Name: Analiza genetyczna dziedzicznej amyloidozy związanej z transtyretyną Ala97Ser (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 33 s
Description: Poznaj protokół diagnostyczny dziedzicznej amyloidozy transtyretynowej z mutacją Ala97Ser. Metoda obejmuje ekstrakcję DNA, PCR i elektroforezę agarozową do potwierdzenia mutacji punktowych w genie TTR.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Pragniemy podziękować Pani Shin-Fun Wu za pomoc w eksperymentach. Badanie to było wspierane przez grant z Chang Gung Medical Research Program (CMRPG3C0371, CMRPG3C0372, CMRPG3C0373) oraz IRB 100-4470A3, 104-2462A3, Tajwan.

Testy przeprowadzone w laboratorium zostały przeprowadzone zgodnie z wymaganiami Poprawek do Poprawy Laboratoriów Klinicznych (CLIA) z 1988 roku, przepisami zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Szpitala i Uniwersytetu Chang Gung Memorial (Licencja nr 100-4470A3 i 104-2462A3). Uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów.
1. Pobieranie próbek krwi
<ol>
	<li>Zbierz krew pełną do dostępnych na rynku probówek poddanych działaniu EDTA. Delikatnie wymieszać i przechowywać próbkę krwi w temperaturze 4 °C do czasu przetworzenia.</li>
</ol>
2. Ekstrakcja DNA z krwi obwodowej
Użyj zestawu do ekstrakcji DNA do ekstrakcji genomowego DNA (zobacz Tabelę materiałów).
<ol>
	<li>Dodać 10 ml roztworu 1 do 4,0 ml próbki krwi. Inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Zawiesić osad w 3 ml roztworu 1.</li>
	<li>Ponownie odwirować próbkę o masie 2 000 x g przez 5 minut w temperaturze 4 °C i odrzucić supernatant. Zawiesić osad w 3 ml roztworu 2.</li>
	<li>Dodać 10 μl roztworu podstawowego pronazy (225 mg/ml), aby uzyskać końcowe stężenie 100 μg/ml i dobrze wymieszać. Inkubować w temperaturze 37 °C przez noc.</li>
	<li>Schłodzić probówkę na lodzie przez 10 minut. Dodać 0,8 ml roztworu 3 do próbki i odwrócić 3 - 5 razy. Umieść próbkę na lodzie na 5 minut.</li>
	<li>Odwirować próbkę o masie 3 000 x g przez 15 minut w temperaturze 4 °C. Ostrożnie przenieść supernatant do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Dodać 6 μl roztworu podstawowego RNazy (10 mg/ml), aby uzyskać końcowe stężenie 20 μg/ml. Inkubować w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Dodaj 2,5 ml alkoholu izopropylowego i dokładnie wymieszaj, delikatnie odwracając kilka razy, aby wytrącić DNA (utworzą się pasma białego, kłaczkowatego materiału). Za pomocą pipety o dużym otworze przenieś środek strącający DNA do nowej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Wirować przy 12 000 x g przez 3 minuty w temperaturze 4 °C. Ostrożnie odrzucić supernatant. Umyj osad DNA, dodając 500 μl 70% etanolu.</li>
	<li>Odwirować przy 12 000 x g przez 1 minutę i odrzucić supernatant. Suchy na powietrzu granulat DNA w temperaturze pokojowej. Dodać 100 μl ddH2O i inkubować w temperaturze 65 °C przez 15 minut w celu ponownego zawieszenia DNA.</li>
</ol>
3. Kwantyfikacja genomowego DNA
Użyj spektrofotometru (zobacz Tabelę materiałów), aby wykryć ilość i jakość genomowego DNA.
<ol>
	<li>Zaloguj się do komputera podłączonego do spektrofotometru. Otwórz oprogramowanie.</li>
	<li>Zainicjuj spektrofotometr:
	<ol>
		<li>Kliknij "Kwas nukleinowy" w oprogramowaniu spektrofotometru.</li>
		<li>Wyczyść cokół jednorazową chusteczką papierową i oczyszczoną wodą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ślepe światło spektrofotometru:
	<ol>
		<li>Załaduj 2 μl oczyszczonej wody na cokół.</li>
		<li>Opuść górne ramię spektrofotometru i kliknij "Puste", aby je skalibrować.</li>
		<li>Po zakończeniu podnieś ramię i osusz cokół chusteczką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zmierz próbkę:
	<ol>
		<li>Kliknij "DNA-50" w typie próbki.</li>
		<li>Załaduj 2 μl próbki DNA na cokół.</li>
		<li>Opuść górne ramię i kliknij "Zmierz", aby zmierzyć stosunek A260/A280 i stężenie próbki.</li>
		<li>Wyczyść cokół między każdym biegiem chusteczką i oczyszczoną wodą.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij "Print Screen", aby zebrać dane.</li>
</ol>
4. Analizy genetyczne mutacji
Amplifikuj docelowe DNA za pomocą PCR4. Przeprowadzić PCR w mieszaninie reakcyjnej o objętości 25 μl przy użyciu zestawu do polimerazy DNA (patrz tabela materiałów). Tabela 1 przedstawia startery intronowe genu TTR.
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>gen</td>
			<td>Sekwencja podkładowa</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekson1</td>
			<td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3' 
			R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekson2</td>
			<td>Prąd: 5'-TCTTGTTTCCCTCCAGATTTC-3' 
			R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekson3</td>
			<td>F: 5'-GTGTTAGTTGGTGGGGGTGT-3' 
			Światło: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ekson4</td>
