłużną funkcji neuronów w mysich modelach neurodegeneracji.
Elektrody igłowe są nieco bardziej inwazyjne niż elektrody pierścieniowe, a zwłaszcza w badaniach podłużnych należy zachować ostrożność, aby zminimalizować uszkodzenie tkanek. Jedną z możliwych wad tej metody jest uraz wynikający z przekłucia nerwu lub mięśnia. Jednak po starannym podskórnym umieszczeniu elektrod można zapobiec urazom i zaburzeniom mięśni i nerwów. W przeciwieństwie do metody z wykorzystaniem elektrod pierścieniowych, przedstawiona tutaj metoda nie wymaga golenia sierści z dużych partii ciała. W konsekwencji nie ma dyskomfortu ani wpływu na termoregulację dla zwierzęcia.
Umiejscowienie elektrod ma kluczowe znaczenie dla prawidłowego i spójnego rejestrowania amplitud i opóźnień CMAP. Zaleca się zmianę położenia elektrod i wykonanie dwóch do trzech pomiarów w każdym miejscu, aby potwierdzić, że osiągnięto maksymalną stymulację i odpowiedzi. Prawidłowe zapisy powinny dać krzywe dwufazowe, jak pokazano na rysunku 2. Aby ustandaryzować metodę, nietransgeniczne myszy bez uszkodzenia nerwów są najlepszymi modelami do ustalenia prawidłowego i spójnego ułożenia elektrod w celu optymalnej stymulacji. Elektrody igłowe wielokrotnego użytku nadają się do wielokrotnego użytku, jeśli są regularnie sterylizowane, np. aldehydem glutarowym przez 20 minut między zwierzętami i sprawdzane pod kątem ostrości.
U zdrowych dorosłych myszy amplitudy CMAP rejestrowane prezentowaną metodą wynoszą zazwyczaj 80-100 mV po stymulacji nerwu kulszowego i splotu ramiennego. Jest to znacznie większe niż odpowiedzi mierzone za pomocą elektrod pierścieniowych, ponieważ istnieje wyższa impedancja spowodowana przez skórę dla elektrod pierścieniowych, która daje wyniki 20-40 mV 8,19,20. W modelach mysich ALS amplituda CMAP po stymulacji nerwu kulszowego lub splotu ramiennego w kończynach sparaliżowanych spada do 10-30 mV. Wielkość amplitudy CMAP jest mniejsza u młodych zwierząt, ponieważ amplituda CMAP wzrasta podczas rozwoju21.
Metoda, którą tutaj opisujemy, jest szczególnie przydatna w mysich modelach ALS, w których odnerwienie i późniejsze deficyty motoryczne występują wcześniej w kończynach tylnych niż w kończynach przednich13. Oprócz denerwacji, metoda może wykrywać reinerwację, która jest określana jako zapobiegnięty lub opóźniony spadek amplitudy CMAP. Dramatyczny spadek amplitudy CMAP w mięśniach kończyn tylnych już w wieku wystąpienia objawów utrudnia śledzenie dalszego postępu choroby; ponieważ amplitudy CMAP osiągają bardzo niskie wartości we wczesnym stadium choroby, nie zmniejszają się dalej w trakcie procesu chorobowego. W przeciwieństwie do tego, utrata aksonów postępuje w wolniejszym tempie w nerwie splotu ramiennego kończyn przednich i stanowi bardziej czułą opcję pomiaru postępu choroby w dłuższym czasie trwania choroby. Co więcej, mniej zdegenerowane kończyny przednie mogą stanowić silniejsze miejsce do oceny podejść terapeutycznych, które mają na celu poprawę funkcji aksonów.
Oczywiste jest, że przedstawiona technika daje nowe możliwości charakterystyki mysich modeli zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Zapisy CMAP z elektrodami igłowymi z nerwu kulszowego i splotu ramiennego to szybka i powtarzalna metoda oceny utraty aksonów i demielinizacji kończyn tylnych i przednich. Czułość metody umożliwia wykrycie deficytów aksonalnych jeszcze przed zarejestrowaniem zauważalnych deficytów motorycznych, a tym samym umożliwia wczesne określenie ilościowe tych wad. Co więcej, możliwość wielokrotnego testowania zmniejsza liczbę wymaganych zwierząt i zapewnia szczegółowy przegląd postępu chorób nerwowo-mięśniowych i neuropatycznych w różnych miejscach u pojedynczego zwierzęcia.

Elektrofizjologia jest używana jako narzędzie diagnostyczne w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych, takich jak zaburzenia neuronu ruchowego, pleksopatie, neuropatie, zaburzenia połączeń nerwowo-mięśniowych i miopatie. W stwardnieniu zanikowym bocznym (ALS), w którym dotknięte są głównie neurony ruchowe, uszkodzenie aksonów i paraliż mięśni1 znajdują odzwierciedlenie w zmniejszonych amplitudach CMAP w badaniach przewodnictwa nerwowego (NCS). W chorobie Charcota-Mariego-Tootha (CMT) zarówno zwyrodnienie aksonów, jak i demielinizację można oszacować w nerwach obwodowych za pomocą NCS2. Technika ta może być wykorzystana do potwierdzenia diagnozy, a także do oceny postępu choroby3,4. NCS umożliwia oszacowanie patologii aksonalnej, która jest wydedukowana na podstawie wielkości amplitudy potencjału czynnościowego5, oraz zakresu demielinizacji - co skutkuje zmniejszoną prędkością przewodzenia, wydłużonymi opóźnieniami dystalnymi lub blokiem przewodzenia6.
Pomiar CMAP jest szybką i czułą metodą oceny przewodnictwa nerwowego zarówno u ludzi, jak i u myszy. Podczas gdy u pacjentów NCS są wykonywane rutynowo w różnych miejscach w celu zarejestrowania różnych nerwów i mięśni, u myszy pomiary CMAP są zwykle wykonywane tylko dla nerwu kulszowego w celu oceny funkcjonalności nerwów w kończynach tylnych. Jednak w niektórych badaniach na zwierzętach korzystne byłoby rejestrowanie CMAP zarówno w kończynach przednich, jak i tylnych, na przykład w celu śledzenia zróżnicowanego postępu choroby między kończynami przednimi i tylnymi w mysich modelach ALS.
Tutaj wprowadzamy metodę rejestrowania CMAP z przednich kończyn myszy za pomocą elektrod igłowych. Dodatkowo zapewniamy podejście do pomiaru CMAP z kończyn tylnych, również za pomocą elektrod igłowych. Pomiar CMAP z kończyn tylnych za pomocą elektrod pierścieniowych został przedstawiony wcześniej7,8. Rejestracja CMAP za pomocą elektrod igłowych jest szybką metodą pomiaru, nie wymaga golenia sierści, a procedura pomiaru zarówno kończyn tylnych, jak i przednich zajmuje doświadczonemu badaczowi tylko 10 minut na zwierzę. Co więcej, to minimalnie inwazyjne podejście jest wykonalne w przypadku powtarzających się pomiarów, aby umożliwić podłużną obserwację wielu nerwów u zwierząt.

<table><tbody><tr><td>Podskórna elektroda igłowa wielokrotnego użytku, Pl/Ir</td><td>Technomed</td><td>TE/S61-434</td><td>Igła ma 13 mm (0,51") długości, 0,4 mm (27G) średnicy</td></tr><tr><td>System elektrodiagnostyczny Natus</td><td>Aparat EMG</td><td>Natus Neurology</td><td>UltraPro S100</td></tr><tr><td>Synergy</td><td>Natus Neurology</td><td>wersja 20.1.0.100</td><td>Oprogramowanie EMG dla UltraPro S100</td></tr><tr><td>Physitem Controller</td><td>Rothacher-Medical GmbH</td><td>TCAT-2LV</td><td>Poduszka grzewcza</td></tr><tr><td>combi-vet Baza systemu anestezjologicznego Cyfrowy przepływomierz z TEC 3 Vaporize</td><td>Rothacher & Partner</td><td>CV 30-301-D</td><td>Parownik i przepływomierz izofluranu</td></tr><tr><td>Iso-Vet 1000 mg/g&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare UK Limited</td><td>AP/DRUGS/220/96</td><td>Myszy z izofluranem</td></tr><tr><td>SOD1-G93A</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#002726</td><td>ALS tg i rodzeństwo z miotu bez tg, tylko samice</td></tr><tr><td>myszy PrP-hFUS-WT3</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#017916&nbsp;</td><td>Plemiot z grupy kontrolnej ALS tg i nie-tg, wszystkie grupy zrównoważone dla samców i samic</td></tr><tr><td>Myszy C57BL/6Jax</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>#000664</td><td>Myszy inne niż tg do aksotomii, samce i samice</td></tr><tr><td>myszy C61-PMP22</td><td>Linia myszy została hojnie podarowana&nbsp; przez prof. M. Seredę (The Max Planck Institute of Experimental Medicine, G&ouml; ttingen, Niemcy).</td><td></td><td>Kontrolne rodzeństwo z miotu CMT tg i nie-tg, wszystkie grupy zrównoważone dla samców i samic</td></tr></tbody></table>

in vivo (in vivo) elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

In Vivo Electrophysiological Measurement of Compound Muscle Action Potential from the Forelimbs in Mouse Models of Motor Neuron Degeneration