			<td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3' 
			Nr kat.: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1. Startery intronowe genu TTR. (Sekwencja referencyjna NCBI: NC_000018.10)
<ol>
	<li>Dodać odczynniki z Tabeli 2 do probówki PCR o pojemności 0,2 ml.</li>
</ol>
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Składniki</td>
			<td>Objętość (μL)</td>
			<td>Końcowe stężenie</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Bufor</td>
			<td>Rozdział 2.5</td>
			<td>1x</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>1,5</td>
			<td>1,5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wzmacniacz 360 GC</td>
			<td>1</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polimeraza DNA 360</td>
			<td>0,2</td> pkt.
			<td>2 U/reakcja</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP Mix (25 mM każdy)</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td>2 mM każdy</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podkład F (10 μM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Podkład R (10 μM)</td>
			<td>1</td>
			<td>0,4 μM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA (100 ng)</td>
			<td>cyfra arabska</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Woda klasy PCR</td>
			<td>Rozdział 13,8</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Całkowita objętość</td>
			<td>25</td>
			<td>-</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 2. warunki reakcji PCR.
<ol start="2">
	<li>Delikatnie wymieszaj i krótko odwiruj na wirówce stołowej, aby zebrać wszystkie składniki na dno probówki. Umieść probówkę w termocyklerze.</li>
	<li>Wykonaj PCR przez 30 cykli. Każdy cykl składa się z etapu denaturacji trwającego 30 s w temperaturze 94 °C, wyżarzania startera przez 30 s w temperaturze 58 °C i przedłużania polimerazy przez 45 s w temperaturze 72 °C (zob. tabela 3).</li>
</ol>
<tabela dla:keep-together.within-page="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>krok</td>
			<td>Temperatura (°C)</td>
			<td>Godzina</td>
			<td>cykl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Początkowa denaturacja</td>
			<td>95 Rozdział 95</td>
			<td>Czas trwania: 5 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etap denaturacji DNA</td>
			<td>94 Rozdział 94</td>
			<td>30 sekund</td>
			<td>30 cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Etap wyżarzania gruntu</td>
			<td>Rozdział 58</td>
			<td>30 sekund</td>
			<td>30 cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok wydłużania polimerazy</td>
			<td>72 Rozdział 72</td>
			<td>45 sekund</td>
			<td>30 cykli</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Krok wydłużenia po wydłużeniu</td>
			<td>72 Rozdział 72</td>
			<td>Czas trwania: 10 min</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Koniec cyklu PCR</td>
			<td>4</td>
			<td>nieokreślony</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 3. Warunki cykliczne dla amplifikacji produktów PCR.
<ol start="4">
	<li>Walidacja produktu PCR poprzez wizualizację za pomocą elektroforezy żelowej:
	<ol>
		<li>Przygotuj żel agarozowy 1,2%:
		<ol>
			<li>Wymieszaj 1,2 g proszku agarozowego ze 100 ml 0,5 x TBE w kolbie kuchennej mikrofalowej. Mikrofaluj przez 2 minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Schłodzić mieszaninę agarozy do temperatury 55 °C.</li>
			<li>Dodać 2 μl roztworu bromku etydyny (10 mg/ml) do mieszaniny agarozy i delikatnie wymieszać. Wlej mieszaninę agarozy do tacki na żel na około 5 - 7 mm, a następnie dodaj grzebień (grzebienie) na miejsce. Pozwól mu zastygnąć (co najmniej 30 minut) i ostrożnie usuń grzebień(y).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Załaduj próbki i uruchom żel agarozowy:
		<ol>
			<li>Umieść żel i tackę w komorze elektroforetycznej. Napełnij komórkę elektroforetyczną 0,5x TBE, aż żel zostanie pokryty.</li>
			<li>Ostrożnie załadować 2 μl drabinki DNA o długości 100 pz (patrz Tabela materiałów) do jednego pasa żelu jako marker wielkości cząsteczki. Załaduj mieszaninę barwnika/próbki (5 μl mieszanki produktów PCR z 1 μl 6-krotnie obciążającym barwnikiem) do dodatkowych pasów.</li>
			<li>Włącz zasilanie. Uruchom żel na 25 minut przy napięciu 100 V.</li>
			<li>Usuń żel z komory elektroforetycznej. Wizualizacja fragmentów DNA w świetle UV w systemie obrazowania.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Sekwencjonowanie DNA
<ol>
	<li>Produkty do PCR należy oczyszczać za pomocą komercyjnego zestawu i sekwencjonowania komercyjnie lub za pomocą automatycznego sekwencera (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Prześlij sekwencje nukleotydowe do serwera NCBI BLAST, aby porównać zapytanie nukleotydowe z bazami danych nukleotydów10. Po wyświetleniu wyników wykonaj wyrównanie sekwencji i zidentyfikuj oczekiwaną mutację.</li>
</ol>