Ocena funkcjonalności aksonu nerwowego dostarcza szczegółowych informacji na temat postępu zaburzeń nerwowo-mięśniowych. Zapisy elektrofizjologiczne zapewniają czułe podejście do pomiaru przewodnictwa nerwowego u ludzi i gryzoni. Aby poszerzyć możliwości techniczne elektromiografii u myszy, opisano tutaj pomiar złożonych potencjałów czynnościowych mięśni (CMAP) z nerwu splotu ramiennego w kończynie przedniej za pomocą elektrod igłowych. Zapisy CMAP po stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych zostały już wcześniej opisane. Nowo wprowadzona metoda pozwala na ocenę przewodnictwa nerwowego w dodatkowym miejscu, a tym samym zapewnia głębszy przegląd funkcjonalności nerwowo-mięśniowej. Technika ta dostarcza informacji zarówno na temat względnej liczby funkcjonalnych aksonów, jak i poziomu mielinizacji. Tym samym metoda ta może być stosowana do oceny zarówno chorób aksonów, jak i stanów demielinizacyjnych. Ta minimalnie inwazyjna metoda nie wymaga ekstrakcji nerwu i dlatego nadaje się do wielokrotnych pomiarów w celu obserwacji podłużnej u tego samego zwierzęcia. Podobne zapisy są wykonywane w konfiguracjach klinicznych, aby podkreślić znaczenie translacyjne metody.

Pomiary elektrofizjologiczne CMAP z wykorzystaniem elektrod igłowych stanowią małoinwazyjną i bardzo czułą metodę monitorowania funkcji nerwowo-mięśniowych w czasie. Technika opisana w niniejszym materiale umożliwia ocenę przewodnictwa nerwowego w kończynach przednich myszy, a tym samym dostarcza informacji o funkcjonalności nerwu.
Amplitudy i latencje CMAP mierzono w kończynach tylnych i przednich w przebiegu choroby w dwóch modelach mysich ALS, SOD1-G93A9 oraz PrP-hFUS-WT310 (Rycina 3), a także w modelu mysim CMT, C61-PMP2211,12 (Rycina 4). Modele mysie ALS stworzono poprzez nadekspresję ludzkich genów związanych z ALS, a mianowicie zmutowanego genu SOD1 lub genu FUS typu dzikiego. W obu modelach u myszy rozwija się obraz ALS przypominający postępującą degenerację neuronów ruchowych prowadzącą do paraliżu. W kontrolnych miotach nie-transgenicznych amplituda CMAP w kończynach tylnych i przednich nie zmieniała się w czasie (Rycina 3A). Z drugiej strony, amplituda CMAP nerwu kulszowego w kończynie tylnej była drastycznie obniżona u myszy SOD1-G93A, jeszcze przed wystąpieniem objawów w okolicach 60 dnia życia (podczas gdy pierwsze objawy ruchowe zazwyczaj obserwuje się w wieku trzech miesięcy)13. Amplituda w tym wieku u miotów nie-transgenicznych (non-tg) wynosiła 90 mV, podczas gdy u myszy SOD1-G93A wynosiła ona zaledwie 30 mV. W miarę postępu choroby do późnego stadium objawowego w wieku 150 dni odnotowano jedynie minimalny dalszy spadek amplitudy. Spadek amplitudy CMAP, a zatem degeneracja aksonów, była opóźniona w nerwach splotu ramiennego kończyn przednich w porównaniu z nerwem kulszowym kończyn tylnych. W kończynach przednich postęp choroby był również bardziej zauważalny, ponieważ amplituda CMAP spadła z 70 mV do 30 mV w pomiarach wykonanych przed i po wystąpieniu deficytów ruchowych u tych myszy.
W modelu mysim ALS PrP-hFUS-WT3 wystąpienie deficytów motorycznych rozpoczyna się mniej więcej w 28. dniu życia10, co zbiega się z początkiem spadku amplitudy CMAP. Jest to model choroby o bardziej przyspieszonym przebiegu, ponieważ myszy osiągają stadium końcowe mniej więcej w 65. dniu życia. Spadek amplitudy CMAP następował szybciej w nerwie kulszowym kończyny tylnej w porównaniu z splotem ramiennym kończyny przedniej, co wskazuje na wcześniejszą degenerację aksonalną w kończynach tylnych (Rycina 3D). Obserwacja ta potwierdza obserwacje kliniczne w obu tych modelach mysich, w których kończyny tylne są sparaliżowane znacznie wcześniej niż kończyny przednie, które pozostają funkcjonalne aż do późnych etapów procesu chorobowego.
Ogólnie czas utajenia od momentu stymulacji do zainicjowania potencjału czynnościowego był krótszy w kończynach przednich w porównaniu do kończyn tylnych (Rycyna 3B, E). Wynika to po prostu z krótszej odległości między elektrodami stymulującymi a rejestrującymi. Czas utajenia dostarcza informacji o stopniu mielinizacji aksonów. Zaobserwowaliśmy, że czasy utajenia CMAP ulegają wydłużeniu w miarę postępu choroby w modelach mysich ALS, mimo że ALS nie jest chorobą demielinizacyjną. Jest to najprawdopodobniej spowodowane utratą większych aksonów ruchowych o szybszym przewodzeniu.
Myszy C61-PMP22 wykazujące nadekspresję 3-4 kopii ludzkiego genu PMP22 oraz myszy heterozygoczne odtwarzają bardzo łagodny fenotyp choroby CMT1A z niewielką demielinizacją i zredukowanymi CMAP, jednak bez widocznego fenotypu11,12. U myszy C61-PMP22 w wieku 1,5-2 lat amplitudy CMAP są zredukowane, a latencje wydłużone zarówno w kończynach tylnych, jak i przednich (Rycina 4). Reprezentatywne zapisy wykazujące zmniejszoną amplitudę i opóźnioną odpowiedź w porównaniu z zapisem od zdrowego osobnika przedstawiono odpowiednio na Rycini 2C, B. Latencje CMAP w kończynach przednich nie są w takim stopniu zaburzone, jak w kończynach tylnych. Jest to zgodne z obrazem klinicznym pacjentów z CMT1A, u których częściej stwierdza się znacznie zredukowane lub niewykrywalne CMAP w kończynach dolnych ze względu na patofizjologiczną naturę CMT jako zaburzenia zależnego od długości włókien14. Dodatkowo stopień ciężkości choroby koreluje z amplitudą CMAP, a nie z latencją czy prędkością przewodzenia, ponieważ amplitudy korelują ze stopniem integralności aksonalnej14,15. Niemniej jednak wyniki wskazują, że metoda ta jest wystarczająco czuła, aby wykryć procesy demielinizacyjne, takie jak te obserwowane w CMT1A.
Zmienność amplitudy i latencji była najniższa w grupach nietransgenicznych (współczynnik zmienności odpowiednio 2-15% i 1-13%). We wszystkich przypadkach zwierząt transgenicznych odnotowano większą zmienność pomiarów (współczynnik zmienności dla amplitudy 8-51% oraz dla latencji 1-21%), co najprawdopodobniej wynika z różnic w postępie choroby u poszczególnych zwierząt. We wszystkich przypadkach zmienność była podobna w kończynach tylnych i przednich. Zgłoszono, że zmienność przy zastosowaniu elektrod igłowych i powierzchniowych jest zbliżona16.