<ol><li>Planté-Bordeneuve, V., Said, G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094129">Familial amyloid polyneuropathy.</a> The Lancet Neurology. 10 (12), 1086-1097 (2011).</li>
<li>Planté-Bordeneuve, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+treatment+of+transthyretin+familial+amyloid+polyneuropathy+with+tafamidis%3A+a+clinical+and+neurophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Long-term treatment of transthyretin familial amyloid polyneuropathy with tafamidis: a clinical and neurophysiological study.</a> Journal of Neurology. 264 (2), 268-276 (2017).</li>
<li>Nichols, W. C., Benson, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+amyloidosis%3A+detection+of+variant+prealbumin+genes+by+restriction+enzyme+analysis+of+amplified+genomic+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Hereditary amyloidosis: detection of variant prealbumin genes by restriction enzyme analysis of amplified genomic DNA sequences.</a> Clinical Genetics. 37 (1), 44-53 (1990).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+Chain+Reaction%3A+Basic+Protocol+Plus+Troubleshooting+and+Optimization+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), e3998(2012).</li>
<li>Hsu, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+expressions+of+hereditary+Transthyretin+Ala97Ser+related+Amyloidosis+%28ATTR%29+in+Taiwanese%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurology%22%5BJournal%5D)">Phenotypic expressions of hereditary Transthyretin Ala97Ser related Amyloidosis (ATTR) in Taiwanese.</a> BMC Neurology. 17 (1), 178(2017).</li>
<li>Barroso, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+safety+and+efficacy+of+tafamidis+for+the+treatment+of+hereditary+transthyretin+amyloid+polyneuropathy%3A+results+up+to+6+years%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Long-term safety and efficacy of tafamidis for the treatment of hereditary transthyretin amyloid polyneuropathy: results up to 6 years.</a> Amyloid. 24 (3), 194-204 (2017).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+profile+and+differential+diagnosis+of+hereditary+transthyretin-related+amyloidosis+with+exclusively+cardiac+phenotype%3A+an+Italian+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Disease profile and differential diagnosis of hereditary transthyretin-related amyloidosis with exclusively cardiac phenotype: an Italian perspective.</a> European Heart Journal. 34 (7), 520-528 (2013).</li>
<li>Mariani, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotype-phenotype+correlation+and+course+of+transthyretin+familial+amyloid+polyneuropathies+in+France%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genotype-phenotype correlation and course of transthyretin familial amyloid polyneuropathies in France.</a> Annals of Neurology. 78 (6), 901-916 (2015).</li>
<li>Hammarström, P., Jiang, X., Hurshman, A. R., Powers, E. T., Kelly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence-dependent+denaturation+energetics%3A+A+major+determinant+in+amyloid+disease+diversity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Sequence-dependent denaturation energetics: A major determinant in amyloid disease diversity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, suppl 4 16427-16432 (2002).</li>
<li>Johnson, M., Zaretskaya, I., Raytselis, Y., Merezhuk, Y., McGinnis, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NCBI+BLAST%3A+a+better+web+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">NCBI BLAST: a better web interface.</a> Nucleic Acids Research. 36, Web Server issue 5-9 (2008).</li>
<li>Fox, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+generation+sequencing+for+the+detection+of+actionable+mutations+in+solid+and+liquid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Next generation sequencing for the detection of actionable mutations in solid and liquid tumors.</a> Journal of Visualized Experiments. (115), (2016).</li>
<li>Date, Y., Nakazato, M., Kangawa, K., Shirieda, K., Fujimoto, T., Matsukura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+three+transthyretin+gene+mutations+in+familial+amyloidotic+polyneuropathy+by+analysis+of+DNA+extracted+from+formalin-fixed+and+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Neurological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Detection of three transthyretin gene mutations in familial amyloidotic polyneuropathy by analysis of DNA extracted from formalin-fixed and paraffin-embedded tissues.</a> Journal of the Neurological Sciences. 150 (2), 143-148 (1997).</li>
<li>Ye, J., Coulouris, G., Zaretskaya, I., Cutcutache, I., Rozen, S., Madden, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer-BLAST%3A+a+tool+to+design+target-specific+primers+for+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Primer-BLAST: a tool to design target-specific primers for polymerase chain reaction.</a> BMC Bioinformatics. 13, 134(2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGreen%2C+MR+%22Molecular+cloning%3A+A+laboratory+manual%22">Molecular cloning: A laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2012).</li>
<li>Buckingham, L., Flaws, M. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBuckingham%2C+L+%22Molecular+diagnostics%3A+Fundamentals%2C+methods%2C+and+clinical+applications%22">Molecular diagnostics: Fundamentals, methods, and clinical applications</a>. , F.A. Davis Co. Philadelphia. (2012).</li>
<li>Tan, S. C., Yiap, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA%2C+RNA%2C+and+Protein+Extraction%3A+The+Past+and+The+Present%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">DNA, RNA, and Protein Extraction: The Past and The Present.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2009, (2009).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+cardiac+amyloidoses%3A+disease+profiles+and+clinical+courses+of+the+3+main+types%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Systemic cardiac amyloidoses: disease profiles and clinical courses of the 3 main types.</a> Circulation. 120 (13), 1203-1212 (2009).</li>
<li>Gertz, M. A., Dispenzieri, A., Sher, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25311231">Pathophysiology and treatment of cardiac amyloidosis.</a> Nature Reviews Cardiology. 12 (2), 91-102 (2015).</li>
<li>Vrana, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+diagnosis+and+typing+of+systemic+amyloidosis+in+subcutaneous+fat+aspirates+by+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Clinical diagnosis and typing of systemic amyloidosis in subcutaneous fat aspirates by mass spectrometry-based proteomics.</a> Haematologica. 99 (7), 1239-1247 (2014).</li>
<li>Nakamura, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+transthyretin+variant+%28Ile49%29+in+familial+amyloidotic+polyneuropathy+using+electrospray+ionization+mass+spectrometry+and+nonisotopic+RNase+cleavage+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Heredity%22%5BJournal%5D)">Identification of a new transthyretin variant (Ile49) in familial amyloidotic polyneuropathy using electrospray ionization mass spectrometry and nonisotopic RNase cleavage assay.</a> Human Heredity. 49 (4), 186-189 (1999).</li>
<li>Ueda, M., Ando, Y. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25228988">Recent advances in transthyretin amyloidosis therapy.</a> Translational Neurodegeneration. 3, 19(2014).</li>
<li>Brown, E. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+testing+improves+identification+of+transthyretin+amyloid+%28ATTR%29+subtype+in+cardiac+amyloidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Genetic testing improves identification of transthyretin amyloid (ATTR) subtype in cardiac amyloidosis.</a> Amyloid. 24 (2), 92-95 (2017).</li>
<li>Tasaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+of+wild-type+and+mutated+transthyretins%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid detection of wild-type and mutated transthyretins.</a> Annals of Clinical Biochemistry. 53 (4), 508-510 (2015).</li>
<li>Plante-Bordeneuve, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17698792">Diagnostic pitfalls in sporadic transthyretin familial amyloid polyneuropathy (TTR-FAP).</a> Neurology. 69 (7), 693-698 (2007).</li>
<li>Hsu, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+prospective%2C+observational+study+of+patients+with+uncommon+distal+symmetric+painful+small-fiber+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A prospective, observational study of patients with uncommon distal symmetric painful small-fiber neuropathy.</a> PLoS ONE. 12 (9), 0183948(2017).</li>
<li>Salvi, F., Pastorelli, F., Plasmati, R., Bartolomei, I., Dall'Osso, D., Rapezzi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genotypic+and+phenotypic+correlation+in+an+Italian+population+of+hereditary+amyloidosis+TTR-related+%28HA-TTR%29%3A+Clinical+and+neurophysiological+aids+to+diagnosis+and+some+reflections+on+misdiagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Amyloid%22%5BJournal%5D)">Genotypic and phenotypic correlation in an Italian population of hereditary amyloidosis TTR-related (HA-TTR): Clinical and neurophysiological aids to diagnosis and some reflections on misdiagnosis.</a> Amyloid. 19, suppl 1 58-60 (2012).</li>
<li>Suhr, O. B., Lundgren, E., Westermark, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One+mutation%2C+two+distinct+disease+variants%3A+Unravelling+the+impact+of+transthyretin+amyloid+fibril+composition%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">One mutation, two distinct disease variants: Unravelling the impact of transthyretin amyloid fibril composition.</a> Journal of Internal Medicine. 281 (4), 337-347 (2017).</li>
<li>Vilà-Rico, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+post-translational+modifications+in+human+serum+transthyretin+associated+with+familial+amyloidotic+polyneuropathy+by+targeted+LC-MS+and+intact+protein+MS%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of post-translational modifications in human serum transthyretin associated with familial amyloidotic polyneuropathy by targeted LC-MS and intact protein MS.</a> Journal of Proteomics. 127, 234-246 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W protokole istnieją dwa kluczowe kroki. Po pierwsze, aby mieć wystarczającą liczbę białych krwinek, należy unikać próbki hemodyluowanej11. Po drugie, stosowanie odpowiednich starterów PCR ma zasadnicze znaczenie dla uzyskania wiarygodnych wyników12. Do zaprojektowania podkładów 4,13 użyliśmy narzędzia sieciowego Primer-BLAST; należy pokryć co najmniej 40 par zasad z każdej strony czterech eksonów TTR. Uruchamiamy r...

Amyloidoza transtyretyny (TTR) (ATTR) jest najczęstszą formą dziedzicznej amyloidozy układowej1, i może być spowodowana przez autosomalną dominująco dziedziczoną mutację w genie transtyretyny (TTR)2. Mutacje TTR destabilizują strukturę białka tetramerycznego i prowadzą do jego dysocjacji na monomery, które ponownie łączą się w fibryle amyloidowe2. Na całym świecie zgłoszono ponad 100 amyloidogennych mutacji TTR1. Analizy genetyczne metodami reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) potwierdzają obecność mutacji punktowej TTR i mają zalety, w tym unikanie obsługi radioaktywnie znakowanych sond w porównaniu z southern blot3. PCR to szybka, łatwa, tania i niezawodna technika, która została zastosowana w wielu dziedzinach nowoczesnych nauk ścisłych4.
Wczesna diagnoza tej postępującej i śmiertelnej choroby jest wyzwaniem ze względu na jej fenotypową niejednorodność. Wraz z rosnącym zainteresowaniem i szerszym uznaniem wczesnych objawów ATTR, a także pojawiających się metod leczenia5, odpowiednie badania diagnostyczne, w tym test genetyczny TTR, mają zatem kluczowe znaczenie dla poprawy rokowania. Co więcej, różne mutacje są związane z różną penetracją cechy, wiekiem zachorowania, wzorcami progresji, ciężkością choroby, medianą przeżycia, skutecznością przeszczepu wątroby lub stabilizatorami TTR2,6 oraz zmiennym stopniem zaangażowania neurologicznego i kardiologicznego, co ma ogromne implikacje dla poradnictwa genetycznego7,8,9. Poza tym bardzo dokładny test genetyczny jest jedynym narzędziem, które rozróżnia dwa różne typy ATTR: dziedziczny (zmutowany) i dziki (forma niezmutowana, starcza amyloidoza układowa, SSA)7. Konieczne jest potwierdzenie rodzajów ATTR, ponieważ terapie różnią się znacznie od siebie2. W związku z tym coraz bardziej konieczne jest opisywanie stopniowego protokołu badania genetycznego TTR.
Molekularne podejście do wykrywania mutacji zostanie zilustrowane na przykładzie Ala97Ser, najpowszechniejszej endemicznej mutacji na Tajwanie. Modyfikacje na etapie ekstrakcji DNA zmniejszają ilość trzech użytych roztworów i dają wystarczającą ilość DNA. W tym protokole przeanalizowano wszystkie cztery eksony TTR, podczas gdy regiony, w tym 5' upstream, 3' downstream, promotory, introny i regiony nieulegające translacji (UTR) nie zostały zsekwencjonowane.