Wymagane natężenia bodźca nie różniły się znacząco pomiędzy modelami nietransgenicznymi a modelami ALS (Rysunek 3C, F). Podobnie, bodziec wymagany do osiągnięcia stymulacji supramaksymalnej w tych przypadkach był zbliżony dla kończyn przednich i tylnych i wynosił od 5-12 mA. W przypadku CMT odnotowano konieczność zwiększenia natężenia bodźca17 i ten sam fenotyp zaobserwowano u myszy C61-PMP22 (Rysunek 4C). Zjawisko to wyjaśniono zwiększoną impedancją elektryczną wynikającą z hipertroficznych zmian endoneuralnych17.
Aby potwierdzić, że amplituda CMAP zarejestrowana z przednich kończyn wynikała ze stymulacji nerwu, a nie stymulacji mięśnia, wykonaliśmy jednostronną częściową aksotomię splotu ramiennego u 5-miesięcznych nietransgenicznych myszy C57BL/6Jax (samców i samic) (Rysunek 5). Aksotomia zmniejszyła amplitudę CMAP z 90 mV do 20 mV, co wskazuje, że w wyniku operacji odcięta została większość aksonów. Nie odnotowano zmian amplitudy w przeciwległej kończynie przedniej ani w kończynach tylnych. Wynik ten jednoznacznie wskazuje, że odpowiedź wykryta w mięśniu dwugłowym ramienia była efektem stymulacji nerwu, a nie stymulacji mięśnia.
<img alt="Amplitudy, latencje, bodźce w zależności od wieku; wykres; badanie odpowiedzi neurofizjologicznych w czasie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Amplituda CMAP, latencja i wymagany bodziec w przebiegu choroby w kończynach tylnych i przednich w modelach mysich ALS. Pomiary u myszy transgenicznych (tg) SOD1-G93A (A-C) i PrP-hFUS-WT3 (D-F) oraz u nietransgenicznych (non-tg) osobników z jednego miotu przeprowadzono w momencie wystąpienia objawów ruchowych, w stadium objawowym oraz w późnej fazie objawowej procesu chorobowego, odpowiednio w wieku 57, 91 i 147 dni (d) lub w dniach 29, 38 i 53 dla myszy SOD1-G93A i PrP-hFUS-WT3. Kolor czarny: kończyna tylna nietransgeniczna, czarna przerywana linia: kończyna przednia nietransgeniczna, kolor szary: kończyna tylna transgeniczna, szara przerywana linia: kończyna przednia transgeniczna. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD. Amplitudy (A, D) były stabilne w czasie u zwierząt nietransgenicznych zarówno w kończynach tylnych, jak i przednich. U zwierząt transgenicznych amplitudy spadały w przebiegu procesu chorobowego. Latencje (B, E) były w mniejszym stopniu dotknięte chorobą, a główne różnice zaobserwowano między kończynami tylnymi i przednimi, niezależnie od genotypu. Zmienność wymaganego bodźca (C, F) była minimalna we wszystkich grupach. Dla SOD1-G93A N = 4 we wszystkich grupach z wyjątkiem tg 147 d, gdzie N = 3. Dla myszy PrP-hFUS-WT3 w grupach wiekowych 29, 38 i 53 N wynosi odpowiednio 4, 5 i 4 dla non-tg oraz 7, 5 i 3 dla tg. Symbole oznaczają różnice między grupami w następujący sposób: *: kończyna tylna non-tg vs. kończyna tylna tg, #: kończyna przednia non-tg vs. kończyna przednia tg, ¤: kończyna tylna non-tg vs. kończyna przednia non-tg, szara *: kończyna tylna tg vs. kończyna przednia tg. Dwuway ANOVA z testem porównań wielokrotnych Tukeya, *: p &lt; 0.05, **: p &lt; 0.01, ***: p &lt; 0.001, ****: p &lt; 0.0001.#: p &lt; 0.05, ##: p &lt; 0.01, ###: p &lt; 0.001, ####: p &lt; 0.0001.¤: p &lt; 0.05, ¤¤: p &lt; 0.01, ¤¤¤: p &lt; 0.001, ¤¤¤¤: p &lt; 0.0001. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres wyników elektrofizjologicznych przedstawiający amplitudę sygnału nerwowego, latencję i bodziec w kończynach." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Amplituda CMAP, latencja i wymagany bodziec w kończynach tylnych i przednich u myszy CMT1A. Pomiary u myszy transgenicznych (tg) C61-PMP22 oraz nietransgenicznych (non-tg) z tego samego miotu przeprowadzono w wieku 1,5-2 lat. Amplituda (A) była obniżona zarówno w kończynach tylnych, jak i przednich u myszy transgenicznych. Latencja (B) była wydłużona we wszystkich kończynach u myszy z CMT, a pomiar ten pozwolił na wykrycie nawet subtelnych zmian w kończynach przednich. Wymagana intensywność bodźca (C) była zwiększona u myszy C61-PMP22, co odpowiada fenotypowi stwierdzanemu u pacjentów z CMT1A. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, dla non-tg N = 4 i tg N = 3. Dwuczynnikowa analiza ANOVA z testem porównań wielokrotnych Sidaka,**: p &lt; 0.01, ****: p &lt; 0.0001. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Efekty aksonotomii: Wykres A przedstawia zmianę amplitudy (mV), Wykres B przedstawia zmianę czasu utajenia (ms)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57741/57741fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Potencjały czynnościowe kończyny przedniej są wywołane stymulacją nerwu. Aby wykluczyć możliwość, że obserwowana odpowiedź CMAP była spowodowana stymulacją mięśni, przeprowadzono (częściową) aksonotomię splotu ramiennego. Amplitudę (A) i czas utajenia (B) CMAP rejestrowano przed (pre) oraz 4 dni po (post) aksonotomii splotu ramiennego u dorosłych myszy nietransgenicznych. Aksonotomia zmniejszyła amplitudę CMAP, co wskazuje, że odpowiedź wynikała ze stymulacji nerwu. Czarny: kończyna tylna, szary: przeciwległa kończyna przednia, szary przerywany: jednostronna kończyna przednia. Wyniki przedstawiono jako średnia ± SD, N = 2. <a href="/files/ftp_upload/57741/57741fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>