<table><tbody><tr><td>Probówki poddane działaniu EDTA Zestaw</td><td></td> do ekstrakcji DNA BD <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Stratagen</td><td>200600</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr NanoDrop ND2000&nbsp;</td><td>Wycieraczki Thermo Fisher Scientific</td><td>NanoDrop 2000</td><td></td></tr><tr><td>Delicate Task</td><td>Kimberly-Clark</td><td>Kimtech Science Kimwipes</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw polimerazy DNA AmpliTaq Gold 360 Applied</td><td>Biosystems</td><td>4398823</td><td></td></tr><tr><td>Startery intronowe genu TTR&nbsp;</td><td>Ekson1</td><td>F: 5'-TCAGATTGGCAGGGATAAGC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson1</td><td>R: 5'-GCAAAGCTGGAAGGAGTCAC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson2</td><td>F: 5'-TCTTGTTTCGCTCCAGATTTC-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson2</td><td>R: 5'-TCTACCAAGTGAGGGGCAAA-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson3</td><td>F: 5'-GTGTTAGTTGGGGGGGGTGT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson3</td><td>R: 5'-TGAGTAAAACTGTGCATTTCCTG-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson4</td><td>F: 5'-GACTTCCGGTGGTCAGTCAT-3'</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Ekson4</td><td>R: 5'-GCGTTCTGCCCAGATACTTT-3'</td><td></td></tr><tr><td>termocykler</td><td>Applied Biosystems</td><td>GeneAmp PCR System 9700</td><td></td></tr><tr><td>komórka do elektroforezy&nbsp;</td><td>ADVANCE</td><td>Mupid-2plus</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka DNA</td><td>Protech</td><td>PT-M1-100</td><td></td></tr><tr><td>barwnik</td><td>BioLabs</td><td>B7021</td><td></td></tr><tr><td>AlphaImager EC</td><td>Alpha Innotech</td><td>AlphaImager Automatyczny</td> sekwencer EC<td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Analizator <td></td>DNA <td>Applied Biosystems</td><td>3730xl</td></tr></tbody></table>

analiza genetyczna dziedzicznej amyloidozy związanej z transtyretyną ala97ser

Genetic Analysis of Hereditary Transthyretin Ala97Ser Related Amyloidosis

Testy genetyczne są najbardziej wiarygodnym testem na dziedziczną amyloidozę związaną z transtyretyną i powinny być wykonywane w większości przypadków amyloidozy transtyretynowej (ATTR). ATTR jest rzadką, ale śmiertelną chorobą o niejednorodnych fenotypach; Dlatego diagnoza jest czasami opóźniona. Wraz z rosnącym zainteresowaniem i szerszym uznaniem wczesnych objawów ATTR, a także pojawiających się metod leczenia, odpowiednie badania diagnostyczne, w tym test genetyczny transtyretyny (TTR), w celu potwierdzenia typów i wariantów ATTR, mają zatem zasadnicze znaczenie dla poprawy rokowania. Analizy genetyczne metodami reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) potwierdzają obecność mutacji punktowych TTR znacznie szybciej i bezpieczniej niż konwencjonalne metody, takie jak southern blot. W niniejszym artykule przedstawiamy genetyczne potwierdzenie mutacji ATTR Ala97Ser, najczęstszej mutacji endemicznej na Tajwanie. Protokół składa się z czterech głównych etapów: pobrania próbki krwi pełnej, ekstrakcji DNA, analizy genetycznej wszystkich czterech eksonów TTR za pomocą PCR oraz sekwencjonowania DNA.

Elektroforeza w żelu agarozowym próbek od dwóch pacjentów i jednej zdrowej osoby wykazała prążki o oczekiwanych rozmiarach, w tym produkt PCR o długości 454 bp dla eksonu 4 genu TTR (Rysunek 1).
<img alt="Wynik elektroforezy żelowej; fragmenty DNA; porównanie prążków; analiza genetyczna; drabinka mas cząsteczkowych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57743/57743fig1.jpg" data-altupdatedat="1788...

Tutaj prezentujemy protokół potwierdzający obecność mutacji punktowej do diagnozy dziedzicznej amyloidozy transtyretynowej, używając jako przykładu Ala97Ser, najpowszechniejszej mutacji endemicznej na Tajwanie.

Analiza genetyczna dziedzicznej amyloidozy związanej z transtyretyną Ala97Ser

Genetic testing is the most reliable test for hereditary transthyretin related amyloidosis and should be performed in most cases of transthyretin ...