Pomiar przewodnictwa nerwowego jest użytecznym narzędziem do oceny mysich modeli neurodegeneracji, ale często jest stosowany tylko do stymulacji nerwu kulszowego w kończynach tylnych. W tym miejscu opisujemy technikę pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) in vivo w mięśniach kończyn przednich myszy unerwionych przez splot ramienny.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Assessing the functionality of the nerve axon provides detailed information on the progression of neuromuscular disorders. Electrophysiological recordings ...

Dzięki tej metodzie możemy oszacować zwyrodnienie aksonów, a także demielinizację nerwów obwodowych mysich modeli neurodegeneracji. Główną zaletą tej techniki jest to, że ta minimalnie inwazyjna metoda jest wykonalna w przypadku powtarzających się pomiarów, tylko nie śledzono wielu nerwów u tych samych zwierząt. Czułość tej metody umożliwia wczesne wykrycie utraty aksonów w modulacji, jeszcze zanim zostanie zarejestrowana zauważalna liczba defektów, co pozwala na wczesne wykrycie tych defektów.Aby rozpocząć tę procedurę, znieczul mysz inhalacją tlenu izofluranu. Potwierdź odpowiednie znieczulenie, wywierając łagodny nacisk na podkładkę do chodzenia kończyny tylnej, aby sprawdzić, czy nie ma odruchu odstawienia bólu. Następnie umieść stożek nosowy na pysku zwierzęcia, aby utrzymać znieczulenie.Upewnij się, że stożek nosowy nie blokuje dróg oddechowych, a zwierzę oddycha miarowo. Następnie utrzymuj temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 stopni Celsjusza za pomocą termostatycznej płyty grzewczej. Aby zmierzyć CMAP na tylnej kończynie, ustaw mysz w pozycji leżącej.Wyprostuj tylną kończynę i przymocuj łapę do powierzchni roboczej za pomocą taśmy klejącej. Następnie umieść pięć milimetrów elektrod stymulujących o rozmiarze 27 podskórnie po obu stronach węzła kulszowego, nie nakłuwając leżących pod spodem mięśni z zachowaniem dwóch centymetrów między elektrodami. Podobnie umieść elektrodę rejestrującą podskórnie powyżej i równolegle do mięśnia brzuchatego łydki.Następnie umieść elektrodę referencyjną podskórnie obok ścięgna Achillesa pod kątem 30 stopni i pozostaw od dwóch do pięciu milimetrów igły pod skórą. Umieść elektrodę uziemiającą podskórnie z boku myszy w podobny sposób, jak elektrody stymulujące. Aby zmierzyć CMAP na kończynach przednich, ustaw mysz na podkładce pod głowę w pozycji leżącej i użyj taśmy klejącej, aby wysunąć obie kończyny przednie po bokach ciała.Następnie umieść podskórnie pięć milimetrów elektrody stymulującej bez nakłuwania leżących poniżej mięśni po obu stronach kończyny przedniej, aby wyrównać się z nerwem splotu ramiennego. Następnie umieść elektrodę rejestrującą podskórnie nad mięśniem dwugłowym ramienia. Następnie umieść trzy milimetry elektrody referencyjnej pod kątem 30 stopni na podkładkach do chodzenia i włóż elektrodę uziemiającą podskórnie z boku myszy.W tej konfiguracji elektrody znajdują się w bliskiej odległości od siebie. Nie dopuszczaj do tego, aby elektrody stykały się ze sobą, ponieważ zniekształca to nagranie. Stymuluj wszystkie aksony za pomocą jednego impulsu na sekundę z czasem trwania bodźca wynoszącym 0,1 milisekundy.Aby pozyskać dane, rozpocznij stymulację, naciskając przycisk powtarzającego się bodźca w jednostce sterującej i przekręć pokrętło regulatora intensywności, aby zwiększyć bodziec. Aby osiągnąć bodźce super maksymalne, stosuj bodźce zwiększające, obracając pokrętło regulatora intensywności, aż amplituda odpowiedzi CMAP przestanie rosnąć. Stamtąd należy dodatkowo zwiększyć bodziec o 20%aby upewnić się, że amplituda CMAP osiągnęła maksymalną odpowiedź.Zakończ stymulację, ponownie naciskając przycisk powtarzającego się bodźca. Użyj narzędzia znacznika, aby wskazać następujące punkty w nagraniu. Inicjacja odpowiedzi, maksymalny dodatni pik i maksymalny ujemny pik.Inicjacja bodźca jest określana automatycznie przez oprogramowanie. Określ opóźnienie jako opóźnienie od zainicjowania bodźca do zainicjowania odpowiedzi. Użyj opóźnienia, aby ocenić demielinizację w aksonach.Zmierz amplitudę od maksymalnego ujemnego do maksymalnego dodatniego piku i użyj wielkości amplitudy, aby skorelować liczbę funkcjonalnych aksonów. Ponieważ dokładne rozmieszczenie elektrod może mieć wpływ na wartość wynikową zapisu, wymień elektrody i zmierz ten sam nerw trzy razy za pomocą super maksymalnego bodźca, aby zapewnić uzyskanie największej odpowiedzi. Użyj średniej z nagrań.Po pomiarach usuń wszystkie elektrody i pozostaw mysz do odzyskania sprawności na płycie grzewczej lub pod lampą podczerwieni przez około dwie do pięciu minut, aż odzyska wystarczającą przytomność. Nie zostawiaj myszy bez opieki i w towarzystwie innych myszy, dopóki w pełni nie wyzdrowieje ze znieczulenia. Myszy C61 PMP22 z nadmierną ekspresją trzech do czterech kopii ludzkiego PMP22 i myszy heterozygotyczne rekapitulują bardzo łagodny fenotyp choroby CMT1A z łagodną demielinizacją i obniżonymi CMAP, ale bez widocznego fenotypu.U półtorarocznego do drugiego roku życia transgenicznych myszy C61 PMP22 amplitudy CMAP są zmniejszone, a opóźnienia wydłużone zarówno w kończynach tylnych, jak i przednich. Amplituda została zmniejszona zarówno w kończynach tylnych, jak i przednich u myszy transgenicznych, a latencja została przedłużona we wszystkich kończynach u myszy transgenicznych CMT, a nawet subtelne zmiany w kończynach przednich wykryto przy tym pomiarze. Zapotrzebowanie na intensywność bodźca wzrosło u myszy C61 PMP22, co przypomina fenotyp wykryty u pacjentów z CMT1A.Po opanowaniu zapisu CMAP można wykonać zarówno dla kończyn tylnych, jak i przednich w ciągu 15 minut, jeśli zostanie wykonany prawidłowo. Przedstawiona technika daje nowe możliwości charakterystyki mysich modeli chorób neurodegeneracyjnych, takich jak stwardnienie zanikowe kąta zanikowego i choroba Charcota-Marie-Tootha. Ocena funkcjonalności aksonu nerwowego dostarcza szczegółowych informacji na temat progresji zaburzeń nerwowo-mięśniowych.Podobne nagrania są wykorzystywane w warunkach klinicznych, co podkreśla potencjał translacyjny tej metody.

in-vivo-electrophysiological-measurement-compound-muscle-action

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Ta nowa metoda umożliwia jednoczesną rejestrację wewnątrzkomórkową pojedynczego motoneuronu dorosłej myszy oraz pomiar siły generowanej przez jego włókna mięśniowe. Połączone badanie właściwości elektrycznych i mechanicznych jednostek motorycznych u zwierząt zdrowych i modyfikowanych genetycznie stanowi przełom w badaniach nad układem nerwowo-mięśniowym.

Symultaniczne rejestrowanie wewnątrzkomórkowe lędźwiowego motoneuronu oraz siły generowanej przez jego jednostkę motoryczną u dorosłej myszy in vivo

Ten film demonstruje technikę in vivo pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) u myszy. Przedstawiono w nim kroki ustawiania elektrod, stymulacji neuronów kończyn przednich, które unerwiają włókna mięśniowe, oraz rejestrowania reakcji mięśni. Technika ta ocenia demielinizację neuronów i funkcjonalną utratę neuronów.

Pomiar złożonych potencjałów czynnościowych mięśni w mięśniach kończyn przednich myszy in vivo

Ten film demonstruje procedurę rejestrowania złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) u szczurów poprzez zastosowanie bodźców elektrycznych do nerwu łokciowego, dostosowanie elektrod do optymalnego sygnału i zwiększenie stymulacji w celu oceny funkcjonalności nerwu. Metoda ta umożliwia badanie in vivo funkcji nerwów obwodowych w zaburzeniach neurologicznych.