Wraz z rosnącym zainteresowaniem wczesnymi objawami amyloidozy transtyretynowej, a także nowymi metodami leczenia, odpowiednie badania w celu potwierdzenia rodzajów i wariantów amyloidozy transtyretynowej mają zasadnicze znaczenie dla poprawy rokowania. Główną zaletą tego protokołu jest to, że test ten jest wykonalny i łatwy do wykonania w laboratorium klinicznym. Aby rozpocząć protokół, należy uzyskać zestaw do ekstrakcji DNA, dodać 10 mililitrów roztworu jeden do poprzedniej uzyskanej 4,0 mililitrowej próbki krwi i inkubować próbkę na lodzie przez 10 minut.Po inkubacji odwirować próbkę w temperaturze 2000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie usunąć i wyrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach roztworu pierwszego.Ponownie odwirować próbkę w temperaturze 2000 G przez pięć minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Odrzucić supernatant. Ponownie zawiesić osad w trzech mililitrach roztworu dwa.Następnie dodaj 10 mikrolitrów roztworu podstawowego Pronase, aby uzyskać końcowe stężenie 100 mikrogramów na mililitr i dobrze wymieszaj zawartość. Inkubuj DNA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia schłodź rurkę na lodzie przez 10 minut.Dodaj 0,8 mililitra roztworu trzy do próbki i odwróć ją trzy do pięciu razy. Następnie umieść próbkę na lodzie na pięć minut. Odwirować próbkę o sile 3000 g przez 15 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Ostrożnie przenieść supernatant do sterylnej stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 15 mililitrów i dodać sześć mikrolitrów roztworu podstawowego RNazy, aby uzyskać końcowe stężenie 20 mikrogramów na mililitr. Inkubuj próbkę, dodaj 2,5 mililitra alkoholu izopropylowego do probówki i delikatnie odwróć probówkę kilka razy, aby wytrącić DNA, które pojawia się jako pasma białego materiału flokulantowego. Za pomocą pipety o dużym otworze przenieś osad do nowej 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej.Odwirować osad o stężeniu 12 000 g przez trzy minuty w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Sklarowany osad należy ostrożnie wyrzucić. Następnie umyj osad DNA, dodając 500 mikrolitrów 70% etanolu.Odwirować DNA przy sile 12 000 G przez jedną minutę i odrzucić supernatant. Wysuszyć na powietrzu osad DNA w temperaturze pokojowej. Dodaj 100 mikrolitrów DDH2O i inkubuj próbkę w temperaturze 65 stopni Celsjusza przez 15 minut, aby ponownie zawiesić DNA.Wykonaj PCR w mieszaninie reakcyjnej o pojemności 25 mikrolitrów przy użyciu zestawu do polimerazy DNA. Dodaj odczynniki do 0,2 mililitrowej probówki do PCR. Delikatnie wymieszaj zawartość i krótko odwiruj ją w wirówce stołowej.Umieść rurkę w termocyklerze. Wykonaj PCR przez 30 cykli z etapem denaturacji przez 30 sekund w temperaturze 94 stopni Celsjusza, starterem umożliwiającym 30 sekund w temperaturze 58 stopni Celsjusza i przedłużeniem polimerazy przez 45 sekund w temperaturze 72 stopni Celsjusza. Przygotuj 1,2% żel agarozowy, mieszając 1,2 grama proszku agarozy ze 100 mililitrami 0,5 XTBE w kolbie mikrofalowej.Podgrzewaj roztwór w kuchence mikrofalowej przez dwie minuty, aż agaroza całkowicie się rozpuści. Mieszaninę agarozy ostudzić do 55 stopni Celsjusza. Dodaj dwa mikrolitry roztworu bromku etydyny do mieszaniny agarozy i delikatnie wymieszaj.Wlej mieszaninę do tacki na żel na około pięć do siedmiu milimetrów. Następnie włóż grzebień. Pozostaw żel do zestalenia się na co najmniej 30 minut.Po zastygnięciu żelu ostrożnie zdejmij grzebień. Umieść żel i tackę w komorze elektroforetycznej. Napełnij komórkę elektroforetyczną 0,5 XTBE, aż żel zostanie pokryty.Ostrożnie załaduj dwa mikrolitry drabiny DNA o długości 100 par zasad do jednego pasa żelu jako marker wielkości cząsteczki. Załaduj mieszaninę barwnika i próbki na dodatkowe pasy. Włącz zasilanie i uruchom żel na 25 minut przy napięciu 100 woltów.Usuń żel z komory elektroforetycznej. Na koniec zwizualizuj fragmenty DNA w świetle UV w systemie obrazowania. Elektroforeza w żelu agarozowym u dwóch pacjentów i jednej zdrowej osoby ujawnia prążki o oczekiwanych rozmiarach, w tym produkt PCR 454 par zasad dla eksonu czwartego genu TTR.Chromatogramy sekwencyjne ujawniły substytucję nukleotydu T dla G w eksonie czwartym genu TTR, co skutkowało mutacją typu missense i substytucją alaniny do seryny w pozycji aminokwasowej 97 u dwóch pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak potwierdzić obecność mutacji punktowych w celu rozpoznania dziedzicznej amyloidozy transtyretynowej.

genetic-analysis-hereditary-transthyretin-ala97ser-related

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Korzystając z mikroskopii sił atomowych w połączeniu z technologią biopanoramowania, stworzyliśmy negatywny i pozytywny system biopanowania, aby uzyskać przeciwciała przeciwko specyficznym dla choroby wariantom białek obecnym w dowolnym materiale biologicznym, nawet w niskich stężeniach.  Udało nam się uzyskać przeciwciała przeciwko wariantom białka TDP-43 zaangażowanym w stwardnienie zanikowe boczne.

Nowatorski biopanning oparty na mikroskopii sił atomowych do izolacji odczynników specyficznych dla morfologii przeciwko wariantom TDP-43 w stwardnieniu zanikowym bocznym

Przedstawiono podejście genetyki odwrotnej do zrozumienia rodzin genów związanych z chorobami ludzkimi, używając myszy jako systemu modelowego, a następnie opisano harmonogram fenotypowania myszy. Ponieważ myszy z wadami genu HtrA2 wykazywały objawy parkinsonowskie, schemat fenotypowania koncentruje się na identyfikacji wad neurologicznych.

Schemat fenotypowania dla genetycznie zmodyfikowanych myszy używany do badania genów związanych z chorobami człowieka związanymi ze starzeniem się

Ten protokół opisuje metodę precyzyjnego pomiaru szybkości transportu nukleocytoplazmatycznego w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych poprzez ilościowe określenie zmian w czasie rzeczywistym w imporcie jądrowym białka NLS-NES-GFP.