Pomiar in vivo złożonego potencjału czynnościowego mięśni u szczura

Pomiary właściwości przewodnictwa nerwowego in vivo są przykładem potężnego narzędzia do charakteryzowania różnych zwierzęcych modeli chorób nerwowo-mięśniowych. Tutaj przedstawiamy łatwy i niezawodny protokół, za pomocą którego można przeprowadzić analizę elektrofizjologiczną nerwów kulszowych znieczulonych myszy.

In vivo (in vivo) Pomiary elektrofizjologiczne nerwów kulszowych myszy

Prezentujemy udoskonalone protokoły, które pozwalają na monitorowanie in vivo funkcji jednostki motorycznej u myszy. Opisano techniki pomiaru złożonego potencjału czynnościowego mięśni (CMAP) i szacowania liczby jednostek motorycznych (MUNE) w mięśniach kończyn tylnych myszy unerwionych przez nerw kulszowy.

Elektrofizjologiczne oszacowanie liczby jednostek motorycznych (MUNE) mierzące złożony potencjał czynnościowy mięśni (CMAP) w mięśniach kończyn tylnych myszy

Ten artykuł przedstawia metodę wielokrotnych pomiarów wentylacji i aktywności mięśni oddechowych w swobodnie zachowującym się modelu myszy ze stwardnieniem zanikowym bocznym (ALS) podczas postępu choroby za pomocą pletyzmografii całego ciała i elektromiografii za pomocą wszczepionego urządzenia telemetrycznego.

Wielokrotne pomiary aktywności mięśni oddechowych i wentylacji w mysich modelach choroby nerwowo-mięśniowej

Kwantyfikacja maksymalnej siły prostownika kolana jest niezbędna do zrozumienia funkcjonalnych adaptacji do starzenia się, chorób, urazów i rehabilitacji. Przedstawiamy nowatorską metodę wielokrotnego pomiaru in vivo izometrycznego szczytowego momentu obrotowego tężcowego wyprostu kolana.

Pomiar in vivo funkcji mięśni prostowników stawu kolanowego u myszy

Obecny protokół opisuje zwięzłe szczegóły eksperymentalne dotyczące oceny i interpretacji danych in vivo dotyczących momentu obrotowego uzyskanych za pomocą elektrycznej stymulacji wspólnego nerwu strzałkowego u znieczulonych świń.

In vivo (in vivo) Pomiar izometrycznego momentu obrotowego zginacza grzbietowego kończyny tylnej od świni

Ten artykuł szczegółowo opisuje, jak przeprowadzić in vivo (przy użyciu matryc elektrod powierzchniowych i igłowych) oraz ex vivo (przy użyciu ogniwa dielektrycznego) mięsień brzuchaty łydki gryzonia. Zademonstruje technikę zarówno na myszach, jak i szczurach oraz szczegółowo omówi dostępne modyfikacje (np. otyłe zwierzęta, młode).

Wykonywanie miografii impedancji elektrycznej in vivo i ex vivo u gryzoni

W tym badaniu demonstrujemy wyrafinowany protokół elektromiografii pojedynczego włókna (SFEMG), który umożliwia pomiar in vivo transmisji połączenia nerwowo-mięśniowego (NMJ) w modelach gryzoni. Opisano podejście krok po kroku do techniki SFEMG, aby umożliwić ilościowe określenie zmienności transmisji NMJ i niewydolności mięśnia brzuchatego łydki szczura.

Stymulowana elektromiografia pojedynczych włókien (SFEMG) do oceny transmisji połączeń nerwowo-mięśniowych w modelach gryzoni

Ten protokół opisuje wytwarzanie rąk i chirurgiczne wszczepianie elektrod elektromiograficznych (EMG) w mięśniach kończyn przednich myszy, aby rejestrować aktywność mięśni podczas eksperymentów z zachowaniem głowy.

Rejestrowanie aktywności mięśni kończyn przednich u myszy z unieruchomioną głową z przewlekle wszczepionymi elektrodami EMG

Poznaj metodę elektrofizjologicznego pomiaru CMAP w kończynach przednich myszy. Technika umożliwia wczesne wykrywanie degeneracji aksonów i demielinizacji w modelach neurodegeneracyjnych.

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych (Wideo) | JoVE Journal

In vivo (in vivo) Elektrofizjologiczny pomiar złożonego potencjału czynnościowego mięśni z kończyn przednich w mysich modelach zwyrodnienia neuronów ruchowych

Przeglądaj więcej filmów