Test do pomiaru transportu nukleocytoplazmatycznego w czasie rzeczywistym w komórkach NSC-34 podobnych do neuronów ruchowych

Odkładanie się amyloidu jest cechą charakterystyczną różnych chorób i dotyka wiele różnych narządów. W pracy opisano zastosowanie luminescencyjnego sprzężonego barwienia fluorescencyjnego oligotiofenem w połączeniu z technikami mikroskopii fluorescencyjnej. Ta metoda barwienia stanowi potężne narzędzie do wykrywania i eksploracji agregatów białkowych zarówno w warunkach klinicznych, jak i naukowych.

Obrazowanie tkanek amyloidowych barwionych luminescencyjnymi sprzężonymi oligotiofenami za pomocą hiperspektralnej mikroskopii konfokalnej i obrazowania fluorescencji

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji to efektywne czasowo i kosztowo podejście, które staje się coraz bardziej popularne zarówno w badaniach nad chorobami, jak i w diagnostyce klinicznej. Opisany tutaj protokół przedstawia złożony przepływ pracy wymagany do sekwencjonowania i procesu bioinformatycznego wykorzystywanego do identyfikacji wariantów genetycznych, które przyczyniają się do choroby.

Ukierunkowane sekwencjonowanie nowej generacji i bioinformatyka w celu oceny genetycznych uwarunkowań chorób konstytucjonalistycznych

W niniejszym badaniu opisujemy metodologię analizy genotypu C924T. Protokół składa się z trzech faz: ekstrakcji DNA, amplifikacji w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) oraz analizy polimorfizmu długości fragmentu restrykcyjnego (RFLP) na żelu agarozowym.

Metoda badania polimorfizmu C924T genu receptora tromboksanu A2

Analiza sygnału do szumu na poziomie aminokwasów określa rozpowszechnienie zmienności genetycznej na danej pozycji aminokwasu, znormalizowanej do zmienności genetycznej tła danej populacji. Pozwala to na identyfikację wariantowych "gorących punktów" w sekwencji białka (sygnału), która wzrasta powyżej częstości występowania rzadkich wariantów występujących w populacji (szum).

Określanie prawdopodobieństwa patogenności wariantów za pomocą analizy zmienności genetycznej na poziomie aminokwasów

Biomarkery chorób neurodegeneracyjnych oparte na krwi są niezbędne do prowadzenia badań klinicznych na dużą skalę. Wiarygodne i zwalidowane badanie krwi powinno wymagać małej objętości próbki, a także być mniej inwazyjną metodą pobierania próbek, przystępną cenowo i powtarzalną. W artykule wykazano, że wysokoprzepustowy test immunologiczny elektroforezy kapilarnej spełnia kryteria potencjalnego rozwoju biomarkerów.

Zastosowanie testu immunologicznego elektroforezy kapilarnej w celu poszukiwania potencjalnych biomarkerów stwardnienia zanikowego bocznego w ludzkich płytkach krwi

Na podstawie rodzinnej rodziny kardiomiopatii dziedzicznej znalezionej w naszej pracy klinicznej, stworzyliśmy model myszy C57BL/6N z mutacją punktową (G823E) w mysim locus MYH7 za pomocą inżynierii genomu za pośrednictwem CRISPR/Cas9, aby zweryfikować tę mutację.

Badanie patogenezy mutacji MYH7 Gly823Glu w rodzinnej kardiomiopatii przerostowej przy użyciu modelu mysiego

Tutaj prezentujemy protokół wykorzystujący najnowszą wersję narzędzia Agencji Ochrony Środowiska USA do przewidywania podatności gatunków (SeqAPASS). Protokół ten demonstruje zastosowanie narzędzia online do szybkiej analizy konserwacji białek i dostarczania konfigurowalnych i łatwych do interpretacji prognoz podatności chemicznej u różnych gatunków.

Demonstracja narzędzia do dopasowywania sekwencji w celu przewidywania podatności różnych gatunków w celu szybkiej oceny zachowania białek

Tutaj opisujemy układ drożdżowy rekonstytuujący ludzką γ-sekretazę. System ten umożliwia identyfikację i badanie mutacji wpływających na aktywność oraz badanie inhibitorów γ-sekretazy (GSI). Wykorzystując właściwości utraty funkcji u rodzinnych mutantów choroby Alzheimera, możliwe jest badanie przesiewowe pod kątem modulatorów γ-sekretazy (GSM).

Saccharomyces cerevisiae Modele choroby Alzheimera do badania genów, mutacji i substancji chemicznych wpływających na produkcję amyloidu beta przez γ-sekretazę

Poznaj protokół diagnostyczny dziedzicznej amyloidozy transtyretynowej z mutacją Ala97Ser. Metoda obejmuje ekstrakcję DNA, PCR i elektroforezę agarozową do potwierdzenia mutacji punktowych w genie TTR.

Analiza genetyczna dziedzicznej amyloidozy związanej z transtyretyną Ala97Ser

Przeglądaj więcej filmów